專利名稱：基于醇脫氫酶的雙相偶聯(lián)酶促反應體系的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及由酶操縱的偶聯(lián)反應體系，該偶聯(lián)反應體系的與眾不同之處為其在雙相的溶劑混合物中進行。具體而言，本發(fā)明涉及一種反應體系，它包括有機化合物的輔因子依賴性酶促轉化以及在同一體系中的酶輔因子的再生。
用生物催化方法對具有光學活性的有機化合物(例如乙醇和氨基酸)的分離變得越來越重要。偶聯(lián)使用兩種可進行輔因子再生的脫氫酶已經證實是大規(guī)模工業(yè)化合成這些化合物的一種方法(DE 197 53 350)。
圖示1 在三甲基丙酮酸被還原性氨基化為L-假亮氨酸的過程中，用NAD依賴性甲酸脫氫酶原位再生NADH(Bommarius et al.Tetrahedron Asymmetry 1995，6，2851-2888)。
與大量的合成的含金屬催化劑比較，有效應用于水性介質的生物催化劑除它們的催化特性以及有效性以外，還具有的其它優(yōu)點是可以避免使用含金屬的添加材料，特別是含有重金屬并因此有毒的添加材料。此外，例如在不對稱還原作用的過程中，也可以避免使用昂貴及可能有害的還原劑，例如硼烷。
然而，在微溶于水的底物的轉化過程中出現了難題。對于微溶于水的產物也存在著同樣的難題。特別是在根據上述觀點制備具有光學活性的醇上便存在這一難題，因為所需的作為原料化合物的酮比圖示1中所采用的α-酮酸有著顯著更低的溶解度。
原則上一個可能的解決方法是在一種極性有機溶劑或其水溶液中實施生物催化還原。在這種情況中，酶和底物兩者以及任選地產物都應當是可溶的。然而，直接出現有機溶劑的一個常見缺點在于，在這些條件下通常發(fā)生酶活性的相當大的減低(見，例如，Anderson et al.，Biot.echnol.Bioeng.1998，57，79-86)。準確地說，甲酸脫氫酶，且特別是來源于博伊丁假絲酵母或其突變體的甲酸脫氫酶，是至今在工業(yè)化規(guī)模生產中所采用的并且是商品化可獲得的唯一一種NADH再生酶，遺憾的是它對有機溶劑有著高敏感性(EP 1 211 316)。在使用DMSO、環(huán)丁砜、MTBE、丙酮、異丙醇和乙醇等有機溶劑成分的對比例1-8中也顯示了這一點，每種溶劑的補給量均為10％(見圖1)。
為解決這個問題的各種已知的方法都考慮到要穩(wěn)定有機溶劑中的來源于博伊丁假絲酵母的甲酸脫氫酶，例如通過以表面活性物質的形式附加使用表面活性劑(tensides)進行反應。但這種方法的缺點是，反應的速度被降低近40倍(！)，并且會出現對甲酸脫氫酶的抑制(B.Orlich et al.，Biotechnol.Bioeng.1999，65，357-362.)。作者另外注意到，因為醇脫氫酶的低穩(wěn)定性，微乳狀液條件下的還原方法是不經濟的。在EP 340 744中所描述的方法原則上也具有相同的缺點，其中在存在水相和/或有機相的情況下將易溶中間相(lyotropic mesophases)選為反應位點。
實現生物催化反應的另一種基本可能性包括在有機溶劑中應用固定化酶或在由水和易混于水的有機溶劑組成的均質溶液中應用酶。然而將這些有機溶劑與酶發(fā)生直接接觸的技術僅在少數的酶類獲得成功，特別是水解酶。例如，在DE 44 36 149中提及“只有少數屬于水解酶類的酶耐受有機溶劑(易混于水的或與非易混于水的)的直接存在”。盡管在此期間已知有其它酶類的一些其它實例(包括醇腈酶和來源于酵母的FDH)，但DE 44 36 149中的陳述對大多數酶而言仍是正確的。此外，來源于博伊丁假絲酵母的FDH能否有效固定化是未知的。另外，與固定化本身相關的是固定化步驟及固定化材料所帶來的額外費用。
