專(zhuān)利名稱(chēng)：一種優(yōu)化的乳酸菌和益生菌冷凍保護(hù)劑組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乳酸菌和益生菌冷凍保護(hù)劑的一種最佳配方。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明對(duì)蔗糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糊精等冷凍保護(hù)劑進(jìn)行篩選，研究其保護(hù)效果，從而設(shè)計(jì)出一種最佳的冷凍保護(hù)劑配方，屬于食品工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
發(fā)酵乳制品在乳制品中占有重要的地位，隨著我國(guó)人民消費(fèi)水平的提高，對(duì)發(fā)酵乳制品中的酸奶有了新的認(rèn)識(shí)，使得酸奶的產(chǎn)量以年平均25％的速度增長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)乳制品的質(zhì)量提出了新的要求。
冷凍保藏和凍干技術(shù)是生物學(xué)的一個(gè)重要應(yīng)用技術(shù)，近年來(lái)這一技術(shù)因?yàn)椤肮δ苄允称贰钡目焖侔l(fā)展而被應(yīng)用于食品生產(chǎn)中，酸奶中的乳酸菌發(fā)酵劑的制備也常用該技術(shù)。然而，要想獲得理想的冷凍及凍干效果，除工藝外，主要是篩選和使用適宜的冷凍保護(hù)劑。適宜的凍干保護(hù)劑能夠使益生菌在凍干過(guò)程中保藏最小限度死亡，減輕冷凍干燥所引起的對(duì)菌體的損傷，在保存時(shí)耐受較高的溫度不損害菌體的活力。因而，凍干保護(hù)劑的種類(lèi)、濃度和配置方法對(duì)益生菌的保存效果有明顯的影響。Harrison(1963)推薦凍干保護(hù)劑應(yīng)具有以下條件1)保護(hù)劑應(yīng)含有能形成骨架的物質(zhì)；2)它應(yīng)含有限制剩余水分的緩沖物質(zhì)；3)應(yīng)含有中和羧基活性的物質(zhì)；4)電解質(zhì)的含量應(yīng)少。
目前，有關(guān)凍干保護(hù)劑的研究主要集中在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域，是凍干生物學(xué)分支的主要內(nèi)容之一。但是，用于生產(chǎn)發(fā)酵劑的凍干保護(hù)劑的研究大多屬于已有的專(zhuān)利技術(shù)資料，而且，許多研究報(bào)告的結(jié)果差異很大。本發(fā)明對(duì)蔗糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糊精等冷凍保護(hù)劑進(jìn)行篩選，研究其保護(hù)效果，從而設(shè)計(jì)出一種最佳的冷凍保護(hù)劑配方。

發(fā)明內(nèi)容
在選定了益生菌優(yōu)良菌種之后，益生菌產(chǎn)品的冷凍保護(hù)劑是影響其品質(zhì)與活力的重要因素。為了保證產(chǎn)品能經(jīng)受產(chǎn)品制備過(guò)程中冷凍、干燥(凍干、噴霧干燥等)不良處理?xiàng)l件(迫協(xié)條件)的作用，使用適宜的冷凍或干燥保護(hù)劑可減少環(huán)境對(duì)菌體的損傷，從而最大限度地保證活菌數(shù)和菌活力。本發(fā)明對(duì)蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽糊精、山梨醇、甘油、側(cè)金盞花醇等13種材料對(duì)乳酸菌的凍干保護(hù)效果進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明，海藻糖、側(cè)金盞花醇為最佳保護(hù)劑，其次為蔗糖、麥芽糊精、山梨醇、谷氨酸鈉、脫脂奶粉，以水和增菌液為基質(zhì)中凍干保護(hù)效果顯著，對(duì)乳球菌的保護(hù)效果優(yōu)于乳桿菌，凍干菌物菌落總數(shù)與菌體產(chǎn)酸力有一定關(guān)系，但與乳糖酶關(guān)系不明確。根據(jù)上述結(jié)果，采用L16(45)正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，(見(jiàn)表4)，得出冷凍保護(hù)劑最佳配方組合，該組合為蔗糖、麥芽糊精、山梨醇和谷氨酸鈉，其最佳的濃度比為4∶4∶3∶4。利用該最佳配方的冷凍保護(hù)劑，測(cè)定其對(duì)菌體活力的影響(主要是產(chǎn)酸力的乳糖酶活力)，得到理想的效果。若在實(shí)際中使用11％的脫脂乳作為懸浮基質(zhì)，則保護(hù)劑的配合水平還可下調(diào)，但同樣可以達(dá)到保護(hù)效果。
具體實(shí)施例方式
1材料與方法1.1材料(1)懸浮基質(zhì)生理鹽水、CMR增菌液、11％脫脂乳，經(jīng)105℃滅20min。
(2)供試菌種ST-1，LB-1，LA-1，SL.
