專利名稱：新的乳酸菌、其細(xì)菌素、及利用該菌的食品加工方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種新穎的乳酸菌及其細(xì)菌素、利用該類乳酸菌的魚(yú)肉食品加工方法與產(chǎn)品以及豆類食品加工方法與產(chǎn)品。更具體而言，本發(fā)明系提供一種篩選自肉中的新穎性乳酸菌，可使用于利用魚(yú)類或豆類作為原料的發(fā)酵加工食品加工方法，且提供由該方法所制得的可抑制雜菌生長(zhǎng)、風(fēng)味特佳、經(jīng)濟(jì)價(jià)值更高的加工食品。本發(fā)明更提供一種由該新穎性乳酸菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素，該細(xì)菌素可有效地抑制其它雜菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而確保保存期間食品的品質(zhì)。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)食品已漸漸不能滿足消費(fèi)者的需求，由市面上健康食品、精致食品的充斥，不難了解食品的多元化、安全性與機(jī)能性是現(xiàn)今食品業(yè)開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)。
乳酸菌是一群可發(fā)酵醣類產(chǎn)生乳酸的微生物，常在蔬菜、谷類、乳品及肉品等發(fā)酵產(chǎn)品中被當(dāng)成發(fā)酵菌酉(starter)使用，可以增進(jìn)食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(Acton等人，1977)、抑制腸內(nèi)病原菌生長(zhǎng)(Bacus和Brown，1981)、提高乳糖的利用性(Siddons和Coates，1985)、具有抗癌(Oda等人，1983)與降低膽固醇(Mann和Spoerry，1974)功能等特性。發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌因利用醣類進(jìn)行糖解作用，而提供產(chǎn)品特殊風(fēng)味；亦能分泌乳酸、醋酸等有機(jī)酸分子，使制品的pH值下降，抑制微生物的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)產(chǎn)品的儲(chǔ)藏期限；此外有些乳酸菌尚能產(chǎn)生過(guò)氧化氫、雙乙醯、細(xì)菌素等產(chǎn)物以抑制腐敗菌或病原菌的生長(zhǎng)(Gibbs，1987；Klaenhammer，1988；Daeschel.1989；Schillinger和Lucke，1989)。
乳酸菌能產(chǎn)生抑制病原菌生長(zhǎng)的物質(zhì)(森地，1997)，主要的物質(zhì)為細(xì)菌素(Bacteriocins)、diacetyl、H2O2和次級(jí)代謝產(chǎn)物。細(xì)菌素是一種含蛋白質(zhì)的大分子，具有抑制微生物生長(zhǎng)作用(Scbillinger和Holzapfel，1996；Roller和Lusengo，1997)。能產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸菌有發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)(Deklerk和Smit，1967)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus plantarum)(Sedewitz等人，1983)、瑞士乳桿菌(Lactobacillshelveticus)(Joerger和Klaenhammer，1986)、嗜酸乳桿菌(Lactobacilluacidophilus)(Muriana和Klaenhammer，1987)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillu plantarum)(West和Warner，1988)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)(Daeschel和Klaenhammer，1985)。
乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)所產(chǎn)生的細(xì)菌素能抑制鮮肉、發(fā)酵香腸、發(fā)酵甘藍(lán)菜、碎牛肉和乳酪中單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的生長(zhǎng)(Nielsen等人，1990；Choi和Beuchat，1994；Motlagh等人，1992；Parente等人，1996；Vignolo等人，1996；Cutter和Siragusa，1996)，增加冷藏的保存期限。德氏乳桿菌乳亞種(Lactobacillus lactis)ATCC 11454，戊糖片球菌ATCC 43200和戊糖片球菌ATCC43201所產(chǎn)生的細(xì)菌素添加于含3～4％食鹽的冷藏調(diào)理食品中，能抑制肉毒梭菌(Clostridium botulinum)孢子的萌芽與生長(zhǎng)(Okereke和Montville，1991)。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceous)所產(chǎn)生的細(xì)菌素能抑制革蘭氏陽(yáng)性的病原菌，如蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和單核細(xì)胞增生利斯特氏菌；此外，對(duì)于某些革蘭氏陰性病原菌，如嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila AH2)、大腸桿菌(Escherichia coli O157H7)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)851和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus A865957)(Spelhaug和Harlander，1989；Helander等人，1997)亦有抑制作用。乳酸乳球菌乳亞種所產(chǎn)生的乳酸鏈球菌肽已被列為GRAS(generallyrecognized as safe)(FDA，1992)，使用于冷藏乳酪以抑制肉毒梭菌孢子的萌芽生長(zhǎng)(園田等，1996)。
乳酸菌除產(chǎn)生細(xì)菌素外，亦產(chǎn)生丁二酮和H2O2。丁二酮(2，3-丁二酮)為乳酸菌中間代謝產(chǎn)物丙酮酸所合成的終產(chǎn)物(Kandler，1983；Monnet等人，1994)。Jay(1982)研究丁二酮在200μg/ml能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌。丁二酮也是GRAS，但具強(qiáng)烈風(fēng)味，揮發(fā)性高，最好限量使用。H2O2為乳酸菌在生長(zhǎng)時(shí)，分別由丙酮酸、乳糖酶和NADH經(jīng)由丙酮酸氧化酶，L-乳糖酶和NADH氧化酶與O2作用產(chǎn)生(Kandler，1983；Sedewitz等人，1983)，能抑制有害微生物的生長(zhǎng)(森地，1997)。H2O2能與其它成分形成良好抑菌物質(zhì)，如以乳糖過(guò)氧化酶作用于硫氰酸鹽，形成中間氧化產(chǎn)物以抑制微生物，此過(guò)程為“乳糖過(guò)氧化乳糖過(guò)氧化酶抗菌系統(tǒng)(lactoperoxidase antibacterial system)”，能增加食品的保存期限(Harnulv等人，1982)。
由片球菌菌屬生產(chǎn)的細(xì)菌素種類及特性，包括由乳酸片球菌H生產(chǎn)的PediocinAcH、乳酸片球菌PA1.0生產(chǎn)的Pediocin PA-1、戊糖片球菌FBB61生產(chǎn)Pediocin A。此外，啤酒片球菌(Ped.cerevesiae)FBB63和乳酸片球菌PC生產(chǎn)的細(xì)菌素目前仍未命名。
