專利名稱：重建胚胎中核轉(zhuǎn)移后融合和活化的方法和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于非人哺乳動物中核轉(zhuǎn)移程序的重建胚胎的融合和活化的改進方法。更特別地，本發(fā)明提供了通過使用至少兩個電活化程序改進核轉(zhuǎn)移程序中重建胚胎的活化的方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明一般地涉及體細胞核轉(zhuǎn)移(SCNT)領(lǐng)域和產(chǎn)生期望的轉(zhuǎn)基因動物。更特別地，它涉及產(chǎn)生得自體細胞的細胞系的方法，轉(zhuǎn)化這些細胞系的方法，和使用這些轉(zhuǎn)化細胞和細胞系來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物種的方法。
對具有某些期望性狀或特征，如體重，奶含量，產(chǎn)奶量，泌乳間隔長度和抗病性增加的動物渴望已久。傳統(tǒng)育種方法能夠產(chǎn)生帶有一些特定期望性狀的動物，但是常常這些性狀伴隨很多不需要的特征，并且費時、昂貴和不可靠。而且，這些方法完全不能允許特定動物系產(chǎn)生基因產(chǎn)物，如所述物種的遺傳互補物中本來完全沒有的期望的蛋白治療劑(即牛奶中的蛛絲蛋白)。
能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)的發(fā)展提供了產(chǎn)生被改造攜帶特殊性狀或被設計表達某些蛋白或其它分子化合物的動物的特別精確方法。那就是，轉(zhuǎn)基因動物是攜帶在發(fā)育早期已被故意導入體細胞和/或生殖系細胞的基因的動物。當動物發(fā)育和生長時，改造給動物的蛋白產(chǎn)物或特殊發(fā)育改變變得明顯。
目前，可利用的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因家畜的技術(shù)效率低并且費時，典型地產(chǎn)生有活力胚胎的百分比很低。在轉(zhuǎn)基因發(fā)展過程中，典型地隨機插入DNA序列，可引起各種問題。這些問題的第一個是插入失活，它是由于編碼或調(diào)節(jié)序列被新來DNA破壞造成的必需基因失活。另一個問題是該轉(zhuǎn)基因可能根本不摻入，或摻入但不表達。更多問題是由于位置效應造成的調(diào)控不準確的可能性。這是指用相同轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體產(chǎn)生的不同founder動物之間基因表達水平和基因調(diào)節(jié)準確度的變異性。因此，產(chǎn)生大量founder動物并且常常證實少于5％的動物以保證轉(zhuǎn)基因系維持的方式表達該轉(zhuǎn)基因并不罕見。
另外，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因家畜的效率低，100個后代中產(chǎn)生1個轉(zhuǎn)基因的效率并不罕見(Wall，1997)。結(jié)果，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物相關(guān)的費用可以多至每個表達動物25-50萬美元(Wall，1997)。
現(xiàn)有方法在克隆過程中典型地使用胚胎細胞類型。這包括Campbell等(Nature，1996)和Stice等(Biol.Reprod.，1996)的工作。在這兩個研究中，胚胎細胞系得自妊娠小于10天的胚胎。在兩個研究中，細胞維持在飼養(yǎng)層防止待用于克隆過程的供體細胞明顯分化。本發(fā)明使用分化細胞。認為胚胎細胞類型也可以與從分化供體核開始的克隆胚胎一起用于本發(fā)明的方法。
因此，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)良基因型的哺乳動物包括山羊的增殖是可能的。這將允許帶有證明的遺傳優(yōu)越性或其它期望性狀的成年動物增殖。例如很多重要哺乳動物種，包括山羊、嚙齒動物、母牛和兔子的進展將加速。通過本發(fā)明，可能有數(shù)十億個可收獲并用于克隆程序的胎兒或成年細胞。這將可能短期產(chǎn)生很多相同后代。
因此，盡管各種方法已經(jīng)產(chǎn)生了幾個不同物種的轉(zhuǎn)基因動物，但是仍缺乏以合理費用，容易和可重復產(chǎn)生能夠表達高產(chǎn)量期望蛋白或表現(xiàn)插入轉(zhuǎn)基因引起的遺傳改變的轉(zhuǎn)基因動物的方法。
因此，在轉(zhuǎn)基因動物發(fā)展中存在允許生產(chǎn)效率增加的改進的核轉(zhuǎn)移方法的需要，尤其是在努力更可靠和有效產(chǎn)生有活力轉(zhuǎn)基因后代時在細胞偶聯(lián)體的同時融合和活化過程中融合細胞活化的增加。
發(fā)明概述簡單說，本發(fā)明提供了通過核轉(zhuǎn)移方法克隆非人哺乳動物的方法，包括獲得待用作供體核來源的期望的分化哺乳動物細胞；從與作為供體核來源的細胞相同的物種的哺乳動物獲得至少一個卵母細胞；除去該至少一個卵母細胞的核；將期望的分化細胞或細胞核轉(zhuǎn)移到去核卵母細胞中；同時融合和活化細胞偶聯(lián)體，形成第一轉(zhuǎn)基因胚胎；提供至少一個另外的活化方案，包括另外的電休克，來活化沒有融合產(chǎn)生第一轉(zhuǎn)基因胚胎，但在初次電休克后被活化的細胞-偶聯(lián)體，形成第二轉(zhuǎn)基因胚胎；培養(yǎng)活化的第一和/或第二轉(zhuǎn)基因胚胎直到超過2細胞發(fā)育期；和最后將第一和/或第二轉(zhuǎn)基因胚胎轉(zhuǎn)移到合適的宿主哺乳動物中，使得該胚胎發(fā)育為胎兒。典型地，通過使用如下供體核完成上面的方法，在所述分化哺乳動物細胞或細胞核插入所述去核卵母細胞前，供體核已被插入、除去或修飾期望基因。也要注意的事實是使用的卵母細胞在去核前優(yōu)選在體外成熟。
此外，本發(fā)明的方法也可用于通過使用被去核并與供體體細胞融合并同時活化的停滯在中期II期的山羊(caprine)卵母細胞優(yōu)化轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)生。分析一個轉(zhuǎn)基因克隆動物的奶表明人的期望靶轉(zhuǎn)基因蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)量水平高。
指出本發(fā)明也可以用于增加可用于例如細胞、組織和器官移植的CICM細胞、胎兒或后代的可利用性也很重要。通過從動物取出胎兒或成年細胞并在克隆程序中使用它，各種細胞、組織和可能器官當它們通過器官發(fā)生而發(fā)育時可從克隆的胎兒獲得。細胞、組織和器官也可以從克隆的后代分離。這個方法可提供很多醫(yī)學和獸醫(yī)治療，包括細胞和基因治療的“材料”來源。如果細胞被轉(zhuǎn)移回到該細胞所來源的動物，那么避免了免疫排斥。而且，因為可從這些克隆分離很多細胞類型，所以其它方法學如造血chimericism可用于避免相同物種動物以及種間動物的免疫排斥。
附圖簡述

圖1顯示了通過核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生克隆動物的方法的概括性圖。
