專利名稱：Cns中crh應(yīng)答基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及抑郁癥的治療和診斷。具體地，本發(fā)明涉及多肽以及編碼這些多肽的多核苷酸，其中所述多肽表現(xiàn)出在介導(dǎo)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的細(xì)胞應(yīng)答中起主要作用。這些多肽和多核苷酸可用于抑郁癥的診 斷、治療和/或預(yù)防。
背景技術(shù)：
最近的社會經(jīng)濟(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)抑郁癥是無能的首要原因和其他疾病發(fā)展的主要的危險因素。此外，在世界范圍規(guī)模內(nèi)，抑郁癥被診斷不足和治療不足。最近的抗抑郁藥物已經(jīng)被證明是有效的，但是存在作用起效慢和副作用的負(fù)擔(dān)。在這上面，仍然不清楚它們通過哪種藥理學(xué)作用模式發(fā)揮它們的臨床效果?；谝钟舭Y的皮質(zhì)類固醇受體假說的假說-驅(qū)動的研究已經(jīng)導(dǎo)致一種新觀念，其聚焦在腦神經(jīng)肽受體，特別是促腎上腺皮質(zhì)激素-釋放激素(CRH)受體作為藥物靶標(biāo)的新概念。
促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)是一種41個氨基酸的多肽，在下丘腦-垂體-腎上腺軸的調(diào)節(jié)中起中心作用，介導(dǎo)對各種應(yīng)激物的內(nèi)分泌應(yīng)答。下丘腦神經(jīng)元應(yīng)答壓力而釋放CRH到垂體門脈系統(tǒng)，刺激垂體促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的分泌和生物合成，導(dǎo)致腎上腺糖皮質(zhì)激素嚴(yán)生增加(1)。一些臨床和臨床前研究針對抑郁癥發(fā)展中CRH系統(tǒng)中變化的原因角色(2)。在人中對CRH的最初研究表明在抑郁癥患者中對CRH的ACTH應(yīng)答被鈍化，反映了連續(xù)增加的下丘腦CRH分泌繼發(fā)的CRH受體脫敏(3；4)。支持鈍化的ACTH應(yīng)答作為增加的CRH釋放的結(jié)果的證據(jù)是發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者的腦脊液中CRH水平升高。加強(qiáng)抑郁狀態(tài)中CRH分泌過多這一觀念的其他發(fā)現(xiàn)為患有抑郁癥的自殺者中CRH分泌性神經(jīng)元的數(shù)目增多和CRH受體的數(shù)目減少(5；6)。
關(guān)于CRH已經(jīng)描述了兩種高親和性受體CRH1-R1和CRH-R2，它們兩者都以幾種剪接變體形式存在。這些受體被CRH的活化導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶的Gs-介導(dǎo)的刺激，導(dǎo)致胞內(nèi)cAMP水平上升。這自身將活化依賴cAMP的蛋白激酶A(KPA)和最終導(dǎo)致cAMP和Ca2+的升高的胞質(zhì)水平。cAMP和Ca2+的升高的水平導(dǎo)致一些其他的激酶如依賴Ca2+/鈣調(diào)蛋白的激酶II(CAMK II)和p42/p44促分裂原活化的激酶(MAPK)的活化。結(jié)果，Ca2+/cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB)被磷酸化并且這反過來將調(diào)節(jié)在啟動子區(qū)含有cAMP應(yīng)答元件(CRE)的基因的轉(zhuǎn)錄。表明參與CRH信號化(signaling)調(diào)節(jié)的這些基因的實例包括c-fos、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子基因Mif、孤兒核受體Nurr77和Nurr1。
為了開發(fā)用于慢性垂體-腎上腺活化的動物模型，已經(jīng)產(chǎn)生了CRF過表達(dá)小鼠(CRF-OE)(Stenzel-Poore等人，(1992)Endocrinology1303378-3386)。由于這些動物中CRF的全身性過表達(dá)導(dǎo)致ACTH和皮質(zhì)酮的終身過度產(chǎn)生，這些轉(zhuǎn)基因小鼠呈現(xiàn)出庫興氏(Cushingoid)表型。與腦CRF介導(dǎo)內(nèi)分泌、對壓力的自主的和行為應(yīng)答一致，CRF-OE小鼠表現(xiàn)出提高的情緒性的自發(fā)狀態(tài)，對應(yīng)激物高度反應(yīng)性，并且CRF受體拮抗劑的主要施用逆轉(zhuǎn)了這些類似anxiogenic的行為(Stenzel-Poore等人，(1994)J.Neurosci.142579-2584)。這些CRF-OE容許研究CRF對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的長期效果并且已經(jīng)被用作焦慮和壓力相關(guān)的行為的遺傳模型。
盡管已經(jīng)廣泛研究了CRH活化的受體的下游途徑并且導(dǎo)致參與信號級聯(lián)的許多基因的鑒定，但是一個主要領(lǐng)域還未被探索。因此，本發(fā)明的目的是研究基因組水平上對CRH刺激的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答以鑒定與促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體活化的基因網(wǎng)絡(luò)有關(guān)的其他基因。這樣鑒定的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸作為篩選技術(shù)的藥物靶標(biāo)為藥物開發(fā)提供了新的機(jī)會，或者可用于抑郁癥的診斷、預(yù)防和/或治療。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供許多基因，這些基因迄今還未與CRH信號化相關(guān)并因此可用于鑒定調(diào)節(jié)細(xì)胞中CRH信號應(yīng)答的化合物的方法中，或者用于診斷方法以鑒定個體中CRH誘導(dǎo)的抑郁癥。
