專(zhuān)利名稱(chēng)：鰻弧菌減毒活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及減毒活疫苗，具體的說(shuō)是鰻弧菌的減毒活疫苗。
背景技術(shù)：
隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的逐步發(fā)展，接踵而來(lái)的是各種病害的大規(guī)模爆發(fā)，病害問(wèn)題日益突出，制約著海水養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。病害的防治和控制已經(jīng)成為海水養(yǎng)殖應(yīng)該解決的首要問(wèn)題。
鰻弧菌是嚴(yán)重危害我國(guó)及世界海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的一類(lèi)細(xì)菌性重要病原體，主要導(dǎo)致養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的出血性敗血病等弧菌病，其主要致病毒力因子為鰻弧菌含有的pJM1類(lèi)質(zhì)粒編碼的鐵攝取系統(tǒng)(Crosa，J.H.，Walsh，C.T.Genetics andassembly line enzymology of siderophore biosynthesis in bacteria.Microbiol MolBiol Rev，2002，66(2)223-49)。
目前，對(duì)于該病原體引發(fā)的弧菌病的主要防治手段為使用抗生素和鰻弧菌滅活疫苗。鑒于抗生素的環(huán)境危害、大量抗藥性病原體的出現(xiàn)，抗生素防治手段已經(jīng)在世界范圍內(nèi)逐漸禁用。作為符合環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的病害防治措施，疫苗防治正成為國(guó)際現(xiàn)代海洋農(nóng)業(yè)的先進(jìn)手段和主要前沿研究與開(kāi)發(fā)領(lǐng)域。疫苗具有針對(duì)性強(qiáng)、抗病周期長(zhǎng)、可終身免疫、效果顯著和防治主動(dòng)的特點(diǎn)。減毒活菌疫苗更是具有給藥方便、免疫效價(jià)高、成本低廉的新技術(shù)優(yōu)勢(shì)，同時(shí)具有開(kāi)發(fā)廣譜疫苗的潛力優(yōu)勢(shì)。
目前，國(guó)外已開(kāi)發(fā)成功并商業(yè)化用于防治鰻弧菌弧菌病的鰻弧菌滅活疫苗(http://ag.ansc.purdue.edu/aquanic/index.htm)。我國(guó)未見(jiàn)任何形式的鰻弧菌商品化疫苗。美國(guó)專(zhuān)利有利用轉(zhuǎn)座子插入突變技術(shù)構(gòu)建鰻弧菌減毒活疫苗的報(bào)道(United State Patent 5,284,653)。國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)其它任何形式的鰻弧菌減毒活疫苗開(kāi)發(fā)文獻(xiàn)報(bào)道。
滅活疫苗往往具有以下缺陷保護(hù)性抗原不完全，免疫應(yīng)答反應(yīng)不穩(wěn)定和水平低下，甚至不能激發(fā)正確免疫反應(yīng)及引發(fā)副作用，給藥不方便等。
使用轉(zhuǎn)座子等基因重組構(gòu)建技術(shù)開(kāi)發(fā)的鰻弧菌活疫苗含有抗生素抗性標(biāo)記和外源基因片段，在技術(shù)上具有毒力易回復(fù)和潛在的環(huán)境安全危害等特征，被包括中國(guó)在內(nèi)的各國(guó)生物制品安全檢查管理機(jī)構(gòu)審批法規(guī)認(rèn)定為具有較高環(huán)境安全風(fēng)險(xiǎn)的生物制品而難以進(jìn)入商業(yè)化開(kāi)發(fā)進(jìn)程。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的在于提供一種鰻弧菌減毒活疫苗及其制備方法。技術(shù)方案及其說(shuō)明，為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種鰻弧菌減毒活疫苗，它是鰻弧菌毒株MVM425的減毒活疫苗，其中缺失了pEIB1質(zhì)粒。本發(fā)明提供了由野生毒株MVM425得到的pEIB1質(zhì)粒缺失株，命名為MVAV6201(于2003年9月19日保藏于位于武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC-M203069)。
