專利名稱：免疫原序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸序列、特別是編碼產(chǎn)生土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis)菌體抗原的酶的基因及其作為疫苗或者在疫苗生產(chǎn)和診斷中的用途。
土拉熱弗朗西絲氏菌是一種小的革蘭氏陰性球桿菌，它引起人獸互傳的兔熱病。根據(jù)伯捷氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊，弗朗西絲氏菌屬(Francisellas)包括兩個(gè)種土拉熱弗朗西絲氏菌和新兇手弗朗西絲氏菌(Francisella novicida)。然而，近來一些工作者已建議考慮新兇手弗朗西絲氏菌為土拉熱弗朗西絲氏菌的亞種(Hollis DG等，J.Clin.Micro.271601-1608)。由于DNA水平的高度相關(guān)性，現(xiàn)在也將密切相關(guān)的細(xì)菌蜃樓耶爾森氏菌(Yersinia philomiragia)考慮為弗朗西絲氏菌屬的一個(gè)成員。除了新兇手(novicida)外，還有幾個(gè)被提議的土拉熱弗朗西絲氏菌亞種；它們是土拉熱(tularensis)亞種、全北區(qū)(holarctica)亞種和中亞細(xì)亞(mediasiatica)亞種。以毒力、瓜氨酸酰脲酶活性和從甘油產(chǎn)酸為基礎(chǔ)，可以鑒定出土拉熱亞種和全北區(qū)亞種(Olsufjev NG等，(1959)J.Hyg.Epidemiol.Microbiol.Immunol.3138-149)。主要在前蘇聯(lián)中亞共和國發(fā)現(xiàn)土拉熱弗朗西絲氏菌中亞細(xì)亞亞種。這個(gè)亞種的菌株擁有瓜氨酸酰脲酶活性，并且能發(fā)酵甘油，但是毒力小于兔的土拉熱弗朗西絲氏菌土拉熱亞種菌株。
兔熱病是發(fā)生在北半球的一種疾?。怀３Ｔ跉W洲、北美、亞洲、北俄羅斯和日本發(fā)現(xiàn)一些病例。嚙齒動物被認(rèn)為是所述細(xì)菌的主要儲存者，蜱是主要的載體之一。
革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)是其外膜的主要成分。所述分子由3個(gè)區(qū)組成，脂質(zhì)-A(嵌入外膜中并且具有種間保守結(jié)構(gòu))和兩個(gè)多糖即核心寡糖(可以改變種間復(fù)雜性)和菌體抗原(是絕對的多態(tài)結(jié)構(gòu))(Kenne L等，(1983)Bacterial Polysaccharides The polysacharides.Academic Press，第287-362頁)。認(rèn)為細(xì)菌需要LPS分子以防止血清殺傷(Whitfield C等，(1997)Mol.Micro.23629-638)和陽離子抗微生物肽(Groisman EA.(1994)Trends.Microbiol.2444-449)。
從較少毒力的土拉熱弗朗西絲氏菌全北區(qū)亞種菌株中分離的LPS的結(jié)構(gòu)和免疫原性，已研究到一定程度(Dreisbach VC等，(2000)Infect.Immun 681988-1996)。用這種LPS免疫的動物可防止全北區(qū)亞種菌株攻擊(Fulop MJ等，(1995)Vaccine 131220-1225)，但不能防止土拉熱亞種菌株攻擊(Fulop MJ等，(2001)Vaccine 194465-4472)。然而，源自全北區(qū)亞種菌株的LPS似乎比其它革蘭氏陰性菌的LPS的毒性低，并且其菌體抗原含有稀有糖，這些糖在結(jié)構(gòu)上與那些在銅綠假單胞菌06(Pseudomonas aeruginosa 06)和痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)7型中發(fā)現(xiàn)的糖相關(guān)。
沒有報(bào)道從更毒的土拉熱亞種菌株中分離出LPS。
當(dāng)研究其它種的LPS結(jié)構(gòu)時(shí)，常常觀察到菌株間僅有的結(jié)構(gòu)差異是菌體抗原的組成。因此，為了提供診斷試驗(yàn)的基礎(chǔ)并且能重組制備菌體抗原以避免操作致病生物，闡明強(qiáng)毒亞種中LPS分子的菌體抗原部分的結(jié)構(gòu)將是有益的。
然而，菌體抗原表達(dá)的遺傳基礎(chǔ)是復(fù)雜的；在大多數(shù)細(xì)菌中，產(chǎn)生完全菌體抗原所需的基因位于細(xì)菌染色體上的聚簇中。因此，鑒定和分離負(fù)責(zé)菌體抗原的基因并不簡單。此外，因?yàn)殡y以用常規(guī)方法染色，所以從強(qiáng)毒株中鑒定和分離LPS就更加復(fù)雜。
本申請人現(xiàn)在已確定土拉熱弗朗西絲氏菌土拉熱亞種中菌體抗原產(chǎn)生的遺傳基礎(chǔ)。此外，他們已確定源自各種土拉熱弗朗西絲氏菌菌株的LPS作為疫苗的功效。
根據(jù)本發(fā)明，提供一種編碼系列酶或酶片段的核酸，其中，如果在細(xì)胞中一起表達(dá)，能產(chǎn)生能在給予所述核酸的動物體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的免疫原性部分，所述應(yīng)答是防止土拉熱弗朗西絲氏菌感染，所述核酸編碼至少一些SEQ ID NO 3-17的酶或其修飾物。
