專利名稱：用于增加植物中總的油類水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物遺傳學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域。更準(zhǔn)確地說(shuō)，本發(fā)明涉及植物中總的油類水平。特別地，本發(fā)明指向用于增加植物和種子中油類水平以及改變油類組成的方法。另外，本發(fā)明包括并提供用于生產(chǎn)具有增加的油類水平的植物并獲得這種種子的方法。這種植物和種子也可顯示出基本上未改變的蛋白質(zhì)組成。
背景植物油類具有廣泛的各種應(yīng)用。例如，大豆油類已經(jīng)被用于各種沙拉和烹調(diào)油，甚至生物柴油和生物潤(rùn)滑油等應(yīng)用。種子油類幾乎全部是由三酰基甘油組成的，其中使脂肪酸酯化至甘油的3個(gè)羥基中的每一個(gè)。用作種子儲(chǔ)備的三?；视驮谟邢薜捏w積內(nèi)使貯能的數(shù)量最大化，因?yàn)橹舅崾歉叨冗€原形式的碳(Miquel and Browse，inSeedDevelopment and Germination，Galili et al.(eds.)，Marcel Dekker，New York，pp.169-193，1994)。在自然界中發(fā)現(xiàn)了大量不同的脂肪酸結(jié)構(gòu)(Gunstone et al.，The Lipid Handbook，Chapman & Hall，London，1994；Hilditch and Williams，The Chemical Constituentsof Natural Fats，Chapman & Hall，London，1964；Murphy，DesignerOil Crops，VCH，Weinheim，1994；van de Loo et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，926743-6747，1993)，但是只有5種占所生產(chǎn)的商品化植物油的90％棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)、油酸(18∶1)、亞油酸(18∶2)、α-亞麻酸(18∶3)。
控制植物或植物部分，例如種子的總的油類水平的因素是復(fù)雜的。因而，選擇總油類增加的植物經(jīng)常是費(fèi)力的過(guò)程，并且所得到的植物經(jīng)常顯示出相當(dāng)大的植物-與-植物間變異(Jensen，PlantBreeding Methodology，John Wiley & Sons，Inc.，USA，1988)。此外，對(duì)于總油類增加的選種經(jīng)常導(dǎo)致種子蛋白質(zhì)部份的減少。因此，需要用于生產(chǎn)總的油類增加的植物，特別是也產(chǎn)生蛋白水平基本上未改變的植物的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明包括并提供用于增加種子中總的油類水平的方法，包括(A)用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，該核酸構(gòu)建體包括作為可操作地連接成分的啟動(dòng)子、能夠調(diào)節(jié)FAD2 mRNA或FAD2蛋白質(zhì)水平的結(jié)構(gòu)性核酸序列；以及(B)使該植物生長(zhǎng)。
本發(fā)明包括并提供用于增加種子中總的油類的方法，包括(A)用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，該核酸構(gòu)建體包括作為可操作地連接成分的啟動(dòng)子、能夠增加油酸水平的結(jié)構(gòu)性核酸序列；以及(B)使該植物生長(zhǎng)。
本發(fā)明包括并提供用于獲得總的油類水平增加的種子的方法，包括(A)使FAD2蛋白質(zhì)或FAD2mRNA水平被調(diào)節(jié)的植物生長(zhǎng)；以及(B)從該植物獲得種子。
本發(fā)明包括并提供用于增加種子中總的油類百分比的方法，包括(A)用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，該核酸構(gòu)建體包括作為可操作地連接成分的啟動(dòng)子、能夠調(diào)節(jié)FAD2mRNA或FAD2蛋白質(zhì)水平的結(jié)構(gòu)性核酸序列；以及(B)使該植物生長(zhǎng)。
本發(fā)明包括并提供用于生產(chǎn)總的油類百分比增加的植物的方法，包括(A)使FAD2蛋白質(zhì)或FAD2mRNA水平改變的第一植物與第二植物雜交以產(chǎn)生分離的群體；(B)篩選分離的群體獲得總的油類百分?jǐn)?shù)增加的成員；以及(C)選擇所述的成員。
本發(fā)明包括并提供嵌合的基因，其包括可操作地連接的、編碼δ-12脫氫酶的分離的核酸片段或任何功能等效的亞片段或這種片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列，并且其中這種組合的表達(dá)導(dǎo)致總的油類的增加。
本發(fā)明也包括包含多種嵌合基因的植物及其植物部分、這種植物的種子、從這種植物的谷粒獲得的油類、來(lái)源于這種谷粒加工的動(dòng)物飼料、上述油類在食品中的用途、動(dòng)物飼料、烹飪用油或工業(yè)應(yīng)用、由這種油類的氫化作用、分級(jí)分離、酯交換或水解制備的產(chǎn)物以及用于改善動(dòng)物尸體(carcass)質(zhì)量的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1描繪了構(gòu)建體pMON67563。
圖2描繪了pMON67563和pCGN9979對(duì)照品系中總的油類的百分比與油酸(18∶1)的相關(guān)性。
圖3描繪了擬南芥屬(Arabidopsis)種子中油酸(18∶1)水平與總的油類的百分比的對(duì)照。
圖4描繪了來(lái)自表達(dá)FAD2 dsRNAi抑制構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因品系(右側(cè)的)對(duì)照包含空載體的對(duì)照品系(左側(cè)的)的T3種子中平均(SEM)的油類百分比。
圖5描繪了構(gòu)建體pMON67589。
圖6描繪了構(gòu)建體pMON67591。
圖7描繪了構(gòu)建體pMON67592。
圖8描繪了構(gòu)建體pMON68655。
圖9描繪了構(gòu)建體pMON68656。
發(fā)明詳述定義如在此所使用的，″總的油類水平″是指總的脂肪酸聚集量，而不考慮脂肪酸的種類。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)″基因″是用來(lái)指包括與基因產(chǎn)物表達(dá)相關(guān)的5′啟動(dòng)子區(qū)、任何內(nèi)含子和外顯子區(qū)以及與基因產(chǎn)物表達(dá)相關(guān)的3′非翻譯區(qū)的核酸序列。
如在此所使用的，″FAD2″、″Δ12脫氫酶″或″ω-6脫氫酶″是能夠催化使雙鍵插入到從羧基端數(shù)起第12位的脂肪?；糠种械拿浮?br> 術(shù)語(yǔ)″亞片段是功能等效的″和″功能等效的亞片段″在此是可互換使用的。這些術(shù)語(yǔ)是指保持改變基因表達(dá)或產(chǎn)生某一表型的能力的分離核酸片段的部分或亞序列，而無(wú)論該片段或亞片段是否編碼活性的酶。例如，可使用該片段或亞片段來(lái)設(shè)計(jì)嵌合的基因以在轉(zhuǎn)化的植物中產(chǎn)生所需要的表型。可通過(guò)連接核酸片段或其亞片段來(lái)設(shè)計(jì)嵌合的基因而用于共抑制或反義，不管它是否以相對(duì)于植物啟動(dòng)子序列為合適的方向而編碼活性的酶。
術(shù)語(yǔ)″非編碼的″是指不編碼部分或全部的所表達(dá)蛋白質(zhì)的核酸分子的序列。非編碼的序列包括但不限于內(nèi)含子、啟動(dòng)子區(qū)、3′非翻譯區(qū)、和5′非翻譯區(qū)。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)″內(nèi)含子″是指該術(shù)語(yǔ)的常規(guī)含義，如是指核酸分子，通常為DNA的片段，其不編碼部分或全部的所表達(dá)蛋白質(zhì)，并且在內(nèi)源的條件下，被轉(zhuǎn)錄成RNA分子，但是在RNA被翻譯成蛋白質(zhì)前，其從內(nèi)源RNA中剪接出來(lái)。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)″外顯子″是指該術(shù)語(yǔ)的常規(guī)含義，如是指核酸分子，通常為DNA的片段，其編碼部分或全部的表達(dá)蛋白質(zhì)。
如在此所使用的，當(dāng)在此是指蛋白質(zhì)和核酸時(shí)，使用普通的大寫，例如″FAD2″表明是指酶、蛋白質(zhì)、多肽、或肽，而使用斜體的大寫，例如，″FAD2″是用來(lái)指核酸，包括但不限于基因、cDNAs、和mRNAs。
如在此所使用的，″可操作地連接″指一個(gè)或多個(gè)核酸序列的啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)一個(gè)或多個(gè)核酸序列的表達(dá)，包括以多順?lè)醋訕?gòu)型的方式排列的多重編碼的或非編碼的核酸序列。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)核酸序列的互補(bǔ)序列是指伴隨其全部長(zhǎng)度的序列的互補(bǔ)序列。
