專利名稱：一種人白細(xì)胞介素-2的基因合成、表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種用基因工程技術(shù)生產(chǎn)人白細(xì)胞介素-2的方法，國(guó)際專利分類為CN12 15/26。
近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分泌一系列具有不同活性的細(xì)胞因子，其中許多因子有很強(qiáng)的抗病毒和抗腫瘤作用，如白細(xì)胞介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子等。它們有的能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，有的能激活免疫效應(yīng)細(xì)胞和誘導(dǎo)產(chǎn)生其他細(xì)胞因子，共同有效地清除腫瘤細(xì)胞、病毒或細(xì)菌感染的細(xì)胞，起到防病和治病的作用。由于這些因子的重要生物學(xué)作用使得它們成為目前基因工程藥物研究和開發(fā)的主要對(duì)象。
白細(xì)胞介素-2(IL-2)是其中最有應(yīng)用開發(fā)前景的細(xì)胞因子之一。尤其是通過IL-2激活免疫細(xì)胞而用以進(jìn)行的過繼免疫治療，已成為腫瘤治療一個(gè)十分有力的手段。估計(jì)IL-2對(duì)下述方面的疾病有潛在的醫(yī)療價(jià)值1.通過激活LAK(Lymphokine Activated Killer)細(xì)胞，清除病毒感染的細(xì)胞而起到防病治病作用。如對(duì)病毒性乙型肝炎的治療;
2.通過激活LAK細(xì)胞，清除細(xì)菌感染的細(xì)胞。如治療麻瘋病。
3.通過激活LAK及TIL(Tumor Infitcating Lymphocyte)細(xì)胞殺仿和清除癌變細(xì)胞。已經(jīng)證實(shí)，將IL-2直接注入腫瘤組織，療效可達(dá)50%以上(如對(duì)黑色素瘤，局部循環(huán)應(yīng)用效果更好)。
4.作為免疫佐劑，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)對(duì)成年人的免疫原性較差，故無(wú)預(yù)防作用，但加入IL-2后，可大為提高其免疫原性，產(chǎn)生較多的抗HBs，這將有實(shí)用價(jià)值。
5.IL-2對(duì)其它免疫功能低下的疾病，如AIDS和SCID等也可能有治療作用。
由于IL-2的實(shí)用價(jià)值，全世界有許多公司和廠家在研制生產(chǎn)IL-2的新方法和新工藝。鑒于遺傳密碼有簡(jiǎn)并性，鑒于大腸桿菌對(duì)氨基酸密碼子的喜愛與人細(xì)胞的不同，本發(fā)明通過專門設(shè)計(jì)合成了能生產(chǎn)人天然IL-2的基因，它不改變產(chǎn)物人IL-2的氨基酸組成與排列順序，而提高了基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平。通過將一人工合成的IL-2基因組裝入專門設(shè)計(jì)的，有強(qiáng)表達(dá)能力的載體PLy-4中，構(gòu)建成IL-2表達(dá)質(zhì)粒PLy-4S。它能在大腸桿菌中高表達(dá)，使IL-2占菌體總蛋白的30-40%。同時(shí)，本發(fā)明也提供了一種高效的產(chǎn)物IL-2的分離純化技術(shù)。在制得純凈的包涵體后，只用一步Sephacryl S-200柱層桿就可獲得純度＞95%，比活達(dá)2×106單位/毫克蛋白的IL-2。產(chǎn)品經(jīng)PAGE及HPLC分析驗(yàn)證，N未端15個(gè)氨基酸順序分析均證明它與天然IL-2相同。生物功能測(cè)定與天然IL-2一樣。因此，本發(fā)明具有大規(guī)模生產(chǎn)的意義。
本發(fā)明的示意圖說明如下

圖1，合成設(shè)計(jì)的人IL-2基因及其相應(yīng)的氨基酸順序。
圖2，合成的IL-20個(gè)小片段的順序。
圖3，IL-2基因大片段合成及完整基因組裝示意圖。
圖4，合成的IL-2基因序列測(cè)定。
圖5，完整IL-2基因組裝過程。
圖6，IL-2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
圖7，IL-2表達(dá)質(zhì)粒的酸切鑒定。
1.λDNA標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ(EcoRI+HindⅢ)2.EcoRI+BamⅢ酶切3.BamHI+ScaLI酶切
4.BgLⅡ+EcoRI酶切圖8，溫度誘導(dǎo)表達(dá)IL-2。
圖中30，42分別代表30℃，42℃培養(yǎng)。
圖9，圖8的黑度掃描。
圖10，包涵體分離的結(jié)果。
圖11，Sephacvye S-200分離IL-2。
圖12，IL-2的電泳鑒定。
圖13，還原型IL-2的HPLC鑒。