Bhunia等人在1987年自發(fā)酵香腸中篩選出能分泌細(xì)菌素Pediocin AcH的菌株乳酸片球菌H菌株，其分子量約2,700Da(SDS-PAGE)。經(jīng)結(jié)果證實(shí)此細(xì)菌素可抑制乳桿菌(Lactobacilli)、明串珠菌(Leuconostocs)、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)和單核細(xì)胞增生利斯特氏菌等微生物的生長(zhǎng)。具有對(duì)蛋白分解酵素敏感、對(duì)熱安定。Pediocin AcH因作用于細(xì)胞膜上，造成細(xì)胞膜內(nèi)鉀離子等的流失，導(dǎo)致細(xì)胞分解(Bhunia等人，1991)。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于上述課題，本發(fā)明人等詳細(xì)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用由肉品中所篩選分離的戊糖片球菌YJL和YJS菌株等特殊乳酸菌可改善鯖魚(yú)等魚(yú)類及豆類的加工適性，且由探討乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的產(chǎn)物對(duì)魚(yú)肉品質(zhì)(質(zhì)地、風(fēng)味、色澤等)及豆類的影響、及乳酸菌所產(chǎn)生的蛋白酶對(duì)魚(yú)肉質(zhì)地及豆類的影響，可增加魚(yú)類及豆類的加工范圍，更提升其利用性。又，進(jìn)一步利用該新穎乳酸菌于在不同條件下進(jìn)行魚(yú)肉或豆類發(fā)酵時(shí)，則因所產(chǎn)生的產(chǎn)物及所生產(chǎn)的蛋白酶作用程度的不同，最終產(chǎn)品的質(zhì)地、色、香、味影響亦不同。因此，本發(fā)明提供一種可以利用發(fā)酵條件來(lái)控制并生產(chǎn)不同新產(chǎn)品的新食品加工技術(shù)。
由上可知，本發(fā)明提供如下發(fā)明。
本發(fā)明一方面提供了一種保藏號(hào)為BCRC910210的戊糖片球菌YJL。
本發(fā)明第二方面提供了一種保藏號(hào)為BCRC910211的戊糖片球菌YJS。
本發(fā)明第三方面提供了一種魚(yú)肉加工方法，該方法使用了上述第1方面或第2方面的乳酸菌、第1方面與第2方面的混合乳酸菌、或其它乳酸菌的混合乳酸菌進(jìn)行魚(yú)肉發(fā)酵者；其加工方法為魚(yú)肉加0.3～2.0％食鹽及0.5～3倍水后使其均質(zhì)，經(jīng)100～115℃殺菌15～30分鐘后冷卻至25～40℃，調(diào)整基質(zhì)水分含量(從不稀釋至五倍稀釋)及添加1.0～6.0％糖后接種乳酸菌，在25～40℃發(fā)酵6～30小時(shí)任意添加適當(dāng)量的調(diào)味劑及香辛料或進(jìn)行包裝。
在上述方法中，其它乳酸菌的混合乳酸菌含有1種以上選自嗜酸乳桿菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亞種CCRC 12315，瑞士乳桿菌CCRC 14092的乳酸菌。魚(yú)肉原料選自紅色肉、白色肉魚(yú)、其混合魚(yú)肉、冷凍魚(yú)漿的至少一種。糖原料選自蔗糖、葡萄糖、甜菜的至少一種。魚(yú)肉基質(zhì)可為不稀釋～五倍稀釋的魚(yú)肉漿。調(diào)味劑選自一般的水果、加工的水果醬、芝麻、花生的至少一種。香辛料選自姜、蒜、味淋(味精)、酒、五香粉的至少一種。發(fā)酵后基質(zhì)的pH在3.8～5.5。
本發(fā)明第四方面提供了一種魚(yú)肉加工食品，其特征在于使用上述第1方面或第2方面的乳酸菌、或第1方面和第2方面的混合乳酸菌、或其它乳酸菌的混合乳酸菌進(jìn)行魚(yú)肉原料發(fā)酵所得的產(chǎn)品。
在該方法中，其它乳酸菌的混合乳酸菌含有1種以上選自嗜酸乳桿菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亞種CCRC 12315，瑞士乳桿菌CCRC 14092的乳酸菌。
本發(fā)明第五方面提供了一種魚(yú)肉加工食品，該食品是用本發(fā)明第三方面的魚(yú)肉加工方法進(jìn)行魚(yú)肉原料發(fā)酵制得的。
本發(fā)明第六方面提供了一種魚(yú)肉加工食品，該食品是用第3方面的魚(yú)肉加工方法進(jìn)行魚(yú)肉原料發(fā)酵后在100～115℃加熱殺菌、成型、部分干燥所得的類似起司(cheese)的產(chǎn)品。
在上述食品中，魚(yú)肉原料為至少一種選自紅色肉、白色肉魚(yú)、其混合魚(yú)肉或冷凍魚(yú)漿等。
本發(fā)明第七方面提供了一種豆類加工方法，該方法使用上述第1方面或第2方面的乳酸菌、或第1方面和第2方面的混合乳酸菌、或其它乳酸菌的混合乳酸菌進(jìn)行豆類發(fā)酵；其加工方法為經(jīng)浸泡豆類加水后均質(zhì)、過(guò)濾后在經(jīng)100～115℃加熱殺菌15～30分鐘后冷卻至25～40℃，調(diào)整基質(zhì)水分含量(50％～98％)及添加1.0～6.0％的糖后接種乳酸菌，在25～40℃發(fā)酵6～30小時(shí)后任意添加適當(dāng)量的調(diào)味劑或進(jìn)行包裝。
在上述方法中，其它乳酸菌的混合乳酸菌為1種以上選自嗜酸乳桿菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亞種CCRC 12315，瑞士乳桿菌CCRC 14092的乳酸菌。豆類原料為選自黃豆或黑豆的至少一種。糖原料為選自蔗糖、葡萄糖、甜菜等的至少一種。豆類發(fā)酵基質(zhì)的水分含量為50％～98％。調(diào)味劑為至少一種選自一般的水果、加工的水果醬的調(diào)味劑。發(fā)酵后豆類基質(zhì)的pH在4.5～6.0。
本發(fā)明第八方面提供了一種豆類加工食品，該食品是用第1方面或第2方面的乳酸菌、或如第1方面和第2方面的混合乳酸菌、或其它乳酸菌的混合乳酸菌進(jìn)行豆類原料發(fā)酵所得的食品。
在該食品的加工方法中，其它乳酸菌的混合乳酸菌為1種以上選自嗜酸乳桿菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亞種CCRC 12315，瑞士乳桿菌CCRC 14092的乳酸菌。
本發(fā)明第九方面提供了一種豆類加工食品，該食品是用上述豆類加工方法進(jìn)行豆類原料發(fā)酵所得的食品。
在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，豆類為至少一種選自于黃豆、黑豆、或其混合物。
本發(fā)明第十方面提供了一種豆類加工食品，該食品是用上述豆類加工方法進(jìn)行豆類原料發(fā)酵后在90～115℃加熱殺菌、成型、部分干燥所得的類似起司的產(chǎn)品。
本發(fā)明第十一個(gè)方面提供了一種細(xì)菌素，其特征為來(lái)自上述第一方面的乳酸菌。該細(xì)菌素是分子量為20～30kDa的抑菌性物質(zhì)。
本發(fā)明第十二個(gè)方面提供了一種細(xì)菌素，其特征為來(lái)自上述第二方面的乳酸菌。該細(xì)菌素是分子量為20～30kDa的抑菌性物質(zhì)。
本發(fā)明提供一種新穎性乳酸菌、使用其的豆類、魚(yú)肉食品加工方法、及使用其的豆類、魚(yú)肉加工食品。更具體而言，本發(fā)明系提供一種篩選自肉中的新穎性乳酸菌，其可使用于利用魚(yú)類或豆類作為原料的發(fā)酵食品加工方法上，且提供由該方法所制得的可抑制雜菌生長(zhǎng)、風(fēng)味特佳、經(jīng)濟(jì)價(jià)值更高的發(fā)酵食品。本發(fā)明更提供一種由該新穎性乳酸菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素，該細(xì)菌素可有效地抑制其它雜菌于食品中的生長(zhǎng)，進(jìn)而確保保存期間食品的品質(zhì)。
圖1表示乳酸四連球菌的鑒定流程。
