專利名稱：一種提高長鏈二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高長鏈二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法，特別適于發(fā)酵法制取C10～C18長鏈二元酸的過程。
背景技術(shù)：
長鏈二元酸是一種重要的精細(xì)化工原料，可用于合成香料、熱熔膠、工程塑料和液晶等，應(yīng)用非常廣泛。
目前，長鏈二元酸主要利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，利用微生物雙末端氧化的特殊功能發(fā)酵正構(gòu)烷烴制取長鏈二元酸。由微生物氧化烷烴生成長鏈二元酸的機(jī)理研究可知，其主反應(yīng)是ω-氧化，副反應(yīng)是β-氧化，生成的產(chǎn)物長鏈二元酸可被進(jìn)一步氧化降解。雖然目前國內(nèi)外生產(chǎn)菌株的ω-氧化能力較強(qiáng)，產(chǎn)酸最高可達(dá)200g/L，但在生產(chǎn)長鏈二元酸過程中面臨的一個首要問題是發(fā)酵產(chǎn)率低，一般烷烴對長鏈二元酸的分子轉(zhuǎn)化率只有50～60％，因此造成了原材料的大量消耗，生產(chǎn)成本過高。由于高生產(chǎn)成本已成為高檔熱熔膠、高級航空潤滑油和特性工程塑料等下游產(chǎn)品開發(fā)的限制因素。如何減弱菌種的β-氧化能力，阻斷或緩解長鏈二元酸進(jìn)一步降解是提高發(fā)酵產(chǎn)率、減少烷烴消耗、降低生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。為此，研究人員從菌種選育、發(fā)酵條件及代謝調(diào)控等方面開展了大量的研究工作，以提高發(fā)酵水平。
WO 91/06660公開了一種利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建工程菌發(fā)酵生產(chǎn)二元酸的方法。它對發(fā)酵菌種C.tropicalis基因組進(jìn)行了專門修飾，導(dǎo)致β-氧化相關(guān)的基因POX4和POX5缺失，使其β-氧化途徑阻斷，可高效生產(chǎn)長鏈二元酸。中國專利CN1233658A公開了一種生產(chǎn)長鏈二元酸的熱帶假絲酵母菌的篩選方法。該方法能快速而高效的獲得α、ω-氧化增強(qiáng)的假絲酵母突變株，為提高產(chǎn)酸量和轉(zhuǎn)化率打下基礎(chǔ)。中國專利CN1257126A公開了一種利用一株難以利用正構(gòu)烷烴作生長碳源的熱帶假絲酵母突變株FP-UV-56氧化C10～C18正構(gòu)烷烴生產(chǎn)α，ω-長鏈二元酸的方法，同時采用雙底物發(fā)酵使產(chǎn)酸量和轉(zhuǎn)化率均有提高。
中國專利CN1130685A、CN1162644A、CN1369564A、CN1092108A、CN1034579A、CN1046757A分別公開了通過硝基胍、亞硝酸和紫外線多次反復(fù)誘變，選育出ω-氧化能力更強(qiáng)的熱帶假絲酵母突變菌株，并以烷烴作生長碳源，氧化正構(gòu)烷烴生產(chǎn)長鏈二元酸的方法。這些菌株對應(yīng)十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸有一定效果。
上述方法主要從菌種改良方面來提高發(fā)酵產(chǎn)率，而菌種改良的工作量大，不確定因素多，發(fā)酵產(chǎn)率仍需進(jìn)一步提高。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種簡單易行的提高二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法。
本發(fā)明提高二元酸發(fā)酵產(chǎn)率方法為在常規(guī)的發(fā)酵法生產(chǎn)C10～C18長鏈二元酸的過程中，加入抑制劑來減弱菌株的β-氧化能力，降低了烷烴消耗，使發(fā)酵產(chǎn)率有較大提高。抑制劑主要有C5～C18鹵代脂肪酸、C5～C18甲基脂肪酸及上述酸的鹽或酯等中的一種或幾種。鹵代脂肪酸可以選自溴代辛烷酸、10-溴代癸酸、11-溴代十一酸、溴代己酸甲酯、2-溴代己酸、6，8-二氯代辛酸乙酯、溴代月桂酸酯、碘代棕櫚酸、溴代棕櫚酸酯等中的一種或幾種。甲基脂肪酸可以選自15-甲基棕櫚酸、4-甲基壬酸、3-甲基辛酸甲酯、2-甲基戊酸、甲基月桂酸等中的一種或幾種。鹵代脂肪酸及甲基脂肪酸鹽可以選自所述酸的鈉鹽、鉀鹽等中的一種或幾種。鹵代脂肪酸及甲基脂肪酸酯可以選自所述酸與C1～C3一元醇反應(yīng)得到的酯類的一種或幾種。抑制劑濃度為0.01～5mmol/L，以0.05～2.0mmol/L為好。抑制劑可以在菌體培養(yǎng)初期加入，也可以在轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸期時加入。