圖14，氧化型IL-2的HPLC鑒定。
圖15，IL-2對(duì)維持CTLC-2的細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
圖16，IL-2單抗體IL-2生物功能的抑制作用。
圖17，IL-2活化LAK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
通過下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征作詳細(xì)描述。
實(shí)施例1材料與方法。
(1)限制性內(nèi)切酶、T4DNA聚合酶、T4DNA連接酶、CIP堿性磷酸酯酶、DNA聚合酶I Klenow片段和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ、Ⅴ均購(gòu)自Boehringer公司和Biolabs公司。
(2)菌種與質(zhì)粒。JM101、103和105，BMH71-18 K802為本實(shí)驗(yàn)室保存;JF1125由劉愛萍贈(zèng)予;PRC23由Crowl贈(zèng)予;PTZ-12、PLR-1由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。
(3)放射性同位素α-32P-dATP、α-32P-dCTP和r-32P-ATP購(gòu)自Amersham公司。
(4)使用ABI公司和DNA合成儀、試劑及方法合成DNA片段。
(5)化學(xué)試劑。Tris購(gòu)自Sigma公司，SDS購(gòu)自Serve公司，Sephacryl S-200購(gòu)自Pharmacia公司;RPM1-1640購(gòu)自日本制藥株式會(huì)社;標(biāo)準(zhǔn)IL-2(2×106單位/毫克蛋白質(zhì))購(gòu)自Boehringer公司。
(6)質(zhì)粒DNA制備，DNA序列分析，DNA轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選，限制性內(nèi)切酶水解等常規(guī)方法均參照Molecular Cloning。
(7)工程菌發(fā)酵，挑單個(gè)含IL-2的工程菌菌落接種于3ml LB培養(yǎng)基中，30℃搖床培育過夜，然后按2%比例接種于M9培養(yǎng)基(補(bǔ)加VitB1，4mg/L，AMP 50mg/L)。30℃培養(yǎng)到OD600為0.35-0.55時(shí)，將溫度升高到42℃，再培養(yǎng)3小時(shí)，讓IL-2大量表達(dá)。
(8)IL-2產(chǎn)物鑒定用SDS-PAGE法。電泳產(chǎn)物用島津CS-930雙波長(zhǎng)掃描儀進(jìn)行黑度掃描。
(9)IL-2活性檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)Glillis，S，etal，J·Immunol，120∶2027-2032，1978。
(10)包涵體制備法，發(fā)酵后，離心5000rpm，10'，菌體用PBS洗一次，每1克濕菌加50ml PBS，用上海超聲波儀器廠CSF-1A型超聲波發(fā)生器破菌，每次30秒，間隔30秒，反復(fù)計(jì)10次。然后離心15000rpm15’，棄上清液，沉淀即包涵體。
(11)柱層析純化IL-2。上述包涵體用PBS洗1次，加入鹽酸胍至8M濃度，PH7.5，溶解，離心除去不溶物，上用同一條件平衡的SephacrylS-200層析柱，分離純化IL-2。
實(shí)施的具體步驟分別敘述如下1.IL-2基因的合成及鑒定。
第一步是設(shè)計(jì)基因;第二步是合成小片段;第三步是合成大片段;第四步是組裝成完整的基因;第五步是鑒定。
A.基因的設(shè)計(jì)(圖1)IL-2由133個(gè)氨基酸組成，其基因有399 bp，加上起始密碼子ATG，終止密碼子TAG和TGA及5'和3’，末端克隆時(shí)用的限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，共有426 bp。將它分為20個(gè)小片段來合成，20個(gè)小片段的序列見圖2。這些片段中一些氨基酸密碼子是選用了大腸桿菌喜愛的密碼子。
B.小片段合成。
用二異丙亞磷酰胺保護(hù)的單體，以亞磷酸三酯法在ABI公司的DNA合成儀上進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，取出帶有合成DNA片段的多孔玻璃珠(CPG)柱，加濃氨水，密封，55℃過夜，脫去保護(hù)基，將DNA片段從硅膠樹脂上洗脫下來。將上清液轉(zhuǎn)移到小管子中，用重蒸水洗滌CPG柱，合并上清液，減壓冷凍抽干。加TE溶解，用7M urea-20%PAGE分離，切下DNA片段，浸泡在TE(PH8.0)-0.3M NaCl中，洗脫DNA片段。用乙醇沉淀后，溶于重蒸水，上Sephadex G25柱，回收DNA片段。取1n mol合成的DNA小片段，用γ-32PATP和T4多核苷酸激酶標(biāo)記后，上同一凝膠電泳鑒定，證明純度是好的。