如在此所使用的，除非另有說(shuō)明，任何所列出的范圍包括該范圍的端點(diǎn)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可參考用于詳細(xì)描述在此所論述的已知技術(shù)或等同技術(shù)的綜合性參考教科書。這些教科書包括Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，1995；Sambrook et al.Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2d ed.)，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York，1989；Birren et al.Genome AnalysisA Laboratory Manual，volumes1 through 4，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NewYork，1997-1999；Plant Molecular BiologyA Laboratory Manual，Clark(ed.)，Springer，New York，1997；Richards et al.PlantBreeding Systems(2d ed.)，Chapman & Hall，The University Press，Cambridge，1997；和Maliga et al.，Methods in Plant MolecularBiology，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York，1995。當(dāng)然在實(shí)施本發(fā)明時(shí)也可參考這些文獻(xiàn)。
本發(fā)明包括并提供用于增加種子中總的油類水平的方法，包括(A)用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，該核酸構(gòu)建體包括作為可操作地連接成分的啟動(dòng)子、能夠調(diào)節(jié)FAD2 mRNA或FAD2蛋白質(zhì)水平的結(jié)構(gòu)性核酸序列；以及(B)使該植物生長(zhǎng)。結(jié)構(gòu)性的核酸序列可選自SEQ ID NOS1、4、7-11、14、19、22、25或26或其反向互補(bǔ)序列、其任何功能等效的亞片段或所述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列。
本發(fā)明包括并提供用于增加種子中總的油類水平的方法。總的油類的增加可以是任何量的增加?？偟挠皖惖脑黾涌赡苁歉淖?cè)黾佑退崴?18∶1)的任何酶或轉(zhuǎn)錄本的水平的結(jié)果。在優(yōu)選的方面，總的油類增加是在種子或種子收集物中發(fā)現(xiàn)的總的油類和在第二代或后代的種子或種子收集物中測(cè)量的總的油類之間的百分比增加。如在此所使用的，以種子或種子收集物中發(fā)現(xiàn)的總的油類和在第二代或后代的種子或種子收集物中測(cè)量的總的油類之間的差異來(lái)計(jì)算增加的百分比。在特別優(yōu)選的方面，相對(duì)于來(lái)自具有相似遺傳背景，但缺乏能夠影響油酸(18∶1)水平的結(jié)構(gòu)性核酸序列的植株種子來(lái)測(cè)量總的油類的增加。在另一個(gè)特別優(yōu)選的方面，相對(duì)于來(lái)自具有相似遺傳背景，但缺乏能夠調(diào)節(jié)FAD2mRNA或FAD2蛋白質(zhì)水平的結(jié)構(gòu)性核酸序列的植株種子來(lái)測(cè)量總的油類的增加。
當(dāng)比較因子的水平時(shí)，優(yōu)選在具有相似遺傳背景的生物體之間進(jìn)行這種比較。在優(yōu)選的方面，相似的遺傳背景是在該背景中待比較的生物體共用50％或更多的其核遺傳物質(zhì)。在更優(yōu)選的方面，相似的遺傳背景是在該背景中待比較的生物體共用75％或更多的，更優(yōu)選為90％或更多的其核遺傳物質(zhì)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，相似的遺傳背景是在該背景中待比較的生物體是植物，并且除了利用植物轉(zhuǎn)化技術(shù)最初導(dǎo)入任何遺傳物質(zhì)外，該植物是等基因的。
在另一個(gè)方面，在通過(guò)使2種植物雜交而產(chǎn)生的植物種子中檢測(cè)增加，并且相對(duì)于用來(lái)產(chǎn)生所述植物(即親本)的一種或多種植物的一個(gè)或多個(gè)種子檢測(cè)植物種子中的增加。
可通過(guò)任何合適的方法測(cè)量總的油類水平。例如，但不限于，經(jīng)常用常規(guī)方法進(jìn)行種子含油量的定量，例如近紅外的分析(NIR)、核磁共振成像(NMR)、索格利特(soxhlet)萃取、加速的溶劑萃取(ASE)、微波提取、和超臨界的流體提取。當(dāng)令人感興趣的樣品接受這些技術(shù)的檢驗(yàn)時(shí)，近紅外的(NIR)分光術(shù)已經(jīng)成為用于篩選種子樣品的標(biāo)準(zhǔn)方法。研究的樣品包括小麥、玉米、大豆、蕓苔、水稻、苜蓿、燕麥等。
可使用單個(gè)種子的近紅外分析(參見(jiàn)Velasco et al.，″Estimationof Seed Weight，Oil Content and Fatty Acid Composition in IntactSingle Seeds of Rapeseed(Brassica napus L.)by Near-InfraredReflectance Spectroscopy，″Euphytica，Vol.106，1999，pp.79-85；Delwiche，″Single Wheat Kernel Analysis by Near-InfraredTransmittanceProtein Content，″Analytical Techniques andInstrumentation，Vol.72，1995，pp.11-16；Dowell，″AutomatedColor Classification of Single Wheat Kernels Using Visible andNearInfrared Reflectance，″Vol.75(1)，1998，pp.142-144；Dowell et al.，″Automated Single Wheat Kernel Quality MeasurementUsing Near-Infrared Reflectance，″ASAE Annual InternationalMeeting，1997，paper number 973022，其所有內(nèi)容在此全部引入作為參考)。也已經(jīng)使用NMR來(lái)分析種子中的含油量(參見(jiàn)，例如，Robertson and Morrison，″Analysis of Oil Content of SunflowerSeed by Wide-Line NMR，″Journal of the American Oil ChemistsSociety，1979，Vol.56，1979，pp.961-964，其在此全部引入作為參考)。
其他的技術(shù)，包括索格利特萃取，加速的溶劑萃取(ASE)、微波提取、和超臨界的流體提取可用于確定含油量。一些技術(shù)使用重量分析法作為最終的測(cè)量步驟(參見(jiàn)，例如，Taylor et al.，″Determination of Oil Content in Oilseeds by AnalyticalSupercritical FluidExtraction，″Vol.70(No.4)，1993，pp.437-439，其在此全部引入作為參考)。然而重量分析法不適用于小的樣品，包括小的種子和含油量小的種子，因?yàn)檫@些樣品中的油類水平低于該技術(shù)的最小靈敏度水平。此外，重量分析法的使用是耗時(shí)的，并且不適于高通量的自動(dòng)控制。
本發(fā)明的方法可用于增加任何種子中總的油類水平。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，種子包括胚乳或胚胎。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，種子包括胚乳和胚胎。種子可來(lái)自于雙子葉植物或單子葉植物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，種子可選自擬南芥屬種子、蕓苔屬種子、Canola(canola)種子、玉米種子、油棕種子、油菜籽、花生種子、菜籽種子、紅花籽、大豆種子、和向日葵籽，而擬南芥屬種子、蕓苔屬種子、Canola種子、玉米種子、和大豆種子是特別優(yōu)選的。
對(duì)植物的轉(zhuǎn)化可能受到導(dǎo)致將構(gòu)建體導(dǎo)入植物的任何方式的影響。用于將所需要的多核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞的多種方法是可利用的并且對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是公知的，這些方法包括但不限于(1)物理方法，例如微注射、電穿孔、和微粒介導(dǎo)的遞送(生物導(dǎo)彈或基因槍技術(shù))；(2)病毒介導(dǎo)的遞送方法；以及(3)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。