圖2表示純化的Pentocins YJL和YJS的SDS-PAGE(8～15％聚丙烯胺)。
圖3表示發(fā)酵魚(yú)肉起司的實(shí)例。
圖4表示發(fā)酵魚(yú)肉酸乳酪(yogurt)的實(shí)例。
圖5表示發(fā)酵黃豆布丁的實(shí)例。
具體實(shí)施方案以下更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明系提供新穎的乳酸菌及其細(xì)菌素、利用該類乳酸菌的魚(yú)肉食品加工方法與產(chǎn)品以及豆類食品加工方法與產(chǎn)品。
本發(fā)明所使用的具有新穎性的乳酸菌系由肉品中所篩選分離出的戊糖片球菌YJL和YJS菌株。片球菌屬為乳酸四鏈球菌，不具運(yùn)動(dòng)性、不產(chǎn)孢子且為觸媒陰性的革蘭氏陽(yáng)性菌。
本發(fā)明的戊糖片球菌YJS(BCRC 910211)和戊糖片球菌YJL(BCRC 910210)已經(jīng)于2003年8月8日保藏于國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(日本茨城縣Tsukuba市東一區(qū)1番3號(hào)(郵編305-8566))(International Patent Organism Depositary NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology，Higashi 1-1-3，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)，保藏號(hào)分別為FERM BP-8449和FERM BP-8450。
本發(fā)明提供一種魚(yú)肉加工方法，其特征為使用戊糖片球菌YJL和YJS菌株或戊糖片球菌YJL和YJS菌株的混合乳酸菌或其它乳酸菌如嗜酸乳桿菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亞種CCRC 12315，瑞士乳桿菌CCRC 14092等進(jìn)行紅色肉或白色肉魚(yú)或其混合魚(yú)肉或冷凍魚(yú)漿等魚(yú)肉發(fā)酵，其加工方法為將作為魚(yú)肉原料的魚(yú)肉基質(zhì)的魚(yú)肉漿加入0.3～2.0％食鹽及0.3～1.5倍水后使其均質(zhì)化，經(jīng)100～115℃殺菌15～30分鐘后冷卻至25～40℃，調(diào)整基質(zhì)水分含量(由不稀釋～五倍稀釋)及添加1.0～6.0％的至少一種選自蔗糖、葡萄糖、甜菜的糖后接種乳酸菌，在25～40℃發(fā)酵6～30小時(shí)后，使該發(fā)酵基質(zhì)的最后pH在3.8～5.0，任意添加適當(dāng)量的至少一種選自水果、加工的水果醬、芝麻、花生的調(diào)味劑及香辛料并視情況做任意包裝。
本發(fā)明又提供一種魚(yú)肉加工食品，其為使用戊糖片球菌YJL BCRC910210和YJSBCRC910211菌株的乳酸菌或戊糖片球菌YJL和YJS菌株的混合乳酸菌或其它乳酸菌如嗜酸乳桿菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亞種CCRC 12315，瑞士乳桿菌CCRC14092等進(jìn)行至少一種選自紅色肉或白色肉魚(yú)或其混合魚(yú)肉或冷凍魚(yú)漿的魚(yú)肉原料發(fā)酵所得的食品。
本發(fā)明又提供一種魚(yú)肉加工食品，其為使用戊糖片球菌YJL BCRC910210和YJSBCRC910211菌株的乳酸菌或戊糖片球菌YJL和YJS菌株的混合乳酸菌或其它乳酸菌如嗜酸乳桿菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亞種CCRC 12315，瑞士乳桿菌CCRC14092等進(jìn)行至少一種選自紅色肉或白色肉魚(yú)或其混合魚(yú)肉或冷凍魚(yú)漿的魚(yú)肉原料，經(jīng)發(fā)酵、加熱殺菌、成型、部分干燥后所得的類似起司的產(chǎn)品。
本發(fā)明又提供一種豆類加工方法，其特征為戊糖片球菌YJL BCRC910210和YJSBCRC910211菌株的乳酸菌或戊糖片球菌YJL和YJS菌株的混合乳酸菌或其它乳酸菌如嗜酸乳桿菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亞種CCRC 12315，瑞士乳桿菌CCRC14092等進(jìn)行豆類發(fā)酵；其加工方法為經(jīng)浸泡的至少一種選自黃豆或黑豆的豆類加水后均質(zhì)、過(guò)濾，在100～115℃加熱殺菌15～30分鐘后冷卻至25～40℃，調(diào)整基質(zhì)水分含量(50％～98％)及添加1.0～6.0％的至少一種選自蔗糖、葡萄糖、甜菜的糖后接種乳酸菌，在25～40℃發(fā)酵6～30小時(shí)后任意添加適當(dāng)量的調(diào)味劑并視情況做包裝。
本發(fā)明又提供一種豆類加工食品，其為使用戊糖片球菌YJL BCRC910210和YJSBCRC910211菌株的乳酸菌或戊糖片球菌YJL和YJS菌株的混合乳酸菌或其它乳酸菌如嗜酸乳桿菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亞種CCRC 12315，瑞士乳桿菌CCRC14092等，對(duì)至少一種選自黃豆或黑豆或其混合物的豆類原料進(jìn)行發(fā)酵所得的產(chǎn)品。
本發(fā)明又提供一種豆類加工食品，其為使用戊糖片球菌YJL BCRC910210和YJSBCRC910211菌株的乳酸菌或戊糖片球菌YJL和YJS菌株的混合乳酸菌或其它乳酸菌如嗜酸乳桿菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亞種CCRC 12315，瑞士乳桿菌CCRC14092等，對(duì)至少一種選自黃豆或黑豆或其混合物的豆類原料經(jīng)發(fā)酵、加熱殺菌、成型、部分干燥后所得的類似起司的產(chǎn)品。
本發(fā)明又提供一種分子量為20～30kDa的抑菌性物質(zhì)的細(xì)菌素，其來(lái)自戊糖片球菌YJL菌株。
本發(fā)明又提供一種分子量為20～30kDa的抑菌性物質(zhì)的細(xì)菌素，其特征為來(lái)自戊糖片球菌YJS菌株。
以下例舉實(shí)施例以更具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
主要儀器低溫振蕩培養(yǎng)箱Orbital shaking incubator(HOTECH 718，Hotech Instruments Co.，Taiwan).
低溫高速離心機(jī)Automatic high speed refrigerated centrifuge(SCR 20B，Hitachi，Japan).
色差儀Model TC-1800MK-II，Tokyo Denshoku Co.，Japan.
pH測(cè)定儀pH Meter(HM-30S，TOA Electronic Co.，Japan).
恒溫恒濕培養(yǎng)箱TC-120HD，Tungtec instruments C.，LTD.
碎肉乳化機(jī)UM-12，Stephan，Germany.
凍干機(jī)Model FD-20-84，F(xiàn)ts ststems，INC.，U.S.A.
胺基酸測(cè)定儀Amino Acid Analyzer(Hitachi L-8500，Japan).
真空減壓濃縮機(jī)Rotavapor(Biichi RE111，Buchi，Switzerland).
迷你電泳Electrophoresis Cell(Mini-PROTEAN II，Bio-Rad，U.S.A.).
電源供應(yīng)器Power Supply(Model 200/2.0，Bio-Rad，U.S.A.).
止泡均質(zhì)機(jī)Waring Blender(subjoined with a baffle，Japan).
冷凍柜-30℃及-80℃為Bio-Freezer(Model 8442，F(xiàn)orma Scientific，U.S.A.).
分光光度計(jì)Hitachi U-2001，Hitachi，Japan.
尾部血壓量測(cè)器Softron BP 98-A，Japan.