本發(fā)明的鰻弧菌毒株MVM425從我國(guó)黃海海域養(yǎng)殖漁場(chǎng)內(nèi)爆發(fā)鰻弧菌弧菌病的病魚(yú)體內(nèi)分離得到，是一種強(qiáng)致病力野生株(Vibrio anguillarum MVM425，馬悅等，“海洋魚(yú)類(lèi)弧菌病疫苗的制備——新型簡(jiǎn)易鰻弧菌培養(yǎng)基優(yōu)化”，《高技術(shù)通訊》Vol.11(7)，2001)。已證實(shí)，該毒株攜帶有pEIB1毒性質(zhì)粒，并已完成了其全序列測(cè)定工作(Genbank登錄號(hào)AY255699)，該質(zhì)粒屬于pJM1類(lèi)野生的游離質(zhì)粒，編碼鐵攝取系統(tǒng)。
本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明減毒活疫苗的方法，該方法包括1)將鰻弧菌野生毒株MVM425的培養(yǎng)物于35-38℃，以37℃為佳，在含0.2-0.5mM，以0.2M為佳的Fe3+的培養(yǎng)基中培養(yǎng)14-18小時(shí)，以16小時(shí)為佳；2)將步驟1所得培養(yǎng)物于25-28℃，以28℃為佳，常溫?cái)U(kuò)增培養(yǎng)12-18小時(shí)，以12小時(shí)為佳；3)重復(fù)步驟1)和2)2-3輪；4)進(jìn)行CAS平板篩選，不能在平板上生長(zhǎng)的為鰻弧菌野生毒株MVM425的減毒活疫苗候選株；5)PCR檢測(cè)質(zhì)粒pEIB1，反應(yīng)呈陰性的候選株鑒定為減毒活疫苗。
本發(fā)明主要基于以下原理在35～38℃的高溫培養(yǎng)條件下，鰻弧菌質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)酶系活力降低，細(xì)胞生長(zhǎng)速度卻無(wú)明顯降低，質(zhì)粒在子代中分配不均勻，導(dǎo)致質(zhì)粒缺失菌株的產(chǎn)生。
本發(fā)明方法中，培養(yǎng)基可選用LB培養(yǎng)基，其中的蛋白胨可以是酪蛋白胨、胰蛋白胨或大豆蛋白胨，補(bǔ)加NaCl至3％。本發(fā)明選用大豆蛋白胨。用于本發(fā)明高溫培養(yǎng)步驟的培養(yǎng)基必須包含0.2-0.5mM的Fe3+。所述的Fe3+的形式可以是例如檸檬酸鐵銨或FeCl3，本發(fā)明優(yōu)選FeCl3。
在本發(fā)明高溫培養(yǎng)之前還可以包括一步常規(guī)的復(fù)蘇培養(yǎng)。即，將保存于斜面的野生毒株接種于新鮮培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至生長(zhǎng)旺盛期，例如O.D＝4.0時(shí)。
本發(fā)明減毒活疫苗的篩選采用CAS平板法(Bernhard Schwyn andJ.B.Neilands.1987.Universal Chemical Assay for the Detection and Determinationof Siderophores.Analytical Biochemistry 160，47-56)。質(zhì)粒缺失株由于缺乏質(zhì)粒參與編碼合成的鐵攝取系統(tǒng)，喪失了攝取非游離鐵營(yíng)養(yǎng)的能力而不能在含有鐵螯合劑的CAS平板上生長(zhǎng)，野生株則能夠通過(guò)鐵載體攝鐵生存，并使CAS平板中與鐵螯合的染料因失去鐵離子而從蘭綠色變?yōu)槌赛S色。
有益效果本發(fā)明由野生毒株MVM425得到一株pEIB1質(zhì)粒缺失株，MVAV6201，其相對(duì)于其野生毒株MVM425具有明顯的低毒性和免疫保護(hù)率，可有效地防護(hù)敏感魚(yú)種免受強(qiáng)弧菌病致病力鰻弧菌野生株的侵染。在給藥濃度遠(yuǎn)低于常規(guī)滅活疫苗給藥量的情況下，仍然具有非常高的免疫保護(hù)率。后文對(duì)比試驗(yàn)表明，該活疫苗免疫效果優(yōu)于相應(yīng)的滅活疫苗，對(duì)海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)具有非常好的弧菌病防治效果。同時(shí)，該減毒疫苗株不含有任何外源基因片段和抗生素抗性標(biāo)記，毒力基因大量缺失，毒力不可回復(fù)，具有技術(shù)上的環(huán)境安全性，有實(shí)際的商業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值。