用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的最通常使用的方法是土壤桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移過(guò)程以及生物導(dǎo)彈或微粒轟擊介導(dǎo)的方法(即，基因槍)。一般地，核轉(zhuǎn)移是合乎需要的，但是其中需要特異性轉(zhuǎn)化的質(zhì)體，例如葉綠體或淀粉體，可利用微粒介導(dǎo)遞送所需要的多核苷酸來(lái)轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體。
通過(guò)使用遺傳工程化的屬于土壤桿菌屬(Agrobacterium)的土壤細(xì)菌來(lái)獲得土壤桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。可使用具有Ti或Ri質(zhì)粒的根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)和發(fā)根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的許多野生型和卸甲(disarmed)菌株用于將基因轉(zhuǎn)移到植物中。通過(guò)將可被遺傳工程化地?cái)y帶任何所需要的DNA片段、稱為″T-DNA″的特異DNA轉(zhuǎn)移到許多植物品種中而進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。
對(duì)植物的土壤桿菌-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化包括幾個(gè)步驟。第一步通稱為″接種″，其中首次將有毒性的土壤桿菌與植物細(xì)胞相互接觸。接種后，允許土壤桿菌和植物細(xì)胞/組織在適于生長(zhǎng)和T-DNA轉(zhuǎn)移的條件下在一起生長(zhǎng)幾個(gè)小時(shí)至幾天以上的一段時(shí)期。該步驟稱為″共培養(yǎng)″。共培養(yǎng)和T-DNA遞送后，用滅菌劑或抑菌劑處理植物細(xì)胞以殺死與外植體保持接觸或包含外植體的容器中的土壤桿菌。如果在缺乏任何選擇性因子促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞對(duì)照非轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞優(yōu)先生長(zhǎng)的情況下進(jìn)行該步驟，則這一般被稱為″延遲″步驟。如果在存在選擇壓力幫助轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞生長(zhǎng)的情況下進(jìn)行該步驟，則其被稱為″選擇″步驟。當(dāng)使用″延遲″時(shí)，一般其后是一個(gè)或多個(gè)″選擇″步驟。
就微粒轟擊而言(美國(guó)專利號(hào)5,550,318；美國(guó)專利號(hào)5,538,880；美國(guó)專利號(hào)5,610,042；以及PCT公開(kāi)WO 95/06128；其每個(gè)在此全部具體地引入作為參考)，顆粒用核酸包涂并通過(guò)推進(jìn)力遞送到細(xì)胞中。例證性的顆粒包括由鎢、鉑以及優(yōu)選黃金組成的顆粒。
通過(guò)加速遞送DNA到植物細(xì)胞中的方法的例證性實(shí)施方案是生物導(dǎo)彈微粒輸送系統(tǒng)(BioRad，Hercules，CA)，其可用于推進(jìn)涂有DNA的微?；蚣?xì)胞經(jīng)過(guò)例如不銹鋼或Nytex的篩子，到達(dá)覆蓋懸浮培養(yǎng)的植物細(xì)胞的過(guò)濾表面上。
微粒轟擊技術(shù)是廣泛適用的，并且可用來(lái)轉(zhuǎn)化幾乎任何的植物品種。已經(jīng)通過(guò)微粒轟擊轉(zhuǎn)化的種屬的實(shí)施例包括單子葉植物種屬，例如玉米(PCT公開(kāi)WO 95/06128)、大麥、小麥(美國(guó)專利號(hào)5,563,055，其在此全部具體地引入作為參考)、水稻、燕麥、黑麥、甘蔗、和高粱；以及許多雙子葉植物包括煙草、大豆(美國(guó)專利號(hào)5,322,783，其在此全部具體地引入作為參考)、向日葵、花生、棉花、番茄、和一般的豆類(美國(guó)專利號(hào)5,563,055，其在此全部具體地引入作為參考)。
為了選擇或記錄轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞而不考慮其轉(zhuǎn)化方法，導(dǎo)入細(xì)胞的DNA可包含在可再生的植物組織中起作用的基因以產(chǎn)生賦予植物組織對(duì)其他有毒化合物的抗性的化合物。用作可選擇的、可篩選的、或可記錄的標(biāo)記的令人感興趣的基因包括但不限于GUS、綠色熒光蛋白(GFP)、熒光素酶(LUX)、抗生素或除草劑耐受性基因?？股乜剐曰虻膶?shí)例包括青霉素、卡那霉素(和新霉素、G418、博來(lái)霉素)；氨甲蝶呤(和三甲氧芐氨嘧啶)；氯霉素；卡那霉素和四環(huán)素。
對(duì)來(lái)自多種轉(zhuǎn)化外植體的植株的再生、發(fā)育、和栽培在本領(lǐng)域中是已有文獻(xiàn)記錄。這個(gè)再生和生長(zhǎng)過(guò)程一般包括選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞和培養(yǎng)個(gè)別細(xì)胞經(jīng)過(guò)胚胎發(fā)育的通常階段到生根幼苗階段的步驟。
類似地再生轉(zhuǎn)基因的胚胎和種子。其后將所得到的轉(zhuǎn)基因的生根枝條種植在合適的植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基，例如土壤中。當(dāng)暴露于選擇性的因子時(shí)仍然存活的細(xì)胞、或已經(jīng)在篩選分析中記錄為陽(yáng)性的細(xì)胞，可在支持植物再生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將發(fā)育的幼苗在轉(zhuǎn)入用于成熟的溫室或生長(zhǎng)箱之前轉(zhuǎn)入較少土壤的植物生長(zhǎng)混合物，并茁壯生長(zhǎng)。
本發(fā)明可用于任何可變化的細(xì)胞或組織。通過(guò)如在此所使用的，可變化的是指細(xì)胞或組織能夠進(jìn)一步地繁殖而產(chǎn)生植株。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到許多植物細(xì)胞或組織是可變化的，其中在插入外源DNA后，以及在合適的培養(yǎng)條件下該植物細(xì)胞或組織可形成分化的植株。適用于這些目的的組織可包括但不限于未成熟的胚胎、角質(zhì)鱗片組織、懸浮的細(xì)胞培養(yǎng)物、未成熟的花序、芽分生組織、結(jié)節(jié)的外植體、愈傷組織、胚軸組織、子葉、根和葉片。
可使用任何合適的植物栽培培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基的實(shí)例包括但不限于基于MS的培養(yǎng)基(Murashige and Skoog，Physiol.Plant，15473-497，1962)或基于N6的培養(yǎng)基(Chu et al.，Scientia Sinica18659，1975)，其中補(bǔ)充附加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，包括但不限于茁長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、ABA和赤霉素。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知當(dāng)對(duì)哪些品種的組織培養(yǎng)基進(jìn)行適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充時(shí)，其可支持植物組織的生長(zhǎng)發(fā)育，并且適合于植物的轉(zhuǎn)化和再生?？勺鳛樯唐坊闹苿┵?gòu)買，或常規(guī)制備以及改進(jìn)這些組織培養(yǎng)基。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到培養(yǎng)基和培養(yǎng)基補(bǔ)充物，例如用于轉(zhuǎn)化和再生的養(yǎng)分和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，以及其它培養(yǎng)條件，例如培養(yǎng)期間的光照強(qiáng)度、pH、和催青溫度可針對(duì)特定的目標(biāo)品種而進(jìn)行優(yōu)化。
構(gòu)建體或載體可包括植物啟動(dòng)子以表達(dá)所選擇的核酸分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在此所描述的任何核酸分子能夠可操作地與在植物細(xì)胞中起作用以促使產(chǎn)生mRNA分子的啟動(dòng)子區(qū)相連。例如，可使用在植物細(xì)胞中起作用以促使產(chǎn)生mRNA分子的任何啟動(dòng)子，例如在此所描述的啟動(dòng)子但不只限于此。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子是植物啟動(dòng)子。
