專利名稱：mB7.1-GPI融合蛋白的制備及其應(yīng)用的制作方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬生物工程技術(shù)，主要涉及糖基化磷脂酰肌醇錨定型小鼠B7.1融合蛋白的制備及該融合蛋白膜表面修飾瘤苗的制備和在腫瘤治療方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗腫瘤瘤苗是腫瘤免疫基因治療的主要策略，在瘤苗制備過程中對自體或異體腫瘤細(xì)胞進(jìn)行表面修飾以增強(qiáng)其免疫原性和免疫效能，目前瘤苗修飾主要通過基因轉(zhuǎn)染手段實(shí)現(xiàn)。如Hodge等[1]將B7.1基因?qū)肽[瘤細(xì)胞中表達(dá)，提供共刺激因子，能增強(qiáng)瘤苗的抗腫瘤免疫反應(yīng)；Shrayer等[2]用SEA基因轉(zhuǎn)染小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞，使之表達(dá)SEA，應(yīng)用該瘤細(xì)胞制成瘤苗，顯示了較強(qiáng)的抗腫瘤作用。
雖然基因轉(zhuǎn)染法在腫瘤免疫基因治療上起著很重要作用，但是基因轉(zhuǎn)染法亦有其局限性[3]，如原代細(xì)胞不易轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率低、整合后基因的降解及其表達(dá)的不穩(wěn)定性以及制備費(fèi)時(shí)和臨床應(yīng)用困難。因此有必要探尋適合于原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染效率高、制備簡便、臨床易推廣應(yīng)用的轉(zhuǎn)染法。
通過基因工程手段將糖基化磷脂酰肌醇(GPI)與目的蛋白質(zhì)嵌合表達(dá)，由此制備的目的蛋白質(zhì)能夠錨定到多種細(xì)胞膜上，這種不通過基因轉(zhuǎn)染手段使目的蛋白在靶細(xì)胞膜上表達(dá)的方法叫蛋白轉(zhuǎn)染法(protein transfer)[4]。
蛋白轉(zhuǎn)染法有許多優(yōu)點(diǎn)[4](1)不依賴于細(xì)胞自身增殖潛能及可轉(zhuǎn)染性，故可用于多種原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，與細(xì)胞的類型和組織器官的來源無關(guān)；(2)在同一細(xì)胞中復(fù)合基因的共轉(zhuǎn)染及協(xié)同表達(dá)還存在一定的困難，而蛋白轉(zhuǎn)染可允許多種蛋白同時(shí)或順序地錨定在細(xì)胞表面，適合于多重免疫分子膜表面修飾瘤苗的制備；(3)在體外，可通過基因工程方法大量制備用于蛋白轉(zhuǎn)染的免疫分子，這些免疫分子與病人自體腫瘤細(xì)胞共同孵育后，可較簡便地制備經(jīng)免疫分子表面修飾的自體腫瘤細(xì)胞的瘤苗，無需在自體腫瘤細(xì)胞中作個(gè)別化的基因轉(zhuǎn)染，因此有較大的臨床應(yīng)用潛力。
本研究通過基因工程方法制備mB7.1-GPI，錨定于小鼠T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞(EL-4)，制備瘤苗，觀察它的抗腫瘤作用。本研究制備mB7.1-GPI的方法國內(nèi)外文獻(xiàn)均無報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是制備mB7.1-GPI融合蛋白，SEQ ID NO1為mB7.1-GPI融合基因的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過蛋白轉(zhuǎn)染法，將mB7.1-GPI融合蛋白錨定于瘤細(xì)胞膜上，制備細(xì)胞膜表面修飾瘤苗。
本發(fā)明是將mB7.1-GPI融合蛋白錨定于小鼠T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞(EL-4)，制備瘤苗。
本發(fā)明制備mB7.1-GPI融合蛋白的方法主要包括以下步驟(1)構(gòu)建hPLAP-1第11外顯子克隆載體pGEM-hPLAP-1 11exon(它包含GPI錨定信號序列)，以此為模板，擴(kuò)增GPI錨定信號序列。
(2)NSX-mB7-1為模板，擴(kuò)增mB7-1基因胞外區(qū)序列。
(3)利用SOEing反應(yīng)，將擴(kuò)增的二個(gè)序列連接起來。
