一種用于肺癌風險預測的基因檢測引物組和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及癌癥風險預測技術領域，尤其涉及一種用于肺癌風險預測的基因檢測 引物組和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 根據(jù)中國腫瘤防治研究辦公室和全國腫瘤登記中心發(fā)布的2013年腫瘤登記工作 總結，2010年我國登記地區(qū)惡性腫瘤病例高達315.7萬，累積發(fā)病率為21.51 %，累積死亡率 為13.49%，成為我國居民的第二大死因。其中肺癌的累積發(fā)病率在所有癌癥中排第一位， 尚達3.7%，死亡率更是遠尚于其它癌癥，是我國癌癥第一殺手。
[0003] 吸煙與肺癌的發(fā)生有顯著相關性，12.56%的死亡因素可歸結于吸煙。肺癌的發(fā)生 通常是一個緩慢的過程，除了吸煙等環(huán)境因素外還有癌癥基因變異、攜帶腫瘤風險基因等 遺傳因素，是基因與環(huán)境共同作用的結果。
[0004] 通過基因檢測和遺傳咨詢，可以預測一些腫瘤的發(fā)病風險，了解到風險基因是否 會遺傳給下一代，還可以結合腫瘤預防手段管理個體健康。當前，我國的基因檢測和遺傳咨 詢還處于發(fā)展初期，早期的疾病預防往往被忽視，更多的人是在發(fā)病中期甚至是晚期才覺 察到。肺癌作為"難治"的腫瘤，更應該注重預防和早期篩查。通過基因檢測，預測肺癌發(fā)病 風險，從而實現(xiàn)早知道、早預防。
[0005] 當前的肺癌風險預測基因檢測，大多基于高加索人的遺傳特征。由于遺傳的異質 性、基因多效性等，例如腫瘤易感位點、易感位點突變頻率、腫瘤發(fā)病率在不同的種群中會 有不同程度的差異，特別的，來源于全基因組關聯(lián)分析研究(GWAS)的腫瘤易感位點對種群 的要求更是嚴格，這些因素促使腫瘤風險預測基因檢測需要根據(jù)中國人群的遺傳特征進行 優(yōu)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種用于肺癌風險預測的基因檢測引物組和試劑盒，針對中國人群肺 癌的易感位點，結合可乘性風險評估模型，可以有效預測肺癌發(fā)病風險。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種用于肺癌風險預測的基因檢測引物組， 包括用于進行肺癌易感SNP的PCR擴增反應的正向引物序列SEQ ID N0:1-22、反向引物序列 SEQ ID N0:23-44,以及用于進行單堿基延伸反應的特異性延伸引物序列SEQ ID N0:45-66〇
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種用于肺癌風險預測的基因檢測試劑盒， 包括第一方面的引物組，即包括用于進行肺癌易感SNP的PCR擴增反應的正向引物序列SEQ ID Ν0:1-22、反向引物序列SEQ ID Ν0:23-44,以及用于進行單堿基延伸反應的特異性延伸 引物序列SEQ ID Ν0:45-66。
[0009] 作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述試劑盒還包括用于進行PCR擴增反應的其 它組分。
[0010] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述用于進行PCR擴增反應的其它組分包括PCR緩沖液、 鎂離子、dNTP混合物、DNA聚合酶和水中的一種或多種。
[0011] 作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述試劑盒還包括用于對PCR產(chǎn)物進行處理的 堿性磷酸酶。
[0012] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述堿性磷酸酶是蝦堿性磷酸酶。
[0013] 作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述試劑盒還包括用于進行單堿基延伸反應的 其它組分。
[0014] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述用于進行單堿基延伸反應的其它組分包括延伸反應 緩沖液（iPLEX緩沖液，iPLEX Buffer plus)、反應終止子（iPLEX終止子，iPLEX terminator)和反應用酶（iPLEX酶，iPLEX enzyme)中的一種或多種。
[0015] 作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述試劑盒還包括用于對上述單堿基延伸反應 的產(chǎn)物進行純化的樹脂。
[0016] 作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述試劑盒還包括用于接受上述純化后的產(chǎn)物 點樣的芯片。
