專利名稱：重組Tα1-BP5融合肽、基因、工程菌及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胸腺素α I與法氏囊五肽ΒΡ5重組融合肽，同時(shí)還涉及編碼該重組融合肽的基因，表達(dá)該融合肽的工程菌及應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胸腺是免疫系統(tǒng)中重要的中樞免疫器官，負(fù)責(zé)細(xì)胞的分化和成熟，胸腺組織產(chǎn)生多種激素或因子，其中胸腺素α1 (Ta 1)是一種高度保守的小分子活性肽，富含酸性氨基酸，由28個(gè)氨基酸組成，Tal是由胸腺上皮細(xì)胞和胸腺內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生，廣泛存在于機(jī)體的胸腺上皮細(xì)胞、外周血、大腦、垂體、精液、濾泡液和羊水中；在某些保護(hù)細(xì)胞及激活的淋巴細(xì)胞上清中也存在著Ta 1 ;在某些腫瘤細(xì)胞中存在著相當(dāng)水平的Ta 1 ;甚至在某些昆蟲、蟹、原生動(dòng)物、真菌和細(xì)菌中也出現(xiàn)了類似Ta I的活性物質(zhì)。除此以外，培養(yǎng)的胸腺上皮細(xì)胞、含有ProT a的人外周血細(xì)胞以及微孔小室胎胸腺上皮細(xì)胞上清中也含有高水平的Ta 1。研究表明，Tal也存在于McF_7細(xì)胞的胞漿中和結(jié)腸腺細(xì)胞的核膜上。Ta I主要作用于胸腺細(xì)胞成熟的早期和晚期，誘導(dǎo)T細(xì)胞分化成熟，能夠增加T細(xì)胞在各種抗原或致有絲分裂原激活后產(chǎn)生INF-a (干擾素a )、INF- Y , IL-1 (白細(xì)胞介素)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7和CSF (集落刺激因子)等多種淋巴因子的分泌，增加T細(xì)胞表面淋巴因子受體的水平。T a I能調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的發(fā)育分化、成熟以及存活。法氏囊(bursa of Fabricus,BF)是禽類獨(dú)有的中樞免疫器官,其功能類似于哺乳動(dòng)物中的骨髓。法氏囊超濾物(IKD以下)中含有許多生物活性物質(zhì)，特別是一些小肽對禽類具有免疫調(diào)節(jié)功能，能促進(jìn)禽類、哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分化發(fā)育，促進(jìn)免疫器官的成熟。其中的法氏囊活性五肽(BP5)是法氏囊中新分離出來的一種新的活性小肽，其氨基酸結(jié)構(gòu)序列為:Cys-Lys-Asp-Val-Tyr。研究發(fā)現(xiàn)，BP5可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖，不但具有提高機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫功能，還具有平衡Thl和Th2類型免疫反應(yīng)的功能。而法氏囊活性五肽的免疫平衡作用是一般免疫增強(qiáng)劑所不具備的。由于法氏囊五肽BP5只能從雞的法氏囊組織中提取，胸腺素α I從胸腺組織中提取，來源受到很大的限制，而且其它雜蛋白含量高，純化難度大，其實(shí)際效果也受到很大程度的影響。而化學(xué)合成的胸腺素α I或法氏囊活性五肽ΒΡ5成本高，不適合田間推廣。因此采用基因工程的方法進(jìn)行研究具有非常重大的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供重組T α 1-ΒΡ5融合肽。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供重組Ta 1-ΒΡ5融合肽，該融合肽的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:5所示。本發(fā)明的目的還在于提供一種重組T a 1-BP5融合肽的基因。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種重組Ta 1-BP5融合肽的基因，該融合肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；該融合肽基因由胸腺素a I基因和法氏囊五肽BP5基因通過柔性連接肽Linker基因串聯(lián)而成，并在5’端加有腸激酶識(shí)別位點(diǎn)基因序列。