術(shù)語“修飾物”是指氨基酸序列，不同于其來源的堿基序列，所述序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代為其它的氨基酸。如果氨基酸被具有廣義上相似特性的不同氨基酸取代，則氨基酸置換可看作“保守的”。非保守置換是指氨基酸被不同類型的氨基酸取代。廣義上講，幾乎所有的非保守置換都可能改變多肽的生物學(xué)活性。適當(dāng)修飾是與堿基序列至少有60％同一性，優(yōu)選至少75％同一性，更優(yōu)選至少90％同一性。
在這個(gè)實(shí)例中，同一性可以例如運(yùn)用Lipman-Pearson算法，用Ktuple2，空位罰分4，空位長度罰分12，標(biāo)準(zhǔn)PAM評分矩陣(Lipman，D.J.和Pearson，W.R.，Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches，Science，1985，第227卷，1435-1441)進(jìn)行判斷。
具體地講，本發(fā)明包括編碼SEQ ID NO 3-17的酶的核酸。
一個(gè)優(yōu)選的核酸的實(shí)例包括SEQ ID NO 1或其變異體。特別是所述核酸是SEQ ID NO 1。
關(guān)于核酸序列的術(shù)語“其變異體”是指任何置換、變異、修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸的核酸或多核苷酸序列，條件是由該多核苷酸編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列表現(xiàn)出與基礎(chǔ)序列編碼的蛋白質(zhì)相似的特性。因此，該術(shù)語包括等位基因變異體、編碼相似蛋白質(zhì)但僅因?yàn)檫z傳密碼簡并性不同的簡并變異體。它也包括與本發(fā)明的多核苷酸序列大致雜交的多核苷酸。優(yōu)選這樣的雜交發(fā)生在低嚴(yán)謹(jǐn)條件和高嚴(yán)謹(jǐn)條件，或者發(fā)生在低嚴(yán)謹(jǐn)條件和高嚴(yán)謹(jǐn)條件之間。一般情況下，低嚴(yán)謹(jǐn)條件可以定義為3×SSC、在約環(huán)境溫度至約55℃，高嚴(yán)謹(jǐn)條件可以定義為0.1×SSC、在約65℃。SSC是0.15M NaCl、0.015M檸檬酸三鈉緩沖液的名稱。3×SSC是三倍濃的SSC等等。
通常，變異體與本發(fā)明多核苷酸序列共有65％或65％以上的核苷酸，更通常70％，優(yōu)選75％，甚至更優(yōu)選80％或85％，以及特別優(yōu)選是90％、95％、98％或99％或99％以上的同一性。
如本領(lǐng)域所理解的，變異體可包括經(jīng)修飾的基礎(chǔ)序列，以確保在具體生物體中增強(qiáng)和最優(yōu)化密碼子使用，其中所述序列需要在所需的生物體例如原核細(xì)胞如大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)。這可包括修飾具體的核苷酸的內(nèi)容，例如改變序列中存在的G和C的百分比，以匹配通常在靶生物體中高表達(dá)基因中出現(xiàn)的百分比。另外，SEQ ID NO1的具體變異體是合成變異體，工程化移除在通用表達(dá)宿主如大腸桿菌高表達(dá)基因中很少發(fā)現(xiàn)的密碼子，同時(shí)，避免引入編碼菌體抗原基因中很少發(fā)現(xiàn)的密碼子。例如，在一切可能的情況下，氨基酸精氨酸(arg)、亮氨酸(leu)、異亮氨酸(ile)、甘氨酸(gly)和脯氨酸(pro)密碼子改變?yōu)镃GT或CGC(arg)，CTG、CTT或CTC(leu)，ATC或ATT(ile)，GGT或GGC(gly)，和CCG、CCA或CCT(pro)，從而消除稀有密碼子。
如果為了測定同一性程度的目的而比較核酸序列，則程序如BESTFIT和GAP(兩者均得自Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)軟件包)。BESTFIT例如比較兩條序列并產(chǎn)生最相似區(qū)段的最佳比對。GAP能夠使序列沿著它們的全長進(jìn)行比對并通過適當(dāng)在任一序列中插入空位形成最佳比對。合適時(shí)，本發(fā)明上下文中如果討論核酸序列的同一性，則所述比較是通過序列沿其全長進(jìn)行序列比對來完成。
SEQ ID NO 1包含一系列編碼許多在下文圖5中和SEQ ID NO3-17中所示的酶的基因。優(yōu)選任何SEQ ID NO 1的變異體編碼SEQ IDNO 3-17的酶或這些酶的修飾物。
關(guān)于氨基酸序列中使用的術(shù)語“片段”，是指給定的具有如完全氨基酸序列相同活性的氨基酸序列的任何部分。片段適當(dāng)包含源自基礎(chǔ)序列的至少20個(gè)、優(yōu)選至少50個(gè)連續(xù)氨基酸。
術(shù)語“片段”也用于核酸序列中。SEQ ID NO 1片段可應(yīng)用于診斷中，并且這些構(gòu)成本發(fā)明的又一方面。對于診斷目的，片段可以相當(dāng)短，例如5-30個(gè)堿基，它可用作引物或探針。在下文中闡明可鑒定用于診斷目的的SEQ ID NO 1的適當(dāng)片段的具體特征區(qū)域。用于治療的片段通常期望較長，例如長600-17,000個(gè)堿基。
已鑒定土拉熱弗朗西絲氏菌Schu 24菌株(土拉熱亞種)基因組的一個(gè)區(qū)，該區(qū)包括SEQ ID NO 1并且負(fù)責(zé)表達(dá)一組構(gòu)建多糖所必需的酶。如下文圖6中的SEQ ID NO 41所示。這個(gè)序列包括許多基因，其中包括一系列編碼如下文圖5中的SEQ ID NO 3-20所示酶的基因?；虻耐贫üδ芡ㄟ^與已知序列比較適用于這些基因，如表1所示。
表1
具體地講，據(jù)信如SEQ ID NO 3-17所示的蛋白參與菌體抗原的生物合成。菌體抗原本身既可應(yīng)用于診斷學(xué)中又可用作預(yù)防性或治療性疫苗。