優(yōu)選實施方案的描述說明書中下列縮寫具有指定的意思縮寫解釋體細胞核轉(zhuǎn)移(SCNT)培養(yǎng)的內(nèi)細胞團細胞(CICM)核轉(zhuǎn)移(NT)合成的輸卵管液(SOF)胎牛血清(FBS)聚合酶鏈式反應(PCR)牛血清白蛋白(BSA)術(shù)語解釋山羊/山羊的-山羊各個種所有的或與之相關(guān)的重建胚胎-重建胚胎是通過去核程序其遺傳物質(zhì)已經(jīng)被除去的卵母細胞。通過融合事件后將成年或胎兒體細胞的遺傳物質(zhì)放置于該卵母細胞中，它已被“重建”。
融合玻片-以固定距離分離放置的平行電極(parallelelectrodes)的玻片。細胞偶聯(lián)體放置于電極之間接受融合和活化電流。
細胞偶聯(lián)體(couplet)-融合和/或活化前的去核卵母細胞和體細胞或胎兒細胞核。
細胞松弛素(Cytocholasin)-B-某些真菌的代謝產(chǎn)物，它選擇性和可逆地阻斷胞質(zhì)分裂，而不影響核分裂。
胞質(zhì)體-真核細胞的細胞質(zhì)物質(zhì)。
細胞核-細胞核，通過去核得自細胞，被狹窄的細胞質(zhì)邊緣和質(zhì)膜環(huán)繞。
體細胞-生物體除了生殖細胞以外的任何細胞。
單性生殖的(parthenogenic)-來自無精子穿透的卵母細胞的胚胎的發(fā)育。
轉(zhuǎn)基因生物-一種生物，其中被實驗轉(zhuǎn)移了來自另一個生物的遺傳物質(zhì)，使得該宿主獲得了其染色體組成中被轉(zhuǎn)移基因的遺傳性狀。
體細胞核轉(zhuǎn)移-也稱作治療性克隆，是體細胞與去核卵母細胞融合的方法。體細胞的核提供遺傳信息，而卵母細胞提供營養(yǎng)和胚胎發(fā)育所需的其它產(chǎn)能物質(zhì)。一旦發(fā)生融合，細胞就是全能的，并最終發(fā)育為胚泡，在此點分離內(nèi)細胞團。
本發(fā)明涉及為核轉(zhuǎn)移程序開發(fā)的增加轉(zhuǎn)基因胚胎數(shù)量的系統(tǒng)。本發(fā)明提供了不成功的初次同時電融合和活化事件后，產(chǎn)生融合和活化胚胎的改進方法。這個能力給活化和融合的能夠核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生各種非人種哺乳動物活后代的胚胎的產(chǎn)生效率提供了改進，所述哺乳動物包括山羊、豬、嚙齒動物、靈長目、兔子和牛。
此外，本發(fā)明涉及克隆程序，其中得自分化胎兒或成年哺乳動物細胞的細胞核，包括無血清饑餓的分化胎兒或成年山羊細胞，移植到與供體核相同物種的去核卵母細胞。該核被重新編程以指導克隆胚胎的發(fā)育，該胚胎接著可轉(zhuǎn)移給受體雌性動物而產(chǎn)生胎兒和后代，或用于產(chǎn)生培養(yǎng)的內(nèi)細胞團(CICM)?？寺∨咛ヒ部梢耘c受精胚胎組合產(chǎn)生嵌合胚胎、胎兒和/或后代。
供體細胞核與去核胞質(zhì)體的融合，和所得偶聯(lián)體的隨后活化是用體細胞核轉(zhuǎn)移成功產(chǎn)生活后代所需的重要步驟。供體細胞核與胞質(zhì)體的電融合是使用的最普通方法。然而更重要的是，已經(jīng)發(fā)表了核轉(zhuǎn)移方法學中使用來啟動很多家畜物種中胚胎發(fā)育過程的幾種活化方法，和活化步驟的時間選擇。在哺乳動物中，盡管物種間有差異，最初信號轉(zhuǎn)導事件和受精時精子誘導的隨后Ca+2振蕩是導致卵母細胞活化和胚胎發(fā)育的正常過程(Fissore等，1992和Alberio等，2001)。目前利用Ca+2動員的化學和電方法活化體細胞核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的偶聯(lián)體。然而，這些方法不產(chǎn)生與典型的體內(nèi)受精模式中精子類似的Ca+2振蕩模式。
自從利用體細胞的綿羊的成功首次報道，核轉(zhuǎn)移上已經(jīng)發(fā)生了顯著的進步(Wilmut等，1997)。自那時以后已經(jīng)從體細胞不同程度成功地克隆了很多其它物種(Baguisi等，1999和Cibelli等，1998)。也已經(jīng)報道了很多其它胎兒和成年體細胞組織類型(Zou等，2001和Wells等，1999)，以及胚胎(Yang等，1992；Bondioli等，1990；和Meng等，1997)。細胞核處于重建時期的細胞周期階段也已經(jīng)被引證為不同實驗室方法中的關(guān)鍵(Kasinathan等，Biol.Reprod.2001；Lai等，2001；Yong等，1998；和Kasinathan等，Nature Biotech.2001)。然而，在融合和活化使用的順序、時間選擇和方法上有相當大程度的變異性。
現(xiàn)有技術(shù)依靠使用早期胚胎的卵裂球進行核轉(zhuǎn)移程序。這個方法受可利用胚胎卵裂球數(shù)量少和不能將外源遺傳物質(zhì)導入這種細胞的限制。相比之下，分化胚胎、胎兒或成年體細胞可起細胞核供體的作用進行核轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)提供了生殖系修飾的廣泛可能性。根據(jù)本發(fā)明，使用重組體細胞系進行核轉(zhuǎn)移，和通過使用“重建”胚胎增加可利用細胞數(shù)量而提高這個程序的效率，不僅允許用常規(guī)轉(zhuǎn)染方法將轉(zhuǎn)基因?qū)敫噢D(zhuǎn)基因動物，而且在克服founder鑲嵌性問題的同時實質(zhì)性地增加了轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生的效率。
我們以前表明同時電融合和活化可成功產(chǎn)生山羊物種和其它動物的活后代。在我們當前的實驗中，我們研究了初次成功同時電融合和活化之后，使用另外的電活化事件來更接近地模擬精子誘導的Ca+2振蕩并通過體細胞核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生胚胎和活后代。最后，我們確定了初次同時電融合和活化事件中沒有成功融合的供體細胞核與去核胞質(zhì)體再次融合，通過體細胞核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生山羊胚胎和活后代的能力。
本發(fā)明所基于的數(shù)據(jù)證明在產(chǎn)生活后代能力上，初次成功同時電融合和活化后單一的另外電活化事件與僅僅同時電融合和活化相比更有效。在隨后實驗中，我們擴展了實驗方案以包括初次成功同時電融合處理后單次或定時的多次另外電活化事件。隨后實驗結(jié)果證明，盡管不同數(shù)量的另外電活化步驟產(chǎn)生能夠在受孕55天建立妊娠的核轉(zhuǎn)移胚胎的能力相當，但是兩種方法都比所述實驗更有效。Bondolli等以前報道了另外電活化事件可成功通過核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生豬物種的活后代。其它報道(Collas等，1993)證明另外的電活化事件可成功產(chǎn)生牛物種的單性生殖胚胎。這里我們的結(jié)果提示在分開的方案方法學中，山羊細胞核和去核體內(nèi)排卵卵母細胞初次成功同時電融合和活化后另外的電活化可提供各種動物尤其是山羊物種中使用核轉(zhuǎn)移的可供選擇和更有效的活化方法。