C.大片段合成如圖3所示，將各相應(yīng)的DNA小片段，有的如上法加5'-P，有的不必加，用T4DNA連接酶連接成FⅠ和FⅡ兩個(gè)大片段。在將FⅠ和FⅡ組裝成完整基因前要測(cè)DNA序列，鑒定合成基因的準(zhǔn)確性。為此，分別將FⅠ和FⅡ片段與相應(yīng)限制性內(nèi)切酶水解的M13mp18RF DNA相連接，連接后轉(zhuǎn)Ce JM105受體菌。經(jīng)篩選后，取有外源DNA片段的單個(gè)噬菌斑制取單鏈重組M13mp18-IL-2FⅠ和M13mp18-IL-2FⅡ DNA，用末端終止法測(cè)定DNA序列，證明FⅠ和FⅡ的DNA序列準(zhǔn)確無(wú)誤。
D.完整IL-2基因組裝如圖4所示，先用限制性內(nèi)切酶EcoRI和PStI切開含F(xiàn)Ⅰ大片段的M13mp18-FI，用限制性內(nèi)切酶PStI和BamHI切開含F(xiàn)Ⅱ大片段的M13mp18-FⅡ，再用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI切開M13mp18RFONA，組裝成含F(xiàn)Ⅰ和FⅡ片段，即完整IL-2基因的M13m 19-Syn IL-2質(zhì)粒，結(jié)果如圖5所示。
E.鑒定由上述過程可知，含完整IL-2合成基因的M13mp19-Syn-IL-2RFDNA中有一個(gè)EcoRⅠ和一個(gè)Bam HI切口，它們分別位于IL-2基因的5’末端和3’末端，用這兩個(gè)酶水解這一重組DNA可得到兩個(gè)片段，一個(gè)是載體M13mp19，一個(gè)是合成的IL-2基因。
2.表達(dá)載體PLY4的構(gòu)建我們構(gòu)建了一個(gè)高表達(dá)的載體。其技術(shù)特征是含有強(qiáng)啟動(dòng)子PRPL;含有溫度敏感的PRPL啟動(dòng)子阻遏蛋白的基因CIts857;含有合適的SD-ACG距離;含有較好的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào);含有“MCS”區(qū)。分別敘述如下(1)選擇PRPL作啟動(dòng)子的原因是表達(dá)率高;可以通過溫度改變誘導(dǎo)IL-2的產(chǎn)出，有利于生產(chǎn)。
(2)一般在帶有PRPL和CIts 857基因的表達(dá)載體中，CIts857基因是用BglⅡ組裝進(jìn)入的，這樣的片段有2.4Kb大小，這不僅片段較大，而且在組裝后要篩選方向正確的產(chǎn)物。我們研究了入DNA中PRPL啟動(dòng)子與CIts857基因結(jié)構(gòu)，發(fā)明了用BglⅡ和PLtI兩個(gè)酶切出一個(gè)包含PR和CIts857的DNA片段，并能夠很容易地，定向地組裝入載體。這樣CIts857的整入和切都十分方便，還省去了CI857方向篩選的工作。
(3)SD順序與ATG起始密碼子之間有AATTC五個(gè)堿基，試驗(yàn)證明是最合適的順序間距。
(4)5S rRNA基因的終止信號(hào)是一個(gè)強(qiáng)終止信號(hào)，將它納入IL-2基因的3’末端有助于基因轉(zhuǎn)錄的有效終止，從而節(jié)約了能量和減少基因連續(xù)而造成的產(chǎn)品不純，這都可大為提高大腸桿菌中LL-2的表達(dá)效率。
(5)PLy4含有的MCS區(qū)來自PVC19，包含有多個(gè)單一限制性內(nèi)切酶的點(diǎn)，有利于外源基因的插入。
3.表達(dá)質(zhì)粒PLy4-Syn rIL-2的構(gòu)建。
用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI水解M13mp 19-SynIL-2，經(jīng)電泳后回收IL-2合成基因，與用同樣兩種限制性內(nèi)切酶水解的PLy4重組就得到構(gòu)建在表達(dá)載體PLy4上的IL-表達(dá)質(zhì)粒PLy4-Syn IL-2(圖6)。為驗(yàn)證IL-2基因是否已克隆入此質(zhì)粒，同樣，用EcoRI和BamHI水解這一質(zhì)粒，圖7顯示其中確實(shí)含有合成的IL-基因。
4.IL-2的發(fā)酵生產(chǎn)將PLy4-Syn IL-2轉(zhuǎn)化宿主菌K802，構(gòu)成IL-2的基因工程菌。工程菌在30℃，過夜培養(yǎng)后，以2%比例接種于補(bǔ)充VitB1(4mg/L)和AMP(50mg/L)的M9培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)呈OD600為0.35-0.55，在5分鐘內(nèi)將度升至42℃，IL-2就誘導(dǎo)產(chǎn)生。溫度誘導(dǎo)表達(dá)IL-2占菌體總蛋白的32-37.9%，說明這一表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)效率是高的。
5.工程菌保存及穩(wěn)定性。