如果本發(fā)明的核酸在宿主細(xì)胞中一起表達(dá)，則它們將產(chǎn)生在動物(包括人)體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原，所述免疫應(yīng)答可防止土拉熱弗朗西絲氏菌感染。因此，它們可用于生產(chǎn)預(yù)防性或治療性疫苗。
核酸可包括在載體如活病毒疫苗中，例如，腺病毒載體或牛痘，或包括在質(zhì)粒中形成所謂的“裸DNA”疫苗，或優(yōu)選包括在細(xì)菌載體如減毒沙門氏菌(Salmonella sp.)中。如本領(lǐng)域所理解的，在這種情況下，核酸將處于合適控制元件如啟動子、信號序列、增強(qiáng)子等的控制之下。在這種情況下，核酸在給予所述疫苗的患者細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，或者就細(xì)菌載體而論，就在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。結(jié)果，產(chǎn)生一系列能在原位構(gòu)建保護(hù)性菌體抗原的酶。
所述載體可與疫苗制劑中的藥學(xué)上可接受的載體適當(dāng)混合。如本領(lǐng)域已理解的，載體的性質(zhì)取決于使用的載體類型。具體地講，如果疫苗包含重組沙門氏菌，則它適合用于適于口服的組合物形式。
或者，所述核酸可包括在用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的表達(dá)載體中。合適的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，但優(yōu)選原核細(xì)胞如大腸桿菌。特別是所用核酸是已在具體的宿主細(xì)胞中優(yōu)化表達(dá)的SEQ ID NO 1的合成變異體。然后，可在培養(yǎng)后從這些細(xì)胞中回收保護(hù)性菌體抗原。
因而，再一方面，提供一種預(yù)防性疫苗或治療性疫苗的制備方法，所述方法包括周本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，然后從中回收產(chǎn)生針對土拉熱弗朗西絲氏菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的部分。
在這種方法中所用的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞及其產(chǎn)物一起構(gòu)成本發(fā)明的又一方面。
這類疫苗將適合于藥用組合物的形式，如本領(lǐng)域所理解的，其中將所述抗原與藥學(xué)上可接受的載體混合。
本發(fā)明的組合物可以為適合于口服使用、吸入給藥(例如作為微細(xì)粉劑或液體氣霧劑)、通過吹入法給藥(例如作為微細(xì)粉劑)或胃腸外給藥(例如作為靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或肌內(nèi)給藥的無菌水性或油性溶液劑或作為直腸給藥的栓劑)的形式。
本發(fā)明的組合物可以通過使用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)藥用賦形劑的常規(guī)方法獲得。
有關(guān)制劑的詳情，讀者可查閱Comprehensive Medicinal Chemistry第5卷25.2章(Corwin Hansch；編輯部主席)，Pergamon Press 1990。
與一種或多種賦形劑結(jié)合產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量必定會根據(jù)待治療宿主和具體的給藥途徑而變化。例如預(yù)期人用口服給藥的制劑通常含有例如0.5mg至2g與適當(dāng)?shù)暮统Ｒ?guī)量的賦形劑混合的活性劑，其中賦形劑占全部組合物的比例可不同，以重量計(jì)約5％至約98％。劑量單位形式通常含有約1mg至約500mg的活性成分。有關(guān)給藥途徑和給藥方案的詳情，讀者可查閱Comprehensive MedicinalChemistry第5卷25.3章(Corwin Hansch；編輯部主席)，Pergamon Press1990。
本發(fā)明部分用于治療或預(yù)防目的的劑量大小將會根據(jù)動物或患者的年齡和性別及給藥途徑，根據(jù)熟知的用藥原則自然變化。
因而，再一方面，本發(fā)明提供土拉熱弗朗西絲氏菌的重組菌體抗原，所述重組菌體抗原可從表達(dá)SEQ ID NO 3-17的蛋白或其修飾物的宿主細(xì)胞獲得。
此外，本申請人所實(shí)現(xiàn)的菌體抗原序列提供這種可能性，這一序列可構(gòu)成診斷試驗(yàn)的基礎(chǔ)，以確定患者是否感染土拉熱弗朗西絲氏菌。在此情況下，可以采集患者的血液樣品或唾液樣品等樣品并且檢測SEQ ID NO 1或其變異體的存在與否。
特效的檢測方法是本領(lǐng)域熟知的，并且可包括擴(kuò)增方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和/或其它使用例如與靶序列、特別是SEQ ID NO 1雜交的標(biāo)記探針的檢測方法。這種引物和探針構(gòu)成本發(fā)明的又一方面。
