專(zhuān)利名稱(chēng)：生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙生產(chǎn)稀有人參皂甙的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用生化技術(shù)生產(chǎn)稀有人參皂甙的方法，特別是屬于一種生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙生產(chǎn)稀有人參皂甙的方法。
背景技術(shù)：
人參在中國(guó)和東南亞地區(qū)的應(yīng)用已有數(shù)千年，人參所具有的滋補(bǔ)強(qiáng)身作用也已聞名全世界，人參屬于五加科人參屬，常用的人參有中國(guó)人參(Panax ginseng)、高麗參(P.ginsen C.A.Meyer)、西洋參(P.quiqueflium L.)和三七人參(P.notoginseng Burk)等，經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀(jì)的研究，從人參植物的根部和其它部位分離了人參皂甙、人參炔醇、人參多糖、多肽、有機(jī)酸及脂、甾醇、氨基酸和微量元素。而且，證明了人參皂甙(ginsenoside)是人參功效的主要成分，隨著分離分析技術(shù)的進(jìn)步，人參皂甙的分離、精制、分子結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能已被逐一闡明，近年還證明了人參制劑中含量極低的Rg3、Rg5、Rh2、Rh3、C-K等具有抗癌活性，稀有人參皂甙可以從天然植物中提取，也可以用化學(xué)法合成獲得，但由于Rh2在紅參中的含量約為萬(wàn)分之二，其分離純化十分困難；化學(xué)法合成因成本過(guò)高而無(wú)法工業(yè)化生產(chǎn)。酶是天然催化劑，是目前已知的催化效率最高、專(zhuān)一性最強(qiáng)、惟一的具備立體異構(gòu)體選擇能力、催化能力可調(diào)節(jié)、在生理?xiàng)l件下作用的催化劑。利用生物催化劑專(zhuān)一而高效地催化無(wú)數(shù)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化方法，在食品和醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用有著悠久的歷史，近60年酶制劑工業(yè)和固定化酶在工業(yè)應(yīng)用中的發(fā)展更顯示出生物催化劑在加速反應(yīng)進(jìn)行、提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)率、降低成本和適于工業(yè)化方面具有極大的優(yōu)勢(shì)。上世紀(jì)以來(lái)，Akao報(bào)道人腸道菌可水解人參皂甙Rb1的糖甙鏈，最終形成化合物K(C-K)(Akao Tetal j.Pharmacol.1998，501155-1160)；在近幾年，采用微生物分離人參皂甙β-葡萄糖甙酶用于水解Rg3生產(chǎn)Rh2的方法也有報(bào)道(Yu HS，MaXQ，Gao Y，Jin FX，J.Ginseng.Res 1999 2250-54)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種采用生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙生產(chǎn)稀有人參皂甙的方法。
本發(fā)明的目的是采用這樣的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的其特征在于選取具有水解人參皂甙的活力菌株，用生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙，其步驟是(1)選用木霉、青霉、黑曲霉及人腸道菌為生物催化劑，(2)將具有降解人參皂甙能力的生物催化劑接種至人參總皂甙溶液；(3)所述的人參總皂甙溶液經(jīng)培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化、發(fā)酵、離心、吸附、洗滌工序后，即可獲得稀有人參皂甙。
本發(fā)明提供了生物催化劑在溫和條件下含量高的人參皂甙可以轉(zhuǎn)化成極具應(yīng)用潛力的稀有皂甙的方法，采用上述方法能夠?qū)⒅袊?guó)人參、高麗人參、西洋參、三七參的總皂甙，或分離純化后的個(gè)別皂甙，經(jīng)生物催化劑轉(zhuǎn)化，可獲得富集Rg3、Rh2、C-K的人參皂甙混合物，用硅膠柱分離及溶劑提取可得高純度皂甙，轉(zhuǎn)化獲得的稀有人參皂甙的生產(chǎn)率達(dá)10％。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明采用選取具有水解人參皂甙的活力菌株，用生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙，其步驟是(1)選用LDW2045木霉；LDW2014青霉Penicillium sp.；LDW2077黑曲霉Aspenrgillus sp.；LDW2216雙歧桿菌Bifidobacterium.；LDW2217真細(xì)菌Eubacterium為降解人參皂甙的生物催化劑；(2)將被選用的生物催化劑接種至人參總皂甙溶液；(3)所述的接種有生物催化劑的人參總皂甙溶液經(jīng)培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化、發(fā)酵、離心、吸附、洗滌工序后，即可獲得稀有人參皂甙。