細胞核和去核胞質(zhì)體電融合的效率基于使用的物種和細胞類型而變化。然而，根據(jù)我們對山羊的經(jīng)驗，以及如其他人所報道(Baguisi等，1999；和Stice等，1992)，在初次融合嘗試過程中存在不成功融合的偶聯(lián)體亞群。在這些實驗中，我們確定了不成功初次同時電融合和活化事件后的另外再次融合嘗試通過體細胞核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生山羊胚胎和活后代的能力。在實驗中，數(shù)據(jù)證明與單單同時電融合和活化(Baguisi等，1999)或初次成功同時電融合和活化后單一另外電活化事件相比，在產(chǎn)生活后代的能力上，再次融合是可能的并且更有效。在隨后實驗中，我們證實了我們的觀察，即未融合偶聯(lián)體的再次融合能夠產(chǎn)生能在受孕55天建立妊娠的核轉(zhuǎn)移胚胎。
供體細胞核是從得自40天轉(zhuǎn)基因雌性胎兒的原代胎兒體細胞系得到的，該轉(zhuǎn)基因雌性胎兒是由陰性成年雌性動物與轉(zhuǎn)基因雄性動物的精子人工受精產(chǎn)生的。用兩種核轉(zhuǎn)移程序產(chǎn)生活后代。在一個方案中，除去停滯在中期-II期的山羊卵母細胞的核，與供體體細胞電融合和同時活化。在第二個方案中，除去在體內(nèi)活化的有絲分裂末期-II期的山羊卵母細胞的核，與供體細胞核電融合和同時活化第二次以誘導基因組再活化。三個健康的相同雌性后代出生。基因型分析證實所有克隆后代得自供體細胞系。一個轉(zhuǎn)基因克隆動物的奶分析表明人抗凝血酶III的產(chǎn)量水平高，類似于親本轉(zhuǎn)基因系。因此，通過本發(fā)明采用的方法和系統(tǒng)，通過體細胞核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因動物，山羊，并且表明能夠在克隆動物的奶中產(chǎn)生靶治療蛋白。
盡管為理解的目的以例證和實例方式有些詳細地描述了前面的發(fā)明，但是可實施某些改變和修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員很明顯。因此，說明書和實施例不應該被解釋為限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明范圍由所附權(quán)利要求描述。
Wilmut等和Campbell等報道了使用單一電脈沖進行重建胚胎的融合，隨后在胚胎化學活化前延遲幾個小時。其它報道已經(jīng)示范了可用于各種物種活化的不同的電和化學刺激(Koo等，2000；和Fissore A.等)。本發(fā)明通過同時融合和活化，兩個事件之間不包含延遲，給活化和融合胚胎使用隨后的另外電脈沖，提供了體細胞核轉(zhuǎn)移的用途。隨后對融合和活化技術(shù)的研究產(chǎn)生了本發(fā)明提供的可供選擇的方法，它提供了提高的效率和使得制備轉(zhuǎn)基因動物或細胞系的過程更可靠和有效。
在開發(fā)增加現(xiàn)有技術(shù)中可利用的融合和活化胚胎的低效率的本方法的過程中，進行調(diào)查以估計如何利用初次未融合但是已經(jīng)被活化的重建胚胎。實施其后實驗觀察測試物種(如山羊)的多次電脈沖。也在核轉(zhuǎn)移后卵母細胞活化和產(chǎn)生活小豬方面在豬模型中測試相同方法。這是為了更好模擬當精子正常穿透和使卵母細胞受精和誘導鈣振蕩時體內(nèi)所觀察到的情況(Alberio等，2001；和Ducibella等，1998)。
材料和方法用作卵母細胞供體的雌性動物的動情期同步化和超排卵及顯微操作如Gavin W.G.1996所述實施，該文獻特別引入這里作為參考。原代體細胞的分離和建立，用作細胞核供體的體細胞的轉(zhuǎn)染和制備也如前述實施。原代體細胞是使用標準的基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染方案，用感興趣基因轉(zhuǎn)染的動物組織得到的分化的非生殖細胞。測試轉(zhuǎn)染細胞，如Baguisi等1999所述培養(yǎng)和制備轉(zhuǎn)基因陽性細胞用作核轉(zhuǎn)移的供體細胞。也應該記住可以用DNA染料Hoechst 33342或使核酸可見的其它熒光敏感成分對卵母細胞染色或不染色來實施去核和重建步驟。然而優(yōu)選使用大約0.1-5.0μg/ml Hoechst 33342來著色中期板上的遺傳物質(zhì)。
山羊用于本研究的一群純育的和混合繁殖的無瘙癢病的Alpine、Saanen和Toggenburg奶山羊按Good Agricultural Practice(GAP)指南維持。
山羊胎兒體細胞系的分離待用作細胞核供體的原代山羊胎兒成纖維細胞細胞系得自用轉(zhuǎn)基因雄性動物的新鮮收集精子人工受精2只非轉(zhuǎn)基因雌性動物產(chǎn)生的35和40天胎兒。手術(shù)取出胎兒并放置于平衡磷酸緩沖鹽水(PBS，無ca++/Mg++)中。切碎在0.025％胰蛋白酶，0.5mM EDTA，38℃中的胎兒組織10分鐘制備單一細胞懸液。用胎兒細胞培養(yǎng)基[補充核苷、0.1mM2-巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素/鏈霉素(10,000I.U.每種/毫升)的含10％胎牛血清(FBS)的平衡培養(yǎng)基-199(M199，Gibco)]洗滌細胞，并培養(yǎng)在25cm2的瓶中。培養(yǎng)4天后通過胰蛋白酶作用收集原代胎兒細胞的匯合單層，接著維持在培養(yǎng)中或冷凍保存。
供體細胞系的性別區(qū)分和基因分型從胎兒組織分離基因組DNA，并用聚合酶鏈式反應(PCR)分析靶信號序列，以及區(qū)分性別有用的序列的存在。通過擴增367bp的序列檢測靶轉(zhuǎn)基因序列。使用zfX/zfY引物對和Sac I限制性酶消化擴增片段來實施性別區(qū)分。
用于胚胎重建的供體細胞的制備轉(zhuǎn)基因雌性動物系(CFF6)用于所有核轉(zhuǎn)移程序。胎兒體細胞接種在含胎兒細胞培養(yǎng)基的4孔板上并維持在培養(yǎng)中(5％CO2，39℃)。48小時后，培養(yǎng)基用新鮮的低血清(0.5％FBS)胎兒細胞培養(yǎng)基替換。接下來的7天，每48至72小時用低血清胎兒細胞培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。第一次添加低血清培養(yǎng)基后第7天，胰蛋白酶作用收集體細胞(待用作細胞核供體)。與去核卵母細胞融合前1-3小時，細胞重新懸于補充2mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/鏈霉素(10,000I.U.每種/毫升)的含10％FBS的平衡M199中。
卵母細胞收集如前所述(Gavin W.G.，1996)進行卵母細胞供體雌性動物的同步和超排卵，并以48小時間隔與切除輸精管的雄性動物交配。收集后，卵母細胞培養(yǎng)在補充2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素/鏈霉素(10,000I.U.每種/毫升)的含10％FBS的平衡M199中。
胞質(zhì)體制備和去核丟棄含附加丘細胞的卵母細胞。無丘細胞的卵母細胞分為兩組停滯的中期-II(一個極體)和分裂末期-II方案(無清晰可見的極體或存在部分擠壓的第二極體)。首先對停滯的中期-II方案中的卵母細胞去核。通過在M199/10％FBS中培養(yǎng)2至4小時制備分配到活化的分裂末期-II方案中的卵母細胞。這個時期后，所有活化卵母細胞(存在部分擠壓第二極體)分組為培養(yǎng)誘導的、鈣活化的分裂末期-II的卵母細胞(分裂末期-II-Ca)并去核。培養(yǎng)期間沒有活化的卵母細胞隨后在含7％乙醇，10％FBS的M199中培養(yǎng)5分鐘誘導活化和接著在含10％FBS的M199中培養(yǎng)另外3小時到達分裂末期-II(分裂末期-II-EtOH方案)。