實(shí)施例1戊糖片球菌YJL BCRC910210及戊糖片球菌YJS BCRC910211的篩選及鑒定結(jié)果由表一結(jié)果得知在MRSA選擇性培養(yǎng)基上呈現(xiàn)乳酸菌乳白色典型菌落的戊糖片球菌YJL菌株為不具運(yùn)動(dòng)性、觸媒陰性的革蘭氏陽(yáng)性四連球菌，可利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸且不產(chǎn)氣；此外，戊糖片球菌YJS菌株亦為觸媒陰性、不具運(yùn)動(dòng)性的革蘭氏陽(yáng)性四連球菌，可利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸且不產(chǎn)氣。由以上結(jié)果根據(jù)1988年Simpson與1991年P(guān)ilone學(xué)者所提菌種分類表(圖一)即可將此二株乳酸菌歸屬于片球菌屬。
進(jìn)一步測(cè)試此二菌株的生長(zhǎng)溫度范圍、耐鹽度和pH范圍等。由表一結(jié)果顯示MPL菌株可于4～45℃、pH4.0～7.0間生長(zhǎng)，10％鹽濃度以上不能生長(zhǎng)。而戊糖片球菌YJS菌株可于15～45℃下生長(zhǎng)，但不能于4℃下生長(zhǎng)且可于pH4.0～7.0間生長(zhǎng)，此外，亦可在10.0％鹽濃度下生長(zhǎng)。在醣類發(fā)酵測(cè)試方面(如表二)，戊糖片球菌YJL和戊糖片球菌YJS二株乳酸菌可發(fā)酵核糖(ribose)、但是不能利用D-阿拉伯糖、L-木糖等醣類進(jìn)行發(fā)酵。此特性與1978年Back學(xué)者提出片球菌屬的菌種分類表，可知此二菌株均屬于戊糖片球菌。
表一.P.pentosaceus YJL及P.pentosaceus YJS之生理特性鑒定 P.pentosaceus YJL P.pentosaceus YJS革蘭氏染色+ +觸酶測(cè)試(Catalase test) -a-運(yùn)動(dòng) - -細(xì)胞型態(tài) 球菌 球菌生長(zhǎng)45℃(2天)c+ +b40℃(2天) + +35℃(2天) + +30℃(2天) + +25℃(3天) + +20℃(3天) + +15℃(7天) + +4℃(7天) + -開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)的pHpH4.0(3天)+ +pH5.0(3天)+ +pH6.0(3天)+ +pH7.0(3天)+ +生長(zhǎng)時(shí)的NaCl濃度％0.0(3天) + +2.5(3天) + +4.0(3天) + +5.0(3天) + +10.0(3天) - +20.0(3天) - -最后pH(3天) 3.99 3.91菌株均培養(yǎng)于MRS培養(yǎng)基。
a“-”表示不生長(zhǎng)或負(fù)反應(yīng)b“+”表示生長(zhǎng)或正反應(yīng)c培養(yǎng)時(shí)間。
API 50CHL系統(tǒng)鑒定將戊糖片球菌YJL及YJS菌株與購(gòu)自食工所的標(biāo)準(zhǔn)菌戊糖片球菌CCRC 14024三株乳酸菌進(jìn)行API 50CHL系統(tǒng)鑒定測(cè)試，結(jié)果列于表三。由表中可知標(biāo)準(zhǔn)菌戊糖片球菌CCRC 14024可利用核糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙醯胺基葡糖、苦杏仁苷、熊果苷(arbutine)、七葉苷(esculin)、纖維二糖酶、麥芽糖、蜜二糖(melibiose)、蔗糖、海藻糖、水楊苷(salicin)。但不能利用β-龍膽二糖、D-阿拉伯糖、木糖及果糖等。測(cè)試結(jié)果經(jīng)系統(tǒng)研判為戊糖片球菌，判別率達(dá)99.8％。因β-龍膽二糖為負(fù)反應(yīng)與系統(tǒng)值相反造成誤差。
戊糖片球菌YJL菌株可利用核糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙醯胺基葡糖、苦杏仁苷、熊果苷、七葉苷、纖維二糖酶、麥芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖。但對(duì)于水楊苷、β-龍膽二糖、D-阿拉伯糖、木糖及果糖等均不能利用。上述結(jié)果經(jīng)系統(tǒng)研判為戊糖片球菌，因水楊苷、β-龍膽二糖為負(fù)反應(yīng)與系統(tǒng)值有不同測(cè)試結(jié)果，使戊糖片球菌YJL菌株的判別率為99.6％。
戊糖片球菌YJS此菌株可利用核糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙醯胺基葡糖、苦杏仁苷、熊果苷、七葉苷、水楊苷、纖維二糖酶、麥芽糖、蜜二糖及蔗糖，但不能利用β-龍膽二糖、D-阿拉伯糖、木糖、水楊苷和果糖等。有二種測(cè)試結(jié)果水楊苷、β-龍膽二糖為負(fù)反應(yīng)與系統(tǒng)值不同，使測(cè)試結(jié)果的判別率為99.3％。綜合以上傳統(tǒng)鑒定方法與API 50CHL乳酸菌系統(tǒng)鑒定法比對(duì)，可確定此二株乳酸菌為戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。
表二.P，pentosaceus YJL及P.pentosaceus YJS之API 50CHL乳酸菌系統(tǒng)鑒定糖類 P.pentosaceus CCRC 14024 P.pentosaceus YJL P.pentosaceus YJS2-celo-葡糖酸 - - -5-celo-葡糖酸 - - -測(cè)金盞花醇 - - -美沙酮 - - -苦杏仁苷 + + +熊果苷(arbutine) + + +纖維二糖 + + +D-阿拉伯糖 - - -D-阿拉伯糖醇 - - -D-果糖 + + +D-海藻糖 - - -D-葡萄糖 + + + - - -D-甘露糖 + + +D-Raffubose+ + + + + +D-松二糖 - - -半乳糖醇 - - -D-木糖 - - + - - -七葉樹(shù)糖甙 + + +半乳糖 + + +葡糖酸鹽 - - -甘油 - - -糖酶 - - - - - -L-樹(shù)膠醛糖 + + +乳糖 + + +L-阿拉伯糖醇(L-Arbitol)- - -L-海藻糖 - - -L-山梨糖 - - -L-木糖 - - -麥芽糖 + + +L-甘露糖醇 - - -松三糖 - - -蜜二糖 + + +N-乙醯胺基葡糖 + + +鼠李糖 + + +核糖 + + +蔗糖 + + +水楊糖 - + +山梨酸醇 - - -海藻糖(Trehalose) + + +木醇糖 - - -α-甲基-D-糖苷 - - -α-甲基-D-甘露糖苷 - - -β-龍膽二糖- + +β-甲基-木糖 - - -P.pentosaceus ID(％) 99.6 99.6 99.3于37℃厭氧培養(yǎng)48小時(shí)。
(+)表示利用；(-)表示不利用。
生化測(cè)試P.pentosaceus YJL及P.pentosaceus YJS均對(duì)精胺酸具水解能力，但無(wú)法利用尿素、四唑紅(tetrazolium red)及丙酮酸等。此二株菌的菌體型態(tài)于TEM下觀察結(jié)果顯示此二菌株均為無(wú)鞭毛的四連球菌。
抗生素敏感性試驗(yàn)抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果如表三所示，由表中得知P.pentosaceus YJL對(duì)頭孢噻甲羧肟(30mcg)、羥羧氧酰胺菌素(30mcg)、萘啶酸(30mcg)具抗性；對(duì)慶大霉素(10mcg)有微耐抗性(intermediate resistant)；對(duì)氨芐青霉素(10mcg)、頭孢噻肟(30mcg)、頭孢氨呋肟(30mcg)、盤尼西林(10mcg)微敏感性(moderately susceptible)；對(duì)氯林肯霉素(2mcg)、紅霉素(15mcg)、Imipenem(10mcg)、乙基西梭霉素(30mcg)、四環(huán)素(30mcg)、替卡西林(75mcg)、萬(wàn)古霉素(30mcg)具敏感性(susceptible)。
P.pentosaceus YJS對(duì)慶大霉素(10mcg)羥羧氧酰胺菌素(30mcg)、萘啶酸(30mcg)、萬(wàn)古霉素(30mcg)具耐抗性；對(duì)四環(huán)素(30mcg)微耐抗；對(duì)氨芐青霉素(10mcg)、頭孢噻肟(30mcg)、頭孢噻甲羧肟(30mcg)具微敏感性(moderatelysusceptible)；而對(duì)頭孢氨呋肟(30mcg)、氯林肯霉素(2mcg)、紅霉素(15mcg)、Imipenem(10mcg)、乙基西梭霉素(30mcg)、盤尼西林(10mcg)、替卡西林(75mcg)具敏感性。
根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果可知此二株乳酸菌在生理生化特性上有差異，因此將的分別命名為戊糖片球菌YJL(P.pentosaceus YJL)和戊糖片球菌YJS(P.pentosaceus YJS)。
