專利名稱：水稻鉀、鈉離子轉(zhuǎn)運基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物學領域，具體地說，本發(fā)明涉及新的水稻(Oryza sativa)的K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白基因及其編碼蛋白。本發(fā)明還公開了編碼這種K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的基因的用途，尤其是在植物品種改良和雜交育種中用于改變植物的耐鹽性。
背景技術：
鉀(K)是植物最重要的三大大量必需元素之一。鉀離子(K+)是植物細胞中含量最高的陽離子之一，其能調(diào)節(jié)植物體的許多重要生理功能，如提高植物耐鹽性、增強植物的光合作用、增強植物體內(nèi)物質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運等。因此研究控制植物K+離子吸收的分子機制顯得十分重要，也是近年來研究的熱點。
植物K+離子吸收主要由通道蛋白基因和轉(zhuǎn)運蛋白基因控制，前者基本上為被動運輸，而后者為主動運輸。通道蛋白基因主要是二大類AKT和KAT，而轉(zhuǎn)運蛋白基因主要有HKT(High-Affinity K+transporter，高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白)和HAK(High-Affinity K+uptake，高親和性鉀離子攝取蛋白)二大類。
近年來的研究表明，有些轉(zhuǎn)運蛋白基因還具有運輸Na+的功能，從而與植物耐鹽性密切相關。目前，在水稻中克隆并功能分析了OsHKT1和OsHKT4基因。結(jié)果表明OsHKT1僅高親和運輸Na+，而OsHKT4卻是對K+/Na+同時運輸。由于植物的長期進化的結(jié)果，形成了復雜的離子吸收機制，涉及的基因較多。
由于K+/Na+轉(zhuǎn)運基因與植物的耐鹽性密切相關，因此，為了有效地、針對性地改變植物品種的耐鹽性，本領域迫切需要開發(fā)與耐鹽性有關的蛋白及其編碼基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白(即水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白)及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途，尤其是在改變植物耐鹽性方面的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白，該多肽源自水稻，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進植物K+/Na+轉(zhuǎn)運功能的由(a)衍生的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-1665位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1662位的序列；(c)具有SEQ ID NO3中1-3999位的核苷酸序列。。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的方法，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的15-1500個核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了抗本發(fā)明蛋白的抗體以及一種檢測樣品中是否存在水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的方法，它包括將樣品與水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白。
在本發(fā)明的第七方面，提供了一種改變植物耐鹽性的方法，它包括步驟
(1)提供攜帶表達載體的農(nóng)桿菌，所述的表達載體含有水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白DNA編碼序列，所述的水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進植物K+/Na+轉(zhuǎn)運功能的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了控制水稻鹽脅迫下K+/Na+轉(zhuǎn)運基因SKc1的氨基酸序列及其與HKT基因家族成員的同源性比較。
圖2顯示了鹽脅迫下(140mM NaCl)水稻SKc1的近等基因系(SKc-NIL)和輪回親本“越光”的Na+濃度。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次從水稻(Oryza sativa.L)中，利用圖位克隆方法結(jié)合生物信息學方法從高度耐鹽水稻品種中克隆到在鹽脅迫下控制水稻K+/Na+離子吸收新基因，并對其進行功能研究，顯示該基因在鹽脅迫下明顯增加K+吸收、而降低Na+，減少離子毒害，進而能增強水稻的耐鹽性，因此在農(nóng)作物抗逆性育種中具有應用前景。
在本發(fā)明中，術語“水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白”、“水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運多肽”、“SKc1蛋白”、“SKc1多肽”等可互換使用，都指具有水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。
在未特別指出時，術語“K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白”包括野生型和突變型K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白或多肽”是指水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領域的技術人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術純化水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術語“水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白”指具有水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。該術語還包括具有與水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白相同功能的、SEQ ID NO.3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術語還包括水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明的水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構(gòu)建含水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內(nèi)重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法。對于轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得耐鹽性改變的植物。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于；常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超濾處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結(jié)合。