在一個實施方案中，鑒定能夠改變細(xì)胞，尤其鼠垂體促腎上腺皮質(zhì)激素細(xì)胞來源的腺瘤細(xì)胞系A(chǔ)tT-20中CRH信號應(yīng)答的化合物的方法包括在所述化合物存在和不存在下將所述細(xì)胞與CRH接觸并確定含有一核酸序列的多核苷酸的表達(dá)水平，該核酸序列選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40。在該篩選方法中，通常使用結(jié)合前述多核苷酸的寡核苷酸探針，優(yōu)選使用陣列技術(shù)方法評估表達(dá)水平。
因此，在特定實施方案中，本發(fā)明提供了鑒定調(diào)節(jié)細(xì)胞中CRH信號應(yīng)答的化合物的方法，所述方法包括在所述化合物存在和不存在下將所述細(xì)胞與CRH接觸；并確定具有核酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.31、SEQ ID NO.32、SEQ IDNO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的多核苷酸的表達(dá)水平，其中這些序列的表達(dá)譜的變化指示能夠改變所述細(xì)胞中CRH信號應(yīng)答的化合物。
附圖簡述表1表明是CNS中CRH誘導(dǎo)的變化的重要介質(zhì)的基因。
表2用于RT-PCR的寡核苷酸的序列

圖1不同小鼠組織中CRH-R1的表達(dá)水平。為腦區(qū)對來自三種不同動物的組織應(yīng)用定量RT-PCR。
圖2在所有研究的腦區(qū)得到的微陣列數(shù)據(jù)的光譜圖分析。正方形表示不同的樣品，而圓圈表示基因。圓圈的直徑相應(yīng)于基因的平均強(qiáng)度。正方形之間的距離測量樣品之間的類似性?；蚺c給定樣品的正關(guān)聯(lián)性(即該具體樣品中該基因的上調(diào))導(dǎo)致該基因和樣品位于通過矩心(通過十字表示)的共有線(common line)上。以下面的順序顯示不同的區(qū)域(A)小腦，(B)額葉皮質(zhì)，(C)海馬，(D)伏隔核，(E)顳區(qū)，(F)垂體。
圖3用于微陣列分析的動物中的HPA軸參數(shù)。與野生型動物相比血漿CORT水平在CRH過表達(dá)者中高6到8倍。ACTH水平?jīng)]有觀察到顯著差異。
圖4與糖皮質(zhì)激素信號化有關(guān)的基因的微陣列和定量RT-PCR數(shù)據(jù)。(A)使用定量RT-PCR(水平針對β-肌動蛋白標(biāo)準(zhǔn)化)證實了表明海馬中11β-羥基類固醇脫氫酶I型(HSD11b1)的下調(diào)的陣列數(shù)據(jù)。(B)表明FK 506結(jié)合蛋白5(Fkbp 5)——糖皮質(zhì)激素受體激活的一種調(diào)節(jié)劑在海馬和額葉皮質(zhì)中的顯著上調(diào)。(C)通過額葉皮質(zhì)中的定量RT-PCR證實了關(guān)于血清/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)的激酶(Sgk)的陣列數(shù)據(jù)。
圖5神經(jīng)降壓肽受體1和2的微陣列和定量RT-PCR數(shù)據(jù)。(A)使用定量RT-PCR建立了在海馬中觀察到的CRH過表達(dá)小鼠的神經(jīng)降壓肽受體2(Ntsr2)的下調(diào)。神經(jīng)降壓肽受體1(Ntsr1)的水平低于微陣列分析中的檢測極限。(B)而定量RT-PCR在CRH過表達(dá)者中建立了Ntsr1的類似下調(diào)。此外，對qRT-PCR數(shù)據(jù)的雙向ANOVA表明了處理的重要作用，該媒介物(vchicle)處理顯然被R121919處理所取消。
圖6通過對冰凍的玻璃封固的腦組織切片的定量放射自顯影確定的對所有NTS-位點(diǎn)的[125I]NT結(jié)合(0.1nM，30min，RT)。數(shù)據(jù)以對每種至少3個不同的前囟點(diǎn)(Bregma)切片的平均IOD±SEM表示。
(*)遺傳組之間的差異，p＜0.05。
AMG包括Ace、MeA、BMA和BLA的杏仁核；CG2前扣帶皮質(zhì)；HC-SR海馬-放射層；RSG后夾肌粒狀皮質(zhì)；TC顳/頂骨皮質(zhì)；U未處理的；Ve媒介物-處理的；RR121919處理的。
圖7Nts2位點(diǎn)被左卡巴斯汀封閉的海馬切片內(nèi)結(jié)構(gòu)上[125I]NT對NTS1 & 3-位點(diǎn)的結(jié)合。通過對冷凍玻璃封固的腦組織切片的定量放射自顯影確定0.1nM[125I]NT(30min，RT)的結(jié)合。數(shù)據(jù)以對每種至少3個不同的前囟點(diǎn)(Bregma)切片的平均IOD±SEM表示。
(***)遺傳組之間的差異，p＜0.001SNC，substantia faigra pars compacta；其他縮寫，見圖5。
發(fā)明詳述如此處所用的，術(shù)語“化合物”或“試劑”指生物或化學(xué)化合物如簡單或復(fù)雜的有機(jī)分子、肽、蛋白質(zhì)或寡核苷酸。如此處所用的“受試化合物”指用于根據(jù)本發(fā)明的方法的“化合物”或“試劑”，用以評估所述化合物是否調(diào)節(jié)CRH信號化活性。
如此處所用的“CRH信號化”指細(xì)胞中CRH使促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體活化后所述細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄的變化。其從而誘導(dǎo)CRH特異基因表達(dá)譜?？梢栽诘鞍踪|(zhì)或基因，RNA水平上評估轉(zhuǎn)錄水平的變化。
如此處所用的“CRH應(yīng)答活性”一般指由于所述細(xì)胞暴露于CRH導(dǎo)致可檢測的細(xì)胞參數(shù)的變化?？蓹z測的細(xì)胞參數(shù)包括膜電位的變化、調(diào)節(jié)所述細(xì)胞中CRH信號化的酶的酶活性的變化、根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的變化或者第二信使如cGMP、cAMP、Ca2+或IP3的量的變化。
術(shù)語“類似物”或“功能類似物”指哺乳動物嘌呤通透酶的修飾形式，其中已經(jīng)進(jìn)行了至少一個氨基酸置換使得所述類似物在體外和/或體內(nèi)保持和未修飾的哺乳動物嘌呤通透酶基本相同的生物學(xué)活性。
如此處所用的“樣品”或“生物學(xué)樣品”指來自如血液、尿、唾液、組織活檢或尸檢材料的細(xì)胞、細(xì)胞提取物、體液或組織樣品。