因此，工業(yè)上已經發(fā)展了新的方法以避免因有機溶劑的存在而引起的酶失活或變性的危險。例如，DE 44 36 149描述了一種方法，其中通過產物可通透性膜將產物從反應溶液提取到有機溶劑中，特別是通過一種疏水性膜。然而，與攪拌罐反應器中的標準方法比較，本發(fā)明無疑在技術上有著更多的要求；另外，所需的有機膜也是增加額外費用的因素。另外，本方法只適合于連續(xù)運作。而且，一個缺點是用這個方法得到的時空產率相對較低。例如，在乙酰苯的還原過程中，所得到的時空產率只有88g/(L*d)(S.Rissom etal.，TetrahedronAsymmetry1999，10，923-928)。關于這一點，要注意到乙酰苯本身是相當好的水溶性酮，而絕大多數類似的取代乙酰苯的酮以及相關的酮具有顯著更低的可溶性，因此常見的疏水性酮的時空產率應當是明顯更低的。盡管存在這些相當大的缺點，但是該方法至今還被認為是用單個酶不對稱生物催化還原弱可溶性酮的優(yōu)選方法(也見A.Liese，K.Seelbach，C.Wandrey，IndustrialBiotransformations，Wiley-VCH Verlag，Weinheim，2000，pp.103-106)。
Tien Van Nguyen(Rheinisch-Westflische Technische HochschuleAachen，1998)的博士論文中描述了一種用于還原對氯乙酰苯的反應體系，其組成為存在于庚烷/水溶劑體系中的醇脫氫酶、NADH、甲酸脫氫酶。在此每種情況下所用的底物的濃度均為10mmol/L溶劑總體積(＝有機溶劑和水性部分的體積的總和。根據這些結果，僅在達到這樣的底物濃度時才有可能得到可接受的產物產率。而底物濃度為10mM或更低時，是不足以進行工業(yè)化應用的，這樣的情況下所得到的時空產率太低，無法進行工業(yè)化應用。
順便提及，就這些問題來說，T.N.Nguyen在更高的底物濃度所做的評估也在其他文獻出版物中得到證實，這導致產生了以上提及的已經被嘗試的溶液，例如通過使用膜。
此外，在其關于通過還原一種酮而生物催化制備一種藥物活性物質的文章中，Anderson等指出(也是通常被認為的)，更高的底物濃度還有其他的缺點，即普遍出現的毒性作用，特別是在疏水性醇的情況下。該文章(B.A.Anderson et al.，J.Am.Chem.Soc.1995，117，12358-12359)記載，不同于活性測試的是，規(guī)?；苽涞姆磻簿驼f以“可接受的底物濃度”進行的反應，由于存在相當程度的毒性作用，因此被證明是有問題的。在這種情況下，甚至當酶被“固定化于”反應室(cells)中時也能觀察到這些作用，此外，在水性溶液中也能觀察到?？梢韵胂?，在更高的底物濃度情況下所出現的相應的抑制作用，也會相應地以更高的程度出現于使用“游離的”分離的酶和存在有機溶劑的情況下。
綜上所述，因此可以注意到現在還不知道有方法可以有助于避免上面羅列的缺點并容許以工業(yè)化規(guī)模酶促制備微溶于水的底物。
因此本發(fā)明的目的是說明一種可能性，具體為如何能夠充分有效地使得微溶于水的有機化合物進行偶聯(lián)的輔因子依賴性酶促轉化，以便在有利于經濟和環(huán)保的條件下實現轉化的工業(yè)化規(guī)模的應用。特別的，一個目的是這種方法應當適合用于微溶于水的酮的還原。
這個目的是以權利要求書中所定義的方式而實現的。權利要求1到10涉及一種根據本發(fā)明進行操縱的反應體系。權利要求11保護一種裝置。權利要求12涉及一種根據本發(fā)明進行操縱的方法，而權利要求13和14涉及根據本發(fā)明的反應體系的優(yōu)選用途。
本發(fā)明能夠提供這樣一種偶聯(lián)酶促反應體系，其包括，在一種水相與液態(tài)有機相直接接觸的雙相溶劑體系中，用醇脫氫酶對有機化合物進行輔因子依賴性酶促轉化并對所述輔因子進行酶促再生，且所述有機化合物的濃度為＞25mM每升溶劑總體積(＝有機溶劑和水性部分的體積的總和)，基于這一點，獲得了對上述目的的解決方案，尤其是以令人驚訝的、決無可預計的、且根據本發(fā)明是特別有利的一種方式獲得了該解決方案。與從本領域的現有技術所能推定出的觀點不同，令人驚奇地是，盡管存在有機溶劑，但仍能夠進行該偶聯(lián)酶促反應體系，且該溶劑不會造成那些濃度足以滿足工業(yè)化規(guī)模生產的酶中的一種的活性減低。