重組的水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于篩選促進或?qū)顾綤+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白篩選多肽庫可用于尋找有價值的能抑制或刺激水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段、或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內(nèi)技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備。本發(fā)明的各類抗體可以利用水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得?？顾綤+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的抗體可用于檢測樣品中的水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白水平的測試方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白水平，可用于解釋水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白在耐鹽性方面重要性。
一種檢測樣品中是否存在水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的方法是利用水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白。
本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析。用水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
在本發(fā)明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從水稻cDNA文庫中分離出的，其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1665個堿基，其開放讀框位于1-1662位，編碼全長為554個氨基酸的水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白(SEQ ID NO2)，其是一種具有10個跨膜區(qū)的膜蛋白。
水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白具有明確的控制植物K+/Na+轉(zhuǎn)運的功能。因此，水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白為改變植物的耐鹽性提供了新的途徑，因而具有巨大的應用前景。可以導入K+/Na+轉(zhuǎn)運基因，可改變現(xiàn)有優(yōu)良農(nóng)作物品種的耐鹽性，獲得高耐鹽性的小麥、水稻等農(nóng)作物或其他品種如林草、果樹、花木等，解決農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中存在的實際問題。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)或植物分子生物學-實驗手冊(PlantMolecular Biology-A Laboratory Mannual，Melody S.Clark編，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白基因的基因定位和連鎖分析利用以高度耐鹽水稻品種“Nona Bokra”(可購自國際水稻研究所等的水稻品種資源庫)與感鹽水稻品種“越光”(可購自從國際水稻研究所等的水稻品種資源庫)構(gòu)建的遺傳群體和分子標記，對鹽脅迫下控制水稻K+離子吸收的基因如下進行基因組定位。按Haruhhina Y，etal，Genetics，148，479-497，1998中所述的方法，首先構(gòu)建一張覆蓋水稻基因組的F2代分子標記連鎖圖，利用相應的F3株系測定水稻K+離子濃度，然后通過常規(guī)的區(qū)間作圖法進行全基因組掃描，定位相關基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個控制鹽脅迫下水稻K+離子吸收的主效基因SKc1，位于第1號染色體上。
進一步通過如下高代回交分析方法即將高度耐鹽品種“NonaBokra”與感鹽品種“越光”雜交獲得F1，再以感鹽品種“越光”作為輪回親本與F1進行3-4次回交，獲得只有攜帶高度耐鹽品種SKc1基因的染色體區(qū)間為雜合分離狀況的大規(guī)模群體，在遺傳背景一致下，利用已知分子標記對該基因進行高精確度連鎖分析。結(jié)果表明，該基因被定位在一個PAC克隆上。
實施例2水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆
(a)基因組序列在高精確度連鎖分析的基礎上，用以下方法從高度耐鹽水稻品種“NonaBokra”基因組中克隆到SKc1基因。根據(jù)水稻基因組的堿基序列設計高密度的分子標記(如CAPS，SSR，STS)篩選大規(guī)模遺傳群體(約7000株)中的交換個體，測定這些交換個體的K+濃度，將該基因鎖定，然后通過PCR技術(引物分別對應于SEQ ID NO3第1-28位，以及3969-3999位)從高度耐鹽水稻品種“Nona Bokra”基因組中克隆到SKc1基因?；蚪M片斷長度為3.999Kb(SEQID NO3)，包含有3個外顯子(exon)和2個內(nèi)含子(intron)。其中外顯子1位于1-1238，外顯子2位于2888-3115，外顯子3位于3801-3999，內(nèi)含子1位于1239-2887，內(nèi)含子2位于3116-3800。
(b)cDNA序列用常規(guī)方法構(gòu)建高度耐鹽水稻品種Nona Bokra的cDNA文庫。以cDNA文庫為模板，用PCR方法(正向引物5’-ATGAGTTCTCTGGATGCCAC-3’(SEQ ID NO4)；反向引物5’-TTATTCTATCTTCCATGCCTGACC-3’(SEQ ID NO5))，獲得擴增產(chǎn)物，構(gòu)建到T載體(Promega公司)上進行測序，從而獲得SKc1基因的全長ORF(openreading-frame)(SEQ ID NO1)，其堿基長度為1.665Kb，編碼554個氨基酸(SEQ ID NO2)，蛋白產(chǎn)物分子量估計為60.1KD，推測其是具有10個跨膜區(qū)的膜蛋白。