術(shù)語“功能類似物”旨在包括根據(jù)本發(fā)明的多肽的“片段”、“變體”、“簡并變體”、“類似物”和“同系物”或“化學(xué)衍生物”。多肽的有用的化學(xué)衍生物是本領(lǐng)域中熟知的并包括，例如具有次級化學(xué)部分的多肽內(nèi)所含的反應(yīng)性有機(jī)位點(diǎn)的共價修飾。熟知的交聯(lián)試劑可用于與氨基、羧基或醛殘基反應(yīng)以導(dǎo)入例如親和標(biāo)記如生物素、熒光染料，或者將多肽綴合到固相表面(例如，產(chǎn)生親和樹脂)。
多核苷酸或多肽的變體，如該術(shù)語在此處所用的，分別是與參比多核苷酸或多肽不同的多核苷酸或多肽。多核苷酸的變體可以是天然發(fā)生的變體如天然發(fā)生的等位基因變體，或者其可以是不知道是天然發(fā)生的變體。(1)在核苷酸序列中與參比多核苷酸不同的多核苷酸。通常差異受到限制從而參比和變體的核苷酸序列總體上非常類似，在許多區(qū)域中相同。如下面所指出的，變體的核苷酸序列的改變可以是沉默的。即，它們可能不改變該多核苷酸編碼的氨基酸。當(dāng)改變局限于這種類型的沉默變化時，變體將編碼具有與參比相同的氨基酸序列的多肽。還如下面所提到的，變體的核苷酸序列的改變可以改變參比多核苷酸所編碼的多肽的氨基酸序列。這種核苷酸改變可導(dǎo)致如上討論的參比序列編碼的多肽中氨基酸置換、加入、缺失、融合和截斷。(2)氨基酸序列與另一參比多肽不同的多肽。一般地，差異受到限制從而參比和變體的多肽序列總體上非常類似并且，在許多區(qū)域中相同。變體和參比多肽在氨基酸序列中可以相差一個或多個置換、插入、缺失、融合和截斷，它們可以以任一組合呈現(xiàn)。
如此處所用的術(shù)語“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)性”指嘌呤和嘧啶核苷酸通過氫鍵結(jié)合形成雙鏈核酸分子的能力。下面的堿基對通過互補(bǔ)性相關(guān)聯(lián)鳥嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；腺嘌呤和尿嘧啶。如此處所用的“互補(bǔ)的”指前述關(guān)系應(yīng)用于所述分子的全長上，含有兩條單鏈核酸分子的基本所有堿基對?！安糠只パa(bǔ)的”指前述關(guān)系，其中兩條單鏈核酸分子之一在長度上短于另一條從而兩個分子之一的一部分保持單鏈的。
術(shù)語“保守置換”或者“保守氨基酸置換”指基于本領(lǐng)域認(rèn)識到的某些氨基酸的可置換性，親本蛋白質(zhì)中一個或多個氨基酸殘基置換而不影響親本分子的生物學(xué)活性(見，例如，M.Dayhoff，Atlas ofProtein Sequence and Structure，卷5，增補(bǔ)3，345-352頁，1978)。
“其片段”指序列在此處公開的核酸或蛋白質(zhì)的片段、片、或亞區(qū)域，從而所述片段含有5或更多氨基酸，或者10個或多個核苷酸，在親本蛋白質(zhì)或核酸分子中這些氨基酸或核苷酸是相鄰的。
如此處所用的“功能片段”指此處公開的蛋白質(zhì)的分離的亞區(qū)域或者片段，或者氨基酸序列，它們例如，含有功能上明顯的區(qū)域，如受體的活化位點(diǎn)。功能片段可通過克隆技術(shù)產(chǎn)生，或者作為備選剪接機(jī)制的天然產(chǎn)物。
術(shù)語“同系物”或“同源的”描述不同核酸分子或氨基酸序列之間的關(guān)系，其中所述序列或分子通過所述分子或序列內(nèi)一個或多個區(qū)組或區(qū)域處的部分同一或類似性相聯(lián)系。“分離的核酸化合物”指任一RNA或DNA序列，其無論如何分析或合成，在位置上與其天然位置不同。
如此處所用的“核酸探針”或“探針”是標(biāo)記的核酸化合物，其與另一種核酸化合物雜交。“核酸探針”指將與單鏈靶核酸序列雜交的單鏈核酸序列。核酸探針可以是寡核苷酸或核苷酸聚合物?！疤结槨蓖ǔ：锌蓹z測部分，其可以附著到該探針的末端或者可以在該探針的序列內(nèi)部。
術(shù)語“引物”是作為例如核酸分子的酶促或合成的延伸的起始底物的核酸片段。
如此處所用的術(shù)語“雜交”指一種過程，其中單鏈核酸分子與互補(bǔ)鏈通過核苷酸堿基配對接合。
術(shù)語“嚴(yán)格性”指雜交條件。高嚴(yán)格性調(diào)節(jié)不利于非同源堿基配對。低嚴(yán)格性條件具有相反作用。例如，通過溫度和鹽濃度可以改變嚴(yán)格性?！皣?yán)格條件”指在含有50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖、和20μg/ml變性的、剪切的鮭精DNA的溶液中于42℃下過夜孵育，然后在0.1×SSC中約65℃下洗滌濾器。其他適宜的雜交條件在實施例中描述。
“較低的嚴(yán)格條件”包括在含有6×SSPE(20X SSPE＝3MNaCl；0.2M NaH2PO4；0.02M EDTA，pH 7.4)、0.5％ SDS、30％甲酰胺、100μg/ml鮭精封閉DNA的溶液中37℃過夜孵育，然后用1×SSPE、0.1％SDS在50℃洗滌。此外，為了實現(xiàn)甚至更低的嚴(yán)格性，可以在更高鹽濃度(例如，5×SSC)下進(jìn)行嚴(yán)格雜交后的洗滌。注意到通過用于抑制雜交實驗中背景的備選封閉試劑的包括和/或替換可以實現(xiàn)上面條件的改變。典型的封閉試劑包括Denhardt試劑、BLOTTO、肝素、變性的鮭精DNA、和通過商業(yè)途徑可得到的專利制劑。特異封閉試劑的包含由于相容性問題可能需要修改上述雜交條件。
如此處所用的術(shù)語“融合蛋白”指為了得到結(jié)構(gòu)域或者接頭(linker)區(qū)的組合功能，組合多個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或者區(qū)而形成的的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。這可以通過編碼這種結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的分子克隆以產(chǎn)生編碼所希望的融合蛋白的新的多核苷酸序列實現(xiàn)。備選地，通過化學(xué)方法連接兩個蛋白質(zhì)產(chǎn)生融合蛋白。