在反應體系中所使用的有機溶劑是用來與存在的水相形成兩個分離相。在這個要求的范圍內，本領域人員原則上可以自由地選擇有機溶劑。然而，如果所選定的有機相的溶劑具有盡可能低的在水中的溶解度(logP值≥3、優(yōu)選的≥3.1、更優(yōu)選的≥3.2等)，已經被證實是有利的。既然有機溶劑同時也用來吸納微溶于水的離析物，那么所述的溶劑具有對所使用的有機化合物的盡可能高的溶解度也是重要的。
在反應體系中可以優(yōu)選地采用的這種類型的有機溶劑是在給定的反應條件下為液態(tài)的芳香族或脂族烴。具體地，甲苯、二甲苯、苯、正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、異辛烷、環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷以及它們的側鏈異構體是最為特別優(yōu)選的。也可以使用鹵代烴(CHCl3、CH2Cl2、氯苯等)。
可以任意選擇有機溶劑與水部分的數量比例。所使用的有機溶劑的相對于溶劑總體積(＝有機溶劑和水性部分的體積的總和)的量是5-80vol％、優(yōu)選的10-60vol％、特別優(yōu)選的20-50vol％。
根據本領域現有技術所用的方法，為了增加酶促轉化，需向酶反應混合物中添加表面活性劑，其中在反應過程中的相變被最小化，與此不同的是，本發(fā)明證實，使用根據本發(fā)明的反應體系，在體系中不含表面活性劑時，可相當成功地進行酶促轉化。
文章中的名詞“表面活性劑”被理解為指的是所有那些能夠建立膠束結構或能夠減低液-液相分界上的表面張力的物質。
如已說明的那樣，在反應體系中所使用的底物的濃度應當是從經濟的角度出發(fā)有利于完成轉化的濃度。因此，反應開始前的有利的有機化合物的濃度應當是每升總體積溶劑(＝有機溶劑和水部分的總和)＞25mM、優(yōu)選＞100mM、特別優(yōu)選＞200mM、以及最為特別優(yōu)選＞500mM。濃度的上限是由確保反應的可行性所自然地決定的；特別的，在每種情況下都應當達到反應混合物的可攪拌性。然而，反應也可以優(yōu)選在超過底物或產物的飽和度限度的濃度情況下進行。
輔因子是本領域人員所熟知的(Enzyme Catalysis in OrganicSynthesis，Ed.K.Drauz，H.Waldmann，1995，Vol I，p.14，VCH)。對于要催化的氧化還原反應而言，在此可以考慮的醇脫氫酶優(yōu)選地可以使用，作為輔因子的分子，例如NAD、NADH、NADPH或NADP作為氫的載體。
根據本發(fā)明，為了將酮基轉化為醇基的目的，本領域人員可以在所有被考慮的酶反應中采用所述的偶聯(lián)酶促反應體系。然而，優(yōu)選設定的是氧化還原酶反應。根據本發(fā)明所使用的醇脫氫酶優(yōu)選地來源于生物體紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)(S-ADH)或高加索酸奶乳桿菌(Lactobacillus kefir)(R-ADH)(Nguyen Doctoral Thesis，Aachen，1998)。
