專利名稱：感染病治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對諸如肺結(jié)核等感染病進行治療的感染病治療劑。
背景技術(shù)：
在醫(yī)療保健方面，毫無疑問，感染病治療劑是必不可少的。目前有許多用于感染病的治療劑，諸如抗生素以及合成抗菌素等，并將這些治療劑用于醫(yī)療保健。
但是，目前主要的用作感染病治療劑的抗菌劑實際上具有一個不可避免的問題，即耐藥性細菌的出現(xiàn)。也就是說，持續(xù)著這樣一種嚴(yán)峻的狀態(tài)一旦提供了一種新的抗菌劑，則隨之產(chǎn)生了一種新的耐藥性細菌。
例如，單一感染病中死亡率占第一位的肺結(jié)核最近具有增加的傾向，這已經(jīng)成為一個世界性的問題。此外，已經(jīng)證實了對幾乎所有抗菌素具有抗性的耐藥性細菌的存在，這一問題已經(jīng)被揭露。
近來，已經(jīng)揭示，在自然殺傷細胞(NK細胞)或者細胞毒性T淋巴細胞(CTL)中表達的一種叫做顆粒溶解酶分子具有直接殺傷諸如結(jié)核分支桿菌等細菌的能力[Stenger，S.et al.，Science 282，121-125(1998)]。
顆粒溶解酶首先被制成15K的一個前體，然后在細胞毒性顆粒內(nèi)被加工成9K顆粒溶解酶，已知這種9K的顆粒溶解酶具有抗菌活性(Pena，S.V.et al.，J.Immunol，158，2680-2688(1997))。此外，還報道了一種穿孔素刺穿靶細胞的一條路徑，其中穿孔素為源于同樣的細胞毒性顆粒內(nèi)的分子，顆粒溶解酶通過該路徑進入細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)殺傷感染細菌[Stenger，S.et.al.，Science 282，121-125(1998)]。
因此，認為顆粒溶解酶在防御感染中發(fā)揮了重要的作用。很難想到活性型的9K顆粒溶解酶使細菌獲得耐藥性，可以考慮采用與抗生素具有不同特征的感染病治療劑。此外，最近懷疑9K顆粒溶解酶除去細胞內(nèi)感染細菌的穿孔素路徑的存在(David，H.C.et al.，J.Immunol，167，2734-2742(2001))。并且，已認識劍該分子的細胞毒性(Pena，S.V.etal.，J.Immunol，158，2680-2688(1997))，當(dāng)施用時，恐怕會產(chǎn)生相當(dāng)大的毒副作用。
本發(fā)明要解決的一個問題就是詳細研究顆粒溶解酶，并為使用該顆粒溶解酶作為感染病治療劑提供手段。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決這一問題，本發(fā)明人進行了詳細的研究。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一條新的路徑，在該路徑中，15K顆粒溶解酶被摻入到巨噬細胞中，然后被活化，從而殺傷被吞噬進巨噬細胞中的細菌。
也就是說，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)采用本身沒有細胞毒性的15K顆粒溶解酶作為活性成分可能為感染提供一種有效的治療劑，其幾乎沒有副作用，并且很難使細菌獲得耐藥性。
本發(fā)明提供了一種活性成分為15K顆粒溶解酶的感染病治療劑(下文將稱之為本發(fā)明治療劑)。
再有，在本發(fā)明中，所謂15K顆粒溶解酶是分子量為15,000(15k)的一種蛋白質(zhì)，其含有145個氨基酸，位于上述的細胞毒性顆粒內(nèi)。在細胞毒性顆粒內(nèi)，切下15K顆粒溶解酶的一部分，結(jié)果15K顆粒溶解酶以分子量為9,000(9k)的蛋白質(zhì)的形式存在(Pena，S.V.，et al.，J.Immunol.，158，2680-2688(1997)，Stenger，S.，et al.，Science，282，121-125(1998))。