去核前15至30分鐘，所有卵母細胞用細胞松弛素-B(Sigma，在含10％FBS的M199中5μg/ml)處理。用25至30μm玻璃吸管通過抽吸第一極體和極體周圍環(huán)繞的相鄰細胞質(zhì)(～30％細胞質(zhì))以除去中期板，除去中期-II期卵母細胞的核。通過除去第一極體和含有部分擠壓第二極體的環(huán)繞細胞質(zhì)(10-30％細胞質(zhì))來除去分裂末期-II-Ca和分裂末期-II-EtOH卵母細胞的核。去核后，立即重建所有卵母細胞。
核轉(zhuǎn)移和重建在與卵母細胞去核中使用的相同培養(yǎng)基中進行供體細胞注射。使用玻璃吸管將一個供體細胞放置于透明帶和卵質(zhì)膜之間。電融合和活化程序前，細胞-卵母細胞偶聯(lián)體在M199中培養(yǎng)30至60分鐘。重建的卵母細胞在融合緩沖液(300mM甘露醇，0.05mM CaCl2，0.1mM MgSO4，1mM K2HPO4，0.1mM谷胱苷肽，0.1mg/ml BSA)中平衡2分鐘。室溫，在含2個制成“融合玻片”(500μm間隙；BTX-Genetronics，San Diego，CA)的不銹鋼鋼電極，充滿融合介質(zhì)的融合室中進行電融合和活化。
使用融合玻片實施融合。融合玻片置于融合皿里面，皿中充滿足夠量的融合緩沖液覆蓋融合玻片的電極。從培養(yǎng)溫箱這取出偶聯(lián)體并通過融合緩沖液洗滌。使用立體顯微鏡，電極間等距放置偶聯(lián)體，細胞核/胞質(zhì)體連接處與電極平行。應該注意應用給偶聯(lián)體促進活化和融合的電壓范圍可以從1.0kV/cm至10.0kV/cm。然而優(yōu)選初次單一同時融合和活化電脈沖具有2.0至3.0kV/cm的電壓范圍，最優(yōu)選在2.5kV/cm，優(yōu)選至少20μ秒的持續(xù)時間。使用BTX ECM 2001電子細胞操作儀(Electrocell Manipulator)將此脈沖應用給細胞偶聯(lián)體。微脈沖的持續(xù)時間可以從10至80μ秒變化。此過程之后，處理的偶聯(lián)體典型地轉(zhuǎn)移到一滴新鮮融合緩沖液中。通過平衡SOF/FBS洗滌融合處理的偶聯(lián)體，接著轉(zhuǎn)移到含或不含細胞松弛素-B的平衡SOF/FBS中。如果使用細胞松弛素-B，其濃度可以從1至15μg/ml變化，最優(yōu)選5μg/ml。偶聯(lián)體在含大約5％CO2的空氣的潮濕氣室37-39℃中培養(yǎng)。應該注意本文公開內(nèi)容中提供的任何方案中，細胞松弛素-B可以使用甘露醇替代(基于HEPES緩沖的甘露醇(0.3mm)的含Ca+2和BSA的培養(yǎng)基)。
融合后10至90分鐘開始，最優(yōu)選在融合后30分鐘開始，確定真實細胞核/胞質(zhì)體融合的存在。為了本發(fā)明的目的，融合的偶聯(lián)體可以接受另外活化處理(雙脈沖)。這個另外脈沖在電壓強度方面可以從0.1至5.0kV/cm變化，時間范圍10至80μ秒。然而優(yōu)選地，融合偶聯(lián)體將接受0.4或2.0kV/cm的另外單一電脈沖(雙脈沖)20μ秒。另外脈沖的給予可以在首次脈沖后至少15分鐘小時開始，然而最優(yōu)選，在初次融合和活化處理后30分鐘至2小時開始這次另外脈沖以促進額外活化。在其它實施方案中，用單一電脈沖再次融合未融合的偶聯(lián)體。這次另外脈沖的電壓范圍和時間可從1.0kV/cm至5.0kV/cm至少10μ秒變化，發(fā)生在初次融合脈沖后至少15分鐘。然而更優(yōu)選地，這次另外脈沖是2.2kV/cm至3.2kV/cm，至少20μ秒，在初次融合和活化處理后30分鐘至1小時開始以促進融合。所有融合的和融合處理的偶聯(lián)體返回SOF/FBS加5μg/ml細胞松弛素-B。偶聯(lián)體在含大約5％CO2的空氣的潮濕氣室中37-39℃培養(yǎng)至少20分鐘，優(yōu)選30分鐘。
本發(fā)明方法的另一版本對于細胞偶聯(lián)體提供了另外的單一電脈沖(雙脈沖)，優(yōu)選2.0kV/cm，至少20μ秒，在初次融合和活化處理后至少15分鐘，優(yōu)選30分鐘至1小時開始，以促進額外的活化。這次另外活化脈沖的電壓范圍可以從1.0至6.0kV/cm變化。
可供選擇地，在后面的工作中，剩余融合的偶聯(lián)體隨后接受至少三次另外單一電脈沖(四脈沖)，最優(yōu)選2.0kV/cm，至少20μ秒，間隔15至30分鐘，在初次融合和活化處理后至少30分鐘開始，以促進另外的活化。然而，應該注意在這個另外方案中，該另外活化脈沖的電壓范圍可以從1.0至6.0kV/cm變化，持續(xù)時間可以從10μ秒至60μ秒變化，在初次融合處理后可以短至15分鐘，或長至4小時開始。在隨后實驗中，用2.6至3.2kV/cm，至少20μ秒，在初次融合和活化處理后1小時開始的單一電脈沖再次融合未融合的偶聯(lián)體以促進融合。所有融合的和融合處理的偶聯(lián)體返回含或不含細胞松弛素-B的平衡SOF/FBS。如果使用細胞松弛素-B，其濃度可以從1至15μg/ml變化，最優(yōu)選5μg/ml。偶聯(lián)體在包含含大約5％CO2的空氣的潮濕氣室37-39℃中培養(yǎng)至少30分鐘?？梢允褂酶事洞继鎿Q細胞松弛素-B。
再次融合后30分鐘開始，確定細胞核/胞質(zhì)體再次融合的成功。用平衡SOF/FBS洗滌融合處理的偶聯(lián)體，接著轉(zhuǎn)移到加5μg/ml放線菌酮的平衡SOF/FBS中。偶聯(lián)體在含大約5％CO2的空氣的潮濕氣室37-39℃中培養(yǎng)最多4小時。
放線菌酮處理后，用補充至少0.1％牛血清白蛋白，優(yōu)選至少0.7％，優(yōu)選0.8％，加100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的平衡SOF培養(yǎng)基(SOF/BSA)充分洗滌偶聯(lián)體。偶聯(lián)體轉(zhuǎn)移到平衡SOF/BSA中，在含大約6％O2，5％CO2，余量為氮的潮濕組合孵育室中37-39℃靜置培養(yǎng)24-48小時。適當發(fā)育(在24至48小時，1細胞到8細胞)年齡的核轉(zhuǎn)移胚胎轉(zhuǎn)移給同步化代理受體。
核轉(zhuǎn)移胚胎培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移給受體所有核轉(zhuǎn)移胚胎在原代山羊輸卵管上皮細胞的單層上，在覆蓋礦物油的含10％FBS的50μl小滴M199中共培養(yǎng)。轉(zhuǎn)移給受體雌性動物之前，胚胎培養(yǎng)物在含5％CO2潮濕39℃溫箱中維持48小時。如前所述實施受體的胚胎轉(zhuǎn)移22。
妊娠和圍產(chǎn)期護理對于山羊，持續(xù)動情期第一天后的第25天開始，超聲波檢查法確定妊娠。每周估計雌性動物直到受孕75天，和其后每月一次估計胎兒活力。對于持續(xù)超過152天的妊娠，用5mg PGF2α(Lutalyse，Upjohn)促進分娩。處理后24小時內(nèi)發(fā)生分娩。出生后立即從母畜移開小山羊，并在分娩后1小時內(nèi)接受熱處理的初乳。