(4)構(gòu)建此連接片段的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/mB7.1-GPI，測序正確。
(5)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將pcDNA3.1(+)/mB7.1-GPI轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，用G418篩選G418抗性克隆，以流式細(xì)胞術(shù)，篩選陽性克隆，篩選到一個(gè)高表達(dá)克隆，其陽性率為96.6％，熒光強(qiáng)度為34.8，命名該克隆為CHO/pcDNA3.1(+)-mB7.1-GPI。
(6)用免疫親和層析方法純化表達(dá)蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot分析顯示純化產(chǎn)物分子量約67KDa。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是制成的瘤苗在腫瘤治療方面的應(yīng)用，本發(fā)明提供的mB7.1-GPI融合蛋白具有膜錨定功能，可以將mB7.1共錨定在腫瘤細(xì)胞膜上，并具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。
本發(fā)明的特點(diǎn)是mB7.1-GPI能錨定在腫瘤細(xì)胞膜上，實(shí)驗(yàn)證明該錨定具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性；同時(shí)保持了免疫蛋白的生物學(xué)活性，在體外有刺激小鼠脾細(xì)胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ因子的功能。mB7-1-GPI錨定腫瘤細(xì)胞，制成的瘤苗，能抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長和延長荷瘤小鼠的存活時(shí)間，其機(jī)制與瘤苗增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動物免疫細(xì)胞NK和CTL活性以及刺激免疫活性細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ細(xì)胞因子有關(guān)。


圖1hPLAP-1基因第11外顯子PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖2重組pGEM-hPLAP-1 11exon質(zhì)粒DNA及其雙酶切產(chǎn)物的凝膠電泳圖3pGEM-hPLAP-1 11exon的測序結(jié)果圖4PCR產(chǎn)物的1％瓊脂糖凝膠電泳圖5pGEM-mB7.1-GPI酶切產(chǎn)物的凝膠電泳圖6pcDNA3.1(+)/mB7.1-GPI酶切產(chǎn)物的凝膠電泳圖7pcDNA3.1(+)/mB7.1-GPI的測序結(jié)果圖8mB7.1抗原在用基因轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中表達(dá)圖9轉(zhuǎn)染基因CHO細(xì)胞的免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果圖10PI-PLC處理前后CHO細(xì)胞表面mB7.1表達(dá)結(jié)果圖11mB7.1-GPI的mCD80-CNBr-Separose 4B親和層析純化圖12SDS-PAGE分析CHO細(xì)胞mB7.1-GPI融合蛋白的表達(dá)和純化結(jié)果(考馬斯藍(lán)染色)圖13Western Blot分析CHO細(xì)胞mB7.1-GPI融合蛋白的表達(dá)和純化結(jié)果圖14mB7.1-GPI錨定EL-4細(xì)胞的免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果圖15荷瘤小鼠在接受不同制劑治療后的腫瘤生長曲線圖16不同制劑治療組小鼠NK活性檢測(LDH釋放法)圖17不同制劑治療組小鼠的CTL活性(LDH釋放法)圖18荷瘤小鼠在接受不同制劑治療后的生存期具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，而非限定本發(fā)明。
本實(shí)驗(yàn)中所有相關(guān)數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)，其它計(jì)量資料采用方差分析(F檢驗(yàn))和兩兩比較q檢驗(yàn)。