本發(fā)明的目的還在于提供一種重組T α 1-ΒΡ5融合肽的工程菌。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種重組Ta 1-ΒΡ5融合肽的工程菌，該工程菌的構(gòu)建方法包括以下步驟:I)重組T a 1-BP5融合肽基因S0E-PCR擴(kuò)增根據(jù)豬大腸桿菌偏嗜密碼子設(shè)計(jì)重組Ta 1-BP5融合肽基因，并針對該融合肽基因設(shè)計(jì)引物Fp F2和F3,然后進(jìn)行SOE-PCR擴(kuò)增；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切下目的條帶進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物中片段大小為114bp的為重組Ta 1-BP5融合肽基因；2)攜帶重組T a 1-BP5融合肽基因的工程菌的構(gòu)建將重組T a 1-BP5融合肽基因和質(zhì)粒載體pET32a用EcoR1、Sail雙酶切，并將酶切的重組T α 1-ΒΡ5融合肽基因和質(zhì)粒載體pET32a連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5 α ;提取質(zhì)粒，并將重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行HindIII缺失酶鑒定；酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒測序，命名為pET32a-T α 1-ΒΡ5 ;將重組質(zhì)粒pET32a_T α 1-ΒΡ5轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21中，篩選陽性克隆，即為表達(dá)重組T α 1-ΒΡ5融合肽的工程菌。所述引物F1:5’ -CCGGAATTCAGCGACGCTGCTGTTGACACTAGCAGCGAAATCACTACTAAAG ACTTG-3’ ；F2:5，-GTTCGGGGTGCTGCCGCCGCCGCCGTTTTCAGCTTCTTCAACAACTTCTTTTTTTTCTTTCAAGTCTTTAGTAGT-3’ ；

F3:5 ’ -GGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTATTAAGTCGACTCG-3，。本發(fā)明的目的還在于提供一種重組T α 1-ΒΡ5融合肽的制備方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種重組Ta 1-ΒΡ5融合肽的制備方法，包括以下步驟: I)將攜帶重組T a 1-BP5融合肽基因的工程菌接種到LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)菌體濃度OD6qq=0.4-0.6時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4 6h，IPTG終濃度為ImM ；2)將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液12000rmp離心IOmin,收集沉淀,用洗漆液重懸沉淀,并超聲波裂解IOmin ;然后12000rmp離心lOmin，收集上清液；3)將上清液用Ni柱親和層析進(jìn)行純化，得到N端連有硫氧還蛋白的重組Ta 1-BP5融合肽的純化產(chǎn)物；4)將步驟3)的純化產(chǎn)物通過N端帶有His標(biāo)簽的腸激酶切去除硫氧還蛋白后，再進(jìn)行Ni柱親和層析，收集穿透峰，并用PBS進(jìn)行透析，得到重組T a 1-BP5融合肽。本發(fā)明將重組Ta 1-BP5融合肽基因插入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得高效表達(dá)重組Ta 1-BP5融合肽的基因工程菌，通過液體培養(yǎng)、純化制得的重組Ta 1-BP5融合肽，該融合肽經(jīng)N端帶有His標(biāo)簽的腸激酶去除硫氧還蛋白，再經(jīng)親和層析純化，可獲得單一的重組T a 1-BP5融合肽。本發(fā)明的目的還在于提供一種重組Ta 1-BP5融合肽在作為免疫佐劑方面的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種重組T a 1-BP5融合肽在作為免疫佐劑方面的應(yīng)用。