再生輔因子的酶原則上取決于所用的輔因子，但另一方面也取決于被氧化或還原的輔助底物(cosubstrate)。Enzyme Catalysis in OrganicSynthesis，Ed.K.Drauz，H.Waldmann，1995，Vol I，VCH，p.721給出了多種用于再生NAD(P)的酶的名稱。為此，優(yōu)選地可使用所謂的甲酸脫氫酶(FDH，圖示1)，該酶具有商業(yè)價值并可大量獲得，同時其也可用于氨基酸的合成。因此，其可優(yōu)選地用于輔因子的再生。最為優(yōu)選地，FDH來源于生物體博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)，也可使用在其基礎上進一步開發(fā)的突變體(DE 197 53 350)。特別令人驚異的是，盡管觀察到其存在與有機溶劑相關聯(lián)的高度不穩(wěn)定性(見實驗部分的對比例)，但在這些條件下，仍可高效地使用來源于博伊丁假絲酵母的甲酸脫氫酶。
來源于例如高加索酸奶乳桿菌(Lactobacillus kefir)或短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的所謂的NADH氧化酶可用于再生NADH。
在下一個進展中，本發(fā)明涉及一種轉化有機化合物的裝置，它包括根據本發(fā)明的反應體系。利于被采用的裝置是例如可以被分批操縱或連續(xù)操縱的攪拌罐或攪拌罐級聯(lián)、或膜反應器。
在本發(fā)明的范圍內，名詞“膜反應器”被理解為指的是任何反應容器，其中催化劑被密封于反應器中而小分子物質能被添加到反應器或能與之分離。同時，膜可以被直接地插入到反應槽中或可以被安裝在外面的獨立的過濾組件中，其中反應溶液連續(xù)或間斷地流經過濾組件而存留物被循環(huán)回到反應器內。在WO 98/22415和在Wandrey et al.in Jahrbuch1998，Verfahrenstechnik and Chemieingenieurwesen，VDI p 151ff.；Wandreyet al.in Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds，Vol.2，VCH 1996，p 832ff.；Kragl et al.，Angew.Chem.1996，6，684f中描述了適宜的實施方案。除操縱的分批和半連續(xù)模式外，在該裝置中還可進行連續(xù)模式的操縱，這可根據需要以交叉流過濾模式(圖3)或死端式過濾的形式(圖2)而實現。在本領域的現有技術中原則上描述了這兩種方法的變更方法(Engineering Processes for Bioseparations，Ed.L.R.Weatherley，Heinemann，1994，135-165；Wandrey etal.，TetrahedronAsymmetry 1999，10，923-928)。
發(fā)明的下一個進展是關于一種通過應用根據本發(fā)明的反應體系對有機化合物進行酶促轉化的方法。方法優(yōu)選的是涉及制備富含對映體的有機化合物優(yōu)選是手性醇的方法。本領域人員根據已描述的反應體系以及下面的實施例能完成方法的設計。在給定的界限條件下，合理地設定酶促轉化的其它已知的條件。
本發(fā)明的下一個方面也是關于根據本方面的反應體系在有機化合物的酶促轉化或有機化合物優(yōu)選是醇的鑒定或分析的方法中的用途。在進一步優(yōu)選的方法中，根據本發(fā)明的反應體系被如上所述用于制備富含對映體的有機化合物(優(yōu)選是醇)的方法中。
“偶聯(lián)酶促體系”這一表述被理解為指的是，根據本發(fā)明，有機化合物的酶促轉化的發(fā)生伴有輔因子的消耗，并且輔因子被第二種酶體系原位再生。因此，這減少了昂貴的輔因子的使用。
根據醇脫氫酶/NADH/FDH/甲酸體系所提供的實施例可以說明本發(fā)明。通過該反應體系可以從相應的酮開始不對稱地合成醇。
圖示2 實驗實施例 (S)-1-(對氯苯基)乙醇(S)-1-苯氧基丙烷-2-醇(R)-2-氯-1-(間氯苯基)乙醇(見實施例3) (見實施例4) (見實施例5)69％轉化率，＞95％轉化率， 77％轉化率，＞99％對映選擇性＞99.8％對映選擇性 ＞99.2％對映選擇性反應混合物的處理通過MtBE的萃取以及通過蒸發(fā)而濃縮有機相而實現。用這個方法在裝置中以非常簡單的方式得到相應的醇，轉化率為69％以及對映選擇性為99％(實施例3)。