圖1angE基因PCR擴(kuò)增片段電泳圖譜，其中1～6泳道為待檢株，泳道7為野生株對(duì)照。其中各泳道待檢株的培養(yǎng)條件分別為1號(hào)株——35℃高溫培養(yǎng)18h，常溫培養(yǎng)10h，0.5mM Fe3+；2號(hào)株——38℃高溫培養(yǎng)14h，常溫培養(yǎng)18h，0.5mM Fe3+；3號(hào)株——35℃高溫培養(yǎng)18h，常溫培養(yǎng)12h，0.5mM Fe3+；4號(hào)株----38℃高溫培養(yǎng)14h，常溫培養(yǎng)18h，0.2mM Fe3+；5號(hào)株——37℃高溫培養(yǎng)16h，常溫培養(yǎng)12h，0.2mM Fe3+；6號(hào)株——35℃高溫培養(yǎng)14h，常溫培養(yǎng)18h，0.5mM Fe3+。如圖所示，其中1，2，6泳道內(nèi)的電泳帶表示pEIB1的特征基因angE，證實(shí)pEIB1質(zhì)粒未缺失，所以1號(hào)、2號(hào)和6號(hào)待檢株并非目標(biāo)減毒活疫苗，被篩除。
圖2牙鲆免疫后感染的累計(jì)死亡情況。
圖3減毒活疫苗MVAV6201與MVM425滅活疫苗的免疫保護(hù)力對(duì)比試驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1鰻弧菌減毒活疫苗的制備取1接種環(huán)保存于LB斜面培養(yǎng)基(大豆蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl 30g/L，瓊脂18g/L，pH7.5)上的種子，接種于裝有1ml液體LB種子培養(yǎng)基(大豆蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl30g/L，pH7.5)的試管，在28℃下培養(yǎng)。12小時(shí)后，取0.01ml生長(zhǎng)旺盛的菌液(O.D＝4.0左右)接種于1ml新鮮富鐵LB培養(yǎng)基(大豆蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl 30g/L，F(xiàn)eCl30.2-0.5mmol，pH6.8)，37℃高溫培養(yǎng)16小時(shí)。取0.01ml菌液，轉(zhuǎn)接于1ml新鮮富鐵LB培養(yǎng)基(含0.2mM Fe3+)，于28℃培養(yǎng)下培養(yǎng)12小時(shí)。如上所述，重復(fù)2至3個(gè)循環(huán)后，所得菌液即為包含候選株的待篩菌液。
重復(fù)以上過(guò)程，改變培養(yǎng)溫度、時(shí)間和Fe3+濃度，制得包含其它候選株的待篩菌液(見(jiàn)圖1)。
制備CAS篩子培養(yǎng)基。溶液A(100ml)稱(chēng)取60.5mg鉻天青(CAS)溶于50ml水；稱(chēng)取72.9mg十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA)溶于40ml水；配置10ml Fe3+溶液，其中包含1mMFeCl3.6H2O和10mM HCl。將上述配置的CAS溶液和Fe3+溶液同時(shí)加入到HDTMA溶液中，不斷攪拌使其充分混合。最后形成100ml的深藍(lán)色溶液。0.1MPa下滅菌20min。溶液B(g/L，900ml)NaCl 25，KCl 0.7，NH4Cl 1.0，NaHCO30.2，酵母浸出物5，CaCl21.0，MgCl2·6H2O 4.6，蔗糖20，KH2PO43，Na2HPO46，瓊脂18，加入25g哌嗪-N，N-雙(2-乙磺酸)(PiPes)后用NaOH調(diào)pH至6.8。0.1MPa下滅菌20min。當(dāng)溶液B冷卻至50℃左右后，將溶液A緩緩加入到溶液B，充分混合均勻，形成藍(lán)黑色溶液，冷卻凝固后即為CAS篩子平板培養(yǎng)基。