將重組T α 1-ΒΡ5融合肽與單獨(dú)的胸腺素α I或法氏囊五肽ΒΡ5進(jìn)行免疫活性比較，結(jié)果顯示，重組的Ta 1-ΒΡ5融合肽在體外淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)中表現(xiàn)出比單獨(dú)的胸腺素a I和法氏囊五肽ΒΡ5更高的刺激淋巴細(xì)胞增殖的活性。本發(fā)明的重組Ta 1-BP5融合肽可作為配合疫苗使用的新型多肽免疫佐劑，與疫苗配合單一胸腺素a I或疫苗配合單一法氏囊五肽BP5相比，具有更好的免疫佐劑效果，能夠有效增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫水平，具有廣闊的應(yīng)用前景。另外，本發(fā)明的重組T a 1-BP5融合肽具有抗病毒、抗感染及抑制腫瘤生長的作用，將本發(fā)明的重組Ta 1-BP5融合肽與抗病毒、抗感染或抗腫瘤藥劑混合在一起，可以達(dá)到提高治療效果目的。本發(fā)明的重組Ta 1-BP5融合肽與疫苗通過物理或簡單混合的方法也可以制成疫苗復(fù)合物。


·圖1為重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_T α 1-ΒΡ5的缺失酶鑒定圖；圖中，I:DL2000DNA Marker ；2 =HindIII 酶切重組質(zhì)粒 pET32a_T α 1-ΒΡ5 ；3:重組質(zhì)粒 pET32a_T α 1-ΒΡ5圖2為重組T α 1-ΒΡ5融合肽在大腸桿菌中不同誘導(dǎo)時(shí)間的SDS-PAGE電泳圖；圖中，1:低分子量蛋白質(zhì)Marker ;2:誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3):3:誘導(dǎo)Oh的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET32a-T α 1-ΒΡ5 ;4:誘導(dǎo)Ih的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET32a-T α 1-ΒΡ5 ；5:誘導(dǎo) 2h 的重組大腸桿菌 BL21 (DE3)/pET32a_T α 1-ΒΡ5 ；6:誘導(dǎo) 3h的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-Ta 1-BP5 ;7:誘導(dǎo)4h的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET32a-Ta 1-BP5 ；8:誘導(dǎo) 5h 的重組大腸桿菌 BL21 (DE3)/pET32a_T a 1-BP5 ；9:誘導(dǎo) 6h的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-Ta 1-BP5 ；10:誘導(dǎo)7h的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET32a-Tα 1-ΒΡ5圖3為重組T α 1-ΒΡ5融合肽在大腸桿菌BL21中的表達(dá)的SDS-PAGE分析圖；圖中，1:低分子量蛋白質(zhì)Marker ;2:未誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3) ;3:未誘導(dǎo)的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET32a-T α 1-ΒΡ5 ;4:誘導(dǎo)的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET32a-Tα 1-ΒΡ5圖4為重組T α 1-ΒΡ5融合肽體外活性測定結(jié)果；圖5為禽流感Η9Ν2ΗΑ抗體亞型IgGl檢測結(jié)果；圖6為禽流感Η9Ν2ΗΑ抗體亞型IgG2a檢測結(jié)果；圖7為小鼠血清中細(xì)胞因子IFN- Y含量測定；圖8為小鼠血清中細(xì)胞因子IL-4含量測定；圖9為小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、表達(dá)重組T α 1-ΒΡ5融合肽工程菌的構(gòu)建1、重組T α 1-ΒΡ5融合肽基因S0E-PCR擴(kuò)增I)設(shè)計(jì)引物根據(jù)豬大腸桿菌偏嗜密碼子設(shè)計(jì)重組T α 1-ΒΡ5融合肽基因，如下:
5， -AGCGACGCTGCTGTTGACACTAGCAGCGAAATCACTACTAAAGACTTGAAAGAA AAAAAAGAAGTTGTTGAAGAAGCTGAAAACGGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTG TAT-3’ (SEQ ID NO:1)并針對該融合肽基因設(shè)計(jì)引物FpF2和F3，其中在引物F1中加上EcoRI酶切位點(diǎn)，引物F3中加上終止密碼子和SalI酶切位點(diǎn)，引物由上海Invitrongen公司合成,如下:F1:5’ -CCGGAATTCAGCGACGCTGCTGTTGACACTAGCAGCGAAATCACTACTAAAG ACTTG-3’(SEQ ID N0:2)，其中下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn)；F2:5，-GTTCGGGGTGCTGCCGCCGCCGCCGTTTTCAGCTTCTTCAACAACTTCTTTTTTTTCTTTCAAGTCTTTAGTAGT-3’ (SEQ ID NO:3);F,:5’-GGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTATTAAGTCGACTCG-3，(SEQ ID NO:4)，其中下劃線部分為Sail酶切位點(diǎn)。2) SOE-PCR 擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系:10 X PCR Buffer5 μ L, MgCl23 μ L, IOmmoI/L 的 dNTPl μ L,終濃度為20pmol/L的引物FpF2和F3各2 μ L，TaKaRa ExTaq0.5 μ L,滅菌超純水34.5 μ L,反應(yīng)總體積 50 μ L0PCR反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性2min，進(jìn)入PCR循環(huán):94°C變性30s，55 °C退火lmin，72°C延伸6min，其中變性和退火共30個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)含有溴化乙錠(Ethidium Bromide, EB) 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切下目的條帶，隨后按膠回收試劑盒(大連TaKaRa公司)使用說明進(jìn)行回收，并對回收產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，片段大小為114bp的即為重組Ta 1-BP5融合肽基因，對基因序列測定后，推導(dǎo)其編碼的重組T a 1-B P5融合肽為38個(gè)氨基酸。2、攜帶重組T a 1-BP5融合肽基因的工程菌的構(gòu)建將重組T a 1-BP5融合肽基因和質(zhì)粒載體pET32a用EcoR1、Sail雙酶切，并置于37°C水浴2h，將酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，膠回收試劑盒進(jìn)行回收鑒定。經(jīng)過酶切的重組Ta 1-BP5融合肽基因和質(zhì)粒載體pET32a按摩爾比1:3的比例在4°C過夜連接。取連接產(chǎn)物加入含有100 μ L感受態(tài)DH5 α的聚丙烯離心管中，輕輕混勻后冰浴30min。將聚丙烯離心管從冰中取出后42°C熱休克90s，然后立即冰浴2min。取出加入37°C預(yù)熱的LB培養(yǎng)基800 μ L中，于37°C振搖(120rpm) 45min。取100 μ L菌液均勻涂布在含氨芐青霉素(Amp) 50 μ g/mL的瓊脂LB平板上，37°C放置20min后，倒置培養(yǎng)18h。按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》上的堿裂解法提取質(zhì)粒。對提取的質(zhì)粒用HindIII對質(zhì)粒進(jìn)行缺失酶鑒定，即將酶切產(chǎn)物進(jìn)行DNA電泳鑒定，DNA電泳結(jié)果顯示質(zhì)粒沒有被HindIII切出相應(yīng)條帶，表明重組質(zhì)粒已經(jīng)缺失HindIII酶切位點(diǎn)，如圖1所示。并將重組陽性質(zhì)粒命名為pET32a-Ta 1-BP5。將重組質(zhì)粒pET32a_T a 1-BP5送上海Invitrongen公司測序。采用CaCl2轉(zhuǎn)化法，將重組質(zhì)粒pET32a-T α 1-ΒΡ5轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，篩選陽性克隆，即為表達(dá)重組T α 1-ΒΡ5融合肽的工程菌，命名為BL21 (DE3)/pET32a_T α 1-ΒΡ5。