本發(fā)明所述的細(xì)胞和固定化細(xì)胞可在溫和條件下依賴(lài)人參皂甙糖苷酶，將皂甙分子上的單糖除去，由于細(xì)胞中含有多種皂甙糖苷酶，會(huì)使人參總皂甙中含量較高的皂甙隨著除去糖基成那些在薄層層析譜上有較高Rf值的稀有皂甙。采用LDW2014青霉Penicillium sp.能夠轉(zhuǎn)化人參總皂甙混合產(chǎn)生富集Rh2產(chǎn)物；人腸道細(xì)菌LDW2216雙歧桿菌Bifidobacterium和LDW2217真細(xì)菌Eubacterium也能使人參皂甙Rc轉(zhuǎn)化成化合物K(C-K)。
本發(fā)明所述的生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙生產(chǎn)稀有人參皂甙的方案，采用生物催化平臺(tái)(由微生物細(xì)胞、酶、固定化細(xì)胞和固定化酶組成)和生物反應(yīng)器在批式攪拌罐中、溫和條件下高效專(zhuān)一地降解人參皂甙轉(zhuǎn)化稀有皂甙的技術(shù)，所述專(zhuān)一高效水解人參皂甙的生物催化劑為經(jīng)篩選得到的木霉、青霉、曲霉及人腸道菌等微生物，這些微生物為以鹽析分離純化專(zhuān)一用于人參皂甙的水解酶，以及以包埋法固定化細(xì)胞和以共價(jià)法固定化酶，多種固定化酶，固定化細(xì)胞可以聯(lián)合起來(lái)形成反應(yīng)器；本發(fā)明所述生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙技術(shù)分別采用批式攪拌器、柱式連續(xù)流動(dòng)、水/有機(jī)溶劑兩項(xiàng)生物反應(yīng)器，本發(fā)明所選用的轉(zhuǎn)化原料為中國(guó)人參、高麗人參、西洋參、三七參的總皂甙，反應(yīng)產(chǎn)物分別為富集Rg3、Rh2、C-K的人參混合物，經(jīng)過(guò)硅膠柱分離及溶劑抽提即獲得高純?cè)磉啊?br> 固定化酶和固定化細(xì)胞引入人參皂甙的轉(zhuǎn)化也為生物催化劑延長(zhǎng)工作壽命，減少雜質(zhì)帶來(lái)好處，尤其在人參皂甙Rh3轉(zhuǎn)化Rh2時(shí)顯示了優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例1LDW2014菌(黑曲霉Aspenrgillus niger)接種到25ml3％葡萄糖-2.5玉米漿-30mg/ml人參總皂甙溶液，PH6.0，30℃旋轉(zhuǎn)搖床140r.p.m上培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化60h；發(fā)酵轉(zhuǎn)化液4000r.p.m離心，上清液經(jīng)HZ-803大孔吸附樹(shù)脂吸附，水洗滌，甲醇洗滌，獲得菌轉(zhuǎn)化的富集Rh2的人參總皂甙，Rh2生產(chǎn)率可達(dá)10％。
實(shí)施例2LDW2014菌(黑曲霉Aspenrgillus niger)接種到50ml3％葡萄糖-2.5玉米漿-0.1％(NH4)2SO4-0.1人參總皂甙培養(yǎng)基中，28-30℃，200r.p.m旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48小時(shí)，4000r.p.m離心，上清液以30-70硫酸銨飽和度獲取酶活力部分，透析后，Q-Sepharose純化皂甙糖苷酶；可得酶G，酶G能用于水解Rg3，生產(chǎn)Rh2；實(shí)施例3LDW2014菌(黑曲霉Aspenrgillus niger)經(jīng)實(shí)施例2硫酸銨沉淀與Q-Sepharose純化的皂甙糖苷酶G(活力150U/ml，蛋白0.65mg/ml)6ml與1g環(huán)氧基的GM多孔載體混合，4℃攪拌反應(yīng)3d砂芯漏斗過(guò)濾，固定化酶顆粒經(jīng)50mm醋酸緩沖液-0.5MnaCl洗滌。即得固定化人參皂甙苷酶G；活力回收28％，固定化酶表現(xiàn)活力250U/g。
實(shí)施例4
LDW2077菌(青霉Penicillium sp)在Medium338，馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基100ml和1％鮮參抽提液中26℃轉(zhuǎn)速200r.p.m搖床中培養(yǎng)60h，直接加入人參總皂甙水溶液30mg/ml，繼續(xù)轉(zhuǎn)化60h后停止反應(yīng)，乙醇提取，過(guò)濾、減壓蒸干，可得Rh2，測(cè)得Rh2轉(zhuǎn)化率6.5％。
實(shí)施例5LDW2077菌(青霉Penicillium sp)和LDW2014菌(黑曲霉Aspenrgillusniger)同時(shí)接種與Medium325麥芽汁培養(yǎng)液100ml(麥芽抽提液20g-葡萄糖20g-蛋白質(zhì)1g/升)和鮮參抽提液，培養(yǎng)48h，200r.p.m離心后，除去上清，備用；同時(shí)取5g聚乙二醇加75ml水，80℃攪拌均勻，與細(xì)胞漿混勻，通過(guò)8#注射針頭滴入5％硼酸溶液中，制成直徑約為2mm顆粒，即得固定化細(xì)胞；用該固定化細(xì)胞再懸于人參總皂甙中，可獲得10％轉(zhuǎn)化為Rh2。
權(quán)利要求