實(shí)施例一 mB7.1-GPI基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及產(chǎn)物的純化一hPLAP-1第11外顯子克隆載體的構(gòu)建1.擴(kuò)增hPLAP-1基因第11外顯子產(chǎn)物的電泳分析PCR擴(kuò)增的hPLAP-1基因第11外顯子大小為307bp，1.5％的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果參見圖1，其中M100bp DNA分子大小標(biāo)志.，泳道1hPLAP-111外顯子的PCR產(chǎn)物。
2.重組pGEM-hPLAP-1 11exon質(zhì)粒DNA的酶切鑒定重組pGEM-hPLAP-1 11exon質(zhì)粒DNA用EcoRI和XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，目的基因大小為307bp，結(jié)果參見圖2，其中M1、M2DNA分子大小標(biāo)，泳道1hPLAP-1 11外顯子的PCR產(chǎn)物，泳道2pGEM-hPLAP-1 11外顯子的酶切產(chǎn)物。
3.擴(kuò)增基因的序列分析hPLAP-1基因第11外顯子序列[4]見Genbank(M19159.1)，我們的測序結(jié)果(參見圖3)與Genbank(M19159.1)中的標(biāo)準(zhǔn)序列比較顯示，上游區(qū)200bp與標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致。hPLAP-1 C末端的GPI錨定信號肽基因序列位于上游區(qū)150bp內(nèi)，故所克隆的hPLAP-1基因第11外顯子序列可以用于mB7.1-GPI融合基因的構(gòu)建。
二、mB7.1-GPI基因的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建1.擴(kuò)增mB7.1基因膜外區(qū)產(chǎn)物的電泳分析以pLNSX-mB7-1質(zhì)粒DNA為模板，用引物P3和P4，PCR擴(kuò)增出用于和hPLAP-1基因第11外顯子GPI錨定信號肽基因序列片段連接的mB7.1因膜外區(qū)片段，大小為761bp，參見圖4，其中M1、M2DNA分子大小標(biāo)志，泳道1hPLAP-1錨定信號肽序列的PCR產(chǎn)物，泳道2mB7.1基因胞外區(qū)序列的PCR產(chǎn)物；泳道3mB7.1-GPI基因序列的PCR產(chǎn)物。
2.擴(kuò)增編碼hPLAP-1基因的GPI錨定信號肽序列的電泳分析以pGEM-hPLAP-1 11exon質(zhì)粒DNA為模板，用引物P5和P6擴(kuò)增出編碼hPLAP-1基因的GPI錨定信號肽序列的片段，大小為155bp，電泳結(jié)果參見圖4。
3.mB7.1-GPI融合基因PCR產(chǎn)物的電泳鑒定以上述1、2的PCR產(chǎn)物為模板，用引物P3和P6擴(kuò)增出膜錨定型共刺激分子mB7.1-GPI融合基因，其大小為891bp，電泳結(jié)果參見圖4。
4.pGEM-mB7.1-GPI和pcDNA3.1(+)/mB7.1-GPI的酶切鑒定克隆載體pGEM-mB7.1-GPI和表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/mB7.1-GPI經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切后，目的基因大小為891bp，酶切產(chǎn)物的1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果參見圖5、6，圖5中MDNA分子大小標(biāo)志，泳道1pGEM-mB7.1-GPI質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；圖6中MDNA分子大小標(biāo)志，泳道1pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，泳道2pcDNA 3.1(+)/mB7.1-GPI質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物，泳道3pcDNA3.1(+)/mB7.1-GPI質(zhì)粒。