如此處所用的術(shù)語“接頭區(qū)”或者“接頭結(jié)構(gòu)域”或者類似的這些描述性術(shù)語指用于克隆載體或融合蛋白的構(gòu)建中的多核苷酸或多肽序列。接頭區(qū)的功能可以包括將克隆位點(diǎn)導(dǎo)入核苷酸序列、將柔性組分或空間產(chǎn)生區(qū)域?qū)雰蓚€蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間，或者產(chǎn)生用于特定分子相互作用的親和標(biāo)記。接頭區(qū)可被導(dǎo)入在多肽或多核苷酸序列構(gòu)建期間作出的選擇導(dǎo)致的融合蛋白中。
篩選方法本發(fā)明涉及用于鑒定調(diào)節(jié)促腎上腺皮質(zhì)激素-釋放激素(CRH)誘導(dǎo)的抑郁癥和緊張的化合物的篩選方法。該方法基于作為CRH活化的CRH受體的下游調(diào)節(jié)劑的許多基因的鑒定。具體地，本發(fā)明提供了鑒定能夠改變細(xì)胞中CRH信號化應(yīng)答的化合物的方法，所述方法包括a)所述化合物存在或不存在時將所述細(xì)胞與CRH接觸；
b)確定調(diào)節(jié)所述細(xì)胞中促腎上腺皮質(zhì)激素-釋放激素(CRH)信號化的至少一種蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄水平上的改變；和c)比較在所述化合物存在和不存在時所述蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄水平；其中，調(diào)節(jié)促腎上腺皮質(zhì)激素-釋放激素(CRH)信號化的蛋白質(zhì)選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ IDNo.41。
為了確定蛋白質(zhì)水平上轉(zhuǎn)錄的變化，可以使用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)確定所述蛋白質(zhì)的量。例如，使用分離技術(shù)如等電聚焦或SDS-PAGE聯(lián)合蛋白質(zhì)染色技術(shù)如考馬斯或銀染。備選地，對于是酶的蛋白質(zhì)，可以按照該酶產(chǎn)生的催化效果，即其底物向反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，測量或分析給定溶液或組織提取物中的量。例如，對于激酶，可以使用含有激酶特異磷酸化位點(diǎn)的底物并通過測量由于放射性磷酸向底物的摻入導(dǎo)致的該底物的磷酸化來評估激酶活性?？梢栽谑茉嚮衔锎嬖诨虿淮嬖跁r實施該測定法。對于不是酶的蛋白質(zhì)，需要其他定量方法。例如，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可通過它們與它們所轉(zhuǎn)運(yùn)的分子的結(jié)合來測量，激素和毒素可通過它們產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)來測定。
為評估基因水平上轉(zhuǎn)錄的變化，RNA或cDNA可被直接使用或者可以在分析前通過使用PCR或其他擴(kuò)增技術(shù)酶促擴(kuò)增。優(yōu)選地，所述分析方法包括使用標(biāo)記的寡核苷酸探針，該探針靶定所述細(xì)胞中編碼調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的基因的適宜區(qū)域。因此，在優(yōu)選的實施方案中，使用結(jié)合編碼一種氨基酸序列的多核苷酸的探針評估基因轉(zhuǎn)錄水平，該氨基酸序列選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41。
在另一實施方案中，可以構(gòu)建含有編碼調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白的核苷酸序列或者其片段的寡核苷酸探針陣列以實施基因表達(dá)的有效篩選。陣列技術(shù)是熟知的并且具有普遍適用性并且可用于處理分子遺傳學(xué)中的各種問題，包括基因表達(dá)、遺傳連鎖，和遺傳變異性(見例如M.Chee等人，Science，卷274，610-613頁(1996))。
在備選的實施方案中，鑒定能夠改變細(xì)胞中CRH信號化應(yīng)答的化合物的方法包括a)在所述化合物存在和不存在時將所述細(xì)胞與CRH接觸；和b)確定含有一種核酸序列的多核苷酸的表達(dá)水平，該核酸序列選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40。
為了評估表達(dá)水平的改變，RNA或cDNA可被直接使用或者可以在分析前通過使用PCR或其他擴(kuò)增技術(shù)酶促擴(kuò)增。優(yōu)選地，所述分析方法包括使用標(biāo)記的寡核苷酸探針，該探針靶定該多核苷酸的適宜區(qū)域。因此，在優(yōu)選的實施方案中，使用結(jié)合含有一種核酸序列的多核苷酸的探針評估基因轉(zhuǎn)錄水平，該核酸序列選自SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40。
在另一實施方案中，可以構(gòu)建含有編碼調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的核苷酸或者其片段的寡核苷酸探針陣列以有效篩選基因表達(dá)。在該實施方案中，本發(fā)明提供了鑒定能夠改變細(xì)胞中CRH信號化應(yīng)答的化合物的方法，所述方法包括在所述化合物存在或不存在時將所述細(xì)胞與CRH接觸；確定具有核酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的多核苷酸的表達(dá)水平。具體地，使用結(jié)合具有核酸序列SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQID 11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的多核苷酸的寡核苷酸探針陣列。陣列技術(shù)是熟知的并且具有普遍適用性并且可用于處理分子遺傳學(xué)中的各種問題，包括基因表達(dá)、遺傳連鎖，和遺傳變異性(見例如M.Chee等人，Science，卷274，610-613頁(1996))。