實(shí)施例2、重組T α 1-ΒΡ5融合肽的制備1、將表達(dá)重組T α 1-ΒΡ5融合肽的工程菌接種到3mL LB液體培養(yǎng)基(50 μ g/mL氨芐青霉素)中，于37°C振搖培養(yǎng)過夜；第二天從中取出菌液加到3mL LB液體培養(yǎng)基中，使菌體濃度達(dá)到OD6tltl 0.1后，37°C振搖培養(yǎng)，當(dāng)菌體濃度OD6tltl 0.4-0.6時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4h，IPTG的終濃度為ImM ;每隔I小時(shí)收集100 μ L菌液，對重組T α 1-ΒΡ5融合肽在大腸桿菌中不同誘導(dǎo)時(shí)間的表達(dá)量進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖2所示。將菌液4000rpm離心lOmin，收集菌體，將收集的菌體用IOO μ L PBS重懸后，加等體積的2XSDS凝膠加樣緩沖液(100mmol/L Tris.Cl (ρΗ6.8)、200mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)、4%SDS (電泳級)、0.2% 溴酚藍(lán)及20%甘油)，100°C煮沸5min以使蛋白質(zhì)變形，然后取10 μ L進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，SDS-PAGE電泳凝膠的配制及電泳條件參照分子克隆手冊，具體步驟如下:I)分離膠(15%)的配制:水 3.4mL ;30% 丙烯酰胺溶液 4.0mL ；1.5M Tris.HCl(pH8.8) 2.5mL ；10%SDS0.1OmL ；10% 過硫酸銨 0.05mL ；TEMED0.0lmL0按以上順序加樣后快速灌膠，小心地在液面上覆蓋一層去離子水。在室溫下放置IOmin待膠凝固后棄取水,用吸水紙吸干。2)濃縮膠(5%)的配制:水 5.7mL ;30% 丙烯酰胺溶液 1.7mL ；1.5M Tris.HCl(ρΗ6.8) 2.5mL ；10%SDS0.1mL ；10% 過硫酸銨 0.05mL ；TEMED0.0lmL03)將濃縮膠液體混勻后覆蓋在分離膠之上，隨后插入梳子，于室溫下放置IOmin待膠凝固后，拔去梳子，向電泳槽內(nèi)倒入Tris-甘氨酸電泳緩沖液(25mmol/L Tris、250mmol/L甘氨酸(電泳級)(pH8.3)、0.1%SDS)，加樣結(jié)束后接通電源。電源負(fù)極端接上槽，正極端接下槽。在濃縮膠中電壓為80V，進(jìn)入分離膠中電壓調(diào)整為120V。直到樣品到達(dá)分離膠底部后關(guān)閉電源，取出凝膠，用考馬斯亮藍(lán)染色lh，隨后在脫色搖床上脫色l_2h，觀察SDS-PAGE電泳蛋白染色結(jié)果。2、將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液12000rmp離心lOmin，收集菌體，用洗滌液(5mM咪唑，0.5MNaCl, 20mM Tris-HCl,pH7.9)重懸菌體，后經(jīng)超聲波裂解lOmin，12000rmp離心lOmin，收獲包涵體沉淀和上清液。SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶性表達(dá)，如圖3所示。將此上清液用Ni柱親和層析進(jìn)行純化，具體操作過程如下:將樹脂搖勻后，向柱子里加入5.0mL樹脂懸液，置于室溫下使其自然沉降，確保柱床體積為2.5mL,隨后分別加入3倍體積的純水、5倍體積IXCharge buffer、3倍體積IXBinding buffer。當(dāng)IXBinding buffer流到柱床底部時(shí)，向柱子里加入上清液，控制流速，以每小時(shí)25mL的流量過柱，確保蛋白能充分地結(jié)合到柱子上。接著加入25mLl XBingding buffer 進(jìn)行洗漆，隨后用 15mLl XWash buffer 洗漆，最終用 15mL 的I XElute buffer洗脫蛋白，即得到重組T α 1-ΒΡ5融合肽的純化產(chǎn)物，分子量約24KDa。該融合蛋白在重組T α 1-ΒΡ5融合肽N端連有硫氧還蛋白。3、將重組T α 1-ΒΡ5融合肽的純化產(chǎn)物通過N端帶有His標(biāo)簽的腸激酶切去除硫氧還蛋白，可獲得保持天然N端的重組T α 1-ΒΡ5融合肽。