與其他蛋白的氨基酸序列比較表明(圖1)，其與大麥基因TaHKT1的相似性(Similarity)和一致性(Identity)分別為52.3％和43.7％；與擬南芥基因AtHKT1的相似性和一致性分別為56.1％和47.9％；與水稻基因OsHKT1的相似性和一致性分別為54.4％和43.7％；與水稻另一基因OsHKT4的相似性和一致性分別是48.3％和41.2％。這提示SKc1是K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白基因，為HKT基因家族的一個新基因成員。
實施例3RT-PCR法獲得水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的編碼序列為了驗證序列的正確性，根據(jù)SEQ ID NO1的序列，設計和合成了如下引物正向引物5’-ATGAGTTCTCTGGATGCCAC-3’(SEQ ID NO4)
反向引物5’-TTATTCTATCTTCCATGCCTGACC-3’(SEQ ID NO5)。
以用常規(guī)方法抽提的Nona Bokra水稻(購自國際水稻研究所水稻品種資源庫)Poly A+RNA為模板，進行RT-PCR擴增，擴增條件為94℃5分鐘，隨后94℃30秒、60℃30秒、72℃1分鐘進行35個循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，回收，連接到T-Easy載體上采用終止物熒光標記(Bi g-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結(jié)果驗證了水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的全長編碼序列(SEQ ID NO2)的正確性。
實施例4水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的點突變對高度耐鹽水稻品種“Nona Bokra”與感鹽水稻品種“越光”的K+/Na+轉(zhuǎn)運基因進行再次測序和比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SKc1基因在高度耐鹽水稻品種“NonaBokra”與感鹽水稻品種“越光”之間存在6個堿基突變，其中第418、551、994和1183的堿基變化造成4個氨基酸替換(表2)。這些位點的變化可能是引起該二品種的基因功能有差異的原因。
表2兩種K+/Na+轉(zhuǎn)運基因的比較

實施例5水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白基因的功能分析實驗高度耐鹽品種“Nona Bokra”與感鹽品種“越光”雜交獲得F1，再以感鹽品種“越光”作為輪回親本與F1進行4次回交獲得BC4F1(4次回交的F1代)，在每次回交過程中利用分子標記進行選擇，獲得遺傳背景均恢復為輪回親本“越光”的植株。最后利用分子標記輔助選擇方法從BC4F2(4次回交的F2代)中選育到SKc1的近等基因系SKc1-NIL(Nearly Isogenic Line)，即通過分子標記跟蹤將高度耐鹽水稻品種的SKc1基因組片段(短片段)導入輪回親本“越光”的遺傳背景中。利用水稻基因組數(shù)據(jù)庫的堿基序列進行基因預測，結(jié)果顯示在所導入的該基因組片段內(nèi)有關離子轉(zhuǎn)運蛋白基因只有SKc1基因而沒有其它基因，因此在近等基因系SKc1-NIL中來自高度耐鹽品種“Nona Bokra”基因組的有關離子轉(zhuǎn)運蛋白基因只有SKc1基因?qū)敫宣}品種“越光”中。利用SKc1-NIL與輪回親本“越光”進行非鹽脅迫與鹽脅迫下(140mMNaCl)K+濃度的測定。
結(jié)果顯示，在非鹽脅迫下SKc1-NIL與“越光”的K+濃度沒有差別，而在鹽脅迫下SKc1-NIL的地上部的K+濃度顯著高于越光(增加27.28％)，表明耐鹽品種SKc1基因位點具有明顯增加K+吸收的功能并且該基因還受到鹽脅迫的誘導；另外測定了Na+濃度，結(jié)果顯示在SKc1-NIL的葉、莖中的Na+濃度顯著低于“越光”，而SKc1-NIL的根中Na+濃度高于“越光”(圖2)。
這表明，耐鹽品種的SKc1基因在鹽脅迫下具有增加水稻地上部的K+吸收、而降低Na+的功能，從而減輕Na+對葉的毒害，提高水稻的耐鹽性?？梢娫摶蛟谵r(nóng)作物抗逆性育種上具有應用價值。這是在農(nóng)作物相關K+/Na+轉(zhuǎn)運基因中首次發(fā)現(xiàn)的新功能。
實施例6水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的制備在該實施例中，以實施例3的擴增產(chǎn)物為模板，用對應于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.6和7)進行擴增，獲得cDNA作為插入片段。
5′寡核苷酸引物序列為5’-GCGGATCCATGAGTTCTCTGGATGCCAC-3’(SEQ ID NO.6，含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點)；3′端引物序列為5’-CGAAGCTTTTATTCTATCTTCCATGCCTGACC-3’(SEQ ID NO.7，含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點)。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應于細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復制起點(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結(jié)合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點。
用BamHI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測序驗證SKc1的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞并將細胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的SKc1。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫SKc1。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘?，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為約60KDa。
此外，用常規(guī)方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.2的序列一致。