在文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了許多在植物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子包括但不限于胭脂堿合酶(NOS)啟動(dòng)子(Ebert et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)845745-5749，1987)、章魚堿合酶(OCS)啟動(dòng)子(其被攜帶在根瘤土壤桿菌的腫瘤誘導(dǎo)的質(zhì)粒上)、花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動(dòng)子(Lawton et al.，plant Mol，Biol，9315-324，1987)和CaMV 35S啟動(dòng)子(Odell etal.，Nature 313810-812，1985)、玄參花葉病毒35S-啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)5,378,619)、來(lái)自核酮糖-1，5-雙-磷酸酯羧化酶小亞基(ssRUBISCO)的光可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、Adh啟動(dòng)子(Walker et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)846624-6628，1987)、蔗糖合酶啟動(dòng)子(Yang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)874144-4148，1990)、R基因復(fù)合體啟動(dòng)子(Chandler et al.，The Plant Cell11175-1183，1989)和葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子已經(jīng)用于產(chǎn)生在植物中表達(dá)的DNA構(gòu)建體；參見(jiàn)例如PCT公開(kāi)WO84/02913。優(yōu)選CaMV 35S啟動(dòng)子用于植物。已知的或發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致植物細(xì)胞中DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子可被用于本發(fā)明。
其他的啟動(dòng)子也可用來(lái)在特異的組織，例如種子或果實(shí)中表達(dá)多肽。實(shí)際上，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所使用的啟動(dòng)子是種子特異性的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子的實(shí)例包括來(lái)自下列基因的5′調(diào)節(jié)區(qū)，如napin(Kridl et al.，Seed Sci.Res.1209219，1991)、菜豆蛋白(Bustos et al.，Plant Cell，1(9)839-853，1989)、大豆胰蛋白酶抑制物(Riggs et al.，Plant Cell 1(6)609-621，1989)、ACP(Baerson et al.，Plant Mol.Biol.，22(2)255-267，1993)、硬脂酰-ACP脫氫酶(Slocombe et al.，Plant Physio.104(4)167-176，1994)、β-伴大豆球蛋白的大豆a′亞基(P-Gm7S，參見(jiàn)例如，Chen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.838560-8564，1986)、蠶豆(Vicia faba)USP(P-Vf.Usp，參見(jiàn)例如，美國(guó)專利申請(qǐng)10/429,516中的SEQ ID NO1、2、和3)和玉米L3油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子(P-Zm.L3，參見(jiàn)例如，Hong et al.，Plant Mol.Biol.，34(3)549-555，1997)。也包括玉米醇溶蛋白，其是在谷類胚乳中發(fā)現(xiàn)的一組儲(chǔ)存蛋白質(zhì)。已經(jīng)分離了玉米醇溶蛋白基因的基因組克隆(Pedersen et al.，Cell 291015-1026，1982；and Russell et al.，Transgenic Res.6(2)157-168)，并且也可使用來(lái)自這些克隆的啟動(dòng)子，包括15kD、16kD、19kD、22kD、27kD和基因。公知在例如谷類中起作用的其他啟動(dòng)子包括下列基因的啟動(dòng)子waxy(蠟樣)、Brittle(脆化)、Shrunken(皺縮)2、分支酶I和II、淀粉合酶、脫支酶、油質(zhì)蛋白、谷蛋白和蔗糖合酶。用于谷類胚乳表達(dá)的特別優(yōu)選的啟動(dòng)子是來(lái)自水稻的谷蛋白基因的啟動(dòng)子，更特別的是Osgt-1啟動(dòng)子(Zhenget al.，Mol.Cell Biol.135829-5842，1993)。適于在小麥中表達(dá)的啟動(dòng)子的實(shí)例包括ADP葡萄糖焦合酶(ADPGPP)亞基、顆粒結(jié)合的淀粉合酶和其他淀粉合酶、分支酶和脫支酶、胚胎發(fā)生-充足的蛋白質(zhì)、麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的啟動(dòng)子。水稻中這種啟動(dòng)子的實(shí)例包括ADPGPP亞基、顆粒結(jié)合淀粉合酶和其他淀粉合酶、分支酶、脫支酶、蔗糖合酶和谷蛋白的啟動(dòng)子。特別優(yōu)選的啟動(dòng)子是水稻谷蛋白，Osgt-1的啟動(dòng)子。大麥中這種啟動(dòng)子的實(shí)例包括ADPGPP亞基、顆粒結(jié)合淀粉合酶、和其他淀粉合酶、分支酶、脫支酶、蔗糖合酶、大麥醇溶蛋白、胚胎球蛋白和糊粉特異蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子。用于在種子中表達(dá)的優(yōu)選啟動(dòng)子是napin啟動(dòng)子、在此指P-Br.Snap2。另一個(gè)用于表達(dá)的優(yōu)選啟動(dòng)子是Arcelin5啟動(dòng)子(美國(guó)專利公開(kāi)2003/0046727)。另一優(yōu)選的啟動(dòng)子是大豆7S啟動(dòng)子(P-Gm.7S)和大豆7Sα′β伴大豆球蛋白啟動(dòng)子(P-Gm.Sphasl)。
可利用的附加啟動(dòng)子在例如美國(guó)專利5,378,619；5,391,725；5,428,147；5,447,858；5,608,144；5,608,144；5,614,399；5,633,441；5,633,435；和4,633,436中有描述。此外，可使用組織特異性的增強(qiáng)子。
構(gòu)建體或載體也可包括利用目標(biāo)區(qū)域，以全部或部分發(fā)揮終止那些區(qū)域轉(zhuǎn)錄的作用的核酸序列。已經(jīng)分離了許多這種序列，包括Tr73′序列和NOS 3′序列(Ingelbrecht et al.，The Plant Cell 1671-680，1989；Bevan et al.，Nucleic AcidsRes.11369-385，1983)。在本發(fā)明的植物表達(dá)構(gòu)建體中也可提供調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄終止的區(qū)域。可通過(guò)編碼目標(biāo)基因DNA序列或來(lái)源于不同基因源的適當(dāng)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域來(lái)提供轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域，例如與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域天然相關(guān)的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。熟練的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到能夠在植物細(xì)胞中終止轉(zhuǎn)錄的任何適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止區(qū)域可用于本發(fā)明的構(gòu)建體。
載體或構(gòu)建體也可包括調(diào)節(jié)元件。其實(shí)例包括Adh內(nèi)含子1(Calliset al.，Genes and Develop.11183-1200，1987)，蔗糖合酶內(nèi)含子(Vasil et al.，Plant Physiol..911575-1579，1989)和TMVΩ元件(Gallie et al.，The Plant Cell 1301-311，1989)。適當(dāng)?shù)臅r(shí)候可包括這些和其他的調(diào)節(jié)元件。