對于基因組DNA不被直接使用的情況，可以分離mRNA，并實施第一條鏈cDNA合成。可以實施DNA合成的第二輪以產(chǎn)生第二條鏈。隨后，通過特異PCR擴(kuò)增，可以得到分離的cDNA。如果希望，雙鏈cDNA可被克隆到任一適宜的載體，例如，質(zhì)粒，從而形成cDNA文庫。類似于上面的方法，可以用靶定編碼調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的基因的任一適宜的區(qū)域的標(biāo)記的寡核苷酸探針篩選在噬菌體或質(zhì)粒穿梭載體中構(gòu)建的cDNA文庫。見例如，PCR ProtocolsA Guide to Method andApplication，編者M(jìn).Innis等人，Academic Press(1990)。
在適宜的載體如質(zhì)粒或噬菌體中構(gòu)建cDNA文庫以在原核或真核細(xì)胞中增殖的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。[見例如Maniatis等人，如前]。適宜的克隆載體是熟知的并且可普遍得到。
在另一實施方案中，在mRNA水平確定基因轉(zhuǎn)錄的變化?？梢允褂糜糜诙嗪塑账岫康谋绢I(lǐng)域中熟知的方法之一在RNA水平測量減少或增加的表達(dá)，這些方法為，例如，核酸擴(kuò)增，例如，通過PCR、RT-PCR；RNA酶保護(hù)；Northern印跡和其他雜交方法。可用于確定蛋白質(zhì)，如來自宿主的樣品中本發(fā)明的多肽的水平的測定技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些測定方法包括放射免疫測定法、競爭-結(jié)合測定法、蛋白質(zhì)印跡分析和ELISA測定法?？捎糜诖_定蛋白質(zhì)衍生物或者變體的存在的測定技術(shù)包括質(zhì)譜法。
從而，本發(fā)明的一個目的是提供鑒定能夠改變細(xì)胞中CRH信號化應(yīng)答的化合物的方法，所述方法包括d)所述化合物存在或不存在時將所述細(xì)胞與CRH接觸；e)確定調(diào)節(jié)所述細(xì)胞中促腎上腺皮質(zhì)激素-釋放激素(CRH)信號化的至少一種蛋白質(zhì)的量；和f)比較在所述化合物存在和不存在時所述蛋白質(zhì)的量；其中，調(diào)節(jié)促腎上腺皮質(zhì)激素-釋放激素(CRH)信號化的蛋白質(zhì)選自SEQ IDNO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41。
優(yōu)選地，測定調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的量的方法是使用結(jié)合含有選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的一種氨基酸序列的多肽的抗體。
從而，在另一實施方案中，本發(fā)明提供了與調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)性的單特異抗體，所述蛋白質(zhì)選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41。
使用常規(guī)方案，通過將本發(fā)明多肽或者含有表位的片段、類似物或者表達(dá)這些的細(xì)胞施用于動物，優(yōu)選非-人動物，可以得到所產(chǎn)生的針對本發(fā)明多肽的抗體。對于單克隆抗體制備，可以使用提供通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)產(chǎn)生的抗體的任一技術(shù)。實例包括雜交瘤技術(shù)(Kohler，G.和Milstein，C.，Nature(1975)256495-497)、trioma技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，Immunology Today(1983)472)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等人，MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY，77-96頁，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
產(chǎn)生單鏈抗體，如美國專利號4,946,778中所描述的那些單鏈抗體的技術(shù)也可適用于產(chǎn)生針對本發(fā)明多肽的單鏈抗體。而且，轉(zhuǎn)基因小鼠，或者其他生物，包括其他哺乳動物，也可以用于表達(dá)人源化抗體。
上述抗體可用于分離或鑒定表達(dá)該多肽的克隆或者通過親和層析純化這些多肽。
針對本發(fā)明多肽的抗體也可用于治療CRH代謝相關(guān)的失調(diào)如CRH誘導(dǎo)的緊張或抑郁癥。
為了確定調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的量，根據(jù)本發(fā)明的抗體被用于常規(guī)免疫學(xué)技術(shù)。適宜的免疫學(xué)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并包括例如，ELISA、蛋白質(zhì)印跡分析、競爭性或三明治免疫測定法等，如所熟知的，它們都依賴于抗原-抗體免疫復(fù)合物的形成，其中為了測定法起見，抗體可以被例如，放射、酶或熒光標(biāo)記物可檢測地標(biāo)記，或者可固定在不可溶的載體上。
例如，在一種ELISA篩選方法中，抗體被加到固相(例如，微量滴定板的底部)，該固相被偶聯(lián)到載體(如BSA)的蛋白質(zhì)或者其片段包被，然后加入綴合可檢測標(biāo)記如酶，優(yōu)選辣根過氧化物酶，或者放射性同位素如125I的抗免疫球蛋白抗體(例如，當(dāng)在小鼠中進(jìn)行免疫時，使用抗小鼠免疫球蛋白抗體，例如，綿羊-抗-小鼠免疫球蛋白(Ig))。
從而本發(fā)明的一個目的是提供確定或檢測調(diào)節(jié)樣品中CRH信號化的蛋白質(zhì)的免疫測定法，該方法包括將樣品與根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)接觸并確定在該抗體和所述蛋白質(zhì)之間是否形成免疫復(fù)合體?？梢詫M織樣品或者體液樣品實施這些方法并且它們通常包括從受試者的身體得到樣品；將所述樣品與根據(jù)本發(fā)明的可檢測標(biāo)記的抗體的成像有效量接觸；并檢測標(biāo)記以鑒定調(diào)節(jié)樣品中CRH信號化的蛋白質(zhì)的存在。