通過選擇獨(dú)特的引物和探針，也可能區(qū)別土拉熱弗朗西絲氏菌菌株間的感染。例如，本申請人發(fā)現(xiàn)，包含下文中陳述的SEQ ID NO21和SEQ ID NO 22以及SEQ ID NO 35和SEQ ID NO 36的引物將區(qū)別土拉熱弗朗西絲氏菌土拉熱亞種菌株和如下所述土拉熱弗朗西絲氏菌全北區(qū)亞種。在前一種情況下，因?yàn)橄掠涡蛄械牟町惗霈F(xiàn)這種可能性，而在后一種情況下，因?yàn)閭?cè)翼轉(zhuǎn)座酶序列的缺失差異而出現(xiàn)這種可能性。因此，使用基于這些區(qū)域的引物或探針的分析可用于確定任何具體菌株是土拉熱弗朗西絲氏菌土拉熱亞種還是另外的菌株。
為了發(fā)現(xiàn)土拉熱亞種菌株的LPS是否與全北區(qū)亞種菌株的LPS具有相似的結(jié)構(gòu)(和性質(zhì))，提取土拉熱弗朗西絲氏菌Schu S4菌株(土拉熱亞種)的LPS。
凝膠電泳后，從土拉熱弗朗西絲氏菌Schu S4菌株提取的LPS顯示特征性梯度圖。然而，所述LPS難以染色并且為了顯現(xiàn)菌體抗原的條帶需要額外的氧化。這提示土拉熱弗朗西絲氏菌Schu S4菌株的菌體抗原中的糖不是與在大多數(shù)其它細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的菌體抗原的糖相同的方式被氧化。
土拉熱弗朗西絲氏菌Schu S4菌株的菌體抗原基因簇含有15個(gè)基因，其推定的功能以BLAST結(jié)果和菌體抗原中含有的糖的結(jié)構(gòu)信息為基礎(chǔ)來確定(參見上表1)。所述聚簇中的基因可能負(fù)責(zé)產(chǎn)生菌體抗原分子以及運(yùn)送所述分子到細(xì)菌細(xì)胞外。
有兩種主要的菌體抗原合成模式，菌體抗原聚合酶(wzy)依賴的和wzy獨(dú)立的。在依賴wzy的系統(tǒng)中，認(rèn)為聚合酶(wzy)、翻轉(zhuǎn)酶(wzx)和鏈長決定簇(wzz)是細(xì)胞壁中使LPS分子聚合和輸出的復(fù)合體的部分。在wzy獨(dú)立的系統(tǒng)中，一組不同的蛋白參與LPS分子的轉(zhuǎn)運(yùn)和聚合。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由ATP驅(qū)動并且由屬于ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的wzt和wzm兩種蛋白組成。
在土拉熱弗朗西絲氏菌菌體抗原基因簇中，存在與wzy和wzx有高度同一性的蛋白，提示菌體抗原的轉(zhuǎn)運(yùn)和聚合是通過依賴wzy的途徑。
對推定的菌體抗原翻轉(zhuǎn)酶(Wzx)和聚合酶(Wzy)蛋白的TMHMM分析支持它們基于序列相似性的確定功能。預(yù)測的土拉熱弗朗西絲氏菌蛋白跨膜螺旋數(shù)，Wzx和Wzy分別是14和11，與那些在其它細(xì)菌中預(yù)測的相似，其中已預(yù)測這些細(xì)胞質(zhì)膜蛋白具有約10-12個(gè)跨膜螺旋。對于土拉熱弗朗西絲氏菌Wzy蛋白，預(yù)測2個(gè)大周質(zhì)結(jié)構(gòu)域與弗氏志賀氏菌(Shigella Flexneri)Wzy蛋白的兩個(gè)大周質(zhì)結(jié)構(gòu)域是一致的。
沒有鑒定出可以編碼Wzz同源物的基因，說明在土拉熱弗朗西絲氏菌基因組中不存在這樣的同源物。
基因wbtA至wbtL緊靠著或重疊提示這些基因作為一個(gè)操縱子轉(zhuǎn)錄。
下游大約0.5Kb是wbtM，其具有自己的推定啟動子。第二個(gè)轉(zhuǎn)座酶的下游是manC和manB，同樣有它們推定的啟動子并且或許不參與菌體抗原的生物合成，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)甘露糖既不是土拉熱弗朗西絲氏菌菌體抗原結(jié)構(gòu)部分，也不是其合成所需的中間產(chǎn)物。
這兩個(gè)基因manC和manB可能曾經(jīng)參與土拉熱弗朗西絲氏菌先祖中菌體抗原的生物合成。鄰接菌體抗原生物合成基因簇wbtA至wbtM的轉(zhuǎn)座酶的存在，提示已同步獲得這個(gè)或許置換祖先的多糖基因簇的聚簇。
菌體抗原基因簇似乎存在于所有篩選過的土拉熱亞種和B菌株中。然而，在土拉熱亞種和B菌株含有轉(zhuǎn)座酶的區(qū)域的聚簇間至少有一處差異。用部分缺失的轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行BLAST分析，已揭示在土拉熱弗朗西絲氏菌Schu S4基因組中所述聚簇可能超過50個(gè)拷貝。所述土拉熱弗朗西絲氏菌基因組中的插入序列源于肺炎鏈球菌(S.pneumonia)并且在基因組內(nèi)隨機(jī)拷貝是可能的。鄰接插入序列的可讀框在土拉熱弗朗西絲氏菌基因組內(nèi)沒有顯著同源性，提示這些基因?qū)τ谶@個(gè)含插入序列的基因座是不重要的。
在土拉熱亞種菌株中，這種插入已變成缺失而僅留下轉(zhuǎn)座酶片段和下游序列。土拉熱亞種和全北區(qū)亞種聚簇間的總體相似性似乎說明所述插入發(fā)生在土拉熱弗朗西絲氏菌中所述亞種分裂前。土拉熱亞種轉(zhuǎn)座酶的部分缺失可達(dá)到穩(wěn)定該DNA區(qū)的結(jié)果，因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)這個(gè)酶是發(fā)生插入事件所必需的。
影響所述聚簇在土拉熱亞種或者B菌株中的表達(dá)似乎是不可能的。其可能是在土拉熱亞種菌株中，轉(zhuǎn)座酶的部分基因由于基因組降低大小已丟失。然而，如果從不同的亞種擴(kuò)增DNA，則跨越該區(qū)產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物大小的總差異可用于診斷方法中。