可以理解可利用單個(gè)構(gòu)建體將本發(fā)明的兩個(gè)或多個(gè)核酸分子導(dǎo)入植物，所述構(gòu)建體包含一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子。在設(shè)計(jì)構(gòu)建體表達(dá)2個(gè)核酸分子的實(shí)施方案中，優(yōu)選這2個(gè)啟動(dòng)子是(i)2個(gè)組成性的啟動(dòng)子、(ii)2個(gè)種子特異性的啟動(dòng)子、或(iii)一個(gè)組成性的啟動(dòng)子和一個(gè)種子特異性的啟動(dòng)子。優(yōu)選的種子特異性的啟動(dòng)子是7S、napin、和玉米球蛋白-1基因啟動(dòng)子。優(yōu)選的組成性啟動(dòng)子是CaMV啟動(dòng)子。進(jìn)一步可理解可利用單個(gè)啟動(dòng)子，優(yōu)選為種子特異性的或組成性的啟動(dòng)子來(lái)物理地連接和表達(dá)兩個(gè)或多個(gè)核分子。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，可在植物中通過(guò)轉(zhuǎn)化其反義或共抑制的構(gòu)建體來(lái)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。特別地，通過(guò)Smith et al.(Nature 407319-320，2000)的方法構(gòu)建的構(gòu)建體可用來(lái)獲得優(yōu)良的效果。其他的構(gòu)建方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是眾所周知的并且已有評(píng)述。
能夠降低FAD2mRNA或FAD2蛋白質(zhì)水平的結(jié)構(gòu)性的核酸序列，包括與FAD2基因具有足夠同源性的任何核酸序列。例證性的核酸包括在US6,372,965、US 6,342,658、US 6,333,448、US 6,291,741、US 6,063,947、WO01/14538 A3、US PAP 2002/20058340、和US PAP 2002/0045232中闡明的核酸。
本發(fā)明包括并提供用于生產(chǎn)與第一或第二植物中的至少一種相比，總的油類水平提高的植物的方法，包括(A)使FAD2蛋白質(zhì)或FAD2mRNA水平改變的第一植物與第二植物雜交以產(chǎn)生分離的群體；(B)篩選分離的群體以獲得總的油類增加的成員；以及(C)選擇所述的成員。
本發(fā)明包括并提供用于生產(chǎn)總的油類百分比增加的植物的方法，包括(A)使FAD2蛋白質(zhì)或FAD2mRNA水平改變的第一植物與第二植物雜交以產(chǎn)生分離的群體；(B)篩選分離的群體以獲得總的油類增加的成員；以及(C)選擇所述的成員。
本發(fā)明包括并提供用于生產(chǎn)總的油類百分比增加的植物的方法，包括(A)使油酸水平增加而亞油酸水平降低的第一植物與第二植物雜交以產(chǎn)生分離的群體；(B)篩選分離的群體以獲得油酸水平增加而亞油酸水平降低的成員；以及(C)選擇所述的成員。
本發(fā)明的植物可以是育種方案的部分或產(chǎn)生自育種方案。繁殖方法的選擇取決于植物繁殖的模式、待改善性狀的遺傳性、和商業(yè)上使用的栽培品種的類型(例如F1雜交體栽培種、純化品系的栽培品種等)。如下闡明本發(fā)明的用于繁殖植物的非限制性的選擇方法?？衫脦椭魏坞s交子代選擇的標(biāo)記來(lái)提高繁殖方案。進(jìn)一步可理解在育種方案中可利用任何商品化的和非商業(yè)性的栽培品種。例如出現(xiàn)茁壯長(zhǎng)勢(shì)、營(yíng)養(yǎng)勢(shì)、脅迫耐受性、疾病抗性、分枝、開(kāi)花、種子定形、種子大小、籽粒密度、直立性、和可脫粒性等因素一般將決定選擇。
對(duì)于高度可遺傳的性狀，在單個(gè)位置評(píng)估優(yōu)良單株植物的選擇可能是有效的，而對(duì)于低遺傳性的性狀，應(yīng)該根據(jù)從相關(guān)植物種類的重復(fù)評(píng)估獲得的平均值來(lái)進(jìn)行選擇。通用的選擇法通常包括譜系選擇、改進(jìn)的譜系選擇、混合選擇、和循環(huán)選擇。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)行回交或循環(huán)的育種方案。
遺傳的復(fù)雜性影響了繁殖方法的選擇。回交育種可用于將高度可遺傳性狀的一個(gè)或幾個(gè)有利的基因轉(zhuǎn)移到合乎需要的栽培品種中。這些方法已經(jīng)廣泛地用于繁殖抗病的栽培品種。使用多種循環(huán)選擇技術(shù)來(lái)改善由許多基因控制的數(shù)量遺傳性狀。自我授粉的農(nóng)作物中對(duì)循環(huán)選擇的利用取決于授粉的簡(jiǎn)易性、來(lái)自每次授粉的成功雜種的頻率、以及來(lái)自每次成功雜交的雜種后代的數(shù)目。
可測(cè)試繁殖品系并且與代表商業(yè)化目標(biāo)區(qū)域的環(huán)境中的相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)物比較兩代或更多代。最好的品系是新的商業(yè)栽培品種的候選物；仍然缺乏性狀的品系可被用作親本以產(chǎn)生用于進(jìn)一步選擇的新群體。
鑒定優(yōu)良植物的一個(gè)方法是觀察其相對(duì)于其他實(shí)驗(yàn)性植株和廣泛栽培的標(biāo)準(zhǔn)栽培品種的性能。如果單一觀察是不確定的，重復(fù)觀察可提供其遺傳學(xué)價(jià)值的最佳評(píng)估。育種者可以進(jìn)行選擇并且將兩個(gè)或多個(gè)親本品系雜交，然后重復(fù)自體授精和選擇，以產(chǎn)生許多新的遺傳組合。
新栽培種的發(fā)育需要品種的發(fā)育和選擇、這些品種的雜交以及優(yōu)良雜交的選擇。可通過(guò)在選擇的雄性可育親本之間進(jìn)行人工雜交或利用雄性不育系統(tǒng)產(chǎn)生雜種種子。通過(guò)特定單個(gè)基因性狀，例如莢色、花色、種子產(chǎn)量、柔毛顏色、或除草劑抗性對(duì)雜交體進(jìn)行選擇，這些性狀表明種子是真正雜種的。親本品種的其他數(shù)據(jù)以及雜種的表型影響了育種者決定是否繼續(xù)特異的雜種雜交。
譜系育種和輪回選擇繁殖方法可用于從繁殖種群開(kāi)發(fā)栽培品種。通過(guò)自花授精和選擇所需要的表型，育種方案將來(lái)自兩個(gè)或多個(gè)栽培品種或多種包含廣泛來(lái)源的合乎需要的性狀組合到開(kāi)發(fā)栽培品種的繁殖庫(kù)中?？稍u(píng)估新的栽培品種以定哪些具有商業(yè)化的潛力。
通常使用譜系育種用于改良自我授粉的農(nóng)作物。使具有有利的、互補(bǔ)性狀的2個(gè)親本雜交以產(chǎn)生F1。通過(guò)使F1的一個(gè)或幾個(gè)自花受粉而產(chǎn)生F2群體從最好的種類選擇最好的個(gè)體。可在F4代中開(kāi)始系列的重復(fù)試驗(yàn)以增加低遺傳性的性狀的選擇有效性。在近交的進(jìn)一步階段(即，F(xiàn)6和F4)，檢測(cè)表型相似品系的最好品系或混合物的釋放潛力以獲得新的載培品種。
回交育種法已經(jīng)用于將簡(jiǎn)單繼承的、高度可遺傳的性狀的基因轉(zhuǎn)移到所需要的純合栽培品種或回交親本的近交系中。待轉(zhuǎn)移的性狀的來(lái)源被稱為供體親本。預(yù)期所得到的植株具有回交親本(例如，栽培品種)的特征和從供體親本轉(zhuǎn)移的所需要的性狀。在最初的雜交后，選擇具有供體親本表型的個(gè)體并且與回交親本重復(fù)地雜交。預(yù)期所得到的親本具有回交親本(例如，栽培品種)的特征和從供體親本轉(zhuǎn)移的所需要的性狀。
嚴(yán)格地說(shuō)單種子傳代方法是指種植分離的群體、收獲每個(gè)植株的一個(gè)種子樣品、并且利用唯一的種子樣品種植下一代。當(dāng)群體已經(jīng)從F2進(jìn)行到所需要的近交水平時(shí)，衍生品系的植株每個(gè)都將追蹤到不同F(xiàn)3個(gè)體。由于一些種子不能發(fā)芽或一些植株不能產(chǎn)生至少一個(gè)種子，群體中植株的數(shù)目每代都會(huì)減退。因而，當(dāng)完成傳代時(shí)，不是群體中最初取樣的所有F2植株都可由子代表示。
在多種子的方法中，育種者通常從群體中的每個(gè)植株收獲一個(gè)或多個(gè)莢果并且使它們一起脫粒以形成批量。使用部分批量種植下一代而將部分作為儲(chǔ)備。該方法已經(jīng)稱為改進(jìn)的單種子傳代法或莢果-批量技術(shù)。多種子的方法已經(jīng)在收獲中被用于節(jié)約勞動(dòng)力。用機(jī)器脫粒莢果比單個(gè)種子法的從每個(gè)莢果手工移出種子是更加快速的。多種子法也使種植每個(gè)近交代群體的相同數(shù)目的種子成為可能。
可在幾個(gè)參考書中發(fā)現(xiàn)關(guān)于通常用于不同性狀和農(nóng)作物的其他繁殖方法的說(shuō)明(例如，F(xiàn)ehr，Principles of Cultivar Development，Vol.1，1987)。
也可利用單性生殖再生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植株。單性生殖是植物中再生的遺傳控制方法，其中沒(méi)有融合卵子和精子而形成胚胎。單性生殖在經(jīng)濟(jì)學(xué)上是很重要的，特別是在轉(zhuǎn)基因的植株中，因?yàn)樗鼘?dǎo)致任何基因型傳代，無(wú)論其是如何雜合的。因此，在重復(fù)的生命循環(huán)中，單性生殖再生的、雜合的轉(zhuǎn)基因植株可保持它們的遺傳學(xué)保真性。用于生產(chǎn)單性生殖植物的方法是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5,811,636。
在此引用的所有文章、專利、和專利申請(qǐng)全部引入作為參考。
下列實(shí)施例是例證性的而不是意圖以任何方式加以限制。