(3)冷凍保護(hù)劑蔗糖、乳糖，葡萄糖、麥芽糊精、山梨醇、甘露醇、甘油、三聚磷酸鈉、焦磷酸鈉、偏磷酸鈉、β-磷酸甘油二鈉、谷氨酸鈉、右旋糖苷，均為分析純?cè)噭┗蛏囼?yàn)，谷氨酸鈉為食品級(jí)，含量為99％。
(4)真空冷凍于燥機(jī)ALPHI-5型，德國(guó)造。
(5)菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基CMR(6)真空封口器與真空泵本所自備。
1.2方法(1)冷凍干燥方法將添加有不同冷凍保護(hù)劑的菌懸液分裝于小凍干瓶中，每瓶0.5ml，在冰柜中速凍12小時(shí)以保證形成小的冰晶和凍結(jié)完全。凍干5-6小時(shí)后逐漸升高加熱板溫度至15℃，以排出剩余的水分，使其凍干制品的水分含量為1.5-2.5％，然后用于測(cè)定菌落總數(shù)，水分活度，掃描和透視電鏡觀察菌體。
(2)菌落總數(shù)測(cè)定按國(guó)際GB4789.2-84.測(cè)定、培養(yǎng)基為CMR[22]。
稀釋液為滅菌生理鹽水.于37℃下，CO2濃度為10％培養(yǎng)36-72小時(shí)。
(3)水分活度測(cè)定將凍干基質(zhì)加于測(cè)定平皿內(nèi)按上述工藝凍干后，采用Novasina表1冷凍保護(hù)劑的篩選試驗(yàn)結(jié)果

水分活度測(cè)定儀測(cè)定。
(4)菌種活力測(cè)定通過(guò)測(cè)定菌種產(chǎn)酸力來(lái)評(píng)價(jià)菌種的活力.酸度測(cè)定按GB5409-89方法測(cè)定[22]，每一凍干管中加入5ml滅菌脫脂乳(11％)于37℃培養(yǎng)5.5hr后測(cè)定滴定酸度OT。乳酸酶活力測(cè)定參照潘道東論文，加入1ml緩沖液，溶解出菌粉，離心6000rpm 10min，取上清0.5ml加入ONPG3ml，混勻，于37℃水浴上反應(yīng)15mln，再加入3ml1MN2CO3中止反應(yīng)在420nm處測(cè)定吸光度值。
(5)凍干菌物電鏡觀察A.透射電鏡觀察凍干菌體挑取凍干菌物，用過(guò)濾除菌的蒸餾水浸溶，然后按3.8節(jié)的方法觀察。
B.掃描電鏡觀察將樣品用雙面膠帶貼于掃描電鏡樣品臺(tái)上，放人IB一5型離子濺射儀中，在樣品表面鍍一層厚度約為150A的鈀一鉑合金(Pd-Pt)膜，用kyky一1000B掃描電鏡觀察并拍攝電鏡照片。
2.2結(jié)果與討論1.冷凍保護(hù)劑(單因素多水平)篩選試驗(yàn)[5-16]將供試菌株ST-1在CMR增菌液中培養(yǎng)24小時(shí)離心(3000rpm×5min)，棄上清，生理鹽水洗二次后，加人滅菌的CMR培養(yǎng)基25ml，使其最后的菌落數(shù)為6.360×109，然后，分裝為25份菌液，每份菌液加人二倍濃度的保護(hù)劑溶液，充分混勻，置于冰柜冷凍及真空干燥。其菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。
從表1發(fā)現(xiàn)海藻糖對(duì)ST-1的冷凍保護(hù)作用與側(cè)金盞花醇的保護(hù)作用相近，為最佳保護(hù)劑，但因這兩種材料均是十分昂貴的糖、醇類(lèi)，無(wú)法應(yīng)用工業(yè)生產(chǎn)之中.保護(hù)作用較好的蔗糖、乳糖、麥芽糊精、山梨醇、甘油、谷氨酸鈉均可用于工業(yè)生產(chǎn)乳酸菌發(fā)酵劑的制備。這一結(jié)果與國(guó)外許多學(xué)者的研究相近，然而測(cè)定值卻低于國(guó)外的有關(guān)報(bào)導(dǎo)數(shù)值，究其原因，可能是菌懸液的凍結(jié)速度低，凍結(jié)溫度高有關(guān).從水分活度值可見(jiàn)，海藻糖與蔗糖的值較低，說(shuō)明兩種糖水化能力強(qiáng)，與細(xì)胞膜表面易形成較穩(wěn)定水化保護(hù)層，使水分凍結(jié)時(shí)形成小的冰晶，提高其冷凍保護(hù)效果，這一測(cè)值與冷凍保護(hù)的結(jié)果相吻合。