本申請人已發(fā)現(xiàn)與在土拉熱弗朗西絲氏菌Schu S4菌株中發(fā)現(xiàn)的相似的菌體抗原基因簇存在于土拉熱弗朗西絲氏菌的其它菌株中。這包括全北區(qū)亞種菌株。因此，利用菌體抗原產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗有希望提供保護(hù)，以防止一些土拉熱弗朗西絲氏菌強(qiáng)毒株的感染。
本申請人已證明源自土拉熱弗朗西絲氏菌土拉熱亞種菌株的LPS是保護(hù)性的。具體地講，它似乎防止除土拉熱弗朗西絲氏菌土拉熱亞種以外的菌株的攻擊，特別是防止土拉熱弗朗西絲氏菌全北區(qū)亞種的攻擊?？紤]到上述報(bào)告的結(jié)果，提示土拉熱弗朗西絲氏菌全北區(qū)亞種的LPS不能防止其它土拉熱弗朗西絲氏菌的感染，所以這一發(fā)現(xiàn)是意想不到的。這樣，如上所述的重組疫苗將特別有用。
因而，再一方面，本發(fā)明提供可從土拉熱弗朗西絲氏菌土拉熱亞種得到的LPS，將其用作防止土拉熱弗朗西絲氏菌感染的疫苗。含有土拉熱弗朗西絲氏菌土拉熱亞種LPS的疫苗組合物也是新穎的并構(gòu)成本發(fā)明的又一方面。這些將包含如上所述的藥學(xué)上可接受的載體。
現(xiàn)在將通過實(shí)施例并參考附圖，對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述

圖1從大腸桿菌K325菌株(1.25μg，泳道1)和土拉熱弗朗西絲氏菌Schu S4菌株(50μg，泳道2)分離的LPS的SDS-PAGE分析。
圖2土拉熱弗朗西絲氏菌Schu S4菌株中菌體抗原基因簇的遺傳組構(gòu)。菌體抗原簇的G+C含量示于上圖。
圖3土拉熱弗朗西絲氏菌Schu S4菌株菌體抗原亞單位的示意結(jié)構(gòu)和菌體抗原基因簇基因推定功能的確定。顯示一個(gè)具有糖殘基和所需糖苷鍵的菌體單位。
圖4表示基因組區(qū)，即其編碼圖5所示的所有蛋白質(zhì)的土拉熱弗朗西絲氏菌基因組的核酸序列。
圖5表示由SEQ ID NO 1編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列以及許多側(cè)翼基因序列。
圖6表示編碼菌體抗原產(chǎn)生必需的酶的核酸序列(SEQ ID NO1)。
實(shí)施例1方法細(xì)菌菌株和生長條件用于本項(xiàng)研究的細(xì)菌菌株如表2所示，在37℃，BCGA瓊脂上培養(yǎng)48小時(shí)。
表2
LPS純化用熱苯酚和水抽提方法(Westphal O等，(1965).Methods inCarbohydrate Chemistry 583-91)，從土拉熱弗朗西絲氏菌Schu S4菌株中純化LPS。
凝膠電泳和銀染色根據(jù)Laemmli的方法(Laemmli UK，(1970).Nature 227680-685)，使用12.5％分離膠和4.5％積層膠，進(jìn)行甘氨酸凝膠電泳。每個(gè)樣品10μl在Mini-protean II板系統(tǒng)(Biorad)中以100mV電泳大約2小時(shí)。根據(jù)Chart的方法(Chart H.(1994)LPSIsolation andCharacterisation.載于Raton B，Arbor A(主編)Methods in PracticalLaboratory Bacteriology.CRC Press，London，Tokyo，第11-20頁)，對凝膠進(jìn)行銀染色。然而，氧化步驟需增加到10分鐘。
核苷酸序列分析編碼菌體抗原生物合成聚簇的序列是從參與其它細(xì)菌的菌體抗原生物合成的已知蛋白質(zhì)序列(得自GenBank)中提取和鑒定的，所述序列用于探測土拉熱弗朗西絲氏菌Schu S4的部分基因組序列(PriorRG等，(2001)Journal of applied microbiology 91614-620)，在http//artedi.ebc.uu.se/Projects/Francisella/，用TBLASTN(Altschul SF.等，(1997)Nucleic acids research 253389-3402)得到。提取含有推定菌體抗原基因簇的毗連群并隨后用注釋工具Artemis(http//www.sanger.ac.uk/Software/Artemis)進(jìn)行分析。使得BLASTN、BLASTX和BLASTP的搜尋、GC含量和其它的在序列和預(yù)測蛋白質(zhì)上進(jìn)行的分析得以顯現(xiàn)。
用TMHMM(Sonnhammer ELL等，(1998)，載于Glasgow J，Littlejohn T等(主編)The sixth international conference on intelligentsystems for molecular biology.AAAI Press，Menlo Park，CA，第175-182頁)分析由推定的菌體抗原翻轉(zhuǎn)酶基因(wzx)和菌體抗原聚合酶基因(wzy)編碼的蛋白質(zhì)序列的跨膜螺旋。
推定的菌體抗原基因簇的PCR分析按Karlsson等，2000(Micro.Comp.Genom.525-39)所描述的，用苯酚抽提制備土拉熱弗朗西絲氏菌菌株DNA，如表1所示。用DNAstar程序PrimerSelect設(shè)計(jì)10對重疊的PCR引物，以擴(kuò)增全部的推定菌體抗原基因簇的約2kb區(qū)段。雖然所有引物都在49℃成功應(yīng)用，但設(shè)計(jì)的引物退火溫度范圍為42-59℃。
這些引物對的結(jié)構(gòu)概述在表3中。
表3