[0017] 現(xiàn)有的腫瘤風險預測通常使用高加索人群數(shù)據(jù)，不同群體的遺傳差異會導致預測 效果大打折扣。本發(fā)明針對中國人群肺癌的易感位點，結合可乘性風險評估模型，可以有效 預測肺癌發(fā)病風險。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明一個實施例的肺癌風險預測模型AUC曲線圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面通過【具體實施方式】結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0020] 本發(fā)明使用全基因組關聯(lián)分析研究(GWAS)中針對中國人群的腫瘤易感位點，篩選 出可以有效預測肺癌發(fā)病風險的22個單核苷酸多態(tài)性位點（SNP);根據(jù)這些SNP，設計相應 的用于PCR擴增反應和單堿基延伸反應的引物組;采集受檢者的唾液或者血液樣本提取出 DNA;通過飛行時間質譜(T0F-MS)技術，準確檢測出肺癌易感SNP的基因型。最終通過基因分 型結果，使用可乘性風險模型(multiplicative risk model)，分析受檢者肺癌發(fā)病風險， 進而可以根據(jù)預測結果，制定科學有效的個體健康管理計劃，降低高風險因素帶來的影響。
[0021] 發(fā)明人已經(jīng)證明，采用本發(fā)明的引物組進行中國人的肺癌風險預測效果優(yōu)異，表 現(xiàn)在其模型AUC結果良好，目前還沒有能夠實現(xiàn)這么優(yōu)異的效果的肺癌風險預測技術。
[0022] 在本發(fā)明的一個實施例中，通過篩選全基因組關聯(lián)分析研究(GWAS)中的肺癌易感 位點，檢測這些單核苷酸多態(tài)性(SNP)的基因型，結合數(shù)學分析模型，預測肺癌的發(fā)病風險。 步驟概括如下：
[0023] 1.篩選GWAS研究中的腫瘤易感位點
[0024]在美國國家生物信息中心(NCBI)的文獻檢測系統(tǒng)(pubMed)上搜索基于中國人群 的GWAS研究中的肺癌易感位點，同時檢索GWAS Catalog提供的數(shù)據(jù)庫，篩選出GWAS研究中 陽性樣本量超過750例、校正后的P值〈0.01、在大規(guī)模病例對照組研究中得到驗證的易感位 點，并要求這些位點在中國人群中頻率不低于〇 . 05，如果SNPs之間的連鎖不平衡系數(shù)r2> 0.8，則選取比值比(OR)最大的SNP。
[0025] 篩選后得到的肺癌易感位點，如表1所示。
[0026] 表 1
[0027]
[0028] 2.使用商業(yè)試劑盒提取人唾液中基因組DNA
[0029] 使用Hipure Blood DNA Mini Kits(Magen，D3111)或類似產(chǎn)品，提取唾液或血液 中的DNA。用分光光度計定量，瓊脂糖凝膠電泳質檢，基因組DNA電泳條帶通常不小于20kb。 將質檢合格的DNA濃度調(diào)整到30-50ngAiL，轉移至384孔板，-20 °C儲存?zhèn)溆谩?br>[0030] 3.使用飛行時間質譜(T0F-MS)技術基因分型
[0031] 檢測過程結合多重PCR技術、MassARRAY iPLEX單堿基延伸技術和基質輔助激光解 吸附電離飛行時間質譜分析質譜技術(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight，MALDI-TOF)進行分型檢測。將包含SNP位點區(qū)域的DNA模板通過PCR技術擴 增，再使用特異的延伸引物與PCR產(chǎn)物進行單堿基延伸反應。由于多態(tài)性位點堿基不同，延 伸產(chǎn)物不同的末端堿基將導致延伸后的產(chǎn)物分子量的差異，因此由SNP多態(tài)性引起的堿基 差異通過分子量的差異而體現(xiàn)，通過基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析質譜技 術，檢測延伸產(chǎn)物分子量的大小，應用專用的分析軟件，通過判斷分子量的差異而進行SNP 分型檢測。詳細過程包括步驟4~10。
[0032] 4.引物設計及合成
[0033]設計并合成待測SNP位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物。SNP位點及對應的PCR 擴增引物和延伸引物序列見表2。
[0034] 表 2
[0035]
[0038]
[0039] 5.PCR 擴增
[0040] 采用多重PCR技術，在384孔板中進行，每個反應體系總體積為5yL。
[0041 ] (1)在一個新的1.5ml EP管中配制PCR預混合液(PCR master mix)溶液，如表3所 不。
[0042] 表 3
[0043]
[0044] (2)使用24通道加樣器，調(diào)節(jié)加樣體積為4yL，在384孔板的每個加樣孔中加入PCR 預混合液。該384孔板即為PCR反應板。
[0045] (3)取出已經(jīng)制備好的DNA樣品384孔板，使用24通道加樣器，調(diào)節(jié)模板加樣體積為 lyL，每個5yL PCR反應體系中包含模板DNA 20-50ng，Hotstar Taq 0.5U，每條擴增引物 0.5pmol，0.1yL的25mM dNTPs。
[0046] (4)在兼容384孔板的PCR儀上設定PCR反應條件為:94°C4分鐘；94°C20秒，56°C30 秒，72 °C 1分鐘，45個循環(huán);72 °C 3分鐘;4 °C保持。將384孔PCR反應板放置于PCR儀上，啟動PCR 反應。
[0047] 6. PCR產(chǎn)物堿性磷酸酶處理
[0048] 在PCR反應結束后，將PCR產(chǎn)物用SAP (shrimp alkaline phosphatase，4下喊