實施例7制備抗體將實施例6中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉淀SKc1基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生沉淀。
實施例8水稻SKc1轉(zhuǎn)基因本實施例采用常用的雙元載體pCAMBIA1300(購自CAMBIA公司，Canberra，Australia)作為水稻轉(zhuǎn)基因載體。該載體編碼一個細菌復制起點(ori)、卡那霉素抗性基因(Kanr)、潮霉素抗性基因(Hygr)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(MCS)。在限制性內(nèi)切酶克隆位點可插入SKc1的基因組DNA或cDNA構(gòu)建成轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒。
(1)帶SKc1基因組DNA的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒構(gòu)建利用PCR方法以高度耐鹽品種“Nona Bokra”基因組DNA作為模板分4段(寡核苷酸引物分別為SEQ ID NO.9與10、11與12、13與14、15與16)擴增。
SEQ ID NO.95’-AGCTGGGAGTTGGAGAAGGACT-3’SEQ ID NO.105’-CGACGTGACAGATTTGGATTAC-3’SEQ ID NO.115’-CCAAATCAAGGGCTCCAA-3’SEQ ID NO.125’-ACTTCCTCTTCATCTCCC-3’SEQ ID NO.135’-TGCTGGTGTTTGTCTTGGACAG-3’SEQ ID NO.145’-ATATGGTCTTCGATGCTGTGGC-3’SEQ ID NO.155’-GAGGGAGAAGAAGTGATTTT-3’SEQ ID NO.165’-TGAATTATACTGCGTGAACC-3’分別用BstxI、NarI、KpnI內(nèi)切酶連接成7.276Kb的基因組DNA片段，包含SKc1基因編碼區(qū)。該片段還包括翻譯起始密碼子ATG上游的2554個堿基及終止密碼子TAA下游723個堿基。該片段的5’端連接EcoRI接頭后與經(jīng)EcoRI和SmaI消化的pCAMBIA1300(購自CAMBIA公司)連接。連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌常用菌株DH5α，在含有Kan(50μg/ml)和X-gal的2YT培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，挑選白色菌落提取質(zhì)粒，用EcoRI和NotI酶解驗證約7.3Kb片段插入載體，并用M13通用引物測序檢驗核苷酸序列是否正確。
(2)帶SKc1基因cDNA的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒構(gòu)建在該實施例中，以實施例3的擴增產(chǎn)物為模板，用對應于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.6和8)進行擴增，獲得的cDNA片段插入pCAMBIA1300上相應的限制性內(nèi)切酶克隆位點。該質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶克隆位點EcoRI和BamHI間插入了CaMV35S啟動子，XbaI和HindIII間插入了NOS基因的終止信號序列。
5′寡核苷酸引物序列為5’-GCGGATCCATGAGTTCTCTGGATGCCAC-3’(SEQ ID NO.6，含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點)；3′端引物序列為5’-CGTCTAGATTATTCTATCTTCCATGCCTGACC-3’(SEQ ID NO.8，含有XbaI限制性內(nèi)切酶的酶切位點)。
用BamHI和XbaI消化cDNA和載體pCAMBIA1300，將cDNA連接到CaMV35S啟動子和NOS基因的終止信號序列之間。連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，在含有Kan(50μg/m1)的2YT培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，挑選單菌落提取質(zhì)粒，用BamHI和XbaI酶解挑選出有約1.7Kb片段插入的克隆，并用M13通用引物測序檢驗核苷酸序列是否正確。
(3)SKc1基因轉(zhuǎn)化水稻上述兩種重組質(zhì)粒通過凍融法導入常用的農(nóng)桿菌菌株EHA105。每200μl EHA105感受態(tài)細胞加0.5-1μg(約10μl)質(zhì)粒DNA混勻，依次于冰上、液氮和37℃水浴中各放置5分鐘；用新鮮的YEB液體培養(yǎng)基稀釋至1ml，于28℃振搖培養(yǎng)2-4小時；取200μl涂布于含抗生素Kan(50μg/ml)的YEB平板上，28℃培養(yǎng)2-3天。長出的菌落在含抗生素的YEB平板上劃單菌，連續(xù)劃3次。參考Hiei等(1994)的方法，從YEB平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落接種到3ml含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中于28℃振搖培養(yǎng)過夜，第2天按1％接種量轉(zhuǎn)接入50ml含抗生素的AB液體培養(yǎng)基中，200rpm繼續(xù)振搖培養(yǎng)至OD600為0.6至0.8左右時，將新鮮的農(nóng)桿菌菌液于5000rpm、4℃離心5分鐘，收集并重懸于1/3體積的AAM液體培養(yǎng)基中，此菌液即可用于轉(zhuǎn)化水稻各種受體材料。
本實施例采用常規(guī)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化水稻中花11(感鹽品種，購自中國農(nóng)業(yè)科學院作物品種資源庫)的幼胚愈傷。取授粉后12-15天的中花11未成熟種子經(jīng)70％乙醇浸泡1分鐘后，用1.5％NaClO溶液消毒90分鐘，無菌水沖洗4-5次，然后用解剖刀和攝子挑出幼胚并接種于N6D2培養(yǎng)基上誘導愈傷組織，在26±1℃、避光條件下培育，4天后可用于轉(zhuǎn)化。將幼胚愈傷浸泡入新鮮的AAM農(nóng)桿菌菌液中并不時搖動，20分鐘后將水稻材料移出，在無菌濾紙上吸去過多的菌液，隨即轉(zhuǎn)移到N6D2C培養(yǎng)基上，于26℃共培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)時，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮作為農(nóng)桿菌Vir基因活化物，使用濃度為100μmol/L。3天后，從共培養(yǎng)培養(yǎng)基上取出愈傷組織，切去胚芽并轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基N6D2S1(Hyg 25mg/l)進行選擇培養(yǎng)。7-12天后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)到N6D2S2(Hyg 50mg/l)選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選。10-12天后生長旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到預分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周左右，再移至分化培養(yǎng)基上分化(12小時光照/天)。再生的小苗在1/2MS0H培養(yǎng)基上生根壯苗，隨后移入人工氣候室盆土栽培。獲得的再生植株移栽成活后提取葉片總DNA，經(jīng)PCR或Southern雜交鑒定轉(zhuǎn)化植株。用轉(zhuǎn)基因T1代進行鹽脅迫下K+、Na+離子濃度測定。