(亦可參見(jiàn)Bernhard Schwyn andJ.B.Neilands.1987.Universal Chemical Assay for the Detection and Determinationof Siderophores.Analytical Biochemistry 160，47-56)取待篩菌液，用3％NaCl無(wú)菌溶液稀釋為不同倍數(shù)(10-2，10-3，10-4，10-5，10-6)，分別涂前述富鐵LB平板(含F(xiàn)e3+0.2mM)，待單菌落長(zhǎng)出。將每個(gè)單菌落按照影印關(guān)系分別點(diǎn)種于CAS篩子平板和LB富鐵平板(Fe3+＝0.1mM～0.3mM，并按照影印關(guān)系在兩板上相應(yīng)編號(hào))。在篩子板上無(wú)法生長(zhǎng)而在富鐵平板正常生長(zhǎng)的即為本發(fā)明的待定減毒活疫苗的候選株。為了剔除假陽(yáng)性的菌株，進(jìn)一步提高目標(biāo)株的得率，可以對(duì)待定候選株進(jìn)一步如前所述進(jìn)行變溫誘變和純化分離。
以鰻弧菌野生毒性株MVM425含有的編碼鐵攝取系統(tǒng)的毒性質(zhì)粒pEIB1上特征基因angE(Genbank登錄號(hào)為AY255699)為目標(biāo)片段進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并與野生株對(duì)照。如PCR反應(yīng)為陰性，即無(wú)目標(biāo)PCR擴(kuò)增片段，則鑒定為毒性質(zhì)粒pEIB1全部缺失的減毒活疫苗MVAV6201。
PCR引物經(jīng)Primer軟件設(shè)計(jì)，引物內(nèi)、引物間無(wú)引物二聚體。目標(biāo)擴(kuò)增片段大小為1,580bp。
引物序列上游—5′CAAGCA TATGAGTTACTCACTGTATAAGGG 3′(SEQ ID NO1)下游—5′GGGG GATCCTATTTAAGTACTATATTCGG 3′(SEQ ID NO2)PCR反應(yīng)條件94℃變性1min；62.5℃退火1.0min；72℃延伸1.5min，29 cycles；72℃最終延伸7min，1 cycle。取5～7μl進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，確定有無(wú)目標(biāo)基因片段，結(jié)果見(jiàn)圖1。
實(shí)施例2以牙鲆為對(duì)象的感染與免疫感染性實(shí)驗(yàn)將鰻弧菌野生毒株V.anguillarumMVM425和pEIB1質(zhì)粒缺失株V.anguillarumMVAV6201在含鐵LB培養(yǎng)基(前述LB種子培養(yǎng)基+0.5mM Fe3+)中于28℃搖床(200r/min)培養(yǎng)24h。離心收集菌體(10,000r/min，10min)，用滅菌生理鹽水(pH7.4)洗滌菌體3次后制成菌懸浮液備用。
試驗(yàn)用魚(yú)為從黃海水產(chǎn)研究所大麥島實(shí)驗(yàn)基地購(gòu)買(mǎi)的牙鲆(Paralichthysolivaceus Temminck et Schlegel)，對(duì)鰻弧菌敏感，平均體長(zhǎng)10±1cm，體重50±2.5g。
將試驗(yàn)用魚(yú)隨機(jī)分組，每組30尾，每天換去1/3飼養(yǎng)水體并充分供氧，養(yǎng)殖水溫22℃。在整個(gè)過(guò)程中不喂食。養(yǎng)殖3天后，臨實(shí)驗(yàn)前剔除不正常個(gè)體。
每尾實(shí)驗(yàn)魚(yú)用醫(yī)用注射器腹部注射103～108cells/ml的前述菌懸液0.2ml，對(duì)照組注射0.85％的生理鹽水，在7天內(nèi)記錄半數(shù)死亡數(shù)及給藥菌濃度，確定LD50值(見(jiàn)表1)。
表1 鰻弧菌毒性株MVM425和減毒株MVAV6201對(duì)牙鲆的感染試驗(yàn)感染菌株LD50備注MVM425 1×104/ml 3天達(dá)到半數(shù)致死MVAV6201108/ml 試驗(yàn)濃度(103～108/ml)均未達(dá)到半數(shù)致死。
上述結(jié)果表明，減毒株MVAV6201具有明顯的減毒效應(yīng)。