圖1顯示了15K顆粒溶解酶對結(jié)核桿菌的抗菌作用研究的結(jié)果。
具體實施例方式
下面將對本發(fā)明的實施方案進行描述。
A.本發(fā)明治療劑的活性成分可將從生物體分離的15K顆粒溶解酶作為本發(fā)明治療劑的活性成分，但是由于15K顆粒溶解酶是生物體內(nèi)的痕量成分，因此優(yōu)選使用通過編碼15K顆粒溶解酶的基因表達得到的重組蛋白。此外，還有一種在生物體內(nèi)產(chǎn)生15K顆粒溶解酶的適宜方法，即利用其中插入了編碼15K顆粒溶解酶的基因的15K顆粒溶解酶的體內(nèi)表達載體，從而產(chǎn)生作為活性成分的15K顆粒溶解酶。
①15K顆粒溶解酶的重組蛋白質(zhì)已經(jīng)報導(dǎo)了編碼15K顆粒溶解酶基因的序列(Jongstra，et al.，J.Exp.Med，165，601)，具體地，報導(dǎo)了具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的基因以及具有與之相應(yīng)的氨基酸序列的15K顆粒溶解酶蛋白。據(jù)此，有效制備了編碼15K顆粒溶解酶的基因，通過表達該基因能夠制備15K顆粒溶解酶的重組蛋白質(zhì)。
具體地，利用與編碼15K顆粒溶解酶的基因序列的兩端互補的核苷酸鏈作為擴增引物，通過諸如PCR方法等基因擴增方法來制備編碼15K顆粒溶解酶基因的基因擴增產(chǎn)物。
將其轉(zhuǎn)導(dǎo)至適宜的基因表達載體中，通過將該重組載體轉(zhuǎn)染到諸如大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、以及昆蟲細胞等適宜的宿主內(nèi)，由此而得到所需的15K顆粒溶解酶。
本發(fā)明所用的基因表達載體優(yōu)選采用通常在待表達基因的上游區(qū)域具有啟動子和增強子，并在該基因的下游區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄終止序列的載體。
此外，并不限于只采用直接表達系統(tǒng)來表達15K顆粒溶解酶基因。例如，也可利用β-半乳糖苷酶基因、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因、或者硫氧化還原蛋白基因等融合蛋白表達系統(tǒng)。
對于采用大腸桿菌作為宿主的基因表達載體，有諸如pQE，pGEX，pT7-7，pMAL，pTrxFus，pET，以及pNT26CII等示例。對于采用枯草桿菌作為宿主的載體，有諸如pPL608，pNC3，pSM23，以及pKH80等示例。
此外，對采用酵母作為宿主的載體，有諸如pGT5，pDB248X，pART1，pREP1，YEp13，YRp7以及YCp50等示例。
另外，對采用哺乳動物細胞或者昆蟲細胞作為宿主的載體，有諸如p91023，pCDM8，pcDL-SRα296，pBCMGSNeo，pSV2dhfr，pSVdhfr，pAc373，pAcYM1，pRc/CMV，pREP4以及pcDNAI等示例。
可以根據(jù)15K顆粒溶解酶表達的目的來選擇基因表達載體。例如，當(dāng)表達15K顆粒溶解酶時，優(yōu)選選擇大腸桿菌、枯草桿菌或酵母為宿主的基因表達載體。當(dāng)表達雖然量很小但仍具有確切活性的15K顆粒溶解酶時，優(yōu)選采用哺乳動物細胞或者昆蟲細胞做宿主的基因表達載體。
此外，既可以選擇上述現(xiàn)有的基因表達載體，當(dāng)然也可根據(jù)目的來制備適宜的基因表達載體并采用該載體。
將插入15K顆粒溶解酶基因的基因表達載體轉(zhuǎn)染至宿主細胞中。所采用的轉(zhuǎn)染方法可以是常規(guī)方法，例如，當(dāng)采用大腸桿菌或枯草桿菌作為宿主細胞時，可采用氯化鈣方法和電穿孔方法，當(dāng)采用哺乳動物細胞或昆蟲細胞作為宿主時，可采用磷酸鈣方法以及電穿孔方法和脂質(zhì)體方法。