5.pcDNA3.1(+)/mB7.1-GPI的測序結(jié)果經(jīng)與Genbank中的mB7.1基因(GeneBank X60958)序列[5]和hPLAP-1基因序列(M19159.1)比較，本研究克隆的mB7.1-GPI融合基因包含mB7.1基因膜外區(qū)編碼序列和hPLAP-1基因的GPI信號肽編碼序列(參見圖7)。
三、mB.1-GPI融合基因的表達(dá)與純化(一)表達(dá)mB.1-GPI融合蛋白的CHO細(xì)胞克隆的鑒定結(jié)果1.FCM術(shù)pcDNA3.1(+)/mB7.1-GPI轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，挑了30個(gè)G418抗性克隆，F(xiàn)CM檢測mB7.1的表達(dá)。13株為陽性表達(dá)，陽性率21.9％～96.6％，平均熒光陽性強(qiáng)度為4.76～34.8；其中1株的表達(dá)高于其他陽性表達(dá)株，為高效表達(dá)克隆，陽性率為96.6％，平均熒光強(qiáng)度為34.8(參見圖8)，命名該克隆為CHO/pcDNA3.1(+)-mB7.1-GPI。野生CHO細(xì)胞及空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中無mB7.1表達(dá)，轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的CHO細(xì)胞命名為CHO/pcDNA3.1(+)。
2.免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察CHO/pcDNA3.1(+)-mB7.1-GPI細(xì)胞爬片，免疫熒光的激光共聚焦顯微鏡觀察，見細(xì)胞膜表面呈綠色熒光(FITC標(biāo)記)(參見圖9)，說明mB7.1-GPI融合蛋白為膜表達(dá)型，野生CHO細(xì)胞、CHO/pcDNA3.1(+)細(xì)胞為陰性。
3.PI-PLC處理結(jié)果CHO/pcDNA3.1(+)、CHO/pcDNA3.1(+)-mB7.1-GPI細(xì)胞經(jīng)PI-PLC處理，F(xiàn)CM檢測PI-PLC[6]處理前后細(xì)胞表面mB7.1的變化，結(jié)果顯示CHO/pcDNA3.1(+)細(xì)胞PI-PLC處理前后細(xì)胞表面均無mB7.1的表達(dá)；CHO/pcDNA3.1(+)-mB7.1-GPI細(xì)胞經(jīng)PI-PLC處理后，mB7.1表達(dá)陽性率從96.6％降為9.46％，熒光強(qiáng)度從34.8降為4.68，參見圖10，其中(a)為處理前，(b)為處理后。
(二)純化蛋白鑒定結(jié)果(SDS-PAGE和Western Blot分析)1.免疫親和層析過程參見圖11洗脫過程只有一個(gè)主峰，說明抗體層析柱是特異的圖。
2.SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果CHO、CHO/pcDNA3.1(+)、CHO/pcDNA3.1(+)-mB7.1-GPI細(xì)胞裂解產(chǎn)物及CHO/pcDNA3.1(+)-mB7.1-GPI細(xì)胞裂解產(chǎn)物免疫親和層析后的純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE(考馬斯藍(lán)染色)(參圖12)和Western Blot(參圖13)分析。參圖12中M蛋白分子量標(biāo)志，泳道1純化的m7.1-GPI蛋白；泳道2CHO細(xì)胞裂解產(chǎn)物，泳道3CHO/pcDNA3.1(+)/mB7.1-GPI細(xì)胞裂解產(chǎn)物，泳道4CHO/pcDNA3.1(+)細(xì)胞裂解產(chǎn)物。參圖13中泳道1純化的m7.1-GPI蛋白，泳道2CHO細(xì)胞裂解產(chǎn)物，泳道3CHO/pcDNA3.1(+)/mB7.1-GPI細(xì)胞裂解產(chǎn)物，泳道4CHO/pcDNA3.1(+)細(xì)胞裂解產(chǎn)物。
結(jié)果顯示CHO/pcDNA3.1(+)/mB7.1-GPI細(xì)胞裂解產(chǎn)物及免疫親和層析的純化產(chǎn)物可見到一條分子量約67KDa的條帶；而CHO、CHO/pcDNA3.1(+)細(xì)胞裂解產(chǎn)物均未出現(xiàn)該條帶；純化蛋白的純度達(dá)95％以上。