免疫性保護(hù)試驗(yàn)將前述MVAV6201菌懸液調(diào)至105/ml待用。首先讓魚(yú)適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室的飼育環(huán)境三周，將大小均勻的實(shí)驗(yàn)魚(yú)隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每次每組各三十條魚(yú)(平均體重50g)，試驗(yàn)三次，取數(shù)據(jù)的平均值。試驗(yàn)組每條魚(yú)分別腹腔注射上述菌懸液0.2ml，對(duì)照組注射同樣劑量的生理鹽水。免疫4周后，用108/ml濃度鰻弧菌野生毒性株MVM425攻擊感染，0.2ml/尾。自免疫后連續(xù)充氣培養(yǎng)三個(gè)月，每天換水三分之一左右，水溫控制在22℃左右，每天投喂合成飼料。記錄累計(jì)死亡率。結(jié)果見(jiàn)圖2。
如圖2所示，當(dāng)免疫給藥劑量為每尾魚(yú)0.2ml，105/ml時(shí)，在85天的免疫保護(hù)期內(nèi)，經(jīng)本發(fā)明減毒活疫苗MVAV6201免疫后的試驗(yàn)累計(jì)死亡率為20％，而未免疫組在感染2天后即達(dá)到100％的死亡率。根據(jù)計(jì)算免疫保護(hù)率％＝(1-死亡率％)/l，減毒疫苗株MVAV6201對(duì)牙鲆的免疫保護(hù)率為80％(85天)，70％(90天)。由此可見(jiàn)，本發(fā)明減毒活疫苗具有非常良好的免疫效果，可有效防治野生毒性鰻弧菌感染。
實(shí)施例3以美國(guó)紅魚(yú)為對(duì)象的感染與免疫試驗(yàn)用魚(yú)為廣東湛江863養(yǎng)殖基地提供的美國(guó)紅魚(yú)，平均體重40g，在水族箱中暫養(yǎng)一周以上無(wú)異常者作為實(shí)驗(yàn)魚(yú)。將野生株MVM425和減毒株接種于前述LB斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)18～24h，用無(wú)菌PBS液(pH7.2)洗下制成懸液，參照麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整菌液濃度成MCF3管(9×108/ml)，然后肌肉注射美國(guó)紅魚(yú)，15尾/組，劑量為0.4ml/尾，對(duì)照組注射無(wú)菌PBS液。注射后將美國(guó)紅魚(yú)置水族箱中飼養(yǎng)，充氧，水溫控制在27.3～32.4℃。逐日觀察，記錄發(fā)病及死亡情況。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 鰻弧菌野生菌MVM425和減毒株MVAV6201對(duì)美國(guó)紅魚(yú)的致病力試驗(yàn)死亡數(shù) 實(shí)驗(yàn)數(shù) 死亡率組別1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d(尾)(尾) (％)MVM425A組 0 01 2 2 1 17 1546.7MVM425B組 0 01 1 0 0 02 1513.3MVM425C組 0 00 0 0 0 11 156.7MVM425D組 0 00 1 0 0 01 156.7減毒株A組 0 00 0 0 0 11 156.7減毒株B組 0 00 0 0 0 00 150減毒株C組 0 00 0 0 0 00 150減毒株D組 0 00 0 0 0 00 150對(duì) 照 組 0 00 0 0 0 00 150
注各組給藥濃度的數(shù)量級(jí)A組為108/ml，B組為106/ml，C組為105/ml，D組為104/ml。
表2表明，減毒株MVAV6201對(duì)美國(guó)紅魚(yú)的致病力明顯低于野生株MVM425，當(dāng)給藥濃度為106/ml時(shí)，減毒株基本上不再具有毒性。
將MVAV6201和滅活MVM425菌懸液調(diào)至108/ml待用。首先讓魚(yú)適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室的飼育環(huán)境三周，將大小均勻的實(shí)驗(yàn)魚(yú)隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每次每組各三十條魚(yú)(平均體重40g)，試驗(yàn)三次，取數(shù)據(jù)的平均值。試驗(yàn)組每條魚(yú)分別腹腔注射上述菌懸液0.2ml，對(duì)照組注射同樣劑量的生理鹽水。免疫3天后，用108/ml濃度鰻弧菌野生毒性株MVM425攻擊感染，0.2ml/尾。自免疫后連續(xù)充氣培養(yǎng)10天，每天換水三分之一左右，水溫控制在22℃左右，每天投喂合成飼料。記錄累計(jì)死亡率。結(jié)果見(jiàn)圖3。