但是用其它酮作為原材料也能獲得出色的對映選擇性。例如在這些反應條件下，苯氧基丙酮經還原生成了對映純度的產物，經定量為＞99.8％ee(實施例4)。
但是，根據本發(fā)明的反應體系也適用于空間要求的酮。以α，m-二氯乙酰苯為例以示例的方式證實了這一點。該酮在甲基和在芳香環(huán)上都被氯原子取代。在雙相體系中的生物催化還原生成了所需的產物2-氯-1-(間氯苯基)乙醇，也有出眾的對映選擇性＞99.2％(實施例5)。其轉化率為77％左右。
相應于實驗實施例3-5的實驗以圖示2表示。
這些高的轉化率及對映選擇性是令人驚奇的，原因是常常觀察到因為有機溶劑的存在不僅降低了酶活性(伴有低轉化率)也改變了酶的立體特異性的特性(伴有對映選擇性的降低)。
然而在本文中，提高底物濃度的試驗結果證實是特別地令人驚奇。這些試驗采用了對氯乙酰苯作為示范底物。如果在上述的試驗中，10mM的底物濃度(這個底物濃度對應于本領域現有技術的試驗中的濃度)獲得69％的轉化率(實施例3)，那么，與普遍的觀點即由于抑制作用等原因提高底物濃度只會使得產量減低相反，提高底物濃度能增加這類反應的產量，現在從相對于溶劑的總體積(＝有機和水性溶劑)來說濃度為＞25mM開始，可獲得更高的轉化率75％(40mM)以及74％(100mM)(實施例6、7)。
就此，要特別提到濃度為100mM時的高轉化率(實施例7)。圖示3和圖4顯示了以不同的底物濃度進行酶促還原的實驗(實施例3、6、7)。
圖示3
在進一步的實驗中研究了來源于博伊丁假絲酵母的FDH在不同溶劑體系中的長期的穩(wěn)定性。絕大多數有機溶劑導致FDH發(fā)生快速失活，與此不同的是(見對比例)，在所述的雙相體系中，特別是在使用前述的烴成分的情況下，甚至在數天后仍然能夠觀察到甲酸脫氫酶(特別是來源于博伊丁假絲酵母的FDH)的出眾的穩(wěn)定特性。例如，盡管當存在丙酮或DMSO時酶的活性在24小時內分別下降了35％或66％，但當存在20vol.％的己烷時，甚至在3天后仍然保持了90％的酶活性。使用正己烷得到的這些結果顯示于圖1和表3。圖1還顯示了使用其他有機溶劑的對比例的結果。
本方法的一個主要優(yōu)點是它的簡便性。例如，不包括復雜的工藝步驟，可以在分批反應器中和連續(xù)地實施本方法。同樣，與較早的方法不同，不需要分離水性介質與有機介質的特殊膜。在這個方法中也不需要在一些以往方法中所需添加的表面活性劑。另一個主要的優(yōu)點在于，首次使得在技術上意義重大的＞25mM的底物濃度條件下進行具有光學活性的醇的酶促制備成為可能。從本領域現有技術的方法中不能得到這些優(yōu)點。
名詞“富含對映體”指定的是在混合物中一種光學對映體對另一種光學對映體的比例要大于50％。
對于存在有一個立體中心的情況，所描繪的結構涉及兩種可能的對映體，對于分子中多于一個立體中心的情況，所描繪的結構涉及所有的可能的非對映立體異構體，對于一種非對映立體異構體，包括所討論的化合物的可能的兩種對映體。
生物體博伊丁假絲酵母保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC 32195，并且是公眾可獲得的。
本申請所公開的內容一并包括在本文中已經被提及的本領域現有技術的文獻。


圖1顯示了具有死端式過濾的膜反應器。通過泵2將底物1轉移到具有膜5的反應器槽3中。除溶劑外，位于攪拌器驅動的反應器槽中的還有催化劑4、產物6和未轉化的底物1。低分子產物6主要通過膜5濾出。
圖2顯示了具有交叉流過濾的膜反應器。這里通過泵8將底物7轉移到被攪拌的也包含溶劑、催化劑9和產物14的反應器槽中。通過泵16驅動溶劑流經任選地存在的熱交換器12到達交叉流過濾比色皿15。這里低分子產物被膜13分開。隨后高分子催化劑9隨溶劑流動一起被轉運回到反應器10內，任選地再次經過熱交換器12，任選地經過閥11。