表三、P.pentosaceus YJL及P.pentosaceus YJS之抗生素敏感性試驗(yàn)抗生素 濃度(mcg) RaIaMSaSaP.pentosaceus YJLP.pentosaceus YJS氨芐青霉素 1021b22-29 30MS MS頭孢噻肟3014 15-22 23MS MS頭孢噻甲羧肟3014 15-22 23RMS頭孢氨呋肟 3014 15-22 23MS S氯林肯霉素 2.0 1415-1617SS紅霉素 151314-1718SS慶大霉素101213-1415IRImipenem10 16SS羥羧氧酰胺菌素 3014 15-22 23RR萘啶酮酸301314-1819RR乙基西梭霉素301213-1415SS盤尼西林1019 20-27 28MS S四環(huán)素 301415-1819SI替卡西林7514 15-19 20SS萬(wàn)古霉素309 10-1112SRaR，具耐抗性；I，微耐抗性；MS，微敏感性；S，具敏感性。
b抑制區(qū)的直徑(mm)。
實(shí)施例2 利用嗜酸乳桿菌CCRC10069、乳酸乳球菌乳亞種CCRC 12315、瑞士乳桿菌CCRC 14092、戊糖片球菌YJL BCRC910210及戊糖片球菌YJS BCRC910211的魚(yú)類加工方法冷凍鯖魚(yú)于室溫下經(jīng)流水解凍，去除內(nèi)臟及頭后，利用采肉機(jī)采肉。以2％NaCl溶液等體積均質(zhì)鹽溶，再作三倍稀釋魚(yú)肉基質(zhì)。經(jīng)100℃殺菌20分鐘后冷卻至40℃，最后添加4％蔗糖、1％葡萄糖及乳酸菌以滅菌玻離棒均勻混合后置于37℃發(fā)酵48小時(shí)。在此基質(zhì)中乳酸菌接種的濃度約為105CFU/g。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的項(xiàng)目包括pH值、乳酸菌數(shù)及好氣性菌數(shù)。此外，亦檢測(cè)原物料及加工制程中可能存在主要微生物菌相的變化，包括假單胞菌、葡萄球菌和腸桿菌等菌群，藉以了解乳酸菌的抑菌能力。最后添加適當(dāng)量的桑椹及糖后作官能品評(píng)。
結(jié)果37℃發(fā)酵48小時(shí)后，五種乳酸菌發(fā)酵制品的pH值自6.2-6.3降低至4.5-4.7，未添加乳酸菌組則pH值上升至7.4-7.6；且VBN值于發(fā)酵24小時(shí)后由8.2-8.6上升至50.2-51.4mg/100g，甚至于發(fā)酵48小時(shí)后亦提高至70.1-71.3mg/100g。然而添加乳酸菌組則僅由8.1-8.6些微上升至21.0-24.8mg/100g。該項(xiàng)結(jié)果顯示利用乳酸菌發(fā)酵可抑制VBN的生成，同時(shí)由于細(xì)菌素的生成而能可有效抑制腐敗菌或病原菌如假單胞菌、葡萄球菌及腸桿菌等的生長(zhǎng)(表四)。五種乳酸菌發(fā)酵制品的Hunter L(透明指示物)、b(黃色/藍(lán)色的指示物)和白度(whiteness)均高于未添加乳酸菌組(L從47.61-49.98升高至59.03-65.06；b從7.14-8.64至9.35-11.68；白度從46.8-49.3％升高至57.9-63.5％，p＜0.05)。五種乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品的口感、風(fēng)味及整體接受性均受好評(píng)。由表五發(fā)現(xiàn)發(fā)酵24小時(shí)產(chǎn)品接受性優(yōu)于48小時(shí)組，但大體上不同乳酸菌的接種其差異不大。
表四 以一倍水稀釋的鯖魚(yú)肉漿在37℃下乳酸菌發(fā)酵48小時(shí)時(shí)過(guò)程的好氧菌，乳酸菌，腸桿菌(Entero)，葡萄球菌(Staph)和假單胞菌(Pseudo)的菌數(shù)變化起始物*發(fā)酵時(shí)間 細(xì)菌b(log CFU/mL)(h) APCLAB Entero.Staph. Pseudo.
NS 04.20±0.31e3.34±0.15c2.78±0.13b2.97±0.13c4.10±0.15c24 7.78±0.36b6.35±0.32b9.04±0.27a6.63±0.23b8.04±0.26b48 8.17±0.33a7.24±0.17a9.08±0.18a7.54±0.15a9.04±0.21aA06.23±0.18b6.40±0.16b3.15±0.15c2.77±0.21c3.22±0.11b24 9.38±0.33a9.46±0.19a3.66±0.21b3.38±0.22b4.00±0.26a48 9.27±0.24a9.49±0.17a4.10±0.18a4.13±0.22a4.20±0.30aB06.28±0.21c6.34±0.21c3.08±0.19e3.10±0.17b3.31±0.22b24 8.20±0.32b8.65±0.17a3.38±0.13bc3.20±0.15b3.52±0.19b48 9.32±0.32a8.85±0.21a4.40±0.23b4.43±0.18a4.53±0.20aC06.28±0.20c6.34±0.21b3.18±0.19b3.10±0.17b3.31±0.21b24 8.20±0.31b8.65±0.17a3.38±0.13b3.20±0.15b3.32±0.19b48 9.32±0.35a8.85±0.22a4.50±0.24a4.43±0.19a4.33±0.20aD06.43±0.19b6.45±0.12b3.19±0.11b2.80±0.25b3.3±0.14b24 9.36±0.20a9.26±0.12a3.95±0.21a3.00±0.16b3.49±0.20b48 9.20±0.27a9.18±0.20a4.30±0.15a4.21±0.20a4.33±0.17a06.43±0.19b6.45±0.12b3.19±0.11e2.80±0.25b3.3±0.14bE24 9.36±0.21a9.26±0.14a3.95±0.20b3.00±0.16b3.09±0.21b48 9.20±0.31a9.18±0.21a4.30±0.14a4.21±0.20a4.33±0.19a*NS無(wú)添加起始物；ALactobacillus plantarum CCRC10069；BLactococcus lactis subsp.lactis CCRC12315；CLactobacillus helveticus CCRC14092；DPediococcus pentosaceus YJL；EPediococcus pentosaceus YJS.b表中數(shù)值為3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)之平均值±SD；各個(gè)處理組中，相對(duì)于同一發(fā)酵時(shí)間、同一欄中具有不同上標(biāo)的數(shù)值顯著地不同(p＜0.05)。
表五、以一倍水稀釋之鯖魚(yú)肉漿在37℃下乳酸菌發(fā)酵四十八小時(shí)過(guò)程之官能品評(píng)結(jié)果恒溫培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí))起始物*官能評(píng)估0 24 48嘗(Taste) 4.1±1.1a--***--NS 風(fēng)味(Flavor)4.2±1.2a-- --組織(Texture) 3.3±0.5a-- --整體接受度 4.0±0.5a-- --品嘗(Taste) 4.2±1.1b7.6±1.2a6.9±1.0aA風(fēng)味(Flavor)3.8±1.2b7.6±1.1a6.8±0.8a組織(Texture) 3.3±1.1b8.2±1.1a7.1±1.1a整體接受度 3.9±1.0b7.9±0.8a6.8±0.7a品嘗(Taste) 4.2±1.2b7.7±1.2a7.1±1.1aB風(fēng)味(Flavor)4.0±1.1b7.9±1.0a6.9±0.9a組織(Texture) 3.4±0.9b8.3±1.2a7.2±0.7a整體接受度 4.0±1.2b7.7±1.2a7.0±1.0a品嘗(Taste) 3.6±0.7b7.9±0.9a6.8±1.2aC風(fēng)味(Flavor)3.9±1.0b7.9±1.1a7.1±1.1a組織(Texture) 3.7±0.6b8.3±1.1a7.3±0.8a整體接受度 3.9±1.0c8.2±1.1a7.0±1.3a品嘗(Taste) 4.0±1.0b7.7±0.7a7.0±1.3aD風(fēng)味(Flavor)4.0±0.8b7.9±1.1a7.1±1.2a組織(Texture) 3.7±0.6b8.4±1.2a7.4±1.1a整體接受度 4.0±1.1b8.2±1.1a7.0±1.1a品嘗(Taste) 3.7±1.0b7.9±0.9a7.0±1.1aE風(fēng)味(Flavor)4.0±0.8b8.0±1.1a7.1±1.2a組織(Texture) 3.9±0.6b8.2±1.0a7.2±1.0a整體接受度 4.1±1.1b8.0±1.1a7.1±1.2a*參考表4的附注**表中數(shù)值為3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)之平均值±SD；同一欄中具有不同上標(biāo)的數(shù)值顯著地不同(p＜0.05)***腐敗實(shí)施例3 利用嗜酸乳桿菌CCRC10069、乳酸乳球菌乳亞種CCRC 12315、瑞士乳桿菌CCRC 14092、戊糖片球菌YJL BCRC910210及戊糖片球菌YJSBCRC910211的魚(yú)肉起司及酸乳酪加工方法冷凍金線鰱魚(yú)漿于5℃下解凍一夜，再以1.0％NaCl溶液等體積均質(zhì)，經(jīng)100～115℃殺菌15分鐘后冷卻至30℃，添加4％蔗糖及乳酸菌以滅菌玻離棒均勻混合后置于37℃發(fā)酵24小時(shí)。在此基質(zhì)中乳酸菌接種的濃度約為105CFU/g。最后添加適當(dāng)量的芝麻或花生粉后于100～115℃殺菌15分鐘，成型(如圖3及4所示)為方形并在適度干燥后進(jìn)行官能品評(píng)。
