專利名稱：一種在蛋白質(zhì)芯片表面固定蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在蛋白質(zhì)芯片表面固定蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是一種組成、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的有機(jī)大分子，幾乎能與所有固體表面發(fā)生相互作用并吸附在表面上。在蛋白質(zhì)芯片表面上固定目標(biāo)蛋白質(zhì)分子已經(jīng)廣泛用于蛋白質(zhì)純化、固相免疫檢測(cè)和生物材料制備等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
目前在蛋白質(zhì)芯片表面上固定蛋白質(zhì)的主要方法是通過物理吸附作用，也就是通過兩者之間的靜電、疏水和氫鍵等相互作用將蛋白質(zhì)固定到固體表面上。如Jonsson，U.；lvarsson，B.；Lundstrom，I.；Berghem，L.J.Colloid.Interface Sci.1982，90，148.中所述，通過物理吸附在蛋白質(zhì)芯片表面固定蛋白質(zhì)，是使用了二氯二甲基硅烷改性硅表面。但是，使用物理吸附的方法，固定在蛋白質(zhì)芯片表面上的蛋白質(zhì)分子的生物活性通常都低于溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)活性，其主要原因是蛋白質(zhì)分子在吸附到固體表面的同時(shí)，其空間構(gòu)像也會(huì)隨之發(fā)生變化，而蛋白質(zhì)分子的生物活性是依賴于其空間構(gòu)像的穩(wěn)定的。此外，通過這種方法固定的蛋白質(zhì)很不穩(wěn)定，一方面，在有流動(dòng)液體的環(huán)境下，固定在蛋白質(zhì)芯片表面上的蛋白質(zhì)容易發(fā)生脫落；另一方面，由于競(jìng)爭(zhēng)吸附，其它蛋白質(zhì)也會(huì)替代原有固定在表面上的蛋白質(zhì)，造成其流失。
另一種較為常用的在蛋白質(zhì)芯片表面上固定蛋白質(zhì)的方法是通過共價(jià)連接的方式。如Haodan Yuan，Wayne M.Mullett and Janusz Pawliszyn，Biological sample analysiswith immunoaffinity solid-phase microextraction，The Analyst，2001，126，1456-1461.中所述的通過共價(jià)方法在蛋白質(zhì)芯片表面固定蛋白質(zhì)，是使用氨丙基三乙氧基硅烷改性硅表面。此方法形成的共價(jià)鍵比物理吸附作用牢固，使得蛋白質(zhì)相對(duì)比較穩(wěn)定，可以部分解決物理吸附方法存在的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定問題。但是，在蛋白質(zhì)芯片表面上用于共價(jià)固定蛋白質(zhì)的基團(tuán)多為極性的基團(tuán)，這會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)芯片表面間的靜電相互作用，從而使得蛋白質(zhì)的空間構(gòu)像發(fā)生更大的改變，引起生物活性的降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服已有固定蛋白質(zhì)的方法使得蛋白質(zhì)空間構(gòu)像發(fā)生較大的改變、蛋白質(zhì)生物活性低、固定的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的缺陷，從而提供一種所固定的蛋白質(zhì)穩(wěn)定、空間構(gòu)像所受影響小、生物活性高的、在蛋白質(zhì)芯片表面固定蛋白質(zhì)的方法。
本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一種在蛋白質(zhì)芯片表面固定蛋白質(zhì)的方法，包括如下的步驟1)配制組分A和組分B的無水乙醇溶液，其中組分A的濃度為1毫摩爾～1摩爾，組分A和組分B的摩爾比為20～100∶1；所述組分A為能夠使蛋白質(zhì)芯片表面呈疏水性的有機(jī)化合物；所述組分B為一端含有能夠與所需固定的蛋白質(zhì)分子以共價(jià)連接的活性基團(tuán)、一端含有極性基團(tuán)的有機(jī)化合物；2)將蛋白質(zhì)芯片的基片放置于步驟1)的溶液中浸泡30分鐘～5小時(shí)進(jìn)行改性；用無水乙醇清洗固體基片3次；再使用常規(guī)方法活化組分B的極性基團(tuán)；3)將所需固定的蛋白質(zhì)溶液中加入0.05～1wt％非離子型表面活性劑；4)將步驟2)改性的蛋白質(zhì)芯片的基片放入步驟3)的蛋白質(zhì)溶液中浸泡30分鐘。