克隆動物的基因分型出生后不久，從克隆的雌性動物(如山羊)和代孕雌親獲得血液樣品和耳朵皮膚活檢組織進行基因組DNA分離。使用特定轉(zhuǎn)基因靶蛋白的引物，通過PCR首先分析每個樣品，接著用那個特定靶蛋白的cDNA，進行Southern印跡分析。對于每個樣品，用EcoRI(New England Biolabs，Beverly，MA)消化5μg基因組DNA，在0.7％瓊脂糖凝膠(SeaKem，ME)中電泳并在本領(lǐng)域已知標準步驟后用毛細管轉(zhuǎn)移固定到尼龍膜(MagnaGraph，MSI，Westboro，MA)上。用α-32P dCTP標記的1.5kb XhoI至Sal I hAT cDNA片段，使用Prime-It試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA)探測膜。在65℃雜交過夜。用0.2 X SSC，0.1％SDS洗滌印跡和用X-OMATTMAR膠片曝光48小時。
奶蛋白分析對于幼年雌性轉(zhuǎn)基因動物，在兩月齡時實施泌乳的激素誘導。對動物手工擠奶，每天一次，收集奶樣品進行hAT表達分析。如所述(Edmunds，T.等，1998)實施Western印跡和rhAT活性分析。
在本發(fā)明的開發(fā)過程中實施的實驗中，在去核和重建之后，細胞核/胞質(zhì)體偶聯(lián)體在補充了1％至15％胎牛血清，優(yōu)選10％FBS，加100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的平衡合成輸卵管液培養(yǎng)基(SOF/FBS)中培養(yǎng)。融合前至少30分鐘，偶聯(lián)體在具有含大約5％CO2的空氣的潮濕氣室中37-39℃培養(yǎng)。
結(jié)果如表1總結(jié)的，在實驗中，嘗試了初次單一同時融合和活化脈沖的1646個偶聯(lián)體中，114個偶聯(lián)體裂解，720個偶聯(lián)體(43.7％)融合。在該720個融合偶聯(lián)體中，364個融合的偶聯(lián)體接受雙脈沖，13個偶聯(lián)體裂解和培養(yǎng)351個雙脈沖的偶聯(lián)體。初次融合嘗試得到的沒有融合的共812個偶聯(lián)體被再次融合。由這些再次融合嘗試，54個偶聯(lián)體裂解，346個偶聯(lián)體(42.6％)融合。初次融合和再次融合的總體融合率是嘗試融合的1646個偶聯(lián)體中1066個偶聯(lián)體(64.8％)融合。
表1.核轉(zhuǎn)移融合分析
表2總結(jié)了接受基于融合和活化類型的核轉(zhuǎn)移胚胎的代孕受體雌性動物足月妊娠的結(jié)果。在這些實驗中，4個接受了再次融合的偶聯(lián)體產(chǎn)生的胚胎的受體雌性動物(6.1％)發(fā)生足月妊娠，而1個接受雙脈沖偶聯(lián)體產(chǎn)生的胚胎的受體雌性動物(2.7％)發(fā)生足月妊娠。可供選擇地，在實驗動物中沒有一只接受單一脈沖偶聯(lián)體產(chǎn)生的胚胎的雌性動物發(fā)生足月妊娠。
表2.核轉(zhuǎn)移妊娠分析
表3總結(jié)了基于融合和活化類型產(chǎn)生的后代的結(jié)果。在實驗中，再次融合產(chǎn)生的346個融合陽性偶聯(lián)體產(chǎn)生了4個后代(1.2％)，而雙脈沖活化方法產(chǎn)生的351個融合陽性偶聯(lián)體產(chǎn)生了1個后代(0.3％)?？晒┻x擇地，同時融合和活化產(chǎn)生的353個融合陽性偶聯(lián)體沒有產(chǎn)生后代。
表3.核轉(zhuǎn)移融合和活化后代分析
表4總結(jié)了轉(zhuǎn)基因founder動物發(fā)育的產(chǎn)出成果的結(jié)果，在這組實驗中，產(chǎn)生的動物是山羊。然而，這里提供的技術(shù)在其它哺乳動物物種中也有效。這個數(shù)據(jù)表示了2001年5月至6月的時期。盡管這個表詳述了產(chǎn)出成果，但是最相關(guān)的方面是成功融合的重建偶聯(lián)體的數(shù)量和轉(zhuǎn)移給受體雌性動物的發(fā)育胚胎的所得數(shù)量。體細胞核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的共902個胚胎移植給138個代孕受體雌性動物，五個受體雌性動物(3.6％)發(fā)生足月妊娠產(chǎn)生了5個健康后代。
表4.核轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)2000/2001季(4月30日-6月22日，2001年)#供體 178#排卵/供體 18.1(共3213排卵)#卵/供體 11.2(共1998卵)#去核 1951(97.6％回收卵母細胞)#重建 1784(91.4％去核卵母細胞)#嘗試融合的偶聯(lián)體 1646(92.3％重建卵母細胞)#融合的偶聯(lián)體 1066(64.8％嘗試融合)#卵裂 536(50.3％融合的偶聯(lián)體)#受體 138(共轉(zhuǎn)移902)#胚胎/受體 6.5(范圍1-24)#妊娠 5/138(3.6％)
#后代 5基于這些實驗的結(jié)果，在隨后實驗中，未將融合的單一脈沖偶聯(lián)體轉(zhuǎn)移給受體雌性動物。換句話說，所有融合的偶聯(lián)體都進行雙和四脈沖處理。此外，在所有隨后實驗中，實施未融合偶聯(lián)體的再次融合。如表5總結(jié)的，在隨后實驗中，在嘗試初次單一同時融合和活化脈沖的2599個偶聯(lián)體中，85個偶聯(lián)體裂解，1404個偶聯(lián)體融合(54.0％)。在1404個融合偶聯(lián)體中，825個融合偶聯(lián)體接受了雙脈沖，22個偶聯(lián)體裂解，培養(yǎng)803個雙脈沖偶聯(lián)體。剩余的融合偶聯(lián)體中，579個融合偶聯(lián)體接受四脈沖，57個偶聯(lián)體裂解和培養(yǎng)522個四脈沖偶聯(lián)體。初次融合嘗試沒有融合的共1110個偶聯(lián)體再次融合。由這些再次融合嘗試，33個偶聯(lián)體裂解和672個偶聯(lián)體融合(60.5％)。初次融合和再次融合的整體融合比率是嘗試融合的2599個偶聯(lián)體中2076個偶聯(lián)體融合(79.9％)。
表5.核轉(zhuǎn)移融合分析
表6總結(jié)了接受基于融合和活化類型的核轉(zhuǎn)移胚胎的代孕受體雌性動物在第55天的超聲結(jié)果。在這些實驗中，7個接受雙脈沖偶聯(lián)體產(chǎn)生的胚胎的受體雌性動物(13.2％)在受孕55天妊娠?？晒┻x擇地，4個接受四脈沖偶聯(lián)體產(chǎn)生的胚胎的受體雌性動物(8.5％)和4個接受再次融合偶聯(lián)體產(chǎn)生的胚胎的受體雌性動物(4.6％)在受孕第55天妊娠。
表6.核轉(zhuǎn)移妊娠分析
<p> 表63對應于表56的多聚核苷酸陣列數(shù)據(jù) 表64對應于表62和63的FACs數(shù)據(jù) 盡管本發(fā)明已經(jīng)通過引用優(yōu)選的實施方案被描述，但是應該理解，可以在不脫離本發(fā)明的精神的情況下作出各種改變。因此，本發(fā)明僅受權(quán)利要求的限制。