根據(jù)常規(guī)方法對得到的轉(zhuǎn)化株進行培養(yǎng)，積聚所需的15K顆粒溶解酶。
可根據(jù)宿主正確選擇培養(yǎng)介質(zhì)。例如，當(dāng)采用大腸桿菌作為宿主時，可恰當(dāng)選擇LB和TB培養(yǎng)基。當(dāng)采用哺乳動物細胞為宿主時，可恰當(dāng)選擇RPMI1640培養(yǎng)基。
可根據(jù)常規(guī)方法從所得培養(yǎng)物中分離純化所得的15K顆粒溶解酶。例如，可利用15K顆粒溶解酶的物理和/或化學(xué)性質(zhì)對培養(yǎng)物進行多種處理從而進行分離純化。
具體地，可利用蛋白沉淀劑、超濾、凝膠過濾、高效液相色譜、離心、電泳、利用特異性抗體的親合色譜、以及透析等處理，這些方法可以單獨使用，也可以組合使用。
可按照上述方法分離、純化15K顆粒溶解酶。
在感染病治療劑中采用15K顆粒溶解酶作為活性成分，將其摻入血液的巨噬細胞中，在此被活化后而殺傷被巨噬細胞吞入其中能引起感染的細菌、病毒以及真菌，籍此可治療這些微生物所引起的感染。如上所述，與9K顆粒溶解酶不同，15K顆粒溶解酶本身沒有細胞毒性，因此預(yù)計作為感染病治療劑而施用后幾乎不產(chǎn)生副作用。
②15K顆粒溶解酶的體內(nèi)表達本發(fā)明治療劑的活性成分的形式是一種重組載體，其中用于表達前述重組蛋白的編碼15K顆粒溶解酶的基因被插入至體內(nèi)表達載體中。
作為體內(nèi)表達載體，例如可以列舉腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，但不限于此。
對于重組體內(nèi)表達載體，例如，將15K顆粒溶解酶的可表達基因進一步轉(zhuǎn)導(dǎo)入粘粒載體，其中前述的病毒基因已經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)入該載體，然后將該粘粒載體和用限制性酶處理的母體病毒DNA-TP轉(zhuǎn)染至293個細胞中，從而在293細胞內(nèi)發(fā)生同源重組，因此產(chǎn)生所需的體內(nèi)表達載體。
B.本發(fā)明治療劑的形式①采用15K顆粒溶解酶重組蛋白作為活性成分的本發(fā)明治療劑在本發(fā)明治療劑的第一種形式中，將15K顆粒溶解酶作為活性成分摻入，同時摻入適宜的藥物制劑載體，將其制備成制劑組合物的形式(當(dāng)然，也可能只有15K顆粒溶解酶)?？筛鶕?jù)具體的劑型恰當(dāng)?shù)貜某Ｒ?guī)使用的藥物制劑載體中自由選擇適宜的藥物制劑載體，例如填充劑、膨脹劑、粘合劑、潤濕劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、崩解劑、以及表面活性劑等賦形劑以及稀釋劑。并未對制劑組合物的形式作特定限定，只要是15K顆粒溶解酶能有效用于治療感染病的形式即可。例如，甚至是能配制成諸如溶液、混懸液以及乳劑等可注射形式的固態(tài)制劑，諸如片劑、粉末劑、顆粒劑以及丸劑。通過向15K顆粒溶解酶中加入適宜的載體可得到干燥的制劑，使用時，可將該干燥的制劑制成液體。
通過上述方式獲得的本發(fā)明治療劑的給藥劑量，可根據(jù)制劑的給藥方法、給藥形式、患者的癥狀等而適宜地選擇，并無特別限定。
可根據(jù)藥物劑型來選擇這些多種藥物制劑形式的適宜的給藥途徑，例如，對注射劑型可選擇靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、骨內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或者腹腔內(nèi)給藥的方式，而對固體劑型則可選擇口服或腸道給藥的方式。
②15K顆粒溶解酶的體內(nèi)表達載體作為活性成分的本發(fā)明治療劑通過分離和純化利用上述方法制備的體內(nèi)表達載體，并將其施用至生物體內(nèi)，可在生物體內(nèi)產(chǎn)生15K顆粒溶解酶，因此顯現(xiàn)出15K顆粒溶解酶的藥理學(xué)作用。