工程菌保存于25%甘油中，-20℃。傳代培養(yǎng)基為軟瓊脂糖，軟瓊脂糖菌在4℃保存。為檢查工程菌的穩(wěn)定性，每傳10代作一次酶的圖譜分析，結(jié)果與原始菌種相同。在50代時(shí)進(jìn)行的IL-2基因序列分析與原始基因相同，證明本發(fā)明中的工程菌是十分穩(wěn)定的。
6.IL-2的分離純化由于IL-2在細(xì)菌中表達(dá)得快，產(chǎn)量高，并以包涵體顆粒存在于細(xì)菌，本發(fā)明中提供了包涵分離和進(jìn)一步層析純化的技術(shù)，可以快速、高速地得到IL-2產(chǎn)物。
a.包涵體的制備發(fā)酵后，5000rpm，10分鐘離心，沉淀菌體，用PBS洗滌后，以每克濕菌體用50ml PBS的比例懸浮菌體。用超聲波破菌體后，于15000rpm，15分鐘離心，得到包涵體。本法分離的包涵體幾乎包含了細(xì)菌中產(chǎn)生的全部IL-2(圖10)，為進(jìn)一步純化IL-2打下良好的基礎(chǔ)。
b.一步色層制備IL-2用8M鹽酸胍溶解包涵體后，上用同一溶液平衡的Sephacryl S-200柱，分部收集，可得到一個(gè)含IL-2的主峰(圖11)。本發(fā)明中IL-2的一步色層分離是簡(jiǎn)便、快速、產(chǎn)量高、純度好。
7.IL-2產(chǎn)物的鑒定a.SDS-PAGE。
圖12表明，上柱后的IL-2是純的。
b.HPLC鑒定圖13、圖14是IL-2的HPL鑒定，其主峰中IL-2含量達(dá)99%以上。
C.N末端分析N端15個(gè)氨基酸鑒定結(jié)果與天然一樣。順序是A·P·T·S·S·S·T·K·T·Q·L·Q·L·E·H·L·L。
8.IL-2產(chǎn)物的生物功能鑒定a.維持CTLL-2細(xì)胞的增殖作用圖15顯示，本發(fā)明制備的IL-2可維持CTLL-2細(xì)胞生長(zhǎng)28天以上，細(xì)胞數(shù)目增加了1000倍。不加IL-2或同時(shí)加入IL-2單抗時(shí)，細(xì)胞很快死亡。
b.IL-2單抗對(duì)IL-2生物功能的抑制作用。
取T淋巴細(xì)胞，加入本發(fā)明制取的IL-2到20單位/毫升，再加不同量的單抗，所得結(jié)果如圖16。IL-2單抗含量在15μg/ml對(duì)20μ/ml的IL-2無(wú)抑制作用，但單抗增到50μg/ml時(shí)則有明顯抑制作用，到200μg/ml時(shí)可100%地抑制IL-2的生物功能，這一抑制作用是不能用鼠等其它來源的單抗代替，有種屬特異性，這說明本發(fā)明的IL-2制品是種專一的。
C.IL-2對(duì)NK細(xì)胞活性的增強(qiáng)作用
Comcentration of Release of91Cr(5)rIL-2(U/ml)Blood donor 1 Blood donor 20 23.18 23.9610 22.46100 32.19 33.301000 44.98 35.0210000 19.94 6.91100000 3.24 1.38從表上說明本發(fā)明制備的IL-2對(duì)NK細(xì)胞活性有增強(qiáng)作用。
d.IL-2對(duì)LAK細(xì)胞的誘導(dǎo)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
圖17表明IL-2可誘導(dǎo)LAK細(xì)胞的生長(zhǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，其增殖作用與殺傷作用增大。用IL-2誘導(dǎo)的LAK細(xì)胞處理HL-60細(xì)胞株及人新鮮肺細(xì)胞表明，LAK對(duì)此三類細(xì)胞均有殺傷作用，殺傷率為37.96-54.84%。
權(quán)利要求
1.一種人白細(xì)胞介素-2(IL-2)基因的合成，表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)工藝，其特征是a.使用人工設(shè)計(jì)、化學(xué)合成的基因，基因結(jié)構(gòu)式如下GA ATT CTT ATG GCT CCG ACT TCT TCT TCT ACT AAA AAG ACT CAGMet Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr GlnCTT CAG CTG GAA CAT CTG CTG CTG GAC CTC CAG ATG ATC CTG AACLeu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu AsnGGT ATC AAC AAC TAC AAA AAC CCG AAA CTG ACC CGT ATG CTG ACCGly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu ThrTTC AAA TTC TAC ATG CCG AAA AAA GCT ACC GAA CTG AAA CAT