再次進(jìn)行Ni柱親和層析，收集穿透峰，將純化的蛋白用PBS進(jìn)行透析，得到純度極高分子量約4KDa的重組Ta 1-BP5融合肽。將得到的重組Ta 1-BP5融合肽在蛋白核酸測定儀(型號(hào)GeneQuant pro RNA/DNACalculator)定量后冷凍干燥。實(shí)驗(yàn)例1、重組T α 1-ΒΡ5融合肽的體外活性測定米用常規(guī)方法分離小鼠淋巴細(xì)胞，置于CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)6h ;將不同濃度的重組 T α 1-BP5 融 合妝(20 μ moL/L、10 μ moL/L、5 μ moL/L、2.5 μ moL/L、l.25 μ moL/L)加入含淋巴細(xì)胞的孔中，每孔100 μ L，并設(shè)對照組(PBS、10 μ moL/L硫氧還蛋白(TRx)、10 μ moL/L標(biāo)準(zhǔn)品T α 1、10 μ moL/L BP5)，MTT法測定重組T α 1-ΒΡ5融合肽體外活性，結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，本發(fā)明的重組Ta 1-ΒΡ5融合肽可顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞的分裂、增殖，與單一的胸腺素α 1和法氏囊五肽ΒΡ5相比，本發(fā)明的重組T α 1-ΒΡ5融合肽刺激淋巴細(xì)胞增殖活性更強(qiáng)，且重組T α 1-ΒΡ5融合肽濃度為5 μ moL/L,20 μ moL/L時(shí)差異顯著(P< 0.05),濃度為10 μ moL/L時(shí)差異極顯著(P < 0.01)。實(shí)驗(yàn)例2、重組T α 1-ΒΡ5融合肽作為免疫佐劑的效果分析將本發(fā)明的重組T α 1-ΒΡ5融合肽配合禽流感Η9Ν2滅活疫苗聯(lián)合免疫，分析其免疫增強(qiáng)效果。禽流感滅活疫苗(Η9Ν2亞型，SDS696株)購自乾元浩生物股份有限公司。 將6周齡雌性BALB/c小鼠分為5組，分別為滅活疫苗組、滅活疫苗+重組T α 1-ΒΡ5融合肽組、滅活疫苗+單獨(dú)胸腺素α I組、滅活疫苗+單獨(dú)法氏囊活性肽ΒΡ5組及PBS對照組，每組10只，重組T α 1-ΒΡ5融合肽、單獨(dú)胸腺T α I和單獨(dú)法氏囊活性肽ΒΡ5使用劑量均為10 μ g/鼠。采用腹膜內(nèi)注射，間隔兩周免疫一次，共免疫三次，最后一次免疫一周后尾靜脈采血。分別測定不同組中小鼠禽流感H9N2病毒抗體亞型、血清中IL-4和IFN- Y的含量，并同時(shí)分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞檢測脾淋巴細(xì)胞增殖，結(jié)果如圖5-9所示。小鼠禽流感H9N2病毒抗體亞型IgG檢測結(jié)果如圖5、6所示。從圖5、6中可以看出，單獨(dú)禽流感H9N2疫苗主要誘導(dǎo)IgGl的產(chǎn)生，而重組Ta 1-BP5融合肽+滅活疫苗組不但能誘導(dǎo)高水平IgGl的產(chǎn)生，而且誘導(dǎo)IgG2a產(chǎn)生的能力好于單獨(dú)禽流感H9N2疫苗組。同時(shí)，重組T α 1-ΒΡ5融合肽+滅活疫苗誘導(dǎo)IgGl和IgG2a的能力好于滅活疫苗+單獨(dú)胸腺素α I和滅活疫苗+單獨(dú)法氏囊活性肽ΒΡ5，重組T α 1-ΒΡ5融合肽二者聯(lián)合免疫后誘導(dǎo)小鼠的抗體分泌水平強(qiáng)于其他組。小鼠血清中IL-4和IFN-Y的含量檢測結(jié)果如圖7、8所示。從圖7、8中可以看出，滅活疫苗+單獨(dú)胸腺素α I主要誘導(dǎo)IL-4的分泌，滅活疫苗+單獨(dú)法氏囊活性肽ΒΡ5主要誘導(dǎo)IFN- Y的分泌，而滅活疫苗+重組T α 1-ΒΡ5融合肽誘導(dǎo)IL-4和IFN- Y的分泌明顯高于滅活疫苗+單獨(dú)胸腺素α I和滅活疫苗+單獨(dú)法氏囊活性肽ΒΡ5。另外，重組T α 1-ΒΡ5融合肽能平衡兩種細(xì)胞因子的分泌。將二次加強(qiáng)免疫14天后的小鼠殺死，分離脾臟淋巴細(xì)胞，用大腸桿菌表達(dá)的Η9Ν2ΗΑ抗原蛋白進(jìn)行刺激，然后檢測淋巴細(xì)胞的增殖情況，如圖9所示。從圖9中可以看出，使用重組Ta 1-ΒΡ5融合肽作為免疫佐劑的小鼠組淋巴細(xì)胞的增殖最強(qiáng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組，其差異極顯著(P < 0.05)。
權(quán)利要求