2.不同懸浮基質(zhì)對(duì)冷凍保護(hù)效果的影響牛乳(通常是脫脂乳)是一種應(yīng)用較廣、保護(hù)效果好的保護(hù)劑.許多冷凍保護(hù)劑添加于脫脂乳中表現(xiàn)的保護(hù)效果不顯著，為此本試驗(yàn)比較了不同懸浮基質(zhì)水、增菌液與11％脫脂乳的保護(hù)效果，結(jié)果見(jiàn)表2。
從上表可以看出，懸浮質(zhì)不同，冷凍保護(hù)劑的保護(hù)效果也不同，其保護(hù)效果在以水和增菌液為基質(zhì)時(shí)表現(xiàn)的十分顯著，可以增加118-268倍(水)，5.7-13.91倍(增菌液)，1.56-3.9倍(脫脂乳)。主要原因是脫脂乳為良好的冷凍保護(hù)劑，而且測(cè)定結(jié)果是在凍干之后就測(cè)定的菌落總數(shù)。若再延長(zhǎng)保存時(shí)間后測(cè)定菌落數(shù)可能還會(huì)表現(xiàn)的更為突出.因此，制備商品化發(fā)酵劑最好的懸浮基質(zhì)仍是脫脂乳。應(yīng)用時(shí)可適當(dāng)提高脫脂乳的NFS的含量達(dá)15％-20％為宜。
表2不同懸浮基質(zhì)保護(hù)效果的比較(試驗(yàn)菌為ST-1)

3.保護(hù)劑對(duì)不同菌種的保護(hù)作用選取12％脫脂乳為懸浮基質(zhì)，將菌濃縮懸浮液加入滅菌脫脂乳中，使其最后的菌落總數(shù)為108，然后將上述四種脫脂乳菌懸液按0.25ml的量分別分裝12管(凍干管)，再加入二倍濃度的冷凍劑溶液(過(guò)濾滅菌)，渦流混合后置冰柜凍結(jié)，真空凍干后立即測(cè)定菌落總數(shù)，具體試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。
表3保護(hù)劑對(duì)不同乳酸菌的保護(hù)作用(cfu/mi)

注射器括號(hào)內(nèi)的數(shù)據(jù)為冷干后菌體存活率(％)表3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，各冷凍保護(hù)劑對(duì)不同菌保護(hù)作用有一定差異，其中海藻糖與側(cè)金盞花醇對(duì)各菌種的保護(hù)作用均保持較高的水平(存活率).麥芽糊精對(duì)SL的保護(hù)效果稍差，僅為60.27％，與脫脂乳的水平相近.谷氨酸鈉與其它同水平的保護(hù)劑相比其效果最差.另外，六種冷凍保護(hù)劑對(duì)嗜熱鏈球菌和乳酸鏈球菌冷凍保護(hù)作用優(yōu)于對(duì)乳桿菌的保護(hù)，這一結(jié)果同其他研究報(bào)導(dǎo)相比雖在趨勢(shì)方面是相同的，但各保護(hù)劑對(duì)保加利亞乳桿菌的保護(hù)效果要高于同類(lèi)研究報(bào)告的數(shù)據(jù)[12]，這可能與該菌對(duì)冷凍及真空干燥的應(yīng)激處理抗性較強(qiáng)有關(guān)。有關(guān)乳酸菌對(duì)熱、冷刺激抗性在本試驗(yàn)未做更詳細(xì)的比較研究。但本項(xiàng)試驗(yàn)中選用的ST-1與SL均為粘性較大的菌株，其生長(zhǎng)中產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)菌體抗冷，熱抗性可能發(fā)揮看一定的促進(jìn)作用。
4.最佳保護(hù)劑優(yōu)化配方設(shè)計(jì)根據(jù)菌體凍傷及冷凍保護(hù)機(jī)理，結(jié)合各保護(hù)劑的保護(hù)效果與作用特點(diǎn)、保護(hù)劑的來(lái)源、性狀，選取A、B、C、D四種保護(hù)劑為試驗(yàn)因素，設(shè)立四個(gè)濃度水平，采用L16(45)正交試驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn)，具體的試驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)表4。