本發(fā)明涉及的發(fā)酵法生產(chǎn)長鏈二元酸的其它條件，如菌體的選育和培養(yǎng)、發(fā)酵過程的原料及條件等，可以與現(xiàn)有技術(shù)相同。下面介紹一種常規(guī)較理想的情況。
本發(fā)明所用菌種為可使C10～C18正構(gòu)烷烴發(fā)酵得到相應(yīng)碳數(shù)的二元酸的微生物菌種。如熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)突變株P(guān)F-UV-56，該突變株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNO.0356，同時也適用于具有β-氧化酶系的可發(fā)酵生產(chǎn)長鏈二元酸的其它類型菌株。
本發(fā)明制取長鏈二元酸的具體方法是1、取一接種環(huán)FP-UV-56酵母菌，涂布在無菌的麥芽汁固體斜面培養(yǎng)基上，于29～32℃培養(yǎng)40～48小時。
2、取一支步驟1培養(yǎng)好的斜面菌種，接入經(jīng)121℃，20min滅菌后裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，在180轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上于29～32℃培養(yǎng)30～48小時，作搖瓶種子液。
3、取一定體積培養(yǎng)好的無雜菌的種子液接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角搖瓶中，在180轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上于29～32℃培養(yǎng)20～40小時，這期間主要消耗糖質(zhì)來迅速繁殖菌體。待糖質(zhì)消耗后，上調(diào)pH值并加入正構(gòu)烷烴，轉(zhuǎn)入發(fā)酵產(chǎn)酸期。在產(chǎn)酸期，根據(jù)發(fā)酵時間延長及二元酸積累量的增加逐漸上調(diào)pH值，其變化范圍為7.0～8.5。正構(gòu)烷烴(nC)采取每隔12～36小時按5％(v/v)分批補(bǔ)加，以發(fā)酵混合液初始體積為準(zhǔn)，烷烴總加入量為5～20％(v/v)，總培養(yǎng)時間為3～4天。分別采用了生長細(xì)胞和休止細(xì)胞兩種發(fā)酵方式。
上述方法所涉及培養(yǎng)基為(1)斜面培養(yǎng)基10Brix麥芽汁加2％瓊脂制成的固體斜面。
(2)種子和發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)糖質(zhì)10～40，金屬磷酸鹽2～10，酵母膏1～3，玉米漿1～3，尿素1～4，NaCl 0.5～1.5，MgSO4·7H2O 0.5～3，銨鹽2～8，維生素B1 20～200ppm，正構(gòu)烷烴(nC)10～50ml/L，自來水配制，自然pH。
糖質(zhì)可以是葡萄糖、蔗糖等；金屬磷酸鹽可以是鉀鹽或鈉鹽；銨鹽可以是(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4或CH3COONH4；正構(gòu)烷烴可以是C10～C18烷烴，特別是C12～C16正構(gòu)烷烴。
本發(fā)明在正構(gòu)烷烴發(fā)酵生產(chǎn)相應(yīng)碳數(shù)二元酸過程中，加入抑制劑來減弱菌株的β-氧化能力，降低了烷烴消耗，使發(fā)酵產(chǎn)率有較大提高。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有產(chǎn)酸速度快、β-氧化弱、烷烴消耗少、發(fā)酵產(chǎn)率高的特點，特別適于制取長鏈二元酸。
具體實施例方式
下面通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的方法和效果。
實施例1(1)取一接種環(huán)FP-UV-56菌種，涂布在20×180mm的大試管固體斜面培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)48小時。
(2)將(1)培養(yǎng)好的菌種接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL三角搖瓶中，于30℃在180轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)40小時。培養(yǎng)基組成為(g/L)葡萄糖30，KH2PO46，酵母膏1，玉米漿1，尿素2，NaCl 1，MgSO4.7H2O 0.5，VB10.1，正十三烷(nC13)20mL/L，自來水配制，自然pH。