實(shí)施例二 mB7.1-GPI融合蛋白的應(yīng)用研究1.mB7.1-GPI融合蛋白對腫瘤細(xì)胞膜的錨定作用mB7.1-GPI與EL-4瘤細(xì)胞孵育，免疫熒光的激光共聚焦顯微鏡觀察見細(xì)胞膜表面呈綠色熒光(參見圖14)，說明mB7.1-GPI蛋白能錨定到EL-4瘤細(xì)胞膜上。mB7.1-GPI與EL-4瘤細(xì)胞共同孵育4hr后4℃放置0h、4h或8h，F(xiàn)CM檢測。錨定后0h、4h、8h樣本的熒光強(qiáng)度分別為13.7、12.7、10.6，陽性細(xì)胞數(shù)百分率分別為95.4％、91.3％、85％。4h、8h樣本與0h樣本比較，熒光強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)百分率降低不明顯，表明融合蛋白與EL-4腫瘤細(xì)胞孵育后，能夠錨定在腫瘤細(xì)胞膜上，而且這種錨定具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。4℃放置0h樣本的EL-4/mB7.1-GPI細(xì)胞及EL-4細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素滅活(終濃度為100ug/ml，37℃，5％CO2溫育1hr)制成腫瘤細(xì)胞疫苗，用于淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和分泌細(xì)胞因子檢測及免疫2.腫瘤細(xì)胞瘤苗刺激小鼠脾細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子的作用EL-4/mB7.1-GPI瘤苗刺激小鼠脾細(xì)胞的增殖能力(用增殖指數(shù)PI表示)和分泌白細(xì)胞介素-2(IL-2)和γ干擾素(IFN-γ)的量較EL-4瘤苗高，差異有顯著性(P＜0.05)。
表1瘤苗刺激小鼠脾細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子能力組 IL-2IFN-γPIAEL-4 22.9±1.4 41±3.2 1.98±0.7BEL-4/mB7.1-GPIa508.8±22.1 805±13.5 3.43±0.6IL-2、IFN-γmean±SD pg/ml，PImean±SD，a與A組比較3.腫瘤疫苗對荷瘤小鼠的治療作用3.1腫瘤疫苗對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用于C57BL/6小鼠的右后肢皮下注射1×106個(gè)野生型EL-4細(xì)胞。7-10天后，發(fā)現(xiàn)有可觸及的腫瘤。各組小鼠皮下腫瘤生長狀況參見圖15。EL-4瘤苗治療組小鼠的平均腫瘤直徑小于PBS組，但其間差異無顯著性(P＞0.05)；EL-4/mB7.1-GPI瘤苗組小鼠的平均腫瘤直徑較EL-4瘤苗治療組和PBS組小，差異有顯著性(P＜0.05)。
3.2荷瘤小鼠脾細(xì)胞的NK活性采用LDH釋放法對不同治療組荷瘤小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行NK活性檢測。靶細(xì)胞為YAC-1，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例分別為25∶1，50∶1和100∶1。參見圖16，結(jié)果表明EL-4/mB7.1-GPI瘤苗組NK活性較EL-4瘤苗組和PBS組高，差異有顯著性(P＜0.05)。
3.3.荷瘤小鼠脾細(xì)胞的CTL活性荷瘤25天，每組隨機(jī)取小鼠3只，常規(guī)制備其脾細(xì)胞，在重組小鼠IL-2存在的情況下，與EL-4細(xì)胞共同孵育7天，誘導(dǎo)CTL產(chǎn)生，LDH法測定CTL的活性。參見圖17，結(jié)果表明EL-4/mB7.1-GPI瘤苗組CTL活性較EL-4瘤苗組和PBS組高，差異有顯著性(P＜0.05)。
3.4荷瘤小鼠的生存期除了用于檢測NK和CTL活性3只小鼠外，對剩余的5只小鼠，觀察其生存期。結(jié)果表明EL-4瘤苗組(平均壽命40.2±1.3天)與PBS組相比生存期稍延長，但無顯著性差異(P＞0.05)；EL-4/mB7-1-GPI瘤苗組小鼠(平均壽命58±3.5天)與PBS組和EL-4瘤苗組相比生存期延長，有顯著性差異(P＜0.05)，參見圖18。
本發(fā)明涉及的部分參考文獻(xiàn)1.odge JW，Abrams S，schlom J，et al.Induction of antitumor immunity byrecombinant vaccinia viruses expressing B7-1 and B7-2 costimulatorymolecules.Cancer Res，1994，545552-5555.
