專利名稱：用于檢測沙門氏菌種的stn基因寡核苷酸引物及使用該引物的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對沙門氏菌(Salmonella)腸毒素基因(stn)具有特異性的寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.21，這些引物對沙門氏菌的快速和特異篩查是有用的；本發(fā)明還涉及沙門氏菌腸毒素基因(stn)的快速且特異檢測方法，該方法通過將寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQID No.21用于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，以確定寄生物沙門氏菌是否存在于受試對象中，該方法包括以下步驟制備所述基因的DNA模板，用所述引物通過PCR對該模板進行擴增，在凝膠上對PCR產(chǎn)物進行電泳，以及對所述寄生物進行檢測。
背景技術(shù)：
沙門氏菌種是兼性的胞內(nèi)寄生物，其侵入上皮細胞的粘膜，并且主要通過水、肉、蛋和禽產(chǎn)品傳染給人。沙門氏菌感染是由動物傳染給人的最常見的食源性胃腸疾病。在許多發(fā)展中國家，傷寒仍然是一種地方性疾??；在世界范圍內(nèi)，非傷寒性沙門氏菌病也是一種主要的食源性疾病，據(jù)估計每年造成死亡的人數(shù)超過500人，僅在美國每年就造成10億～15億美元的損失(Threlfall 1996；Mead等，1999)。在印度，這些數(shù)據(jù)沒有得到完全記載，但是預計要高得多。為了防止沙門氏菌感染，需要良好的檢測和篩查程序。通過常規(guī)細菌學方法對沙門氏菌進行檢測非常耗時，通常需要至少5天。因此，許多工作者已進行了嘗試以減少所需要的時間和提高沙門氏菌檢測方法的靈敏性(Notermans等，1997；Ferretti等，2001；Carli等，2001)。
由于公眾健康相關(guān)意識的增強和食源性污染和疾病對經(jīng)濟影響的增加，所以導致付出了更多的努力以研發(fā)更靈敏的病原檢測和鑒定方法。隨著分子生物學技術(shù)，尤其是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的發(fā)展，微生物的鑒定和監(jiān)測更加可靠。PCR還成為研究食源性疾病的發(fā)作和鑒定引起微生物流行性疾病的病原體的重要工具。PCR技術(shù)使得靈敏性提高，操作時間更快，對細菌病原的檢測得以改進。除了對食物進行分析之外，PCR還成功地應(yīng)用于對臨床或環(huán)境樣品中的病原微生物進行檢測和鑒定(Simon，1999；White，1992)。
產(chǎn)腸毒素作用被認為是引起腹瀉的細菌的顯著的病理學性質(zhì)之一。還證明了已知與人和動物中的腸胃炎和腹瀉有關(guān)的沙門氏菌血清型可以產(chǎn)生腸毒素。stn基因定位在沙門氏菌(Salmonella lyphimurium)的染色體大約89分鐘，完整的stn基因的存在對沙門氏菌總體毒力具有顯著作用。本發(fā)明人在此提供了stn基因作為沙門氏菌的檢測標記的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是研發(fā)用于檢測寄生物沙門氏菌的引物。
本發(fā)明的另一個主要目的是研發(fā)寄生物沙門氏菌的快速有效的檢測方法。
本發(fā)明的另外的一個主要目的是研發(fā)從食物和生物樣品等中檢測寄生物沙門氏菌的方法。
本發(fā)明涉及對沙門氏菌腸毒素基因(stn)基因具有特異性的寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.21，這些引物對沙門氏菌的快速和特異篩查是有用的；本發(fā)明還涉及沙門氏菌腸毒素基因(stn)基因的快速且特異檢測方法，該方法通過將寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.21用于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，以確定寄生物沙門氏菌是否存在于受試對象中，該方法包括以下步驟制備所述基因的DNA模板，用所述引物通過PCR對該模板進行擴增，在凝膠上對PCR產(chǎn)物進行電泳，以及對所述寄生物進行檢測。


圖1顯示了1％瓊脂糖凝膠，該凝膠顯示了在檢測沙門氏菌中所使用的所有4個PCR產(chǎn)物。泳道1顯示了1kb的DNA梯度(Fermentas)。泳道2顯示了用引物QVR133和QVR134進行的PCR擴增(200bp)；泳道3了顯示用引物QVR135和QVR136進行的PCR擴增(207bp)；泳道4顯示了用引物QVR137和QVR138進行的PCR擴增(1318bp)；泳道5顯示了用引物QVR139和QVR140進行的PCR擴增(450bp)；泳道6顯示了采用引物QVR139和QVR140的陰性對照。
圖2顯示了1％瓊脂糖凝膠，該凝膠顯示了用引物QVR137和QVR138從血液中檢測不同數(shù)量的沙門氏菌細胞。泳道1顯示了1kb的DNA梯度(Fermentas)。泳道2顯示了陽性對照；泳道3顯示了摻入約1個細胞并且經(jīng)過了5小時的預富集的血樣；泳道4顯示了陰性對照(未接種的血樣)；泳道5顯示了摻入低于10個細胞而未經(jīng)預富集而進行PCR的血樣；泳道6顯示了摻入10個細胞并且未經(jīng)預富集而進行PCR的血樣；泳道7顯示了摻入103個細胞并且未經(jīng)預富集而進行PCR的血樣。
圖3顯示了1％瓊脂糖凝膠，該凝膠顯示了用巢式PCR檢測沙門氏菌的PCR擴增產(chǎn)物。用引物QVR137和QVR138進行第一次PCR反應(yīng)，而用引物QVR139和QVR140進行巢式PCR反應(yīng)。泳道1顯示了1kb的DNA梯度(Fermentas)；泳道2～泳道7顯示了沙門氏菌的不同血清型；泳道8顯示了陰性對照。