(3)在裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角搖瓶中，接入5mL上述種子液，同時加入0.5mmol/L的抑制劑2-溴代辛烷酸(2-Bromooctanoic acid，簡稱BA)，并且做3個平行樣，在180轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上于30℃發(fā)酵4天。發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L)葡萄糖30，KH2PO44，酵母膏1，玉米漿1，尿素1(分消)，NaCl1，MgSO4.7H2O 0.5和(NH4)2SO45(分消)，VB10.05，nC1350mL/L，自來水配制，自然pH，在121℃下滅菌20分鐘。發(fā)酵期間每12小時用5N NaOH調(diào)pH值至7.5～8.2。發(fā)酵基質(zhì)為nC13，總加入量為15％(v/v)。發(fā)酵結(jié)束后，取1mL發(fā)酵液以肉豆蔻酸作內(nèi)標(biāo)，經(jīng)酸化、乙醚萃取、去乙醚、用甲醇溶解，三氟化硼作催化劑于80℃左右酯化，再用正己烷萃取后用氣相色譜分析酸含量。另取1mL發(fā)酵液，按殘烴含量與內(nèi)標(biāo)比約1∶1加入nC15，并用正己烷萃取后用氣相色譜分析殘烴含量，通過計算得出發(fā)酵產(chǎn)率，結(jié)果見表1。
實施例2按實施例1的方法，但以抑制劑15-甲基棕櫚酸甲酯(15-Methylpalmitic acidmethyl ester簡稱ME)替代BA，在搖瓶接種時加入，濃度為1mmol/L，發(fā)酵基質(zhì)為nC14，加入量為10％(v/v)，發(fā)酵3天。發(fā)酵結(jié)束后，用實施例1方法測定二元酸及殘余烷烴，經(jīng)計算得出發(fā)酵產(chǎn)率，結(jié)果見表1。
實施例3按實施例1的方法，但以抑制劑11-溴代十一酸(11-Bromoundecane acid簡稱BD)替代BA，并在菌體培養(yǎng)40小時時加入，濃度為0.05mmol/L，發(fā)酵基質(zhì)為nC15，加入量為15％(v/v)，發(fā)酵4天。發(fā)酵結(jié)束后，用實施例1方法測定二元酸及殘余烷烴，經(jīng)計算得出發(fā)酵產(chǎn)率，結(jié)果見表1。
實施例4按實施例1的培養(yǎng)方法，在菌體培養(yǎng)40小時時將培養(yǎng)液以4000轉(zhuǎn)/分速度離心10分鐘去清液，并用1/15M磷酸緩沖液(pH6.8)洗滌菌體，然后再加入50mL該緩沖液及5mmol/L抑制劑溴代棕櫚酸乙酯(Bromoopalmitate，簡稱BP)，繼續(xù)培養(yǎng)1小時后再離心。然后加入1/15M磷酸緩沖液(pH8.0)及10％(v/v)發(fā)酵基質(zhì)正nC16。在產(chǎn)酸期pH值變化范圍為7.0～8.5，發(fā)酵產(chǎn)酸3天。發(fā)酵結(jié)束后，用實施例1方法測定二元酸及殘余烷烴，經(jīng)計算得出發(fā)酵產(chǎn)率，結(jié)果見表1。
實施例5按實施例1的培養(yǎng)方法，在接種時加入0.5mmol/L抑制劑甲基棕櫚酸鈉鹽(Methylpalmitate，簡稱MP)，培養(yǎng)40小時后將培養(yǎng)液以4000轉(zhuǎn)/分速度離心10分鐘去清液，并用1/15M磷酸緩沖液(pH7.4～8.5)洗滌菌體，然后再加入50mL該緩沖液、1mmol/L抑制劑甲基戊酸(Methyl valeric acid，簡稱MA)及10％(v/v)發(fā)酵基質(zhì)nC12。在產(chǎn)酸期pH值變化范圍為7.0～8.5，發(fā)酵產(chǎn)酸3天。發(fā)酵結(jié)束后，用實施例1方法測定二元酸及殘余烷烴，經(jīng)計算得出發(fā)酵產(chǎn)率，結(jié)果見表1。
比較例按實施例1的培養(yǎng)方法，但不加抑制劑。在菌體培養(yǎng)40小時時轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸期，發(fā)酵基質(zhì)為nC13，發(fā)酵4天。發(fā)酵結(jié)束后，用實施例1方法測定二元酸及殘余烷烴，經(jīng)計算得出發(fā)酵產(chǎn)率，結(jié)果見表1。
表1 各實施例結(jié)果

(注以比較例的發(fā)酵產(chǎn)率為100％，各實施例與之相比)
權(quán)利要求