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權(quán)利要求
1.mB7.1-GPI融合蛋白的制備及其應(yīng)用，其特征是制備mB7.1-GPI融合蛋白，SEQ ID N01為mB7.1-GPI融合基因的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mB7.1-GPI融合蛋白的制備及其應(yīng)用，其特征是通過蛋白轉(zhuǎn)染法，將mB7.1-GPI融合蛋白錨定于瘤細(xì)胞膜上，制備細(xì)胞膜表面修飾瘤苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的mB7.1-GPI融合蛋白的制備及其應(yīng)用，其特征是將mB7.1-GPI融合蛋白錨定于小鼠T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞(EL-4)，制備瘤苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mB7.1-GPI融合蛋白的制備及其應(yīng)用，其特征是制備mB7.1-GPI融合蛋白的方法主要包括以下步驟(1)構(gòu)建hPLAP-1第11外顯子克隆載體pGEM-hPLAP-1 11exon(它包含GPI錨定信號序列)，以此為模板，擴(kuò)增GPI錨定信號序列。(2)pLNSX-mB7-1為模板，擴(kuò)增mB7-1基因胞外區(qū)序列。(3)利用SOEing反應(yīng)，將擴(kuò)增的二個(gè)序列連接起來。(4)構(gòu)建此連接片段的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/mB7.1-GPI，測序正確。(5)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將pcDNA3.1(+)/mB7.1-GPI轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，用G418篩選G418抗性克隆，以流式細(xì)胞術(shù)，篩選陽性克隆，篩選到一個(gè)高表達(dá)克隆，其陽性率為96.6％，熒光強(qiáng)度為34.8，命名該克隆為CHO/pcDNA3.1(+)-mB7.1-GPI。(6)用免疫親和層析方法純化表達(dá)蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot分析顯示純化產(chǎn)物分子量約67KDa。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mB7.1-GPI融合蛋白的制備及其應(yīng)用，其特征是本發(fā)明提供的mB7.1-GPI融合蛋白具有膜錨定功能，可以將mB7.1共錨定在腫瘤細(xì)胞膜上，并具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mB7.1-GPI融合蛋白的制備及其應(yīng)用，其特征是制成的瘤苗在腫瘤治療方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種mB7.1－GPI融合蛋白的制備及其應(yīng)用，是糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨定型小鼠B7.1(mB7.1－GPI)的真核表達(dá)系統(tǒng)(pcDNA3.1(+)－mB7.1－GPI)，制備了mB7.1－GPI融合蛋白。它們能錨定在腫瘤細(xì)胞膜上，實(shí)驗(yàn)證明該錨定具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性；同時(shí)保持了免疫蛋白的生物學(xué)活性，在體外有刺激小鼠脾細(xì)胞增殖和分泌IL－2、IFN－γ因子的功能。mB7－1－GPI錨定腫瘤細(xì)胞，制成的瘤苗，能抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長和延長荷瘤小鼠的存活時(shí)間，其機(jī)制與瘤苗增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動物免疫細(xì)胞NK和CTL活性以及刺激免疫活性細(xì)胞分泌IL－2、IFN－γ細(xì)胞因子有關(guān)。
文檔編號C12N15/62GK1544637SQ200310108778
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月18日
發(fā)明者余海, 易平勇, 余 海 申請人:浙江大學(xué)