具體實施例方式
相應(yīng)地，本發(fā)明涉及對沙門氏菌腸毒素基因(stn)基因具有特異性的寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.21，這些引物對沙門氏菌的快速和特異篩查是有用的；本發(fā)明還涉及沙門氏菌腸毒素基因(stn)基因的快速且特異檢測方法，該方法通過將寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.21用于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，以確定寄生物沙門氏菌是否存在于受試對象中，該方法包括以下步驟制備所述基因的DNA模板，用所述引物通過PCR對該模板進行擴增，在凝膠上對PCR產(chǎn)物進行電泳，以及對所述寄生物進行檢測。
在本發(fā)明的一個實施方案中，其中，寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.21對沙門氏菌腸毒素基因(stn)基因具有特異性，對快速且特異篩查沙門氏菌是有用的。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，沙門氏菌腸毒素基因(stn)基因的快速且特異檢測方法為通過將寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQID No.21用于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，以確定寄生物沙門氏菌是否存在于受試對象中，該方法包括以下步驟●制備所述基因的DNA模板，●用所述引物通過PCR擴增對該模板進行擴增，●在凝膠上對PCR產(chǎn)物進行電泳，和●檢測所述寄生物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，所述的基因是由沙門氏菌的血清型來測序的。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，所述的引物可以檢測每毫升至多含有(up to)約1個細胞的水，該水經(jīng)過或未經(jīng)過任何富集。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，所述的引物可以檢測每毫升至多含有10個細胞的血液，該血液經(jīng)過或未經(jīng)過任何富集。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，所述的引物可以檢測每克至多含有1個細胞的食物和臨床樣品，所述食物和臨床樣品經(jīng)過或未經(jīng)過任何富集。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，來自血液和背景微菌群的DNA不會干擾PCR分析。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，可以將所述方法用于水的質(zhì)量控制和沙門氏細菌的診斷。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，所述受試對象是人和動物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2組成的一套引物產(chǎn)生200bp的擴增子。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4組成的一套引物產(chǎn)生207bp的擴增子。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6組成的一套引物產(chǎn)生1318bp的擴增子。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8組成的一套引物產(chǎn)生450bp的擴增子。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，所述引物的濃度為1pM～100pM。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，在濃度為0.3％～2.7％的凝膠上使PCR產(chǎn)物可視化。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，PCR包括在93℃～97℃進行30秒～7分鐘的起始變性；和進行23～50個循環(huán)93℃～97℃進行3秒～2分鐘，在50℃～67℃進行10秒～2分鐘，在70℃～75℃進行10秒～2分鐘；以及在70℃～75℃進行2分鐘～10分鐘的最終延伸。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，所述的DNA是分離自純培養(yǎng)物、水、食物和臨床樣品。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，所述的stn基因由沙門氏菌的幾個血清型來測序的，并發(fā)現(xiàn)該序列是保守的。通過使用基于沙門氏菌腸毒素基因(stn)的特異引物，研發(fā)出了基于PCR的沙門氏菌檢測程序。這些引物和PCR程序已由本發(fā)明人設(shè)計并且首次報道的。本方法具有高度特異性，并且可以檢測未經(jīng)預富集的直到每毫升含有1個細胞的水和每毫升含有低于10個細胞的血液。所述引物沒有顯示任何擴增非沙門氏菌DNA的傾向。來自血液和背景微菌群的DNA既不產(chǎn)生任何非特異性PCR擴增子，也不抑制PCR分析，因而不干擾PCR分析?？梢詫⒃摲椒ㄓ糜谒馁|(zhì)量控制和人和動物中的沙門氏菌血癥的診斷。