從表4的分析可見(jiàn)，A、B、C三因素的極差大于誤差項(xiàng)的極差，而C因素的極差值卻小于誤差極差值，說(shuō)明A、B、D項(xiàng)對(duì)菌落總數(shù)的影響是顯著的，而C因素的影響在實(shí)驗(yàn)水平內(nèi)不顯著，但仍然有一定的保護(hù)作用.四因素影響程度大小依次為A-D-B-C，最佳配方組合為A4B4C3D4，本實(shí)驗(yàn)為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果及各因素的影響更顯著，選取的懸浮基質(zhì)為生理鹽水，若在實(shí)際中使用11％脫脂乳，則各保護(hù)劑的配合水平還可下調(diào)，同樣可以達(dá)到保護(hù)效果。
5.冷凍保護(hù)劑對(duì)菌體生物學(xué)特性的保護(hù)作用在篩選保護(hù)劑時(shí)，一般均采用菌落總數(shù)為最為可靠的評(píng)價(jià)指標(biāo)，但是菌落總數(shù)的測(cè)定工作繁雜，極易造成污染而使菌落無(wú)法計(jì)數(shù)，因而本試驗(yàn)測(cè)定了保護(hù)劑對(duì)菌體活力的影響(主要是產(chǎn)酸力和乳糖酶活力)具體結(jié)果見(jiàn)表5。
表4冷凍保護(hù)劑優(yōu)化配方正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析表

表5的結(jié)果表明，冷凍保護(hù)劑對(duì)乳酸菌ST-1的產(chǎn)酸力、乳糖酶釋放量有一定影響。本試驗(yàn)曾選取發(fā)酵8.5hr為測(cè)定時(shí)間，結(jié)果使各試驗(yàn)組的酸度無(wú)明顯差異，其原因是受傷的菌體在短時(shí)間得以修復(fù)而恢復(fù)了產(chǎn)酸力。以5.5hr發(fā)酵時(shí)間則可揭示各試驗(yàn)組的活力差異，產(chǎn)酸效果與菌落總數(shù)測(cè)定值基本一致。但是，冷凍保護(hù)劑對(duì)菌體乳糖酶的影響不大，酶活性與產(chǎn)酸力，菌存活率相差較大。從另一側(cè)面也說(shuō)明真空冷凍干燥法對(duì)菌體破裂性損傷很小.產(chǎn)酸力與菌存活率之間雖有一定相關(guān)性，但目前尚難以確定精確的相關(guān)關(guān)系。因此，在評(píng)價(jià)冷凍保護(hù)劑保護(hù)效果時(shí)仍以菌落總數(shù)值為判定標(biāo)準(zhǔn)。產(chǎn)酸力僅可作為參考指標(biāo)。
表5冷凍保護(hù)劑對(duì)菌體產(chǎn)酸力與乳糖酶活力的影響

權(quán)利要求
1.一種冷凍保護(hù)劑組合物，主要由蔗糖、麥芽糊精、山梨醇、谷氨酸鈉組成。
2.權(quán)利要求1的冷凍保護(hù)劑組合物，還含有乳糖、甘油、甘露醇、側(cè)金盞花醇、海藻糖等冷凍保護(hù)劑。
3.權(quán)利要求1或2的冷凍保護(hù)劑組合，其中的蔗糖、麥芽糊精、山梨醇和谷氨酸鈉的濃度比為4∶4∶3∶4。
4.權(quán)利要求1或2的冷凍保護(hù)劑組合物，其所用的懸浮基質(zhì)為水、增菌液或脫脂乳。
5.權(quán)利要求3的冷凍保護(hù)劑組合物，其中的脫脂乳NFS含量為15-20％。
全文摘要
本發(fā)明涉及乳酸菌和益生菌冷凍保護(hù)劑的一種最佳配方。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明對(duì)蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽糊精、山梨醇、甘油、側(cè)金盞花醇等13種材料對(duì)乳酸菌的凍干保護(hù)效果進(jìn)行了比較研究，采用L16(45)正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)出冷凍保護(hù)劑最佳配方組合，該組合為蔗糖、麥芽糊精、山梨醇和谷氨酸鈉，其最佳的濃度比為4∶4∶3∶4。
文檔編號(hào)A23C9/12GK1623408SQ20031011557
公開(kāi)日2005年6月8日 申請(qǐng)日期2003年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月2日
發(fā)明者呂加平, 張和平, 于景華, 丁玉振 申請(qǐng)人:北京三元食品股份有限公司