1.一種提高長鏈二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法，包括以C10～C18正構(gòu)烷烴為原料，用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)相應(yīng)二元酸，其特征在于在發(fā)酵生產(chǎn)過程中加入抑制劑來減弱菌株的β-氧化能力，抑制劑包括C5～C18鹵代脂肪酸、C5～C18甲基脂肪酸及以及上述酸的鹽或酯中的一種或幾種，抑制劑濃度為0.01～5mmol/L。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的抑制劑選自溴代辛烷酸、10-溴代癸酸、11-溴代十一酸、溴代己酸甲酯、2-溴代己酸、6，8-二氯代辛酸乙酯、溴代月桂酸酯、碘代棕櫚酸、溴代棕櫚酸酯、15-甲基棕櫚酸、4-甲基壬酸、3-甲基辛酸甲酯、甲基戊酸、上述酸類鈉鹽、上述酸類鉀鹽、上述酸與C1～C3一元醇反應(yīng)的酯。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的抑制劑的加入濃度為0.05～2.0mmol/L。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的抑制劑在菌體培養(yǎng)初期加入或在轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸期時加入。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的微生物菌株為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)突變株P(guān)F-UV-56，保藏編號為CGMCC NO.0356。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于微生物發(fā)酵法制取長鏈二元酸的過程為(1)取一接種環(huán)FP-UV-56酵母菌，涂布在無菌的麥芽汁固體斜面培養(yǎng)基上，于29～32℃培養(yǎng)40～48小時；(2)取一支步驟(1)培養(yǎng)好的斜面菌種，接入經(jīng)121℃，20min滅菌后裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，在180轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上于29～32℃培養(yǎng)30～48小時，作搖瓶種子液；(3)取一定體積培養(yǎng)好的無雜菌的種子液接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角搖瓶中，在180轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上于29～32℃培養(yǎng)20～40小時，然后上調(diào)pH值并加入正構(gòu)烷烴，轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸期；正烷烴采取每隔12～36小時按5％分批補(bǔ)加，以發(fā)酵混合液初始體積為準(zhǔn)，總加入量為5％～20％(v/v)，總培養(yǎng)時間為3～4天。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的斜面培養(yǎng)基為10Brix麥芽汁加2％瓊脂制成的固體斜面。
8.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的種子和發(fā)酵培養(yǎng)基為糖質(zhì)10～40g/L，金屬磷酸鹽2～10g/L，酵母膏1～3g/L，玉米漿1～3g/L，尿素1～4g/L，NaCl 0.5～1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5～3g/L，銨鹽2～8g/L，VB120～200ppm，正構(gòu)烷烴10～50ml/L。
9.按照權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述的糖質(zhì)是葡萄糖、蔗糖或半乳糖；金屬磷酸鹽是鉀鹽或鈉鹽；銨鹽是(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4或CH3COONH4；正構(gòu)烷烴是C10～C18直鏈烷烴。
10.按照權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述的正構(gòu)烷烴是C12～C16正構(gòu)烷烴。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高長鏈二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法。本發(fā)明方法以C
文檔編號C12P7/46GK1611608SQ20031010498
公開日2005年5月4日 申請日期2003年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月31日
發(fā)明者方向晨, 劉樹臣, 李淑蘭, 范峰 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院