這種情況下的劑型通常為可注射劑型，該治療劑可采用靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、骨內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或腹腔內(nèi)的給藥方式。
可不受特別限制地根據(jù)制劑的給藥方法、給藥形式、患者癥狀來適宜地選擇本發(fā)明治療劑的給藥劑量。通常優(yōu)選制備表達15K顆粒溶解酶的體內(nèi)表達載體為活性成分，以每日一次或者分成每日數(shù)次的適宜劑量來施用該制劑。
實施例下面將對本發(fā)明的實施例進行描述。
當(dāng)15K顆粒溶解酶與巨噬細胞共同存在時對結(jié)核桿菌的抗菌效果的研究(1)15K顆粒溶解酶的特異性單克隆抗體的制備在100至200單位/ml的IL-2存在的條件下培養(yǎng)人外周血淋巴細胞(在含有5％CO2的37℃的溫箱中，在含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)2×106細胞/ml的人外周血淋巴細胞10天)，然后用常規(guī)方法提取所得細胞中的RNA，采用該RNA作為模板進行RT-PCR(PCR引物1SEQ ID NO2，PCR引物2SEQ ID NO3)來合成含有編碼15K顆粒溶解酶全長蛋白的區(qū)域的基因部分[Jongstra et al.，J.Exp.Med，165，601part corresponding to amino acid sequence of SEQ ID NO1]來作為互補DNA(cDNA)的擴增產(chǎn)物。將該編碼15K顆粒溶解酶全長蛋白的cDNA摻入至哺乳動物表達載體pRc/CMV或pcDL-SRα296中，將所得的重組載體溶解于生理鹽水中，然后用該溶液對小鼠進行皮下或皮內(nèi)免疫。以1至2周的間隔免疫4至5次后，采用間接熒光抗體法(按照后述的方法進行)發(fā)現(xiàn)小鼠脾細胞中抗體滴度增加，利用常規(guī)方法使小鼠脾細胞進行細胞融合，再次采用間接熒光抗體法來尋找可產(chǎn)生顆粒溶解酶特異性抗體的雜交瘤細胞。所述間接熒光抗體法也即將上述編碼15K顆粒溶解酶的基因轉(zhuǎn)染至細胞中，用4％多聚甲醛固定表達該基因的細胞(Cos7)，用0.5％的吐溫20溶解膜，然后將雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清加入其中與抗體反應(yīng)，與熒光標(biāo)記的抗鼠IgG抗體進行反應(yīng)，檢測熒光，從而篩選出能產(chǎn)生與顆粒溶解酶特異性結(jié)合的抗體的雜交瘤細胞。結(jié)果，得到了9種能生成與顆粒溶解酶特異性結(jié)合的抗體的雜交瘤細胞。對所得的每種雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清液進行硫酸銨沉淀并用蛋白G柱進行純化，制備兩種15K顆粒溶解酶的單克隆抗體。下面將其稱作單克隆抗體RF10(與15K顆粒溶解酶結(jié)合，但不與9K顆粒溶解酶結(jié)合)或者單克隆抗體RC8(與15K顆粒溶解酶和9K顆粒溶解酶都結(jié)合)。
(2)15K顆粒溶解酶的多克隆抗體的制備采用常規(guī)方法用顆粒溶解酶的部分氨基酸序列(29個氨基酸)(J.Exp.Med.165601-614(1987)，J.Exp.Med.，1721159-1163(1990))Arg Thr Gly Arg Ser Arg Trp Arg Asp Val Cys Arg Asn Phe Met ArgArg Tyr Gln Ser Arg Val Thr Gln Gly Leu Val Ala Gly(N5-1SEQ IDNO4)與嘁血藍蛋白的結(jié)合物來免疫兔，以獲得抗血清。利用硫酸銨沉淀和蛋白G柱來純化所得抗血清，然后用結(jié)合有前述合成肽(N5-1)的柱進行親合色譜來進一步純化，以此制備顆粒溶解酶的多克隆抗體(抗N5-1抗體)。