#排出和吸出的卵 3188#去核 3001(94％回收卵母細胞)#重建 2798(93％去核卵母細胞)#嘗試融合的偶聯(lián)體 2599(93％重建卵母細胞)#融合的偶聯(lián)體 2076(80％嘗試融合)#卵裂 765(40％融合的偶聯(lián)體)(在大約48小時是57％)#轉(zhuǎn)移的核轉(zhuǎn)移胚胎 1562#受體 262#胚胎/受體 6.0(范圍1-1 4)#妊娠 15/188(8.0％)#后代 NA通過提供活化和融合轉(zhuǎn)基因胚胎的額外產(chǎn)生，本發(fā)明允許增加轉(zhuǎn)基因程序的效率。這些胚胎可以植入代孕動物或可以克隆繁殖和保存或利用。通過核轉(zhuǎn)移與體外修飾或選擇這些細胞的能力組合，這個程序比以前的轉(zhuǎn)基因胚胎技術(shù)更有效。根據(jù)本發(fā)明，這些轉(zhuǎn)基因克隆胚胎可以用于產(chǎn)生CICM細胞系或其它胚胎細胞系。因此，本發(fā)明消除了得到和體外維持有助于基因工程技術(shù)的未分化細胞系的需要。
因此，在一個方面，本發(fā)明提供了克隆哺乳動物的方法。通常，哺乳動物可以用核轉(zhuǎn)移方法制備，所述方法包括下列步驟(i)獲得待用作供體核來源的期望的分化哺乳動物細胞；(ii)從與供體核來源細胞相同的物種的哺乳動物獲得卵母細胞；(iii)將所述卵母細胞去核；(iv)將期望的分化細胞或細胞核轉(zhuǎn)移給去核的卵母細胞；(v)同時融合和活化該細胞偶聯(lián)體，形成第一轉(zhuǎn)基因胚胎；(vi)通過提供至少一個另外的活化方案包括另外的電休克來活化沒有融合產(chǎn)生第一轉(zhuǎn)基因胚胎，但在初次電休克后被活化的細胞-偶聯(lián)體，形成第二轉(zhuǎn)基因胚胎；(vii)培養(yǎng)所述的活化的第一和/或第二轉(zhuǎn)基因胚胎直到超過2細胞發(fā)育期；和(viii)將所述第一和/或第二轉(zhuǎn)基因胚胎轉(zhuǎn)移給宿主哺乳動物，使得該胚胎發(fā)育為胎兒。
本發(fā)明也包括克隆基因工程或轉(zhuǎn)基因哺乳動物的方法，其中分化的哺乳動物細胞或細胞核插入去核卵母細胞之前，分化的哺乳動物細胞或細胞核中被插入、除去或修飾期望的基因。
本發(fā)明也提供了根據(jù)上面的方法獲得的哺乳動物，和那些哺乳動物的后代。本發(fā)明優(yōu)選用于克隆山羊。本發(fā)明進一步提供了核轉(zhuǎn)移胎兒和核轉(zhuǎn)移和嵌合后代在細胞、組織和器官移植領(lǐng)域中的用途。
在另一個方面，本發(fā)明提供了制備CICM細胞的方法。該方法包括(i)獲得待用作供體核來源的期望的分化哺乳動物細胞；(ii)從與供體核來源細胞相同的物種的哺乳動物獲得卵母細胞；(iii)將所述卵母細胞去核；(iv)將期望的分化細胞或細胞核轉(zhuǎn)移給去核的卵母細胞；(v)同時融合和活化細胞偶聯(lián)體，形成第一轉(zhuǎn)基因胚胎；(vi)通過提供至少一個另外的活化方案包括另外的電休克來活化沒有融合產(chǎn)生第一轉(zhuǎn)基因胚胎，但在初次電休克后被活化的細胞-偶聯(lián)體，形成第二轉(zhuǎn)基因胚胎；(vii)培養(yǎng)所述的活化的第一和/或第二轉(zhuǎn)基因胚胎直到超過2細胞發(fā)育期；和(viii)培養(yǎng)從所述培養(yǎng)的活化胚胎獲得的細胞，得到CICM細胞。
這里所述方法得到的CICM細胞也有利地用于細胞、組織和器官移植領(lǐng)域，或制備胎兒或后代，包括轉(zhuǎn)基因胎兒或后代。分化的哺乳動物細胞是經(jīng)過了早期胚胎階段的那些細胞。分化的細胞可以得自外胚層、中胚層或內(nèi)胚層組織或細胞層。
也可以使用可供選擇的方法，其中細胞偶聯(lián)體可接受多次電休克來增強融合和活化。通常，通過核轉(zhuǎn)移方法產(chǎn)生哺乳動物，所述方法包括下列步驟(i)獲得待用作供體核來源的期望的分化哺乳動物細胞；
(ii)從與供體核來源細胞相同的物種的哺乳動物獲得卵母細胞；(iii)將所述卵母細胞去核；(iv)將期望的分化細胞或細胞核轉(zhuǎn)移至去核的卵母細胞中；(v)對細胞-偶聯(lián)體采用至少兩次電休克，啟動所述細胞-偶聯(lián)體的融合和活化成為活化和融合的胚胎。
(vii)培養(yǎng)所述的活化和融合的胚胎直到超過2細胞發(fā)育期；和(viii)將所述的第一和/或第二轉(zhuǎn)基因胚胎轉(zhuǎn)移至宿主哺乳動物，使得該胚胎發(fā)育為胎兒；其中，所述至少兩次電休克的第二次在初次電休克之后至少15分鐘給予。
哺乳動物細胞，包括人細胞，可以用熟知方法獲得。例如，本發(fā)明中有用的哺乳動物細胞包括上皮細胞、神經(jīng)細胞、表皮細胞、角質(zhì)細胞、造血細胞、黑素細胞、軟骨細胞、淋巴細胞(B和T淋巴細胞)、紅細胞、巨噬細胞、單核細胞、單個核細胞、成纖維細胞、心肌細胞和其它肌細胞等。此外，用于核轉(zhuǎn)移的哺乳動物細胞可以從不同器官獲得，如皮膚、肺臟、胰腺、肝臟、胃、腸、心臟、生殖器官、膀胱、腎臟、尿道和其它泌尿器官等。這些僅僅是合適供體細胞的實例。合適的供體細胞，即本主題發(fā)明中有用的細胞可以從肌體的任何細胞或器官獲得。這包括所有體細胞或生殖細胞。
成纖維細胞是理想的細胞類型，因為它們可從發(fā)育的胎兒和成年動物大量獲得。成纖維細胞是多少分化的，因此，以前認為是用于克隆程序的不良細胞類型。重要的是，這些細胞容易在體外繁殖，倍增時間快，并可以克隆繁殖用于基因打靶步驟。再者本發(fā)明是新的，因為使用分化的細胞類型。本發(fā)明是有利的，因為這些細胞容易繁殖，遺傳修飾和體外選擇。
合適的卵母細胞來源的哺乳動物包括山羊、綿羊、母牛、豬、兔子、豚鼠、小鼠、倉鼠、大鼠、靈長目等。優(yōu)選，該卵母細胞從山羊和有蹄類動物獲得，最優(yōu)選山羊。分離卵母細胞的方法是本領(lǐng)域熟知的?；旧希@將包括從哺乳動物如山羊的卵巢或生殖道分離卵母細胞。山羊卵母細胞容易獲得的來源是來自激素誘導的雌性動物。
為了技術(shù)如基因工程、核轉(zhuǎn)移和克隆的成功使用，在這些細胞可以用作受體細胞進行核轉(zhuǎn)移之前，和它們可以被精子受精發(fā)育為胚胎之前，優(yōu)選卵母細胞可在體內(nèi)成熟。已經(jīng)在體內(nèi)成熟的中期II期卵母細胞已經(jīng)成功用于核轉(zhuǎn)移技術(shù)。基本上，動情發(fā)作過去或注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)或類似激素過去幾個小時，通過手術(shù)從非超排卵或超排卵的動物收集成熟的中期II卵母細胞。
此外，應該注意通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)修飾動物基因組的能力提供了制備重組蛋白的新的可供選擇技術(shù)。轉(zhuǎn)基因畜牧動物的奶中人重組藥物的產(chǎn)生解決了與微生物生物反應器(如缺乏翻譯后修飾、不正確的蛋白折疊、高純化費用)或動物細胞生物反應器(如資本費用高、昂貴培養(yǎng)基、產(chǎn)量低)相關(guān)的很多問題。
已報道了去核和核轉(zhuǎn)移時卵母細胞的成熟階段對核轉(zhuǎn)移方法的成功很重要(First和Prather 1991)。通常，成功的哺乳動物胚胎克隆實踐使用中期II期卵母細胞作為受體卵母細胞，因為在這個時期據(jù)信該卵母細胞可以被或足以被“活化”從而如同它對受精精子一樣處理導入的核。對于家畜，特別是山羊，卵母細胞活化期通常發(fā)生在精子接觸和穿透進入卵母細胞質(zhì)膜的時間。
固定時間的成熟期(范圍從大約10至40小時，優(yōu)選大約16-18小時)之后，將卵母細胞去核。去核前，優(yōu)選取出卵母細胞并在除去丘細胞前，放置于含1毫克每毫升透明質(zhì)酸酶的RMCARE培養(yǎng)基中。這可通過很細小孔的吸移管重復吸吹或通過簡單渦旋實行。剝脫的卵母細胞接著篩選極體，并選擇中期II卵母細胞，如極體的存在所確定的，然后用于核轉(zhuǎn)移。去核如下。