實(shí)施例實(shí)施例1為了通過(guò)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默(PTGS)減少擬南芥屬中FAD2的表達(dá)，根據(jù)Smith等人的方法產(chǎn)生基因沉默構(gòu)建體。(Smith et al.，Nature407319-320，2000)。利用napin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)以有義(SEQ ID NO1)和反義方向側(cè)接內(nèi)含子的方式、包含F(xiàn)AD2的120個(gè)核苷酸的3′-非翻譯區(qū)(SEQ ID NO1)的發(fā)夾RNA(hpRNA)表達(dá)來(lái)構(gòu)建構(gòu)建體(pMON67563，圖1)。通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，用pMON67563轉(zhuǎn)化擬南芥屬植株。也通過(guò)土壤桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將空的napin載體(pCGN9979)轉(zhuǎn)化入擬南芥屬植株而作為對(duì)照。
實(shí)施例2通過(guò)氣相色譜法(GC)和近紅外的分光術(shù)(NIR)分析來(lái)自轉(zhuǎn)化的擬南芥屬植株種子的脂肪酸圖譜和總的含油量。GC分析表明用pMON67563轉(zhuǎn)化的擬南芥屬植株相對(duì)于對(duì)照，其油酸(18∶1)的比例增加，而亞油酸(18∶1)的比例降低。轉(zhuǎn)化的品系67563-1至67563-13相對(duì)于未轉(zhuǎn)化的對(duì)照品系9979-11至9979-15，顯示油酸(18∶1)的比例增加，而亞油酸(18∶2)的比例降低。以與對(duì)照品系9979-11至9979-15的百分?jǐn)?shù)(w/w)的方式測(cè)量油酸和亞油酸的相對(duì)數(shù)量，顯示油酸水平在大約14％(w/w)和大約18％(w/w)范圍之間，而亞油酸水平在大約30％(w/w)和大約32％(w/w)范圍之間。轉(zhuǎn)化的品系67563-1至67563-3以及67563-5至67563-15顯示油酸水平在大約34％(w/w)和大約50％(w/w)范圍之間，而亞油酸水平在大約7％(w/w)和大約18％(w/w)范圍之間。NIR分析表明用pMON67563轉(zhuǎn)化的植物與對(duì)照植物相比，顯示總的油類水平增加而蛋白水平基本上相同。對(duì)照品系9979-11至9979-15顯示總的油類百分比在大約33.5％和大約36.8％范圍之間。與對(duì)照品系相比，轉(zhuǎn)化品系67563-1至67563-3以及67563-5至67563-15顯示總的油類百分比增加，并且其范圍為大約35.5％至大約38.9％。如圖2所說(shuō)明的，當(dāng)對(duì)對(duì)照和轉(zhuǎn)化品系進(jìn)行作圖以比較總的油類％(X-軸)對(duì)照油酸％(18∶1)，油酸含量增加與總的含油量增加相關(guān)。
實(shí)施例3使用pMON67563轉(zhuǎn)化的擬南芥屬植株(圖1)生長(zhǎng)到T3種子代。收獲T3種子并進(jìn)行分析。使用氣相色譜法(GC)和近紅外的(NIR)分析分別確定脂肪酸圖譜和總的含油量。GC分析的結(jié)果表明100％的轉(zhuǎn)化植物的后代油酸(18∶1)水平增加，這與在親本植株中所觀察到的相似。
植物子代也顯示總的油類增加。圖3提供了油酸(18∶1)水平與總的油類百分比的比較。
如圖4中所說(shuō)明的，與包含空載體的對(duì)照種子相比，來(lái)自轉(zhuǎn)基因品系的T2和T3種子的平均油類百分比增加。在T3代種子中明顯的油酸百分?jǐn)?shù)增加和總的油類百分?jǐn)?shù)增加之間的相關(guān)性似乎是基因可遺傳的。
如圖3所說(shuō)明的，當(dāng)對(duì)對(duì)照和轉(zhuǎn)化品系進(jìn)行作圖以比較總的油類百分?jǐn)?shù)(X-軸)與油酸(18∶1)百分?jǐn)?shù)，轉(zhuǎn)基因的擬南芥屬T3種子中油酸含量增加與總的含油量增加相關(guān)。
實(shí)施例4Canola FAD-2構(gòu)建體通過(guò)PCR擴(kuò)增分離歐洲油菜(Brassica napus)FAD2基因的片段。用引物對(duì)17942 5′-GCGGCCGCGCGTCCTAACCGGCGTCTGGGTC-3′(SEQ ID NO2)和17944 5′-CCATGGGAGACCGTAGCAGACGGCGAGG-3′(SEQ ID NO3)，從歐洲油菜(cv.烏檀木(Ebony))基因組DNA擴(kuò)增FAD2編碼序列的堿基對(duì)284-781。向片段的5′末端加入NotI位點(diǎn)，向3′末端加入NcoI位點(diǎn)以便于克隆。將所得到的PCR片段克隆到pCR2.1 Topo中。獲得完整的雙鏈序列。
通過(guò)用NotI和NcoI消化除去包含CR-BN.BnFad2-0的444bp片段(SEQ ID NO4)。將該片段連接到已經(jīng)用NotI和NcoI消化的歐洲油菜啟動(dòng)子和擬南芥屬FAD2基因(At3g12120)的第一內(nèi)含子之間。所得到的質(zhì)粒被命名為pMON67589(圖5)。利用已知的方法確定核酸序列并且確認(rèn)克隆接合點(diǎn)的完整性。
通過(guò)PCR擴(kuò)增分離歐洲油菜FAD2基因的片段。用引物對(duì)17943 5′-CCCGGGGCGTCCTAACCGGCGTCTGGGTC-3′(SEQ ID NO5)和17945 5′-GGTACCGAGACCGTAGCAGACGGCGAGG-3′(SEQ ID NO6)，從歐洲油菜(cv.烏檀木)基因組DNA擴(kuò)增FAD2編碼序列的堿基對(duì)284-781。向片段的3′末端加入KpnI位點(diǎn)，向5′末端加入SmaI位點(diǎn)以便于克隆。將所得到的PCR片段克隆到pCR2.1 Topo中。獲得完整的雙鏈序列。
通過(guò)用KpnI和SmaI消化除去包含AS-BN.BnFad2-0的455bp片段(SEQ ID NO7)。將該片段連接到已經(jīng)用SmaI和KpnI消化的擬南芥屬FAD2基因(At3g12120)的第一內(nèi)含子和pMON67589中的napin 3′UTR之間。所得到的質(zhì)粒被命名為pMON67591(圖6)。利用已知的方法確定核酸序列并且確認(rèn)克隆接合點(diǎn)的完整性。
通過(guò)用NotI和SmaI消化從pMON67591去除包含CR-BN.BnFad2-0后接擬南芥屬FAD2基因(At3g12120)的第一內(nèi)含子和AS-BN.BnFad2-0的2030bp片段。將該片段連接到已經(jīng)用NotI和HindIII消化的質(zhì)粒中(在連接前HindIII位點(diǎn)是平末端)。所得到的質(zhì)粒被命名為pMON67592(圖7)。利用已知的方法確定核酸序列并且確認(rèn)克隆接合點(diǎn)的完整性。將該載體隨后用于轉(zhuǎn)化Canola，這是通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化而進(jìn)行的。
實(shí)施例5分析來(lái)自用pMON67592轉(zhuǎn)化的R2 Canola植株的種子以確定總的油類、油酸含量和蛋白質(zhì)含量。如可在表1中所看到的，純合的陽(yáng)性和無(wú)效的分離體之間的差異是，總的油類為1.7-2.5％，以及油酸為20.4-25.6％。蛋白水平保持相同。表2顯示來(lái)自所有事件的綜合結(jié)果。
表1.來(lái)源于5個(gè)單獨(dú)轉(zhuǎn)化體的R2 Canola種子中平均的總的油類和油酸水平。
以JMP版本4.0.4(SAS Institute)計(jì)算平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤差。純合陽(yáng)性和無(wú)效分離體的5個(gè)事件中每一個(gè)的總的油類和油酸平均數(shù)之間的差異是統(tǒng)計(jì)上顯著的(p＜.0001)。
表2.用pMON65792轉(zhuǎn)化的R2 Canola種子中平均的總的油類和油酸水平
以JMP版本4.0.4(SAS Institute)計(jì)算平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差。植物來(lái)源于5個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體。純合的陽(yáng)性和無(wú)效的分離體的平均數(shù)之間的差異是統(tǒng)計(jì)上顯著的(p＜.0001)實(shí)施例6根據(jù)擬南芥屬、大豆和玉米δ-12脫氫酶(FAD2)的序列相似性，在專有的玉米單基因數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定了4個(gè)基因。其已經(jīng)被命名為FAD2-1、FAD2-2、FAD2-3和FAD2-4。Zm.FAD2-1的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQID NO8所示。它編碼387個(gè)氨基酸的多肽(翻譯讀框核苷酸182-1342)。Zm.FAD2-2的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID NO9所示。它編碼390個(gè)氨基酸的多肽(翻譯讀框核苷酸266-1435)。Zm.FAD3-3的全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID NO10所示。它編碼382個(gè)氨基酸的多肽(翻譯讀框核苷酸170-1315)。Zm.FAD 2-4的部分序列如SEQ ID NO11所示。它編碼252個(gè)氨基酸的部分多肽(翻譯讀框核苷酸1-256)。