每一對引物與每一個(gè)DNA模板的PCR擴(kuò)增在下列混合物中進(jìn)行1×PCR緩沖液(包括1.5mM MgCl2)，0.2mM脫氧核苷三磷酸(dNTP)，2.5mM正向引物，2.5mM反向引物，2.0μl模板DNA，0.5UTaq聚合酶和到20μl最終體積的過濾的無菌水。反應(yīng)混合物在90℃保溫1分鐘，然后在90℃1分鐘，49℃1分鐘，72℃2分25秒循環(huán)共30次，最終在72℃保溫10分鐘。PCR產(chǎn)物在0.5％瓊脂糖凝膠上，用溴化乙錠染色顯現(xiàn)。PCR緩沖液、dNTP和聚合酶購自Roche。PCR引物由MWG-Biotech合成。
PCR產(chǎn)物克隆將用引物對8，從Schu S4、HN63和LVS DNA擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T easy(Promega)中，供測序分析用。將連接的DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(Promega)中，推定的克隆既用菌落PCR又用限制性內(nèi)切酶消化進(jìn)行篩選。包括連接、轉(zhuǎn)化、菌落PCR、限制性內(nèi)切酶消化和瓊脂糖凝膠電泳在內(nèi)的所有DNA操作均按照Sambrook等，(1987)Molecular cloningA laboratory manual.Cold Spring Harbor，New York)描述的方法進(jìn)行。
根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書，用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)完成從瓊脂糖凝膠中純化PCR產(chǎn)物。
這三個(gè)構(gòu)建體使用通用引物，用雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger F等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.745463-5467)，在Oswel上測序。比較每個(gè)序列并且用ARTEMIS軟件包的BLAST(Altschul SF等，(1990)Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.215403-410)功能在本地保留的GenBank數(shù)據(jù)庫中搜尋同源性，以鑒定DNA差異區(qū)的功能。
菌體抗原分子的質(zhì)譜法分析結(jié)果LPS純化采用熱苯酚-水抽提方法，從2.2g凍干土拉熱弗朗西絲氏菌SchuS4菌株中純化LPS。這可獲得7mg LPS，得率是0.3％。LPS在SDS-PAGE和銀染色后難以顯現(xiàn)。將氧化步驟從5分鐘增加到10分鐘，以顯現(xiàn)梯狀帶(圖1)。
土拉熱弗朗西絲氏菌菌體抗原生物合成的基因簇發(fā)現(xiàn)土拉熱弗朗西絲氏菌菌體抗原生物合成基因簇的長度是17kb并且含有15個(gè)基因，推定為側(cè)翼接有兩個(gè)轉(zhuǎn)座酶(圖2)的基因，參與菌體抗原生物合成?？赡艿膯幼游稽c(diǎn)鑒定為剛好在wbtA和wbtM基因的上游。manC和manB基因位于第二轉(zhuǎn)座酶的下游，而可能的啟動子正好在manC的上游。
圖2也顯示使用500個(gè)堿基窗口大小的聚簇的G+C含量圖。所述基因組該區(qū)的全部G+C含量在31.27％，略低于該基因組大約33％的平均G+C含量。該圖顯示所述聚簇的中心部分，從wzy至wbtK，通常具甚至更低的G+C含量。
在相反鏈上manC的下游，坐落有轉(zhuǎn)錄終止因子rho和硫氧還蛋白基因。在大腸桿菌中，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因都鄰接腸細(xì)菌共同抗原-多糖生物合成基因簇的一端。
土拉熱弗朗西絲氏菌的菌體抗原重復(fù)單位和參與菌體抗原生物合成基因的推定作用如圖3所示，基于它們與其它LPS和糖生物合成基因的同源性，特別是表達(dá)相似菌體抗原重復(fù)結(jié)構(gòu)的銅綠假單胞菌06血清型(Knirel YA等，(1985)Eur.J.Biochem.150541-550)，確定了該基因產(chǎn)物的推定作用。
推測2-乙酰氨基-2，6-雙脫氧-D-葡萄糖(QuiNAc)的生物合成涉及脫水酶WbtA和顯示與尿苷二磷酸葡糖4-差向異構(gòu)酶同源的WbtC。WbtA和WbtC共享與銅綠假單胞菌06菌株的WbpM和WbpV的同源性，認(rèn)為兩者都參與QuiNAc生物合成并且是06菌體抗原合成的要素。推測WbtE、WbtF和WbtH參與2-乙酰氨基-2-脫氧-D-半乳糖醛胺(GalNAcAN)的生物合成。WbtF顯示與尿苷二磷酸葡糖4-差向異構(gòu)酶有同源性，包括WbpP和VipB，而WbtE顯示與WbpO和VipA有同源性，UDP-GalNAc脫氫酶分別參與銅綠假單胞菌和腸道沙門氏菌傷寒變種(Salmonella enterica var typhi)中2-乙酰氨基-2-脫氧-D-半乳糖醛酸(GalNAcA)的形成。WbtH同谷氨酰胺轉(zhuǎn)酰胺酶產(chǎn)生有意義的排列，包括銅綠假單胞菌06血清型的WbpS，推測可能參與GalNAcAN酰胺基形成。第四種糖即4N-甲酰-奎諾糖胺(Qui4NFm)的生物合成最有可能涉及WbtI、WbtJ、WbtL和WbtM。序列同源性提示W(wǎng)btM作為dTDP-D-葡萄糖4，6-脫水酶起作用時(shí)，WbtL可能與WbtM一起參與活化糖dTDP-D-葡萄糖的形成。預(yù)測WbtI參與Qui4NFm氨化，因?yàn)槠滹@示與perosamine合成酶RfbE有同源性。最終，WbtJ可能負(fù)責(zé)添加顯示與甲酰轉(zhuǎn)移酶有顯著同源性的N-甲酰基部分。