(3)含有顆粒溶解酶的培養(yǎng)上清液的制備利用常規(guī)方法將SEQ ID NO1核苷酸序列中編碼15K顆粒溶解酶蛋白部分的核苷酸序列的核苷酸鏈摻入至pFLAG-CMV載體中(Sigma制造)，制備基因重組載體。采用未與基因重組的pFLAG-CMV載體作為對照。將上述每一基因重組載體轉(zhuǎn)染至Cos7細胞中，然后利用DMEM培養(yǎng)基(Gibco制造)在含有5％CO2的37℃條件下培養(yǎng)72小時。完成培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物離心(2500rpm·20min·4℃)，得到培養(yǎng)上清液。
將每一培養(yǎng)上清液中的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE分離。當(dāng)將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE電泳凝膠上轉(zhuǎn)移至尼龍膜上后，將該膜用封閉溶液(1％脫脂乳/洗滌溶液)封閉，將15K顆粒溶解酶特異性RF10單克隆抗體與膜結(jié)合，再加入酶標(biāo)記抗鼠抗體和顯色底物進行結(jié)合。結(jié)果，編碼15K顆粒溶解酶蛋白的基因所表達得到的上清液中出現(xiàn)了分子量為15K的條帶。但是在對照中，并未發(fā)現(xiàn)該條帶。此外，當(dāng)采用與15K和9K顆粒溶解酶結(jié)合的多克隆抗體N5-1進行類似實驗時，可觀察到15K的條帶，但是不能看到9K的條帶。
上述結(jié)果揭示，15K顆粒溶解酶特異性存在于前述的顆粒溶解酶培養(yǎng)上清液中，但是顆粒溶解酶并未存在于對照培養(yǎng)上清液中。
(4)抗菌效果的研究按照常規(guī)方法將從人血液中分離的淋巴細胞懸浮于培養(yǎng)液(RPMI1640，10％人血清)中，使每1ml含有約2×107個細胞，置于塑料培養(yǎng)板(24孔/板)中，每孔分入1ml，于37℃培養(yǎng)24小時，淋巴細胞黏附于培養(yǎng)板壁表面，在這些黏附的巨噬細胞中研究15K顆粒溶解酶的抗菌效果。
然后，每孔中加入1ml的RPMI1640(含有10％人血清)，在5％CO2條件下于37℃靜態(tài)培養(yǎng)結(jié)核桿菌(H37Rv，1×105至1×106cfu)4至12小時，從而用結(jié)核桿菌感染巨噬細胞。感染完成后，向孔中分別加入1ml含有15K顆粒溶解酶的上清液(Grn上清液)和不含有15K顆粒溶解酶的上清液(Cont上清液)，在同樣的條件下靜態(tài)培養(yǎng)2至12小時。
完成培養(yǎng)后，移去培養(yǎng)上清液，用PBS洗滌黏附于板上的細胞3次，用總共5ml的1％皂角甙水溶液提取細胞中的結(jié)核桿菌，稀釋提取液，種于平板瓊脂培養(yǎng)基上[7H11(Gibco制造)]，將其在37℃靜態(tài)培養(yǎng)14天，計數(shù)菌落數(shù)。
結(jié)果如圖1所示。
在圖1中，Cont表示對照培養(yǎng)上清液，Grn表示顆粒溶解酶培養(yǎng)上清液?？v坐標(biāo)軸表示菌落數(shù)。在橫坐標(biāo)軸上，1表示如上所述將巨噬細胞、結(jié)核桿菌以及培養(yǎng)上清液接觸后的結(jié)果。2與1相同，表示只是在不含巨噬細胞的情況下，對各培養(yǎng)上清液和結(jié)核桿菌進行靜態(tài)培養(yǎng)，洗滌之后，在7H11平板瓊脂培養(yǎng)基上進行靜態(tài)培養(yǎng)，并確認結(jié)核桿菌在板內(nèi)的非特異性吸附的影響結(jié)果。3表示每1ml培養(yǎng)上清液和結(jié)核桿菌在前述的培養(yǎng)板中于37℃培養(yǎng)2小時，然后在7H11平板瓊脂培養(yǎng)基中進行靜態(tài)培養(yǎng)的結(jié)果。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)15K顆粒溶解酶通過巨噬細胞的參與起到了抗菌作用。當(dāng)沒有巨噬細胞的參與時，并未發(fā)現(xiàn)15K顆粒溶解酶對結(jié)核桿菌的抗菌作用。