3個(gè)基因的編碼區(qū)享有顯著的序列同一性。FAD2-1與FAD2-2在核苷酸水平享有91％的同一性，在氨基酸水平享有88％的同一性。FAD2-1與FAD2-3在核苷酸水平享有85％的同一性，在氨基酸水平享有68％的同一性。FAD2-1與FAD2-4在核苷酸水平享有82％的同一性，在氨基酸水平享有68％的同一性。FAD2-3與FAD2-4在核苷酸水平享有80％的同一性，在氨基酸水平享有65％的同一性。
使用有效的northern來(lái)確定4個(gè)基因中哪些存在于玉米的種子組織中。FAD2-1和FAD2-2存在于在不同的種子發(fā)育時(shí)期收集的完整的種子、胚組織和胚胎組織中。FAD2-3和FAD2-4都不存在于種子組織中，但是都在葉片組織中被檢測(cè)到。
來(lái)自FAD2-1和FAD2-2的3′UTR融合的RNAi構(gòu)建體構(gòu)建的表達(dá)構(gòu)建體包括玉米L3啟動(dòng)子、啟動(dòng)子3′端和RNAi元件5′端為水稻-肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子，RNAi元件后是位于RNAi元件3′端的球蛋白3′末端。RNAi元件由通過(guò)BamH1位點(diǎn)與Zm.FAD2-2 3′UTR片段連接的Zm.FAD2-1 3′UTR的片段組成，兩個(gè)片段以有義的方向通過(guò)包含內(nèi)含子剪接位點(diǎn)的HSP70內(nèi)含子與反義方向的2個(gè)相同F(xiàn)AD2 3′UTR片段連接。使HSP70內(nèi)含子以相對(duì)于啟動(dòng)子為有義的方向放置。3′UTR片段有義和反義的順序不是重要的，只要每個(gè)片段(FAD2-1和FAD2-2)在中心內(nèi)含子的一側(cè)是有義的，而在另一側(cè)是反義的。構(gòu)建體適于通過(guò)微粒轟擊或通過(guò)土壤桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)化到玉米中。
使用PCR來(lái)獲得5′末端上有Bsp120I以及3′末端上有Stul位點(diǎn)的HSP70內(nèi)含子。使用特異于HSP70內(nèi)含子序列的引物(SEQ ID NOS12和13)來(lái)克隆內(nèi)含子。
將820個(gè)堿基對(duì)的Bsp120I和StuI片段PCR產(chǎn)物(SEQ ID NO14)克隆到包含具有NOS 3′的花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的nptII和后接水稻肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子和球蛋白3′的玉米L3啟動(dòng)子的turbo雙元的相同位點(diǎn)中，以制備中間構(gòu)建體。
通過(guò)PCR獲得Zm.FAD2-1和FAD2-2 3′UTRs的片段。使用Monsanto文庫(kù)克隆作為模板，利用特異于FAD2-1的引物(SEQ ID NO15，包含附加的克隆位點(diǎn)Sse83871和Sacl；以及SEQ ID NO16，包含附加的克隆位點(diǎn)BamH1)或特異于FAD2-2的引物(SEQ ID NOS17，包含附加的克隆位點(diǎn)BamH1 ；以及SEQ ID NO18，包含附加的位點(diǎn)Bsp120I和EcoRV)。
為了連接2個(gè)PCR產(chǎn)物，每個(gè)用BamHI消化、經(jīng)凝膠純化、連接，使用連接產(chǎn)物作為模板，并利用引物SEQ ID NOS15和18。得到447個(gè)堿基對(duì)的片段(SEQ ID NO19)。
將SEQ ID NO19的Sacl/Bsp120I片段克隆到中間構(gòu)建體的相同位點(diǎn)中，而將SEQ ID NO19的Sse8387I/EcoRV片段克隆到中間構(gòu)建體的Sse83871/Stul位點(diǎn)中以產(chǎn)生pMON56855(圖8)。
實(shí)施例7來(lái)自FAD2-1和FAD2-2的內(nèi)含子融合的RNAi構(gòu)建體構(gòu)建的表達(dá)構(gòu)建體包括玉米L3啟動(dòng)子、啟動(dòng)子的3′端和RNAi元件的5′端為谷類水稻-肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子，RNAi元件后是位于RNAi元件3′端的球蛋白3′末端。RNAi元件由通過(guò)BamH1位點(diǎn)與Zm.FAD2-2內(nèi)含子部分連接的Zm.FAD2-1內(nèi)含子的部分組成，兩個(gè)部分以有義的方向通過(guò)包含內(nèi)含子剪接位點(diǎn)的HSP70內(nèi)含子與反義方向的2個(gè)相同F(xiàn)AD2內(nèi)含子連接。使HSP70內(nèi)含子以相對(duì)于啟動(dòng)子為有義的方向放置。內(nèi)含子片段有義和反義的順序不是重要的，只要每個(gè)片段(FAD2-1和FAD2-2)在中心內(nèi)含子的一側(cè)是有義的，而在另一側(cè)是反義的。構(gòu)建體適于通過(guò)微粒轟擊或通過(guò)土壤桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)化到玉米中。
使用PCR來(lái)獲得如上述實(shí)施例所描述的HSP70內(nèi)含子。
通過(guò)PCR從來(lái)自Zm.FAD2-1和FAD2-2基因的內(nèi)含子獲得片段。將利用Dellaporta等人的方法(Dellaporta et al.(1983)A plant DNAminipreparationversion II.Plant Mol Biol Rep 119-21)從玉米品種LH59的葉片制備的基因組DNA用作模板。對(duì)于FAD2-1，使用特異的引物(SEQ ID NO20，具有附加的克隆位點(diǎn)Sse83871和Sacl；和SEQ ID NO21)來(lái)產(chǎn)生267個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物(SEQ ID NO22)。對(duì)于FAD2-2，使用特異的引物(SEQ ID NO23，其包括與SEQ ID NO22的3′序列重疊的21個(gè)堿基；和SEQ ID NO24，包含附加的位點(diǎn)Bsp120I和EcoRV)來(lái)產(chǎn)生260個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物(SEQ ID NO25)。
為了連接2個(gè)PCR產(chǎn)物(SEQ ID NOS22和25)，在一個(gè)PCR反應(yīng)中，將它們都用作模板，利用引物SEQ ID NO20和SEQ ID NO24以產(chǎn)生506個(gè)堿基對(duì)的融合體(SEQ ID NO26)。凝膠純化來(lái)自SEQ IDNO26的Sacl和Bsp120I片段，然后克隆到相同的位點(diǎn)中以產(chǎn)生pMON68656(圖9)。
序列表<110>SHEWMAKER，CHRISTINE KVAN EENENNAAM，ALISONHAWKINS，DEBRA TSANDERS，RICK<120>用于增加植物中總的油類水平的方法<130>MONS052CN<140>PCT/US2003/025751<141>2003-08-12<150>US 60/402,527<151>2002-08-12<160>26<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>120<212>DNA<213>擬南芥<400>1gcatgatggt gaagaaattg tcgacctttc tcttgtctgt ttgtcttttg ttaaagaagc 60tatgcttcgt tttaataatc ttattgtcca ttttgttgtg ttatgacatt ttggctgctc120<210>2<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物