使用本發(fā)明抗體的測量方法不被具體限制。可以使用任一測量方法，只要相應(yīng)于抗原的抗體、抗原或者抗原-抗體復(fù)合體的量可被化學(xué)或物理方法檢測，并且從通過使用含有已知量的抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到。例如，可以適宜地使用濁度測定法、競爭法、免疫測量方法和三明治方法。對于靈敏性和特異性，尤其優(yōu)選使用下面描述的三明治方法。
在使用標(biāo)記物質(zhì)的測量方法中，放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等被用作標(biāo)記劑。放射性同位素的實例包括125I、131I、3H和14C。酶通常被綴合適宜的底物，該底物反過來又催化可檢測的反應(yīng)物而使得該酶可被檢測。該底物的實例包括，例如，β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶，優(yōu)選辣根過氧化物酶。發(fā)光物質(zhì)包括，例如，魯米諾、魯米諾衍生物、螢光素、水母發(fā)光蛋白和螢光素酶。此外，抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)也可以用于標(biāo)記抗體和本發(fā)明的免疫原。
因此，在另一方面，本發(fā)明提供了鑒定能夠改變細(xì)胞中CRH信號化應(yīng)答活性的化合物的方法，該方法包括a)將表達(dá)含有選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的至少一種蛋白質(zhì)的細(xì)胞與所述受試化合物接觸；和b)比較所述化合物存在和不存在時所述細(xì)胞中CRH應(yīng)答活性。
使用常規(guī)電生理學(xué)技術(shù)并且當(dāng)它們可以得到時，使用當(dāng)前正在開發(fā)的新的高通量方法測量膜電位的變化。因為膜電位的改變通常是離子通量的結(jié)果，作為備選方法，使用離子敏感的熒光染料，包括fluo-3、fluo-4、fluo-5N、fura red、Sodium Green、SBFI和來自包括Molecular Probes的供應(yīng)商的其他類似探針，可以通過細(xì)胞內(nèi)離子濃度的變化間接測量膜電位的變化。來自包括Molecular Probes的供應(yīng)商的其他熒光染料如DIBAC4(3)或Di-4-Anepps可以檢測膜電位變化。例如，使用熒光測量和熒光成像技術(shù)，包括熒光顯微術(shù)，用或不用激光共聚焦方法組合圖像分析算法，可以實時表征鈣和鈉離子通量。
在優(yōu)選的實施方案中，該測定法基于稱作熒光成像板讀出器((FLIPR)，Molecular Devices Corporation)的儀器。在其最通常的配置中，該儀器激發(fā)并測量基于螢光素的染料發(fā)出的熒光。其使用氬離子激光在熒光團(tuán)的488nm處產(chǎn)生高能量激發(fā)，用光學(xué)系統(tǒng)快速掃描96-/384-孔板的底部并用靈敏的冷CCD相機(jī)捕捉發(fā)出的熒光。其還包括96/384-孔移液頭以允許該儀器遞送試劑溶液到96-/384-孔板的孔中。FLIPR測定法被設(shè)計用于同時從所有96-/384-孔實時地測量化合物加入之前、之中和之后來自細(xì)胞群體的熒光信號。
從而本發(fā)明的一個目的是提供用于篩選和鑒定在調(diào)節(jié)細(xì)胞CRH應(yīng)答中具有功能活性的化合物的FLIPR測定法，所述細(xì)胞表達(dá)選自SEQ IDNO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的蛋白。
在備選實施方案中，可以使用電生理學(xué)方法評估細(xì)胞的活性。因此，可以使用全細(xì)胞和單通道電生理學(xué)鑒定調(diào)節(jié)細(xì)胞中CRH信號化的蛋白質(zhì)。
從而，本發(fā)明的另一個目的是提供鑒定調(diào)節(jié)細(xì)胞中CRH信號化應(yīng)答活性的化合物的篩選方法，所述方法包括a)將表達(dá)選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞與受試化合物接觸；b)使用電生理技術(shù)測量受試化合物對所述細(xì)胞膜電位的影響；和c)比較所述化合物存在和不存在時所述細(xì)胞中CRH應(yīng)答活性。
在優(yōu)選的實施方案中，宿主細(xì)胞是爪蟾(Xenopus)卵母細(xì)胞并且電生理學(xué)測量由使用電壓鉗技術(shù)在不同的膜電位測量膜電流組成。
調(diào)節(jié)所述細(xì)胞中CRH信號化的酶的酶活性的變化一般可以按照酶產(chǎn)生的催化效果，即底物向反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化來測量或分析。例如，對于激酶，可以使用含有該激酶特異磷酸化位點(diǎn)的底物并通過測量該底物的磷酸化評估該激酶的活性。類似地對于磷酸酶，可以使用磷酸化底物并通過測量該底物的去磷酸化評估磷酸酶活性?？梢栽谑茉嚮衔锎嬖诤筒淮嬖跁r實施這些測定。
從而本發(fā)明的一個目的是提供鑒定能夠改變細(xì)胞中CRH信號化應(yīng)答活性的化合物的方法，所述方法包括a)將包括選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的激酶的混合物與磷酸源和適宜的激酶底物接觸；b)在所述化合物存在或不存在時孵育所述混合物；
c)測量與所述受試化合物不存在時所述底物的磷酸化水平相比所述化合物存在時所述底物的磷酸化水平。
在本發(fā)明的測定法中，激酶可作為蛋白質(zhì)提供或者其可以作為編碼所述激酶的mRNA在測定混合物中提供。當(dāng)該測定法包括無細(xì)胞組分時，該激酶以蛋白質(zhì)提供。當(dāng)該測定法在細(xì)胞環(huán)境中實施時，該激酶可以作為蛋白質(zhì)或者作為編碼所述激酶的mRNA提供，其中，為了該激酶可以在該測定法中被利用，該mRNA被翻譯從而產(chǎn)生激酶蛋白。從此處提供的實施例得到該激酶的mRNA并將該mRNA注射到細(xì)胞中以產(chǎn)生激酶蛋白是顯然是很簡單的事情。還可以通過編碼激酶蛋白的質(zhì)粒的表達(dá)提供激酶?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建編碼激酶蛋白的可操作質(zhì)粒并在細(xì)胞中表達(dá)質(zhì)粒(Sambrook，等人，1989，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)。