1.一種生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙生產(chǎn)稀有人參皂甙的方法，其特征在于選取具有水解人參皂甙的活力菌株，用生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙，其步驟是(1)選用木霉、青霉、黑曲霉及人腸道菌為生物催化劑，(2)將具有降解人參皂甙能力的生物催化劑接種至人參總皂甙溶液；(3)所述的人參總皂甙溶液經(jīng)培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化、發(fā)酵、離心、吸附、洗滌工序后，即可獲得稀有人參皂甙。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙生產(chǎn)稀有人參皂甙的方法，其特征在于所述的人參總皂甙為中國(guó)人參、高麗人參、西洋參、三七參的總皂甙。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙生產(chǎn)稀有人參皂甙的方法，其特征在于所述的生物催化劑轉(zhuǎn)化是指生物催化平臺(tái)和生物反應(yīng)器在批式攪拌罐中、溫和條件下高效專(zhuān)一地降解人參皂甙轉(zhuǎn)化稀有皂甙。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙生產(chǎn)稀有人參皂甙的方法，其特征在于所述的生物催化平臺(tái)由微生物細(xì)胞、酶、固定化細(xì)胞和固定化酶組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙生產(chǎn)稀有人參皂甙的方法，其特征在于所述的生物催化劑為經(jīng)篩選得到的木霉、青霉、曲霉及人腸道菌等微生物，這些微生物為以鹽析分離純化專(zhuān)一用于人參皂甙的水解酶，以及以包埋法固定化細(xì)胞和以共價(jià)法固定化酶，多種固定化酶，固定化細(xì)胞能聯(lián)合形成反應(yīng)器。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙生產(chǎn)稀有人參皂甙的方法，其特征在于所述的生物反應(yīng)器是指批式攪拌器、柱式連續(xù)流動(dòng)、水/有機(jī)溶劑兩項(xiàng)生物反應(yīng)器。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙生產(chǎn)稀有人參皂甙的方法，其特征在于所述的LDW2014菌(黑曲霉Aspenrgillus niger)接種到25ml3％葡萄糖-2.5玉米漿-30mg/ml人參總皂甙溶液，PH6.0，30℃旋轉(zhuǎn)搖床140r.p.m上培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化60h；發(fā)酵轉(zhuǎn)化液4000r.p.m離心，上清液經(jīng)HZ-803大孔吸附樹(shù)脂吸附，水洗滌，甲醇洗滌，獲得菌轉(zhuǎn)化的富集Rh2的人參總皂甙，Rh2生產(chǎn)率可達(dá)10％。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙生產(chǎn)稀有人參皂甙的方法，其特征在于所述的LDW2014菌(黑曲霉Aspenrgillus niger)經(jīng)實(shí)施例2硫酸銨沉淀與Q-Sepharose純化的皂甙糖苷酶G(活力150U/ml，蛋白0.65mg/ml)6ml與1g環(huán)氧基的GM多孔載體混合，4℃攪拌反應(yīng)3d砂芯漏斗過(guò)濾，固定化酶顆粒經(jīng)50mm醋酸緩沖液-0.5MnaCl洗滌。即得固定化人參皂甙苷酶G；活力回收28％，固定化酶表現(xiàn)活力250U/g。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙生產(chǎn)稀有人參皂甙的方法，其特征在于所述的LDW2077菌(青霉Penicillium sp)在Medium338，馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基100ml和1％鮮參抽提液中26℃轉(zhuǎn)速200r.p.m搖床中培養(yǎng)60h，直接加入人參總皂甙水溶液30mg/ml，繼續(xù)轉(zhuǎn)化60h后停止反應(yīng)，乙醇提取，過(guò)濾、減壓蒸干，可得Rh2，測(cè)得Rh2轉(zhuǎn)化率6.5％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用生化技術(shù)生產(chǎn)稀有人參皂甙的方法，特別是屬于一種生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙生產(chǎn)稀有人參皂甙的方法，其特征在于選取具有水解人參皂甙的活力菌株，用生物催化劑轉(zhuǎn)化人參皂甙，其步驟是選用木霉、青霉、黑曲霉及人腸道菌為生物催化劑；將具有降解人參皂甙能力的生物催化劑接種至人參總皂甙溶液；所述的人參總皂甙溶液經(jīng)培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化、發(fā)酵、離心、吸附、洗滌工序后，即可獲得稀有人參皂甙。本發(fā)明能夠?qū)⒅袊?guó)人參、高麗人參、西洋參、三七參的總皂甙，或分離純化后的個(gè)別皂甙，經(jīng)生物催化劑轉(zhuǎn)化，可獲得富集Rg3、Rh2、C－K的人參皂甙混合物，用硅膠柱分離及溶劑提取可得高純度皂甙，轉(zhuǎn)化獲得的稀有人參皂甙的生產(chǎn)率達(dá)10％。
文檔編號(hào)C12P33/00GK1477205SQ0314159
公開(kāi)日2004年2月25日 申請(qǐng)日期2003年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月10日
發(fā)明者黃亞平 申請(qǐng)人:黃亞平