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，基于stn基因(沙門氏菌腸毒素基因)而設(shè)計并用于聚合酶鏈式反應(yīng)的寡核苷酸引物對通過PCR程序快速且特異性地檢測沙門氏菌是有用的，所述PCR程序包括在93℃～97℃進行30秒～7分鐘的起始變性；和進行23～50個循環(huán)93℃～97℃進行3秒～2分鐘，在50℃～67℃進行10秒～2分鐘，在70℃～75℃進行10秒～2分鐘；以及在70℃～75℃進行2分鐘～10分鐘的最終延伸。通過任何已知適合于PCR的方法從純培養(yǎng)物、水、食物和臨床樣品中分離DNA后，用Ifg～1Oug的DNA和熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進行PCR，然后在0.5％～2.5％的瓊脂糖凝膠上使PCR產(chǎn)物可視化。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，在沙門氏菌的快速檢測方法中選擇以下引物以下分別是組成第1套引物的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，也稱為QVR133和QVR1345’GAAGCAGCGCCTGTAAAATC3’/5’TGGCTGTGGTGCAAAATATC3’；以下分別是組成第2套引物的SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，也稱為QVR135和QVR1365’GCCACCAGCTTTTCTTTACG 3’/5’ACGAACCAGCGAAACAAACT 3’；以下分別是組成第3套引物的SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，也稱為QVR137和QVR1385’GGTCAAAATCCAGCGGTTTA 3’/5’TTGCTGCTAACGGCGAGA 3’；以下分別是組成第4套引物的SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，也稱為QVR139和QVR1405’GCCGGCTTTCAACGCCTCTAC3’/5’GACCAAAGCTGACGGGACAG3’；SEQ ID NO.95’ACGCCTCTACCGCCGTTTCC3’，SEQ ID NO.105’CGACCAAAGCTGACGGGACAG3’，SEQ ID NO.115’CGTTTCCACGCTGGAAAATGC3’，SEQ ID NO.125’GCCGGCTTTCAACGCCTCTAC3’，SEQ ID NO.135’CATGGCGGCGCGATTAAGG3’，SEQ ID NO.14
5’AATCGGAATGGCGGGATTGAG3’，SEQ ID NO.155’TGCCGTTCATAATCAAAATCG3’，SEQ ID NO.165’GATTTTACAGGCGCTGCTTC3’，SEQ ID NO.175’GGTCAAAATCCAGCGGTTTA3’，SEQ ID NO.185’GCTCAGGTGCGTGAGAAAGT3’，SEQ ID NO.195’GTTCGAGCAATTCGCTTACC3’，SEQ ID NO.205’GCTTGATGCAATGAAGCGTA3’，SEQ ID NO.215’TTCCCGCTATCGGTAACAGT3’。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，涉及在如權(quán)利要求1和2所要求的引物和沙門氏菌的快速檢測方法，其中所使用的引物濃度可以為1pM～100pM，第1套引物、第2套引物、第3套引物和第4套引物分別產(chǎn)生200bp、207bp、1318bp和450bp的特異性擴增子(圖1)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，涉及檢測沙門氏菌的引物和快速方法，其中可以從諸如食物、臨床樣品(圖2)或和水樣等不同來源中檢測出沙門氏菌的所有類型血清型(圖3)，所述樣品可以經(jīng)過富集或未經(jīng)富集，每毫升或每克樣品的細胞含量可以低至1個細胞。在如權(quán)利要求1～4所要求的檢測沙門氏菌的引物和快速方法，可以從每25毫升或每25克樣品含有1個細胞的不同來源中檢測出沙門氏菌的所有類型血清型，所述樣品可以經(jīng)過富集或未經(jīng)富集。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中，涉及引物和沙門氏菌純培養(yǎng)物的檢測，其中可以在PCR中使用包括制備熱激溶解產(chǎn)物在內(nèi)的任何已知方法分離的染色體DNA，然后在0.5％～2.5％的瓊脂糖凝膠上使PCR產(chǎn)物可視化。
方法程序主要包括3個步驟●模板DNA的制備●聚合酶鏈式反應(yīng)●產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的可視化用于PCR的DNA分離將來自1ml液體培養(yǎng)物的細胞沉淀或瓊脂培養(yǎng)基上的單菌落懸浮在100μl的無菌的Millipore水中，并在干浴器中于100℃溫育5分鐘。將該混合物立即轉(zhuǎn)移到冰浴器中，并放置3分鐘。將所得到的細胞溶解物在7000rpm離心3分鐘。將2μl的上清液直接用于20μl的PCR反應(yīng)中。
只要覺得有必要，即可用分離的染色體DNA進行分析。對于純?nèi)旧wDNA的分離，可以將所述培養(yǎng)物在營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)6小時，并通過GES法(Pitcher等，1989)對DNA進行分離。在20μl的反應(yīng)分析中通常使用10ng的DNA。
從血液中制備模板將DNA分離試劑盒(M/S Bio Basic，加拿大)用于從血液中分離DNA(圖2)。