所述組分A為甲基三乙氧基硅烷、十一烷硫醇或甲基三甲氧基硅烷。
所述組分B為氨丙基三乙氧基硅烷、羧基十一烷硫醇或巰基三甲氧基硅烷。
所述蛋白質(zhì)芯片的基片為玻璃、硅片、金屬或塑料。
所述蛋白質(zhì)包括人免疫球蛋白G、人血清蛋白、單克隆抗體。
所述非離子型表面活性劑為Tween 20(吐溫)。
該方法的原理是通過兩種有機(jī)化合物——組分A和組分B同時(shí)使用，在蛋白質(zhì)芯片表面固定蛋白質(zhì)。其中，組分A用來封閉蛋白質(zhì)芯片表面，使蛋白質(zhì)芯片表面呈強(qiáng)疏水性、電中性，不與蛋白質(zhì)分子形成氫鍵，如甲基三乙氧基硅烷、烷硫醇等；而組分B為一端含有能夠與所需固定的蛋白質(zhì)分子以共價(jià)連接的活性基團(tuán)、一端含有極性基團(tuán)的有機(jī)化合物，如氨基三乙氧基硅烷、羧基烷硫醇等。
本發(fā)明提供的在蛋白質(zhì)芯片表面固定蛋白質(zhì)的方法與已有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)在于1、一方面，該方法使用組分B的活性基團(tuán)，在蛋白質(zhì)分子和固體表面間形成共價(jià)鍵，固定的蛋白質(zhì)比較穩(wěn)定；2、同時(shí)，由于蛋白質(zhì)分子與固體表面之間形成的共價(jià)鍵數(shù)量越少，就越有利于蛋白質(zhì)分子保持其空間構(gòu)像，所以通過控制組分A和組分B的量，使得在一個(gè)蛋白質(zhì)分子覆蓋的面積上，僅以一個(gè)共價(jià)鍵連接，就足以使其固定在蛋白質(zhì)芯片表面上，并能夠有效降低蛋白質(zhì)芯片表面與蛋白質(zhì)分子間的相互作用，減少蛋白質(zhì)芯片表面對(duì)蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)像的影響；3、可以選擇與蛋白質(zhì)分子的分子量和體積差距大的表面改性的有機(jī)分子，這樣用于共價(jià)固定蛋白質(zhì)的有機(jī)分子僅需稀疏地散布于蛋白質(zhì)芯片表面上，就足以形成飽和蛋白質(zhì)分子膜層，能夠有效降低蛋白質(zhì)芯片表面與蛋白質(zhì)分子間的相互作用，減少蛋白質(zhì)芯片表面對(duì)蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)像的影響；4、通過加入少量的非離子型表面活性劑，能夠有效抑制蛋白質(zhì)分子在蛋白質(zhì)芯片表面上的物理吸附，保持蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)像；5、通過調(diào)控兩種有機(jī)分子的比例，可以定量地控制蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)芯片表面上的固定量6、通過這種方法固定的蛋白質(zhì)的生物活性比通過物理吸附或單純組分B固定的蛋白質(zhì)生物活性提高1倍以上。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1配制甲基三乙氧基硅烷和氨丙基三乙氧基硅烷(二者的摩爾比為20∶1)的混合乙醇溶液，甲基三乙氧基硅烷的濃度為1毫摩爾；將以硅片為基片的蛋白質(zhì)芯片放置于上述溶液中浸泡5小時(shí)進(jìn)行改性；用無水乙醇清洗固體基片3次；再使用戊二醛活化氨丙基三乙氧基硅烷上的氨基；配制1mg/ml人免疫球蛋白G PBS(磷酸緩沖液)溶液，其中含有0.05wt％Tween 20；
將改性的蛋白質(zhì)芯片放入此人免疫球蛋白G溶液中浸泡30分鐘。
實(shí)施例2配制十一烷硫醇和羧基十一烷硫醇(二者的摩爾比為100∶1)的混合乙醇溶液，十一烷硫醇的濃度為1摩爾；將以金為基片的蛋白質(zhì)芯片放置于上述溶液中浸泡30分鐘進(jìn)行改性；用無水乙醇清洗固體基片3次；再使用乙基碳二亞胺(EDC)活化羧基十一烷硫醇的羧基；配制1mg/ml人血清蛋白PBS溶液，其中含有1wt％Tween 20；將改性的蛋白質(zhì)芯片放入此人血清蛋白溶液中浸泡30分鐘。