實驗部分實施例1(應用來源于博伊丁假絲酵母(雙重突變體C23S/C262A)的FDH的FDH活性的對比例)稱量2.72g(0.8mol/L)甲酸鈉和1.14g(0.1mol/L)磷酸氫二鉀三水化物，并溶解于40mL去離子H2O中。用氨水(25％)和甲酸(100％)或相應的稀釋液將溶液的pH值調至8.2。然后將溶液轉移到50mL量瓶內并用去離子H2O將其完全注滿。與這些分開進行的是，稱量71.7mg(4mmol/L)NAD+三水化物并溶解于約20mL去離子H2O中。用氨水(25％)和甲酸(100％)或相應的稀釋液將溶液的pH值調至8.2。然后將溶液轉移到25mL量瓶內并用去離子H2O將其完全注滿。隨后，在每種情況中，將500μl底物溶液以及NADH溶液混合于被用于測定的1cm比色皿中。在加入10μl酶溶液后，其中使用的溶劑是含有10％有機溶劑的水溶液(見表)，進行短時間的搖晃，將比色皿置于光度計中，并開始記錄數據。在開始測定之前首先直接加入酶溶液。通過光度測定NAD+形成NADH的反應，確定特定時間段后的來源于博伊丁假絲酵母(雙重突變體C23S/C262A)的FDH的活性。在溫度為30℃、340nm波長下進行光度測定，測定時間為15分鐘。在下面的表1和表2中顯示了結果。
表1.來源于博伊丁假絲酵母(雙重突變體C23S/C262A)的FDH的酶活性單位U/mL，表示為溶劑和時間的函數。

表2.來源于博伊丁假絲酵母(雙重突變體C23S/C262A)的FDH的酶活性單位U/mL，表示為溶劑和時間的函數。

實施例2(FDH活性的測定)根據實施例1的說明進行活性的測定，將己烷用作有機溶劑成分。結果列于下面的表3中。
表3.來源于博伊丁假絲酵母(雙重突變體C23S/C262A)的FDH的酶活性單位U/mL，表示為己烷和時間的函數。

實施例3(對氯乙酰苯的轉化)將10.1U醇脫氫酶(來源于紅串紅球菌)和10U甲酸脫氫酶(來源于博伊丁假絲酵母的FDH，表達于E.coli，雙重突變體C23S/C262A)添加到組成為對氯乙酰苯(78.4mg；10mM)、甲酸鈉(50mM)和NADH(2mM)的10mL正庚烷及40mL磷酸緩沖液的溶液中。將形成的反應混合物在30℃下攪拌21小時。隨后用3×25mL MTBE進行萃取操作，用硫酸鈉干燥所收集的有機相。測定在真空管中去除溶劑后所得到的粗產物的轉化率(用1H-NMR光譜測定)和對映選擇性(用手性GC)。
轉化率69％對映選擇性＞99％ee
實施例4(苯氧基丙酮的轉化)將10.1U醇脫氫酶(來源于紅串紅球菌)和10U甲酸脫氫酶(來源于博伊丁假絲酵母的FDH，表達于E.coli，雙重突變體C23S/C262A)添加到組成為苯氧基丙酮(76.0mg；10mM)、甲酸鈉(50mM)和NADH(2mM)的10mL正庚烷及40mL磷酸緩沖液的溶液中。將形成的反應混合物在30℃下攪拌21小時。隨后用3×25mL MTBE進行萃取操作，用硫酸鈉干燥所收集的有機相。測定在真空管中去除溶劑后所得到的粗產物的轉化率(用1H-NMR光譜測定)和對映選擇性(用手性GC)。
轉化率95％對映選擇性＞99.8％ee實施例5(2，3’-二氯乙酰苯的轉化)將10.1U醇脫氫酶(來源于紅串紅球菌)和10U甲酸脫氫酶(來源于博伊丁假絲酵母的FDH，表達于E.coli，雙重突變體C23S/C262A)添加到組成為2，3’-二氯乙酰苯(102.7mg；10mM)、甲酸鈉(50mM)和NADH(2mM)的10mL正庚烷及40mL磷酸緩沖液的溶液中。將形成的反應混合物在30℃下攪拌21小時。隨后用3×25mL MTBE進行萃取操作，用硫酸鈉干燥所收集的有機相。測定在真空管中去除溶劑后所得到的粗產物的轉化率(用1H-NMR光譜測定)和對映選擇性(用手性GC)。