從水中制備模板為了從水源性細菌中分離DNA，將1ml的樣品在5ml的微量離心管中以7000rpm離心3分鐘，倒掉上清液，將10μl的經(jīng)熱壓處理的Millipore水加到各管中。渦旋振蕩所獲得的懸浮液，在干浴器中于100℃溫育5分鐘，將所有體積的溶液用于20μl的PCR反應(yīng)中。
富集就血液而言，將250μl的等分樣品接種到5ml的液體培養(yǎng)基中；而對于水，將1ml的等分試樣接種到1ml的二倍濃縮的腦心浸出物培養(yǎng)液(Brain Heart Infusion Broth，HiMedia，印度)并在37℃溫育5小時。按以上方法制備所述的細胞溶解產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.21，這些引物對沙門氏菌腸毒素基因(stn)基因具有特異性，并對沙門氏菌的快速且特異篩查有用。
2.沙門氏菌腸毒素基因(stn)基因的快速且特異檢測方法，該方法通過將寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.21用于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，以確定寄生物沙門氏菌是否存在于受試對象中，該方法包括以下步驟i.制備所述基因的DNA模板，ii.用所述引物通過PCR對該模板進行擴增，iii.在凝膠上對PCR產(chǎn)物進行電泳，和iv.檢測所述寄生物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述的基因是由沙門氏菌的血清型來測序的。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述引物可以檢測每毫升至多含有約1個細胞的水，所述水經(jīng)過或未經(jīng)過任何富集。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述的引物可以檢測每毫升至多含有10個細胞的血液，所述血液經(jīng)過或未經(jīng)過任何富集。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述的引物可以檢測每克至多含有1個細胞的食物和臨床樣品，所述食物和臨床樣品經(jīng)過或未經(jīng)過任何富集。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，來自血液和背景微菌群的DNA不會干擾PCR分析。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，可以將所述方法用于水的質(zhì)量控制和沙門氏細菌的診斷。
9.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述受試對象是人和動物。
10.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2組成的一套引物產(chǎn)生200bp的擴增子。
11.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4組成的一套引物產(chǎn)生207bp的擴增子。
12.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6組成的一套引物產(chǎn)生1318bp的擴增子。
13.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8組成的一套引物產(chǎn)生450bp的擴增子。
14.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述引物的濃度為1pM～100pM。
15.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，在濃度為0.3％～2.7％的凝膠上使PCR產(chǎn)物可視化。
16.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述PCR包括在93℃～97℃進行30秒～7分鐘的起始變性；和進行23～50個循環(huán)93℃～97℃進行3秒～2分鐘，在50℃～67℃進行10秒～2分鐘，在70℃～75℃進行10秒～2分鐘；以及在70℃～75℃進行2分鐘～10分鐘的最終延伸。
17.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述的DNA是分離自純培養(yǎng)物、水、食物和臨床樣品的。
全文摘要
本發(fā)明涉及對沙門氏菌(Salmonella)腸毒素特異基因(stn)基因具有特異性的寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.21，這些引物對沙門氏菌的快速且特異篩查是有用的。本發(fā)明還涉及沙門氏菌腸毒素特異基因(stn)基因的快速且特異檢測方法，該方法通過將寡核苷酸引物SEQID No.1～SEQ ID No.21用于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，以確定寄生物沙門氏菌是否存在于受試對象中，所述方法包括以下步驟制備所述基因的DNA模板，用所述引物通過PCR對該模板進行擴增，在凝膠上對PCR產(chǎn)物進行電泳，以及對所述寄生物進行檢測。
文檔編號C12N15/87GK1771331SQ03826430
公開日2006年5月10日 申請日期2003年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月31日
發(fā)明者吳拉姆·納比·卡齊, 維杰施瓦·維爾馬, 賽義德·里亞齊-烏-哈桑 申請人:科學和工業(yè)研究委員會