1.重組Ta1-BP5融合肽，其特征在于，該融合肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的重組Ta 1-BP5融合肽的基因，其特征在于，該融合肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種編碼重組Ta 1-BP5融合肽的基因，其特征在于，所述融合肽基因由胸腺素a I基因和法氏囊五肽BP5基因通過柔性連接肽Linker基因串聯(lián)而成，并在5’端加有腸激酶識(shí)別位點(diǎn)基因序列。
4.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述的重組Ta 1-BP5融合肽的工程菌，其特征在于，該工程菌的構(gòu)建方法包括以下步驟: 1)重組Ta 1-BP5融合肽基因SOE-PCR擴(kuò)增 根據(jù)豬大腸桿菌偏嗜密碼子設(shè)計(jì)重組Ta 1-BP5融合肽基因，并針對該融合肽基因設(shè)計(jì)引物Fp F2和F3,然后進(jìn)行SOE-PCR擴(kuò)增；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切下目的條帶進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物中片段大小為114bp的為重組T a 1-BP5融合肽基因； 2)攜帶重組Ta 1-BP5融合肽基因的工程菌的構(gòu)建 將重組T a 1-BP5融合肽基因和質(zhì)粒載體pET32a用EcoR1、Sail雙酶切，并將酶切的重組Ta 1-BP5融合肽基因和質(zhì)粒載體pET32a連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5 α ;提取質(zhì)粒，并將重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行HindIII缺失酶鑒定；酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒測序，命名為pET32a-T α 1-ΒΡ5 ;將重組質(zhì)粒pET32a_T α 1-ΒΡ5轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21中，篩選陽性克隆，即為表達(dá)重組T α 1-ΒΡ5融合肽的工程菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組Ta1-ΒΡ5融合肽基因的工程菌，其特征在于，所述引物F1:5’ -CCGGAATTCAGCGACGCTGCTGTTGACACTAGCAGCGAAATCACTACTAAAG ACTTG-3’ ； F2:5’ -GTTCGGGGTGCTGCCGCCGCCGCCGTTTTCAGCTTCTTCAACAACTTCTTTTTTTTCTTTCAAGTCTTTAGTAGT-3’ ；F3:5’ -GGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTATTAAGTCGACTCG-3’。
6.—種如權(quán)利要求1所述的重組 T a 1-BP5融合肽在作為免疫佐劑方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了重組Tα1-BP5融合肽、基因、工程菌及應(yīng)用。該重組融合肽為胸腺素α1和法氏囊五肽BP5通過柔性Linker融合而成。本發(fā)明將重組Tα1-BP5融合肽基因插入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得高效表達(dá)重組Tα1-BP5融合肽的基因工程菌，通過液體培養(yǎng)、純化制得的重組Tα1-BP5融合肽，該融合肽經(jīng)N端帶有His標(biāo)簽的腸激酶去除硫氧還蛋白，再經(jīng)親和層析純化，可獲得單一的重組Tα1-BP5融合肽。本發(fā)明的重組Tα1-BP5融合肽可作為配合疫苗使用的新型多肽免疫佐劑，能夠有效增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫水平，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/21GK103145853SQ20131006994
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者王臣, 馮書營, 趙戰(zhàn)勤, 牛明媚, 郭香玲, 李振華, 李小康, 劉一塵, 張春杰 申請人:河南科技大學(xué)