如此處所討論的，可以在體外(其中測定混合物無細(xì)胞或者其中活細(xì)胞被包括在測定法中)，或者體內(nèi)在動物中實施鑒定激酶調(diào)節(jié)劑的方法。從而，在本發(fā)明的一個方面，混合物被包含在真核細(xì)胞中并且可以實施本發(fā)明的方法，其中測定混合物的一些組分可以通過這些組分向細(xì)胞的微注射外源地提供給細(xì)胞，一些組分可以是細(xì)胞內(nèi)源的。
如此處所用的術(shù)語“細(xì)胞內(nèi)源的”指該組分在受試細(xì)胞中天然地產(chǎn)生。
如此處所用的術(shù)語“細(xì)胞外源的”指該組分在受試細(xì)胞中沒有天然地發(fā)現(xiàn)，或者在細(xì)胞中以低水平發(fā)現(xiàn)，和被加到細(xì)胞中。
當(dāng)使用真核細(xì)胞實施本發(fā)明方法時，一種或多種激酶蛋白、激酶底物和受試化合物可以在真核細(xì)胞孵育前注射到真核細(xì)胞中。然后如此注射的細(xì)胞在促進(jìn)蛋白質(zhì)激酶活性的條件下孵育，在孵育期之后，使用此處描述的測定法隨后測量蛋白質(zhì)激酶活性水平。
用于本發(fā)明方法中的真核細(xì)胞可以是非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母細(xì)胞、非洲爪蟾胚細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞(如IOTI/2細(xì)胞)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)S2細(xì)胞、Dictyostefium discoideum細(xì)胞和酵母細(xì)胞。更優(yōu)選地，真核細(xì)胞是鼠垂體促腎上腺皮質(zhì)激素細(xì)胞-來源的腺瘤細(xì)胞系細(xì)胞AtT-20之一。
用于本發(fā)明方法的磷酸源可以是磷酸的任一普通來源，包括，但不限于，核苷酸三磷酸如，但不限于，ATP或GTP。在優(yōu)選的實施方案中，磷酸源上結(jié)合可檢測的標(biāo)記，在反應(yīng)期間該標(biāo)記隨磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到激酶底物。這樣，磷酸化激酶底物可以與非-磷酸化激酶底物區(qū)分，因為磷酸化底物將含有可檢測的標(biāo)記而非磷酸化底物將不含有標(biāo)記。在另一實施方案中，磷酸源上不結(jié)合可檢測標(biāo)記；而是，例如通過抗體識別底物的一種形式而不能識別另一種形式，可以將磷酸化激酶底物與非-磷酸化激酶底物區(qū)分。
用于本發(fā)明的方法中的可檢測標(biāo)記可包括任一已知或至今未知的可檢測標(biāo)記，該標(biāo)記由于蛋白質(zhì)激酶活性的結(jié)果在磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移時轉(zhuǎn)移到激酶底物?？捎玫臉?biāo)記包括，但不限于，放射性標(biāo)記，如γ32P、31S和非放射性標(biāo)記，如生物素等。
優(yōu)選的激酶測定法在細(xì)胞中實施并包括a)將含有選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的激酶的細(xì)胞與磷酸源和適宜的激酶底物接觸；b)在所述化合物存在或不存在時孵育所述混合物和；c)在所述化合物存在和不存在時比較所述細(xì)胞的CRH應(yīng)答活性。
類似地，可以使用磷酸測定法評估CRH信號應(yīng)答中的變化，所述測定法包括a)將含有選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的磷酸酶的混合物與適宜的磷酸化底物接觸；b)在所述化合物存在或不存在時孵育所述混合物；測量與所述受試化合物不存在時所述底物的磷酸化水平相比，所述化合物存在時所述底物的磷酸化水平。
對于激酶測定法，本發(fā)明的測定法中的磷酸酶可以以蛋白質(zhì)提供或者其可以作為編碼所述磷酸酶的mRNA在測定混合物中提供。通常用可檢測的磷酸殘基標(biāo)記磷酸化底物?？捎玫臉?biāo)記物包括，但不限于，放射性標(biāo)記，如γ32P、31S和非放射性標(biāo)記，如生物素等。對于用于磷酸酶活性測定法，底物優(yōu)選由在酪氨酸或絲氨酸殘基被磷酸化，典型地用γ32P標(biāo)記的肽底物組成。通常，可以以各種方法完成磷酸化。典型地，使用蛋白質(zhì)酪氨酸激酶。例如，可以使用可溶的EGF-受體激酶聯(lián)合.sup.32P標(biāo)記的ATP磷酸化本發(fā)明的肽上的酪氨酸殘基。這種磷酸化反應(yīng)通常允許在30℃持續(xù)約2小時或者在室溫過夜。
然后從磷酸化反應(yīng)混合物純化磷酸化肽，其在下文中被稱為“磷酸肽”。例如，通過加入三氯乙酸并離心，從而肽保留在上清液中，可以從反應(yīng)混合物分離肽。一般通過柱層析，例如在C18上進(jìn)一步純化肽。純化的磷酸化肽可被凍干并在-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 孵育后，通過磷酸肽的去磷酸化(即從去磷酸化釋放的游離放射性磷)釋放的放射性分離沒有去磷酸化的磷酸肽(“未-去磷酸化的磷酸肽”)。如此處所用的，術(shù)語“放射性磷“包括所有形式，其中放射性磷原子可存在于酪氨酸殘基上并且可通過去磷酸化，例如，作為磷酸根基團(tuán)被除去。通常，通過離心，然后通過加入包括非放射性磷酸酯和活性炭的物質(zhì)終止去磷酸化反應(yīng)實現(xiàn)未-去磷酸化的磷酸肽與磷酸肽的去磷酸化釋放的游離的放射性磷的分離。通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法確定上清液的放射性。基于最初通過磷酸肽加入測定混合物的放射性的量和作為去磷酸化釋放的放射性在測定法的末尾檢測的放射性的量，可以計算所分析的樣品的磷酸酶酶促活性。
優(yōu)選地，磷酸酶測定法在細(xì)胞中實施并包括a)將含有選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的磷酸酶的細(xì)胞與適宜的磷酸化底物接觸；b)在所述化合物存在或不存在時孵育所述混合物和；c)比較所述化合物存在和不存在時所述細(xì)胞的CRH應(yīng)答活性，其中通過底物的磷酸化水平的改變確定所述細(xì)胞的CRH應(yīng)答活性。