實(shí)施例3配制甲基三甲氧基硅烷和巰基三甲氧基硅烷(二者的摩爾比為80∶1)的混合乙醇溶液，甲基三甲氧基硅烷的濃度為0.5毫摩爾；將以塑料為基片的蛋白質(zhì)芯片放置于上述溶液中浸泡2小時(shí)進(jìn)行改性；用無水乙醇清洗固體基片3次；再使用GMBS(N-succinimidyl 4-maleimidobutyrate)活化巰基三甲氧基硅烷的巰基；配制1mg/ml單克隆抗體PBS溶液，其中含有0.5wt％Tween 20；將改性的蛋白質(zhì)芯片放入此人單克隆抗體溶液中浸泡30分鐘。
權(quán)利要求
1.一種在蛋白質(zhì)芯片表面固定蛋白質(zhì)的方法，包括如下的步驟1)配制組分A和組分B的無水乙醇溶液，其中組分A的濃度為1毫摩爾～1摩爾，組分A和組分B的摩爾比為20～100∶1；所述組分A為能夠使蛋白質(zhì)芯片表面呈疏水性的有機(jī)化合物；所述組分B為一端含有能夠與所需固定的蛋白質(zhì)分子以共價(jià)連接的活性基團(tuán)、一端含有極性基團(tuán)的有機(jī)化合物；2)將蛋白質(zhì)芯片的基片放置于步驟1)的溶液中浸泡30分鐘～5小時(shí)進(jìn)行改性；用無水乙醇清洗固體基片3次；再使用常規(guī)方法活化組分B的極性基團(tuán)；3)將所需固定的蛋白質(zhì)溶液中加入0.05～1wt％非離子型表面活性劑；4)將步驟2)改性的蛋白質(zhì)芯片的基片放入步驟3)的蛋白質(zhì)溶液中浸泡30分鐘。
2.如權(quán)利要求1所述的在蛋白質(zhì)芯片表面固定蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述組分A為甲基三乙氧基硅烷、十一烷硫醇或甲基三甲氧基硅烷。
3.如權(quán)利要求1所述的在蛋白質(zhì)芯片表面固定蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述組分組分B為氨丙基三乙氧基硅烷、羧基十一烷硫醇或巰基三甲氧基硅烷。
4.如權(quán)利要求1所述的在蛋白質(zhì)芯片表面固定蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述蛋白質(zhì)芯片的基片為玻璃、硅片、金屬或塑料。
5.如權(quán)利要求1所述的在蛋白質(zhì)芯片表面固定蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述蛋白質(zhì)包括人免疫球蛋白G、人血清蛋白、單克隆抗體。
6.如權(quán)利要求1所述的在蛋白質(zhì)芯片表面固定蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述非離子型表面活性劑為Tween 20。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在蛋白質(zhì)芯片表面固定蛋白質(zhì)的方法。該方法使用組分A和組分B的無水乙醇溶液浸泡蛋白質(zhì)芯片，所述組分A為能夠使蛋白質(zhì)芯片表面呈疏水性的有機(jī)化合物；所述組分B為一端含有能夠與所需固定的蛋白質(zhì)分子以共價(jià)連接的活性基團(tuán)、一端含有極性基團(tuán)的有機(jī)化合物；然后使用常規(guī)方法活化組分B的極性基團(tuán)；最后將此蛋白質(zhì)芯片放入所需固定的蛋白質(zhì)溶液中浸泡。該方法固定的蛋白質(zhì)比較穩(wěn)定；而且能夠有效降低蛋白質(zhì)芯片表面與蛋白質(zhì)分子間的相互作用，減少蛋白質(zhì)芯片表面對(duì)蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)像的影響；通過這種方法固定的蛋白質(zhì)的生物活性比通過物理吸附或單純組分B固定的蛋白質(zhì)生物活性提高1倍以上。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1598587SQ03157199
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2003年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月18日
發(fā)明者王戰(zhàn)會(huì), 靳剛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院力學(xué)研究所