如圖3所示，當(dāng)減毒活疫苗株MVAV6201與MVM425滅活疫苗株的免疫給藥濃度均為108/ml數(shù)量級(jí)時(shí)，在10天的保護(hù)期對(duì)比中，MVAV6201的累計(jì)死亡率為6.7％，滅活MVM425的累計(jì)死亡率為23.3％，本發(fā)明減毒活疫苗的保護(hù)力優(yōu)于滅活疫苗。證實(shí)本發(fā)明減毒活疫苗比之滅活疫苗可以激發(fā)更高的免疫效價(jià)。
序列表<110>華東理工大學(xué)<120>鰻弧菌減毒活疫苗<130>034289<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1caagcatatg agttactcac tgtataaggg 30<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2gggggatcct atttaagtac tatattcgg 29
權(quán)利要求
1.一種鰻弧菌減毒活疫苗，它是鰻弧菌毒株MVM425的減毒活疫苗，其中缺失了pEIB1質(zhì)粒。
2.如權(quán)利要求1所述的鰻弧菌減毒活疫苗，它是保藏號(hào)為CCTCC-M203069的鰻弧菌減毒株MVAV6201。
3.一種制備權(quán)利要求1所述鰻弧菌減毒活疫苗的方法，該方法包括1)將鰻弧菌野生毒株MVM425的培養(yǎng)物于35-38℃，在含0.2-0.5mM Fe3+的培養(yǎng)基中培養(yǎng)14-18小時(shí)；2)將步驟1所得培養(yǎng)物于25-28℃培養(yǎng)12-18小時(shí)；3)重復(fù)步驟1)和2)2-3輪；4)進(jìn)行CAS平板篩選，不能在平板上生長(zhǎng)的為鰻弧菌野生毒株MVM425的減毒活疫苗候選株；5)PCR檢測(cè)質(zhì)粒pEIB1，反應(yīng)呈陰性的候選株鑒定為減毒活疫苗。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，步驟1)中的培養(yǎng)在37℃進(jìn)行。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，步驟1)中的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，步驟1)中的培養(yǎng)基含0.2mM Fe3+。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，步驟1)中的Fe3+為FeCl3。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，步驟1)中的培養(yǎng)持續(xù)16小時(shí)。
9.如權(quán)利要求2所述的方法，步驟2)中的培養(yǎng)持續(xù)12小時(shí)。
10.如權(quán)利要求2所述的方法，步驟5)PCR所用引物為如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種鰻弧菌減毒活疫苗及其制備方法。相對(duì)于其野生毒株具有明顯的低毒性和免疫保護(hù)率，可有效地防護(hù)敏感魚(yú)種免受強(qiáng)弧菌病致病力鰻弧菌野生株的侵染。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1600368SQ03151159
公開(kāi)日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2003年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月24日
發(fā)明者馬悅, 張?jiān)d, 邵明非, 孫修勤, 何建國(guó), 葉巧真, 黃志堅(jiān), 劉允坤 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)