結(jié)果37℃發(fā)酵24小時(shí)后，五種乳酸菌發(fā)酵制品的pH值均降低至4.6-4.8，五種乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品的口感、風(fēng)味及整體接受性均受好評(píng)。
實(shí)施例4利用戊糖片球菌YJL及戊糖片球菌YJS的豆類加工方法經(jīng)浸泡的黃豆加水后進(jìn)行均質(zhì)、過(guò)濾，以100～115℃加熱殺菌20分鐘后冷卻至30℃，調(diào)整基質(zhì)水分含量為60％，最后添加4％蔗糖與1％葡萄糖及乳酸菌以滅菌玻離棒均勻混合后置于37℃發(fā)酵24小時(shí)。在此基質(zhì)中乳酸菌接種的濃度約為105CFU/g。并檢測(cè)pH值、乳酸菌數(shù)、好氣性菌數(shù)、主要微生物菌相～假單胞菌、葡萄球菌和腸桿菌等菌群的變化。最后添加適當(dāng)量的草莓及糖后作成布丁(如圖5)，并作官能品評(píng)。
結(jié)果37℃發(fā)酵24小時(shí)后，乳酸菌發(fā)酵制品的pH值自6.0-6.2降低至4.7-4.9，未添加乳酸菌組則pH值上升至7.5-7.7；假單胞菌、葡萄球菌及腸桿菌等的生長(zhǎng)均有效被抑制(表六)。五種乳酸菌發(fā)酵制品的Hunter L、b和白度(whiteness)均高于未添加乳酸菌組(p＜0.05)。五種乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品的口感、風(fēng)味及整體接受性均受好評(píng)(表七)。
表六、豆?jié){在37℃下乳酸菌發(fā)酵24小時(shí)后的好氧菌、乳酸菌、腸桿菌(Entero)、葡萄球菌(Staph)和假單胞菌(Pseudo)的菌數(shù)變化細(xì)菌b(log CFU/mL)起始物*發(fā)酵時(shí)間(小時(shí))APCLAB Entero. Staph. Pseudo.
0 4.20±0.31e3.34±0.15c2.78±0.13b2.97±0.13c4.10±0.15cNS24 7.79±0.37b6.33±0.33b9.14±0.27a6.73±0.23b8.10±0.26b0 6.43±0.19b6.45±0.12b3.19±0.11b2.80±0.25b3.3±0.14bA24 9.37±0.20a9.29±0.12a3.55±0.21a3.10±0.16b3.29±0.20b0 6.23±0.19b6.35±0.12b3.09±0.11e2.90±0.25b3.20±0.14bB24 9.32±0.21a9.28±0.14a3.45±0.21b3.05±0.11b3.09±0.20b*NS無(wú)添加起始物；APediococcus pentosaceus YJL；BPediococcus pentosaceus YJS.
b表中數(shù)值為3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)之平均值±SD；各個(gè)處理組中，相對(duì)于同一發(fā)酵時(shí)間、同一欄中具有不同上標(biāo)的數(shù)值顯著地不同(p＜0.05)。
表七、豆?jié){在37℃下乳酸菌發(fā)酵二十四小時(shí)后之官能品評(píng)結(jié)果起始物 官能評(píng)估024品嘗(Taste) 4.1±1.1a**4.0±1.3a**NS 風(fēng)味(Flavor)4.2±1.2a4.1±1.5a整體接受度 4.0±0.5a4.0±0.8a品嘗(Taste) 4.3±1.1a**7.6±1.2aA風(fēng)味(Flavor)4.0±1.2a7.6±1.1a整體接受度 4.0±0.7a7.9±0.8a品嘗(Taste) 4.2±1.1a**7.7±1.2aB風(fēng)味(Flavor)4.2±1.4a7.9±1.0a整體接受度 4.1±0.6a7.7±1.2a*參考表6的附注**表中數(shù)值為3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)之平均值±SD；同一欄中具有不同上標(biāo)的數(shù)值顯著地不同(p＜0.05)。
實(shí)施例5來(lái)自戊糖片球菌YJL及戊糖片球菌YJS的細(xì)菌素的萃取及定性結(jié)果1.粗細(xì)菌素的分離乳酸菌接種至MRS培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)48小時(shí)后，以5,000xg，離心30min后，上層液經(jīng)0.45μm膜過(guò)濾(No.4654，Gelman)，以去除菌體。抑菌活性測(cè)定則以L.monocytogenes CCRC 14845做為指示菌株，所得濾液則進(jìn)行抑菌活性測(cè)定確認(rèn)其為具有抑菌活性的粗細(xì)菌素液。
2.氯仿萃取分別接種0.1％戊糖片球菌YJL和戊糖片球菌YJS二菌液至400mL MRS培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)18小時(shí)。所得菌液以9,500g離心15min(4℃)，上層液再以0.45μm膜過(guò)濾，所得濾液混合200mL氯仿劇烈攪拌20min后進(jìn)行10,400g(4℃)離心20min。離心后則分為四相，其中溶劑與水層的界面層及沉淀層具有最大的抑菌活性，利用5-10mL緩沖液(0.1M Tris-HCl，pH7.0)懸浮溶解。其余二相包括水相與溶劑相均不具有活性。懸浮后的緩沖液再以真空濃縮機(jī)(40℃)(Rotavapor R114，BCHI)去除氯仿，最后濃縮至約2-3mL(Burianek和Yousef，2000)，分別命名為Pediocin YJL和Pediocin YJS。
3.SDS-PAGE為確定細(xì)菌素的純度并測(cè)定其分子量，將細(xì)菌素液溶解在樣品緩沖液解離緩沖液(62.5mM Tris-HCl緩沖液，pH6.8，含3％SDS和0.002％溴酚藍(lán))并隔水煮沸5min。再以8-15％丙烯醯胺進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(Laemmli，1970)。泳動(dòng)完成后的膠片以15％TCA進(jìn)行固定，用考馬斯亮藍(lán)G-250染色，最后以25％甲醇脫色，并將膠片夾于玻璃紙中陰干即可。
4.蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)定量依Bradford(1976)的方法進(jìn)行，并以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。
5.抑菌活性測(cè)定本實(shí)驗(yàn)法是采用Piddock(1990)的瓊脂擴(kuò)散法。將指示菌株接種于10ml適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液中，在其最適生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)8小時(shí)，調(diào)整菌液濃度約1.5×105CFU/ml，取菌液0.1ml指示菌株的懸浮液加至15ml適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(45℃)中，充分振蕩，再將含菌液的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，靜置30min后移入冰箱(4℃)中放置1小時(shí)。之后，以直徑8mm的金屬環(huán)在培養(yǎng)基表面挖洞，再取細(xì)菌素溶液30μl，滴于洞內(nèi)，并于指示菌株最適生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察是否有抑制環(huán)并記錄其大小。
6.生化特性6.1 細(xì)菌素對(duì)蛋白水解性酶的敏感性將細(xì)菌素液以1.0N HCl或1.0N NaOH分別調(diào)至pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0后，各別加入所測(cè)試酵素20.0mg/ml(胃泌素[來(lái)自豬胃粘膜，Sigma]、α-胰凝乳蛋白酶[來(lái)自牛胰，Sigma]、鏈霉蛋白酶[來(lái)自灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)，Sigma]、菠蘿蛋白酶[來(lái)自菠蘿莖干，Sigma]，37℃作用2小時(shí)后，于80℃下加熱15分鐘，使蛋白質(zhì)分解酵素失活，再置于冰浴槽中使其溫度迅速冷卻至室溫，測(cè)其抑菌活性(Piddock，1990)。
6.2 經(jīng)純化的細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性首先將抑菌物質(zhì)分別以1.0N HCl或NaOH調(diào)整其pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，并于80℃、100℃下15min、30min、45min、60min及121℃、15min的條件進(jìn)行熱處理后迅速置于冰浴槽中使其溫度冷卻至室溫，再測(cè)其抑菌活性(Piddock，1990)。
6.3 抑菌范圍試驗(yàn)細(xì)菌素液Pentocin YJL和Pentocin YJS對(duì)于食品中常見(jiàn)病原菌及腐敗菌的抑菌范圍測(cè)試如表八所示。