<400>2gcggccgcgc gtcctaaccg gcgtctgggt c31<210>3<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>3ccatgggaga ccgtagcaga cggcgagg28<210>4<211>440<212>DNA<213>歐洲油菜<400>4gcgcgtccta accggcgtct gggtcatagc ccacgagtgc ggccaccacg ccttcagcga 60ctaccagtgg cttgacgaca ccgtcggtct catcttccac tccttcctcc tcgtccctta120cttctcctgg aagtacagtc atcgacgcca ccattccaac actggctccc tcgagagaga180cgaagtgttt gtccccaaga agaagtcaga catcaagtgg tacggcaagt acctcaacaa240ccctttggga cgcaccgtga tgttaacggt tcagttcact ctcggctggc cgttgtactt300agccttcaac gtctcgggaa gaccttacga cggcggcttc gcttgccatt tccaccccaa360cgctcccatc tacaacgacc gcgagcgtct ccagatatac atctccgacg ctggcatcct420cgccgtctgc tacggtctcc440<210>5<211>29<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>引物<400>5cccggggcgt cctaaccggc gtctgggtc 29<210>6<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>6ggtaccgaga ccgtagcaga cggcgagg28<210>7<211>441<212>DNA<213>歐洲油菜<400>7cgagaccgta gcagacggcg aggatgccag cgtcggagat gtatatctgg agacgctcgc 60ggtcgttgta gatgggagcg ttggggtgga aatggcaagc gaagccgccg tcgtaaggtc120ttcccgagac gttgaaggct aagtacaacg gccagccgag agtgaactga accgttaaca180tcacggtgcg tcccaaaggg ttgttgaggt acttgccgta ccacttgatg tctgacttct240tcttggggac aaacacttcg tctctctcga gggagccagt gttggaatgg tggcgtcgat300gactgtactt ccaggagaag taagggacga ggaggaagga gtggaagatg agaccgacgg360tgtcgtcaag ccactggtag tcgctgaagg cgtggtggcc gcactcgtgg gctatgaccc420
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<223>引物<400>18cgatatcggg cccgtgtttt acaacaacac gaagg35<210>19<211>447<212>DNA<213>玉米
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1.一種用于增加種子中總的油類水平的方法，包括(A)用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，該核酸構(gòu)建體包括作為可操作地連接成分的啟動(dòng)子、能夠調(diào)節(jié)FAD2 mRNA或FAD2蛋白質(zhì)水平的結(jié)構(gòu)性核酸序列；以及(B)使所述的植物生長(zhǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用于增加種子中總的油類水平的方法，其中所述的植物是擬南芥屬。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的用于增加種子中總的油類水平的方法，其中所述的植物是玉米。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的用于增加種子中總的油類水平的方法，其中所述的植物是Canola。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的用于增加種子中總的油類水平的方法，其中所述的啟動(dòng)子是種子特異性的啟動(dòng)子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的用于增加種子中總的油類水平的方法，其中所述的種子特異性啟動(dòng)子選自napin啟動(dòng)子、大豆胰蛋白酶抑制劑啟動(dòng)子、ACP啟動(dòng)子、硬脂酰-ACP脫氫酶啟動(dòng)子、b-伴大豆球蛋白的大豆a′亞基啟動(dòng)子、油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子、β-伴大豆球蛋白啟動(dòng)子、玉米球蛋白-1基因啟動(dòng)子、和玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的增加種子中總的油類水平的方法，其中與來(lái)自缺乏所述的核酸構(gòu)建體的第二植物的種子相比，所述種子中總蛋白的水平保持基本上不變。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的增加種子中總的油類水平的方法，其中與來(lái)自缺乏所述的核酸構(gòu)建體的第二植物的種子相比，所述種子中油酸的水平增加而亞油酸的水平降低。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的增加種子中總的油類水平的方法，其中與來(lái)自缺乏所述的核酸構(gòu)建體的第二植物的種子相比，所述種子中總的油類的百分比增加。
10.一種用于增加種子中總的油類的方法，包括(A)用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，該核酸構(gòu)建體包括作為可操作地連接成分的啟動(dòng)子、能夠增加油酸水平的結(jié)構(gòu)性核酸序列；以及(B)使所述的植物生長(zhǎng)。
11.一種包括核酸片段的嵌合基因，該核酸片段選自SEQ ID NOS1、4、7-11、14、19、22、25和26或其反向互補(bǔ)序列、其任何功能等效的亞片段或所述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列，其中所述的片段是可操作地連接的，并且進(jìn)一步地其中嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致總的油類增加。
12.一種用于增加種子中總的油類水平的方法，包括(A)用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，所述核酸構(gòu)建體包括作為可操作地連接成分的啟動(dòng)子和序列，該序列選自SEQ ID NOS1、4、7-11、14、19、22、25和26或其反向互補(bǔ)序列、其任何功能等效的亞片段或所述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列；以及(B)使所述的植物生長(zhǎng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用于增加種子中總的油類水平的方法，其中所述的植物是擬南芥屬。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的用于增加種子中總的油類水平的方法，其中所述的植物是玉米。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的用于增加種子中總的油類水平的方法，其中所述的植物是canola。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的用于增加種子中總的油類水平的方法，其中所述的啟動(dòng)子是種子特異性的啟動(dòng)子。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的增加種子中總的油類水平的方法，其中所述的種子特異性啟動(dòng)子選自napin啟動(dòng)子、大豆胰蛋白酶抑制劑啟動(dòng)子、ACP啟動(dòng)子、硬脂酰-ACP脫氫酶啟動(dòng)子、b-伴大豆球蛋白的大豆a′亞基啟動(dòng)子、油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子、β-伴大豆球蛋白啟動(dòng)子、玉米球蛋白-1基因啟動(dòng)子、和玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子。
18.根據(jù)權(quán)利要求12的增加種子中總的油類水平的方法，其中與來(lái)自缺乏所述的核酸構(gòu)建體的第二植物相比，所述種子中總蛋白的水平保持基本上不變。
19.根據(jù)權(quán)利要求12的增加種子中總的油類水平的方法，其中與來(lái)自缺乏所述的核酸構(gòu)建體的第二植物的種子相比，所述種子中油酸的水平增加而亞油酸的水平降低。
20.根據(jù)權(quán)利要求12的增加種子中總的油類水平的方法，其中與來(lái)自缺乏所述的核酸構(gòu)建體的第二植物的種子相比，所述種子中總的油類的百分比增加。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物遺傳學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域。更準(zhǔn)確地說(shuō)，本發(fā)明涉及影響植物中油類水平和組成的基因。特別地，本發(fā)明指向用于增加植物和種子中油類水平的方法。另外，本發(fā)明包括并提供用于生產(chǎn)脂肪酸組成改變的植物并獲得這種種子的方法。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1705748SQ03824138
公開(kāi)日2005年12月7日 申請(qǐng)日期2003年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月12日
發(fā)明者C·K·休馬克, A·范埃寧納姆, D·J·霍金斯, R·桑德?tīng)査?申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司