可以用已知方法實行去核，如美國專利4,994,384所述，它引入這里作為參考。例如，中期II期卵母細胞放置于EMCARE培養(yǎng)基中，優(yōu)選含7.5微克每毫升細胞松弛素B，用于立即去核，或可放置于合適的培養(yǎng)基中，例如胚胎培養(yǎng)基如CR1aa，加10％FBS，接著之后去核，優(yōu)選不超過24小時后，和更優(yōu)選16-18小時后去核。
可以用顯微手術(shù)使用微量吸管除去極體和相鄰細胞質(zhì)完成去核。接著可篩選該卵母細胞鑒定其中已成功去核的那些。這個篩選可以通過用1微克每毫升33342 Hoechst染料在EMCARE或SOF中對卵母細胞染色，接著在紫外線照射下觀察卵母細胞少于10秒來實行。已成功去核的卵母細胞接著可放置于合適的培養(yǎng)基中。
在本發(fā)明中，受體卵母細胞將優(yōu)選是在體外或體內(nèi)成熟開始后大約10小時至大約40小時去核，更優(yōu)選在體外或體內(nèi)成熟開始后大約16小時至大約24小時，最優(yōu)選在體外或體內(nèi)成熟開始后大約16-18小時時去核。
接著，與去核卵母細胞相同物種的單一哺乳動物細胞轉(zhuǎn)移至用于產(chǎn)生活化胚胎的去核卵母細胞的卵周隙中。哺乳動物細胞和去核卵母細胞將用于根據(jù)本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生活化胚胎。例如，可以通過電融合來融合細胞。通過提供足以引起質(zhì)膜瞬間打破的電脈沖來完成電融合。這種質(zhì)膜的打破非常短，因為膜迅速重新形成。因此，如果誘導兩相鄰膜打破和重新形成時脂雙層混合，在這兩個細胞之間將開放小的通道。由于這種小開口的熱力學不穩(wěn)定性，它擴大直到兩個細胞變成一個。Prather等的美國專利4,997,384提供了這個方法更多討論(其全部內(nèi)容引入這里作為參考)?？梢允褂酶鞣N電融合介質(zhì)包括如蔗糖、甘露醇、山梨醇和磷酸鹽緩沖溶液。也可以使用仙臺病毒作為融合劑來完成融合(Ponimaskin等，2000)。
而且，在有些情況下(如小供體核)，優(yōu)選將核直接注射給卵母細胞而不是使用電穿孔融合。Collas和Barnes，Mol.Reprod.Dev.，38264-267(1994)中公開了這種技術(shù)，其全部內(nèi)容引入這里作為參考。
可以用已知技術(shù)活化活化胚胎。這種方法包括如在亞生理溫度下培養(yǎng)活化胚胎，基本上是通過給活化胚胎應用寒冷，或?qū)嶋H上涼的溫度休克來進行。這可以通過在室溫培養(yǎng)活化胚胎來最方便地進行，該室溫相對于胚胎正常暴露的生理溫度條件是寒冷的。
可供選擇地，可以應用已知活化劑完成活化。例如，已經(jīng)表明受精過程中精子穿透卵母細胞活化灌注卵母細胞而產(chǎn)生更多數(shù)量的成活妊娠和核轉(zhuǎn)移后的多個遺傳學相同的小牛。而且，可以使用如電和化學休克等處理在融合后活化NT胚胎。合適的卵母細胞活化方法是Susko-Parrish等的美國專利5,496,720的主題，其全部內(nèi)容引入這里作為參考。
另外，最好同時實行活化，盡管確實存在隨后活化的方案。在活化方面，發(fā)生下列細胞事件(i)增加卵母細胞中二價陽離子的水平，和(ii)降低卵母細胞中細胞蛋白的磷酸化。
上面的事件可以通過將二價陽離子如鎂、鍶、鋇或鈣，如以離子載體的形式導入卵母細胞的細胞質(zhì)而外源性地刺激發(fā)生。增加二價陽離子水平的其它方法包括使用電休克，用乙醇處理和用籠形螯合劑(cagedchelators)處理?？梢杂靡阎椒ń档土姿峄?，如添加激酶抑制劑，如絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑，如6-二甲基-氨基嘌呤，星形孢菌素，2-氨基嘌呤和鞘氨醇?？晒┻x擇地，通過將磷酸酶，如磷酸酶2A和磷酸酶2B導入卵母細胞可以抑制細胞蛋白的磷酸化。
因此，應該理解本發(fā)明這里提供的增加活化和融合的“重建胚胎”的可利用性的實施方案僅僅是舉例說明本發(fā)明原理的應用。由前述說明書明顯可知這里公開的重建胚胎用于SCNT的改善用途的方法的各種形式、使用方法和各種成分的應用方面的變化是新的，并且可以被修改和/或采用而不背離本發(fā)明的精神，或所附權(quán)利要求的范圍。
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權(quán)利要求
1.一種通過核轉(zhuǎn)移方法克隆非人哺乳動物的方法，包括(i)獲得待用作供體核來源的目的分化哺乳動物細胞；(ii)從與供體核來源細胞相同的物種的哺乳動物獲得至少一個卵母細胞；(iii)將所述至少一個卵母細胞去核；(iv)將目的分化細胞或細胞核轉(zhuǎn)移至去核的卵母細胞中；(v)同時融合和活化細胞偶聯(lián)體，形成第一轉(zhuǎn)基因胚胎；(vi)通過提供至少一個另外的活化方案，包括另外的電休克，來活化沒有融合產(chǎn)生第一轉(zhuǎn)基因胚胎，但在初次電休克后被活化的細胞-偶聯(lián)體，形成第二轉(zhuǎn)基因胚胎；(vii)培養(yǎng)所述的活化的第一和/或第二轉(zhuǎn)基因胚胎直到超過2細胞發(fā)育階段；和(viii)將所述第一和/或第二轉(zhuǎn)基因胚胎轉(zhuǎn)移至宿主哺乳動物中，使得該胚胎發(fā)育為胎兒。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自中胚層。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自內(nèi)胚層。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自外胚層。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自胎兒體細胞組織。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自胎兒體細胞。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自成纖維細胞。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自有蹄類動物。
9.權(quán)利要求1或8的方法，其中所述供體細胞或供體細胞核來自選自牛、羊、豬、馬、山羊和水牛的有蹄類動物。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自成年非人哺乳動物體細胞。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞選自組上皮細胞、神經(jīng)細胞、表皮細胞、角質(zhì)細胞、造血細胞、黑素細胞、軟骨細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、紅細胞、巨噬細胞、單核細胞、成纖維細胞和肌細胞。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自選自皮膚、肺臟、胰腺、肝臟、胃、腸、心臟、生殖器官、膀胱、腎臟和尿道的器官。
13.權(quán)利要求1的方法，其中在去核前，所述的至少一個卵母細胞在體內(nèi)成熟。