表八、抑菌范圍試驗(yàn)用菌株所用的培養(yǎng)條件微生物培養(yǎng)基/溫度a來(lái)源糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 8750 NA/37℃ CCRCbAeromonas faecalisNA/37℃ Prof.Tsaic環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)ATCC 11059NA/37℃ CCRC枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 10225 NA/37℃ CCRC枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 10254 NA/37℃ CCRC蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ATCC 11778 NA/37℃ CCRC生孢梭菌(Clostridium sporogenous)ATCC 11259 TSB/37℃CCRC產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aetogenes)ATCC 13048 NA/37℃ CCRC大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC 11229 NA/37℃ CCRC大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC 11303 Na+0.5％NaCl/37℃ CCRC產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ATCC 13182 NA/37℃ CCRC單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)RII TSBYE/37℃ FDAd單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)LM TSBYE/37℃ FDA單核細(xì)胞增生利斯特氏菌CCRC 14845 TSBYE/37℃ CCRC熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)ATCC 13523 NA/26℃ CCRC普通變形菌(Proteus vulgaris)ATCC 13315NA/37℃ CCRC金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923 TSA/37℃CCRC表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ATCC 14990NA/37℃ CCRC糞腸球菌(Streptococcus faecalis)DS-5 MRS/37℃CCRC痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)ATCC 13983 NA/37℃ CCRC霍亂弧菌(Vibrio cholerae) Na+0.5％NaCl/26℃ CCRCa培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)bCCRC菌種保藏和研究中心-食品工業(yè)發(fā)展研究所c國(guó)立臺(tái)灣海洋大學(xué)食品科學(xué)系江善宗教授實(shí)驗(yàn)室dNLFD行政院衛(wèi)生署藥物食品檢驗(yàn)局7.結(jié)果7.1 戊糖片球菌YJL和戊糖片球菌YJS細(xì)菌素的純化根據(jù)超濾膜濃縮所得細(xì)菌素液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及經(jīng)蛋白酶作用后均無(wú)抑菌活性，顯見(jiàn)Pentocins YJL和YJS其分子量為27與25kDa且該細(xì)菌素為一蛋白質(zhì)。此外，Pentocin YJL和Pentocin YJS分別在pH4.0-8.0與pH4.0-6.0時(shí)，80℃加熱30min仍有80％殘存活性。Pentocin YJS甚至pH4.0和5.0于100℃加熱30min后亦分別有41％及37％殘存活性。Pentocin YJL在pH4.0下，經(jīng)100℃加熱30min后仍有34％殘存活性。該現(xiàn)象顯示這兩個(gè)細(xì)菌素可廣泛應(yīng)用在作為多種加工制程上的天然保鮮劑。
7.2 抑菌范圍Pentocin YJL和Pentocin YJS對(duì)于食品中常見(jiàn)病原菌及腐敗菌的抑菌范圍測(cè)試結(jié)果列于表九。由表中可觀察到Pentocin YJL對(duì)革蘭氏陰性菌Shigella、E.aerogenes、P.vulgaris、S.dysenteriae、V.cholerae及革蘭氏陽(yáng)性菌B.subtilis、B.cereus、B.circular、L.monocytogenes、S.epidermidis等有明顯的抑制表現(xiàn)。細(xì)菌素Pentocin YJS對(duì)革蘭氏陰性菌Shigella、K.oxytoca、V.cholerae和革蘭氏陽(yáng)性菌B.subtilis、B.cereus、B.circular及L.monocytogenes等有抑菌表現(xiàn)。顯示此二細(xì)菌素為一廣效性細(xì)菌素。
表九 Phentocins YJL和YJS細(xì)菌素液抑菌范圍微生物 Pentocin YJL Pentocin YJSG(-)糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 8750-*-Aeromonas faecalis - -產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aetogenes)ATCC 13048 + -大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC 11229 - -大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC 11303 + -產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ATCC 13182 + +熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)ATCC 13523- -普通變形菌(Proteus vulgaris)ATCC 13315 + +痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)ATCC 13983 + +霍亂弧菌(Vibrio cholerae) + +G(+)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)RII + +單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)LM + +單核細(xì)胞增生利斯特氏菌CCRC 14845 + +金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923- -表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ATCC 14990 + -糞腸球菌(Streptococcus faecalis)DS-5 - -形成孢子的細(xì)菌環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)ATCC 11059 + +枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 10225 + +枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 10254 + +蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ATCC 11778+ +生孢梭菌(Clostridium sporogenous)ATCC 11259+ +*a″-″抑制區(qū)＜6mm；b″+″抑制區(qū)＞6mm7.3 產(chǎn)孢菌及其孢子萌發(fā)的抑制由上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素Pentocin YJL和Pentocin YJS對(duì)Bacillus和Clostridium等產(chǎn)孢菌有良好的抑菌效果，因此進(jìn)一步探討對(duì)Bacillus subtilis ATCC 10225、B.subtilis ATCC 10254、B.cereus等產(chǎn)孢菌的孢子進(jìn)行抑制活性試驗(yàn)。由表十發(fā)現(xiàn)此二細(xì)菌素均具有明顯抑制孢子萌發(fā)的效果，以細(xì)菌素Pentocin YJL而言，抑制Bacillussubtilis ATCC 10225、B.subtilis ATCC 10254、B.cereus產(chǎn)孢菌的抑菌環(huán)面積分別為120.3、174.3、236.3mm2；抑制孢子萌發(fā)的抑菌環(huán)面積分別為64.0、96.3、189.0mm2。以細(xì)菌素Pentocin YJS而言，抑制產(chǎn)孢菌的抑菌環(huán)面積分別為189.0、146.3、236.3mm2；抑制孢子萌發(fā)的抑菌環(huán)面積分別為85.0、108.0、189.0mm2。由結(jié)果得知細(xì)菌素PentocinYJL和Pentocin YJS均對(duì)B.cereus及其孢子萌發(fā)的抑制環(huán)面積最大，可達(dá)236.3、189.0mm2。此外，二株菌的細(xì)菌素對(duì)產(chǎn)孢菌的抑菌效果較抑制孢子佳。