結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性有所提高，這驗證SKc1基因功能。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>水稻鉀、鈉離子轉(zhuǎn)運基因及其應用<130>036261<160>16<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1665<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1665)<223>
<400>1atg agt tct ctg gat gcc act act cct aga tat gac gag ttt aaa agg 48Met Ser Ser Leu Asp Ala Thr Thr Pro Arg Tyr Asp Glu Phe Lys Arg1 5 10 15atc tac cac ctt ttc ctt ttc cat gca cac cca ttc tgg ctc caa ctg 96Ile Tyr His Leu Phe Leu Phe His Ala His Pro Phe Trp Leu Gln Leu20 25 30ctg tac ttc ctc ttc atc tcc ctc ttg ggt ttc ttg atg ctg aaa gct144Leu Tyr Phe Leu Phe Ile Ser Leu Leu Gly Phe Leu Met Leu Lys Ala35 40 45ctg ccg atg aag acc agc atg gtg ccg agg ccc atg gac ttg gac ctg192Leu Pro Met Lys Thr Ser Met Val Pro Arg Pro Met Asp Leu Asp Leu50 55 60atc ttc acg tcg gtg tcg gcg acg acg gtg tcg agc atg gtc gcc gtc240Ile Phe Thr Ser Val Ser Ala Thr Thr Val Ser Ser Met Val Ala Val65 70 75 80gag atg gag tcc ttc tcc aac tcc cag ctc ctc ctc atc acc ctc ctc288Glu Met Glu Ser Phe Ser Asn Ser Gln Leu Leu Leu Ile Thr Leu Leu85 90 95atg ctg ctt ggt ggt gag gtc ttc acc agc atc ctt ggc ctc tac ttc336Met Leu Leu Gly Gly Glu Val Phe Thr Ser Ile Leu Gly Leu Tyr Phe100 105 110acc aac gcc aag tac tcc tcc aag atg ata gca acc tta cct gat gat384Thr Asn Ala Lys Tyr Ser Ser Lys Met Ile Ala Thr Leu Pro Asp Asp115 120 125gac gac cat ggt ggc agt ggc aaa cca cca cca gca acg acg tca cct432Asp Asp His Gly Gly Ser Gly Lys Pro Pro Pro Ala Thr Thr Ser Pro130 135 140
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權(quán)利要求
1.一種分離的水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，它包含具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進植物K+/Na+轉(zhuǎn)運功能的由(a)衍生的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列編碼權(quán)利要求1所述的多肽。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-1665位的核苷酸序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1662位的核苷酸序列；(c)具有SEQ ID NO3中1-3999位的核苷酸序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體或基因組中整合有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
8.一種水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白。
9.一種改良植物的方法，其特征在于，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農(nóng)桿菌，所述的表達載體含有水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白的編碼序列，所述的水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進植物K+/Na+轉(zhuǎn)運功能的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入水稻K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法改良植物的耐鹽性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的植物基因－水稻K
文檔編號C12N15/63GK1618804SQ20031010868
公開日2005年5月25日 申請日期2003年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月19日
發(fā)明者林鴻宣, 任仲海, 高繼平, 晁代印, 朱美珍, 王宗陽, 蔡秀玲 申請人:中國科學院上海生命科學研究院