需要特殊的糖基轉(zhuǎn)移酶形成菌體抗原重復(fù)的寡糖單位。四種糖基轉(zhuǎn)移酶在土拉熱弗朗西絲氏菌中每一種菌體抗原單位的合成中是必不可少的。基于同源性，推測WbtB介導(dǎo)將QuiNAc添加到磷酸十一萜醇(Und-P)上，以起始菌體抗原生物合成。WbtD和WbtG很可能是GalNAcAN轉(zhuǎn)移酶，可能參與將兩個(gè)連續(xù)的GalNAcAN殘基添加到菌體抗原單位上。WbtD與銅綠假單胞菌06菌株的WbpU共享同源性，推測將2-甲酰胺基-2-脫氧-D-半乳糖醛胺(GalNFmAN)轉(zhuǎn)移到QuiNAc上(Belanger M等，(1999).Microbiology 1453505-3521)。WbtG與銅綠假單胞菌的WbpT同源，被認(rèn)為參與將GalNAcA添加到GalNFmAN。WbtK可能是第四個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，其添加4，6-雙脫氧-4-甲酰胺基-D-葡萄糖(QuiNA4Fm)，以完成四糖O單位。
Wzx和Wzy一旦裝配，菌體抗原重復(fù)單位就通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/翻轉(zhuǎn)酶Wzx轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)膜的周質(zhì)面。然后，Wzy擔(dān)當(dāng)菌體抗原重復(fù)單位聚合酶。如果用TMHMM分析，土拉熱弗朗西絲氏菌Wzx蛋白具有預(yù)測的14個(gè)跨膜螺旋，其兩端位于膜的細(xì)胞質(zhì)一側(cè)。土拉熱弗朗西絲氏菌Wzy蛋白具有預(yù)測的11個(gè)跨膜螺旋，預(yù)測的氨基末端在膜的細(xì)胞質(zhì)一側(cè)，羧基末端在間質(zhì)一側(cè)。另外，預(yù)測Wzy蛋白具有氨基酸142-178和氨基酸268-327的兩個(gè)大的周質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
與菌體抗原鏈長決定簇(wzz)同源的基因在當(dāng)前的土拉熱弗朗西絲氏菌Schu S4序列數(shù)據(jù)集中尚未鑒定出來。
菌體抗原基因簇的PCR分析8個(gè)來自每個(gè)模板DNA的PCR產(chǎn)物(引物組2、3、4、5、6、7、9和10)，如果通過瓊脂糖凝膠電泳觀察，顯示一樣的大小。由于缺乏適當(dāng)?shù)脑摼鄞厣嫌我l(fā)位點(diǎn)，覆蓋基因簇起始位點(diǎn)的引物對1必須設(shè)計(jì)可擴(kuò)增一個(gè)4.8Kb區(qū)，因?yàn)樵谒鐾晾瓱岣ダ饰鹘z氏菌Schu S4基因組中存在發(fā)現(xiàn)多次的插入元件。該引物對1對于土拉熱弗朗西絲氏菌Schu S4，產(chǎn)生對應(yīng)大小的產(chǎn)物，但是如果用于全北區(qū)亞種LVS菌株，則沒有產(chǎn)物產(chǎn)生。因此，該引物對可具體應(yīng)用于需要區(qū)別土拉熱弗朗西絲氏菌土拉熱亞種和土拉熱弗朗西絲氏菌全北區(qū)亞種的診斷中。在含有前者的DNA樣品存在時(shí)，運(yùn)用引物對1的PCR將產(chǎn)生在第二種情況下不存在的產(chǎn)物。
使用引物對8的PCR揭示土拉熱亞種菌株和全北區(qū)亞種和中亞細(xì)亞亞種間的大小差異。如果與全北區(qū)亞種菌株(包括LVS)和中亞細(xì)亞亞種比較，則土拉熱亞種菌株顯示303個(gè)核苷酸缺失。對土拉熱亞種Schu S4菌株的該區(qū)的克隆和序列分析，全北區(qū)亞種HN63和LVS菌株顯示發(fā)生在Schu S4中推定轉(zhuǎn)座酶起始部位的缺失與肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的ORF1 IS630-spn 1轉(zhuǎn)座酶相似。
因此，引物對8也可具體用于區(qū)別土拉熱弗朗西絲氏菌菌株。含DNA的樣品在用這些引物進(jìn)行PCR反應(yīng)后，以大小為基礎(chǔ)分離產(chǎn)物，例如在凝膠上分離，應(yīng)可揭示它們間可區(qū)別的差異。
實(shí)施例2保護(hù)效果LPS純化利用上述實(shí)施例1中提及的熱苯酚和水抽提方法，從土拉熱弗朗西絲氏菌Schu S4菌株中或LVS菌株中純化LPS。
LPS免疫和保護(hù)研究通過用所得純的LPS，經(jīng)腹膜內(nèi)途徑免疫多組雌性BALB/c小鼠(每組6只小鼠)，測定土拉熱弗朗西絲氏菌LVS菌株或Schu S4菌株LPS保護(hù)BALB/c小鼠免遭土拉熱弗朗西絲氏菌感染的能力。在每次給藥情況下，給予小鼠含50μg LPS的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。小鼠接受三次免疫，每次間隔7天。
在最后一次免疫后21天，用土拉熱弗朗西絲氏菌LVS(1×105cFU)經(jīng)腹膜內(nèi)攻擊小鼠。所有的對照動物在攻擊后全都死亡。已免疫從所述LVS菌株分離的LPS的小鼠獲得保護(hù)免于死亡。已用SchuS4或LVS菌株的LPS免疫的小鼠顯示并延長死亡時(shí)間。在攻擊劑量10cfu時(shí)，用Schu S4 LPS免疫的動物比未免疫對照動物平均存活時(shí)間長64小時(shí)(有99％置信度)。
權(quán)利要求
1.一種編碼一系列酶或酶片段的核酸，所述核酸當(dāng)在細(xì)胞中一起表達(dá)時(shí)，能夠在給予所述核酸的動物體內(nèi)產(chǎn)生免疫原性部分，所述免疫原性部分能夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，所述應(yīng)答可防止土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis)感染，所述核酸至少編碼SEQ ID NO 3-17的某些酶或其修飾物。