轉化率77％對映選擇性＞99.2％ee實施例6(40mM的對氯乙酰苯的轉化)將10.1U醇脫氫酶(來源于紅串紅球菌)和10U甲酸脫氫酶(來源于博伊丁假絲酵母的FDH，表達于E.coli，雙重突變體C23S/C262A)添加到組成為對氯乙酰苯(78.4mg；10mM)、甲酸鈉(50mM)和NADH(2mM)的2.5mL正庚烷及10mL磷酸緩沖液的溶液中。將形成的反應混合物在30℃下攪拌21小時。隨后用3×25mL MTBE進行萃取操作，用硫酸鈉干燥所收集的有機相。測定在真空管中去除溶劑后所得到的粗產物的轉化率(用1H-NMR光譜測定)和對映選擇性(用手性GC)。
轉化率75％實施例7(100mM的對氯乙酰苯的轉化)將10.1U醇脫氫酶(來源于紅串紅球菌)和10U甲酸脫氫酶(來源于博伊丁假絲酵母的FDH，表達于E.coli，雙重突變體C23S/C262A)添加到含有對氯乙酰苯(78.4mg；10mM)、甲酸鈉(50mM)和NADH(2mM)的1mL正庚烷及4mL磷酸緩沖液的溶液中。將形成的反應混合物在30℃下攪拌21小時。隨后用3×25mL MTBE進行萃取操作，用硫酸鈉干燥所收集的有機相。測定在真空管中去除溶劑后所得到的粗產物的轉化率(用1H-NMR光譜測定)和對映選擇性(用手性GC)。
轉化率74％
權利要求
1.一種偶聯(lián)酶促反應體系，包括在一種雙相溶劑體系中用醇脫氫酶對有機化合物進行輔因子依賴性酶促轉化并對所述輔因子進行酶促再生，其中水相與液態(tài)有機相相接觸，且所述有機化合物的濃度為＞25mM每升溶劑總體積。
2.權利要求1的反應體系，其特征在于，所使用的有機溶劑具有盡可能低的在水中的溶解度，而對于所使用的有機化合物來說，所述有機溶劑具有盡可能高的溶解度。
3.權利要求1或2的反應體系，其特征在于，將在反應條件下為液態(tài)的芳香族或脂族烴用作有機溶劑。
4.前述權利要求中任一項的反應體系，其特征在于所述有機溶劑的量為溶劑總體積的5-80vol％。
5.前述權利要求中任一項的反應體系，其特征在于，該體系不含表面活性劑。
6.前述權利要求中任一項的反應體系，其特征在于，在反應開始前所述有機化合物的濃度為＞100mM每升溶劑總體積。
7.前述權利要求中任一項的反應體系，其特征在于，將NADH或NADPH用作輔因子。
8.前述權利要求中任一項的反應體系，其特征在于，將來源于高加索酸奶乳桿菌(Lactobacillus kefir)的醇脫氫酶用作轉化所述有機化合物的酶。
9.權利要求1到7中任一項的反應體系，其特征在于，將來源于紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)的醇脫氫酶用作轉化所述有機化合物的酶。
10.前述權利要求中任一項的反應體系，其特征在于，通過甲酸脫氫酶、優(yōu)選地通過來源于博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)或其突變體的甲酸脫氫酶實現所述輔因子的再生。
11.一種用于轉化有機化合物的裝置，包括權利要求1至10中任一項的反應體系。
12.一種通過應用權利要求1至10中任一項的反應體系對有機化合物進行酶促轉化的方法。
13.權利要求1至10中任一項的反應體系用于有機化合物的酶促轉化或優(yōu)選地用于醇的鑒定或分析的用途。
14.權利要求13的用途，用于制備富含對映體的有機化合物的方法中，優(yōu)選為用于制備富含對映體的醇的方法中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在由有機相和水相組成的雙相體系中實施的偶聯(lián)酶促反應體系。所述體系用輔因子依賴性酶進行操縱，所述輔因子可連續(xù)地酶促再生。
文檔編號C12N9/04GK1668738SQ03817327
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月7日 優(yōu)先權日2002年7月20日
發(fā)明者哈拉爾德·格勒格爾, 維爾納·胡梅爾 申請人:德古薩股份公司