本發(fā)明并不限定于上述實(shí)施型態(tài)，于不脫離其要旨的范圍內(nèi)，可施以諸種改變而加以實(shí)施。
表十、Pentocins YJL和YJS細(xì)菌素液對(duì)產(chǎn)孢菌的繁殖體及孢子生長(zhǎng)的抑制效果抑制區(qū)(mm2)細(xì)菌 Pentocin YJL Pentocin YJS枯草芽孢桿菌ATCC 10225營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞 120.3 189.0孢子 64.0 85.0枯草芽孢桿菌ATCC 10254營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞 174.3 146.3孢子 96.3 108.0蠟狀芽孢桿菌ATCC 11778營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞 236.3 236.3孢子 189.0 189.0
權(quán)利要求
1.一種保藏號(hào)為BCRC 910210的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)YJL。
2.一種保藏號(hào)為BCRC 910211的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)YJS。
3.一種魚(yú)肉加工方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1或2所述的乳酸菌、或權(quán)利要求1和2的混合乳酸菌、或與其它乳酸菌的混合乳酸菌進(jìn)行魚(yú)肉發(fā)酵；其加工方法為魚(yú)肉加0.3～2.0％食鹽及0.5～3倍水后使其均質(zhì)，經(jīng)100～115℃殺菌15～30分鐘后冷卻至25～40℃，在從不稀釋到稀釋五倍的范圍內(nèi)調(diào)整基質(zhì)水分含量，并添加1.0～6.0％的糖，然后接種乳酸菌，在25～40℃發(fā)酵6～30小時(shí)后任意添加適當(dāng)量的調(diào)味劑及香辛料或進(jìn)行包裝。
4.如權(quán)利要求3所述的魚(yú)肉加工方法，其中其它乳酸菌的混合乳酸菌為1種以上選自嗜酸乳桿菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亞種CCRC 12315，瑞士乳桿菌CCRC14092的混合乳酸菌。
5.如權(quán)利要求3所述的魚(yú)肉加工方法，其中魚(yú)肉原料為至少一種選自紅色肉、白色肉魚(yú)、其混合魚(yú)肉、冷凍魚(yú)漿的魚(yú)肉原料。
6.如權(quán)利要求3所述的魚(yú)肉加工方法，其中糖原料為至少一種選自蔗糖、葡萄糖、甜菜的糖原料。
7.如權(quán)利要求3所述的魚(yú)肉加工方法，其中魚(yú)肉基質(zhì)是未經(jīng)稀釋或至多經(jīng)五倍稀釋的魚(yú)肉漿。
8.如權(quán)利要求3所述的魚(yú)肉加工方法，其中調(diào)味劑為至少一種選自水果、加工的水果醬、芝麻、花生的調(diào)味劑。
9.如權(quán)利要求3所述的魚(yú)肉加工方法，其中香辛料為至少一種選自姜、蒜、味淋、酒、五香粉的香辛料。
10.如權(quán)利要求3所述的魚(yú)肉加工方法，其中發(fā)酵后基質(zhì)的pH在3.8～5.5。
11.一種魚(yú)肉加工食品，其特征在于，它是用權(quán)利要求1或2的乳酸菌、或權(quán)利要求1和2的混合乳酸菌、或和其它乳酸菌的混合乳酸菌進(jìn)行魚(yú)肉原料發(fā)酵所得的食品。
12.如權(quán)利要求11所述的食品，其中其它乳酸菌的混合乳酸菌為1種以上選自嗜酸乳桿菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亞種CCRC 12315，瑞士乳桿菌CCRC 14092的乳酸菌。
13.一種魚(yú)肉加工食品，其特征在于，它是用權(quán)利要求3所述的魚(yú)肉加工方法進(jìn)行魚(yú)肉原料發(fā)酵所得的食品。
14.一種魚(yú)肉加工食品，其特征在于，它是用權(quán)利要求3所述的魚(yú)肉加工方法進(jìn)行魚(yú)肉原料發(fā)酵后在90～115℃加熱殺菌、成型、部分干燥所得的類似起司的產(chǎn)品。
15.如權(quán)利要求11～14中任一項(xiàng)的魚(yú)肉加工食品，其中魚(yú)肉原料為至少一種選自紅色肉、白色肉魚(yú)、其混合魚(yú)肉或冷凍魚(yú)漿的魚(yú)肉原料。
16.一種豆類加工方法，其特征為用權(quán)利要求1或2的乳酸菌、或權(quán)利要求1和2的混合乳酸菌、或與其它乳酸菌的混合乳酸菌進(jìn)行豆類發(fā)酵；其加工方法為經(jīng)浸泡的豆類加水后均質(zhì)、過(guò)濾后在經(jīng)100～115℃加熱殺菌15～30分鐘后冷卻至25～40℃，調(diào)整基質(zhì)水分含量，添加1.0～6.0％的糖后接種乳酸菌，在25～40℃發(fā)酵6～30小時(shí)后任意添加適當(dāng)量的調(diào)味劑或進(jìn)行包裝。
17.如權(quán)利要求16所述的加工方法，其中其它乳酸菌的混合乳酸菌為1種以上選自嗜酸乳桿菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亞種CCRC 12315，瑞士乳桿菌CCRC14092的乳酸菌。
18.如權(quán)利要求16所述的豆類加工方法，其中豆類原料為至少一種選自黃豆或黑豆的豆類原料。
19.如權(quán)利要求16所述的豆類加工方法，其中糖原料為至少一種選自蔗糖、葡萄糖、甜菜的糖原料。
20.如權(quán)利要求16所述的豆類加工方法，其中豆類發(fā)酵基質(zhì)的水分含量為50％～98％。
21.如權(quán)利要求16所述的豆類加工方法，其中調(diào)味劑為至少一種選自水果、加工的水果醬的調(diào)味劑。
22.如權(quán)利要求16所述的豆類加工方法，其中發(fā)酵后豆類基質(zhì)的pH在4.5～6.0。
23.一種豆類加工食品，其特征在于，它是用權(quán)利要求1或2的乳酸菌、或權(quán)利要求1和2的混合乳酸菌、或與其它乳酸菌的混合乳酸菌進(jìn)行豆類原料發(fā)酵所得的食品。
24.如權(quán)利要求23的加工方法，其中其它乳酸菌的混合乳酸菌為1種以上選自嗜酸乳桿菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亞種CCRC 12315，瑞士乳桿菌CCRC 14092的乳酸菌。
25.一種豆類加工食品，其特征在于，它是用權(quán)利要求16的豆類加工方法進(jìn)行豆類原料發(fā)酵所得的食品。
26.如權(quán)利要求23～25中任一項(xiàng)的豆類加工食品，其中豆類為至少一種選自黃豆、黑豆、或其混合物的豆類。
27.一種豆類加工食品，其特征在于，它是用權(quán)利要求16所述的豆類加工方法進(jìn)行豆類原料發(fā)酵后在90～115℃加熱殺菌、成型、部分干燥所得的類似起司的產(chǎn)品。
28.一種細(xì)菌素，其特征為，它來(lái)自權(quán)利要求1所述的乳酸菌。
29.如權(quán)利要求28所述的細(xì)菌素，其為分子量為20～30kDa的抑菌性物質(zhì)。
30.一種細(xì)菌素，其特征為，它來(lái)自權(quán)利要求2所述的乳酸菌。
31.如權(quán)利要求30所述的細(xì)菌素，其為分子量為20～30kDa的抑菌性物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及保藏號(hào)為BCRC 910210的戊糖片球菌YJL菌株及保藏號(hào)為BCRC910211的戊糖片球菌YJS菌株的新穎菌株。本發(fā)明提供一種使用上述菌株的魚(yú)肉食品加工方法及該方法所制得的魚(yú)肉加工產(chǎn)品。本發(fā)明又提供一種使用上述菌株的豆類食品加工方法及該方法所得的豆類加工產(chǎn)品。本發(fā)明更提供由上述菌株所得的細(xì)菌素。該方法可制得可抑制雜菌生長(zhǎng)、風(fēng)味特佳、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的加工產(chǎn)品。又，該細(xì)菌素可有效地抑制其它雜菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而確保保存期間食品的品質(zhì)。
文檔編號(hào)A23L1/20GK1590533SQ0315930
公開(kāi)日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2003年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月2日
發(fā)明者江善宗, 殷儷容 申請(qǐng)人:金衣生命科學(xué)股份有限公司