14.權(quán)利要求1的方法，其中在去核前，所述的至少一個卵母細胞在體外成熟。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述的非人哺乳動物是嚙齒類動物。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞是非靜止體細胞或分離自所述非靜止體細胞的核。
17.權(quán)利要求1或8的方法，其中胎兒發(fā)育為后代。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述的至少一個卵母細胞在體外成熟開始后大約10至60小時被去核。
19.權(quán)利要求1的方法，其中在所述分化哺乳動物細胞或細胞核插入所述去核卵母細胞前，在所述分化哺乳動物細胞或細胞核中插入、除去或修飾目的基因。
20.權(quán)利要求1或19的方法產(chǎn)生的后代。
21.權(quán)利要求19的產(chǎn)生后代，進一步包括其中由所述核轉(zhuǎn)移程序產(chǎn)生的后代是嵌合的。
22.權(quán)利要求1的方法，其中在克隆方案中使用細胞松弛素-B。
23.權(quán)利要求1的方法，其中在克隆方案中不使用細胞松弛素-B。
24.一種制備培養(yǎng)的內(nèi)細胞團細胞的方法，包括(i)獲得待用作供體核來源的目的分化哺乳動物細胞；(ii)從與供體核來源細胞相同的物種的哺乳動物獲得至少一個卵母細胞；(iii)將所述至少一個卵母細胞去核；(iv)將目的分化細胞或細胞核轉(zhuǎn)移至去核的卵母細胞中；(v)同時融合和活化細胞偶聯(lián)體，形成第一轉(zhuǎn)基因胚胎；(vi)通過提供至少一個另外的活化方案，包括另外的電休克，來活化沒有融合產(chǎn)生第一轉(zhuǎn)基因胚胎、但在初次電休克后被活化的細胞-偶聯(lián)體，形成第二轉(zhuǎn)基因胚胎；和(vii)培養(yǎng)從所述培養(yǎng)的活化胚胎獲得的細胞以得到培養(yǎng)的內(nèi)細胞團細胞。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自中胚層。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自內(nèi)胚層。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自外胚層。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自胎兒體細胞組織。
29.權(quán)利要求24的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自胎兒體細胞。
30.權(quán)利要求24的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自成纖維細胞。
31.權(quán)利要求24的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自有蹄類動物。
32.權(quán)利要求24或31的方法，其中所述供體細胞或供體細胞核來自選自牛、羊、豬、馬、山羊和水牛的有蹄類動物。
33.權(quán)利要求24的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自成年哺乳動物體細胞。
34.權(quán)利要求24的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞選自上皮細胞、神經(jīng)細胞、表皮細胞、角質(zhì)細胞、造血細胞、黑素細胞、軟骨細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、紅細胞、巨噬細胞、單核細胞、成纖維細胞和肌細胞。
35.權(quán)利要求24的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞來自選自皮膚、肺臟、胰腺、肝臟、胃、腸、心臟、生殖器官、膀胱、腎臟和尿道的器官。
36.權(quán)利要求24的方法，其中在去核前，所述的至少一個卵母細胞在體內(nèi)成熟。
37.權(quán)利要求24的方法，其中在去核前，所述的至少一個卵母細胞在體外成熟。
38.權(quán)利要求24的方法，其中所述哺乳動物細胞來自嚙齒類動物。
39.權(quán)利要求24的方法，其中所述待用作供體核或供體細胞核來源的供體分化哺乳動物細胞是非靜止體細胞或分離自所述非靜止體細胞的核。
40.權(quán)利要求24或31的方法，其中任何所述培養(yǎng)的內(nèi)細胞團細胞胎兒發(fā)育為非人后代。
41.權(quán)利要求24的方法，其中所述的至少一個卵母細胞在體外成熟開始后大約10至60小時被去核。
42.權(quán)利要求24的方法，其中在所述分化哺乳動物細胞或細胞核插入所述去核卵母細胞前，在所述分化哺乳動物細胞或細胞核中插入、除去或修飾目的基因。
43.權(quán)利要求24或42的方法產(chǎn)生的后代。
44.權(quán)利要求42的產(chǎn)生后代，進一步包括其中由所述核轉(zhuǎn)移程序產(chǎn)生的任何非人后代是嵌合的。
45.權(quán)利要求24的方法，其中在該方案中使用細胞松弛素-B。
46.權(quán)利要求24的方法，其中在該方案中不使用細胞松弛素-B。
47.權(quán)利要求24的方法，其中在該方案中使用細胞松弛素-B。
48.權(quán)利要求24的方法，其中所述培養(yǎng)的內(nèi)細胞團細胞用于發(fā)育移植用的功能器官。
49.權(quán)利要求24的方法，其中所述培養(yǎng)的內(nèi)細胞團細胞用于器官發(fā)生。
50.一種通過核轉(zhuǎn)移方法克隆非人哺乳動物的方法，包括(i)獲得待用作供體核來源的目的分化哺乳動物細胞；(ii)從與供體核來源細胞相同的物種的哺乳動物獲得至少一個卵母細胞；(iii)將所述卵母細胞去核；(iv)將目的分化細胞或細胞核轉(zhuǎn)移至去核的卵母細胞中；(v)對細胞-偶聯(lián)體采用至少兩次電休克以啟動所述細胞-偶聯(lián)體的融合和活化成為活化和融合的胚胎。(vii)培養(yǎng)所述的活化和融合的胚胎直到超過2細胞發(fā)育階段；(viii)將所述的第一和/或第二轉(zhuǎn)基因胚胎轉(zhuǎn)移至宿主哺乳動物中，使得該胚胎發(fā)育為胎兒；其中所述至少兩次電休克的第二次在初次電休克之后至少1 5分鐘給予；和其中在所述分化哺乳動物細胞或細胞核插入所述去核卵母細胞前，在所述分化哺乳動物細胞或細胞核中插入、除去或修飾目的基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了數(shù)據(jù)證明不成功初次同時電融合和活化事件后，哺乳動物細胞核與去核的體內(nèi)排出的卵母細胞的再次融合，提供了建立用于產(chǎn)生各種非人哺乳動物物種包括山羊、豬、嚙齒動物、靈長目、兔和牛的活后代的活化和融合的能核轉(zhuǎn)移的胚胎的另外的替代方法和改進。另外，多次電脈沖在動物核轉(zhuǎn)移程序中產(chǎn)生有活力后代的同時融合活化方法學提供了替代的和更有效的活化方法。
文檔編號C12N5/10GK1615356SQ03802084
公開日2005年5月11日 申請日期2003年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月11日
發(fā)明者W·G·伽溫, D·米里肯, R·E·巴特勒 申請人:Gtc生物治療學公司