2.權(quán)利要求1的核酸，其中所述核酸編碼SEQ ID NO 3-17的酶。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的核酸，所述核酸包括SEQ ID NO 1或其變異體。
4.權(quán)利要求3的核酸，其中所述核酸是SEQ ID NO1。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸，其中已優(yōu)化用于細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的密碼子。
6.權(quán)利要求5的核酸，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)。
7.一種包括SEQ ID NO 1片段的核酸，其中所述核酸可用于檢測樣品中存在的SEQ ID NO 1。
8.權(quán)利要求7的核酸，其中所述核酸包括擴(kuò)增引物。
9.權(quán)利要求8的核酸，其中所述核酸選自SEQ ID NO 21、SEQ IDNO 22、SEQ ID NO 35或SEQ ID NO 36。
10.一種活疫苗載體，所述活疫苗載體包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸。
11.權(quán)利要求10的活疫苗載體，所述活疫苗載體包括細(xì)菌載體。
12.權(quán)利要求11的活疫苗載體，其中所述細(xì)菌是沙門氏菌(Salmonella sp.)。
13.一種疫苗，所述疫苗包含權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的活疫苗載體以及藥學(xué)上可接受的載體。
14.一種制備預(yù)防性疫苗或治療性疫苗的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的核酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，然后從所述培養(yǎng)物中回收保護(hù)性免疫原性部分。
15.一種表達(dá)載體，所述載體包含權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的核酸。
16.一種用權(quán)利要求15的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
17.土拉熱弗朗西絲氏菌的重組菌體抗原，所述重組菌體抗原可通過權(quán)利要求14的方法獲得。
18.一種疫苗，所述疫苗包含權(quán)利要求17的重組菌體抗原以及藥學(xué)上可接受的載體。
19.一種診斷土拉熱弗朗西絲氏菌感染的方法，所述方法包括檢測取自懷疑受感染患者的樣品中的權(quán)利要求7的核酸序列。
20.一種區(qū)別土拉熱弗朗西絲氏菌菌株的方法，所述方法包括選擇對SEQ ID NO 1具有特異性而對除土拉熱弗朗西絲氏菌土拉熱亞種以外的亞種中的相似序列沒有特異性的引物或探針，或者當(dāng)用于分析其它種屬時(shí)，產(chǎn)生可區(qū)別的產(chǎn)物，并利用所述引物或探針進(jìn)行分析。
21.權(quán)利要求20的方法，其中使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和一對引物進(jìn)行所述分析。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述引物對SEQ ID NO 1的起始區(qū)具有特異性。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述引物是SEQ ID NO 21和SEQID NO 22。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述引物對SEQ ID NO 1的末端轉(zhuǎn)座酶編碼區(qū)具有特異性。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述引物是SEQ ID NO 35和SEQID NO 36。
26.從土拉熱弗朗西絲氏菌土拉熱亞種獲得的脂多糖(LPS)，所述脂多糖用作抵抗土拉熱弗朗西絲氏菌感染的疫苗。
27.權(quán)利要求26的LPS，其中所述土拉熱弗朗西絲氏菌土拉熱亞種菌株是Schu4菌株。
28.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含權(quán)利要求26或權(quán)利要求27的LPS以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本申請涉及編碼負(fù)責(zé)產(chǎn)生土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis)菌體抗原的酶的核酸及其作為疫苗或者在疫苗生產(chǎn)和診斷中的用途。
文檔編號C12N1/19GK1671845SQ03817518
公開日2005年9月21日 申請日期2003年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月31日
發(fā)明者J·L·普里奧爾, R·G·普里奧爾, P·G·希欽, A·德爾, R·W·蒂特巴爾 申請人:英國國防部