由前述的試驗例可以看出，15K顆粒溶解酶具有抗菌活性，表明15K顆粒溶解酶可用作感染治療劑的有效成分。
已有報導(dǎo)，當(dāng)15K顆粒溶解酶轉(zhuǎn)染至諸如Cos7細胞、HeLa以及PC12等的細胞中時，在培養(yǎng)上清液中可檢測到15K顆粒溶解酶，但未觀察到細胞損傷。而在穿孔素存在下以9K顆粒溶解酶代替15K顆粒溶解酶時，則誘導(dǎo)細胞毒活性或細胞凋亡(Pena，S.V.et al，J.Immunol.，158，2680-2688(1997))。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供了一種有效治療感染的治療劑，其中含有作為活性成分的15K顆粒溶解酶，該治療劑沒有觀察到副作用。
序列表<110>株式會社BML國立療養(yǎng)所近畿中央病院岡田全司<120>感染病治療劑<130>PBM67/PCT<150>JP2002-45865<151>2002-02-22<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>745<212>DNA<213>人類<220>
<223>發(fā)明人岡田全司發(fā)明人高森靖發(fā)明人小川一行發(fā)明人永田欽也<220>
<221>CDS<222>(129).(563)<223>
<400>1gtatctgtgg taaacccagt gacacggggg agatgacata caaaaagggc aggacctgag 60aaagattaag ctgcaggctc cctgcccata aaacagggtg tgaaaggcat ctcagcggct120gccccacc atg gct acc tgg gcc ctc ctg ctc ctt gca gcc atg ctc ctg 170Met Ala Thr Trp Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Met Leu Leu1 5 10
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1.一種感染病治療劑，其含有作為活性成分的15K顆粒溶解酶。
2.權(quán)利要求1的感染病治療劑，其中，15K顆粒溶解酶是重組蛋白質(zhì)。
3.一種感染病治療劑，其包含作為活性成分的15K顆粒溶解酶的體內(nèi)表達載體，該載體中摻入了編碼15K顆粒溶解酶的基因。
全文摘要
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一條新的路徑，其中本身沒有細胞毒性的15K顆粒溶解酶被摻入至巨噬細胞中并被活化，從而殺傷進入巨噬細胞內(nèi)的細菌。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)采用上述15K顆粒溶解酶作為活性成分可提供一種有效的感染病治療劑，該治療劑幾乎沒有副作用，細菌對其難以產(chǎn)生耐藥性，即提供一種含有作為活性成分的15K顆粒溶解酶的感染病治療劑。
文檔編號C12N15/09GK1635902SQ0380433
公開日2005年7月6日 申請日期2003年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月22日
發(fā)明者岡田全司, 高森請, 小川一行, 永田欽也 申請人:獨立行政法人國立病院機構(gòu), 岡田全司, 高森靖, 株式會社Az生物器材