CTGPhe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His LeuCAG TGC CTT GAA GAA GAA CTG AAA CCG CTG GAA GAA GTT CTG AACGln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu AsnCTG GCT CAG TCT AAA AAC TTC CAT CTG CGT CCG CGT GAC CTG ATCLeu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Are Pro Are Asp Leu IleTCT AAC ATC AAC GTT ATC GTT CTG GAA CTG AAA GGT TCT GAA ACCSer Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu ThrACC TTC ATG TGC GAA TAC GCT GAC GAA ACC GCT ACC ATC GTT GAGThr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val GluTTC CTG AAC CGT TGG ATC ACC TTC TGC CAG TCT ATC ATC GTT GAG Thr Phe Met Glu Tyr Asp GLu Thr llEValGlu TTC GTG AAC GGT TGG ATC ACC TTC TCC CAGTCT TCT ACC Phe Leu Asn Arg Trp lle Phe Cys GlnSer lle Ser Thr GTG ACC TGA TAG GAT CCLeu Thr TermTermIL-2由133個(gè)氨基酸組成，合成的該基因有399bp，加上起始密碼子ATG，終止密碼子TAG和TGA及5′和3′，末端克隆用的限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，共有426 bp，選用了大腸桿菌使用頻率高的密碼子，使合成的il-2基因能在大腸桿菌中高效表達(dá)，產(chǎn)生大量的人Il-2，而不改變IL-2的氨基酸順序；(b)將合成的IL-2基因克隆入帶有Pl啟動(dòng)子Cl t857溫控阻遏蛋的基因、核糖體t1t25SrRNA終止信號(hào)和MCS區(qū)的基因載體PLy4后，構(gòu)建成IL-2的表達(dá)質(zhì)粒Ply4-Syn IL-2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后獲得高效表達(dá)；(c)表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形成存在，得包涵體產(chǎn)物后用8M鹽酸胍溶解，上Sephacryl S-200柱，一步柱層析可以得到純度＞95%，經(jīng)活＞2×106國(guó)際單位/毫克的IL-2。
2.根據(jù)要求1所述的IL-2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，其特征是使用了表達(dá)載體PLy-4，它是由PL強(qiáng)啟動(dòng)子、CIts857溫度敏感的PL啟動(dòng)子阻遏蛋白基因，這個(gè)基因與PL啟動(dòng)子相連的片段是用Pst和BglⅡ兩個(gè)限制性內(nèi)切酶組裝入質(zhì)粒的，易于切出，SD順序與起始密碼子之間有AATTC5個(gè)堿基距離和在插入基因的3'末端的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)t1t2(來自5SRNA基因)，以上結(jié)構(gòu)使PLy-4載體成為一個(gè)高效表達(dá)載體。
全文摘要
白細(xì)胞介素-2是作為一種免疫藥物可用于治療某些病毒和治療癌癥，有很好的應(yīng)用前景，臨床需要量很大，是國(guó)際上競(jìng)相開發(fā)的產(chǎn)品。本發(fā)明是通過構(gòu)建帶有天然白細(xì)胞介素-2基因的表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中高效表達(dá)，表達(dá)量達(dá)菌體總蛋白的30—40％。本發(fā)明還建立了一種高效的包涵體分離技術(shù)和獲得高比活的白細(xì)胞介素-2純化方法，這為大量生產(chǎn)白細(xì)胞介素-2創(chuàng)造了優(yōu)越的條件。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1093109SQ93112388
公開日1994年10月5日 申請(qǐng)日期1993年3月31日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月31日
發(fā)明者劉新垣 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所