本發(fā)明的一個實施方案是提供鑒定能夠改變細(xì)胞中CRH信號化應(yīng)答活性的化合物的方法，所述方法包括
a)將表達(dá)包括選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列至少一種蛋白質(zhì)的細(xì)胞與所述受試化合物接觸；和b)比較所述化合物存在和不存在時所述細(xì)胞中第二信使，如cAMP、cGMP、Ca2+或IP3的水平。
使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)確定含有前述蛋白質(zhì)之一的全細(xì)胞或細(xì)胞提取物中第二信使的水平。
鑒定能夠改變細(xì)胞中CRH信號化應(yīng)答活性的化合物的另一方法是基于基因的使用，如報道基因，其可操作地連接基因啟動子或者其調(diào)節(jié)序列元件，其特征是所述基因啟動子或者調(diào)節(jié)序列元件含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中所述轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞中CRH信號化。在優(yōu)選的實施方案中，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞中CRH信號化的轉(zhuǎn)錄因子選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41。因此，本發(fā)明提供了含有如上面定義的基因啟動子區(qū)的重組DNA分子。在所述重組DNA分子中，啟動子區(qū)可操作地連接編碼可檢測的產(chǎn)物的核酸分子，如報道基因。如此處所用的，術(shù)語“可操作地連接”指按適宜的框?qū)⒒蚺c啟動子功能性融合以表達(dá)處于該啟動子控制下的基因。如此處所用的，術(shù)語“報道基因”指一種基因，其編碼的基因產(chǎn)物可以用簡單、便宜的方法鑒定并且該基因可以可操作地連接到啟動子區(qū)或者其活性片段。報道基因如，例如，螢火蟲螢光素酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、細(xì)菌氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶或者綠色熒光蛋白報道基因可用于確定根據(jù)本發(fā)明的篩選測定法中的轉(zhuǎn)錄活性(見，例如，Goeddel(編著)，Methods Enzymol.，卷185，San DiegoAcademicPress，Inc.(1990)；還見Sambrook，如前)。在優(yōu)選的實施方案中，報道基因是螢火蟲螢光素酶基因。本發(fā)明還提供了含有如上定義的重組DNA分子的載體，以及用所述載體，或者一般用根據(jù)本發(fā)明的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。術(shù)語“載體”指用于將DNA轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中以通過宿主細(xì)胞復(fù)制和/或適宜表達(dá)外源DNA的任何外源DNA運(yùn)載工具。因此，在特定實施方案中，所述載體是表達(dá)載體，如通過商業(yè)途徑可得到的pGL31uc表達(dá)載體。
CRH誘導(dǎo)的基因表達(dá)圖譜的鑒定另一方面，本發(fā)明涉及分離的和純化的核酸分子的使用，已表明它們在長時間暴露于CRH的上升的水平時被上調(diào)和下調(diào)，其中所述核酸分子為RNA、DNA、cDNA或者基因組DNA，作為細(xì)胞中的CRH信號化標(biāo)記。
具體地，本發(fā)明包括分離和純化的核酸分子，該核酸分子包括選自如下組的一個成員a)與選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ D No.8、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31的多核苷酸在所述多核苷酸的全長上具有至少70％同一性、優(yōu)選至少80％同一性、更優(yōu)選至少90％同一性、甚至更優(yōu)選至少95％同一性、甚至更優(yōu)選至少97-99％同一性的核苷酸序列；b)與選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ D No.8、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31的多核苷酸在所述多核苷酸的全部編碼區(qū)上具有至少70％同一性、優(yōu)選至少80％同一性、更優(yōu)選至少90％同一性、甚至更優(yōu)選至少95％同一性、甚至更優(yōu)選至少97-99％同一性的核苷酸序列；c)具有選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ D No.8、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31的核苷酸序列的多核苷酸。
同一性和相似性，如本領(lǐng)域中公知的，是如通過比較序列確定的兩個和多個多肽序列或者兩個或多個多核苷酸序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，同一性還指多肽或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)性的程度，可以如通過這些序列串之間的匹配確定?？梢匀菀椎赜嬎阃恍院拖嗨菩?Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，編者，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.，編者，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis ofSequence Data，PartI，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，編者，M Stockton Press，New York，1991)。盡管有許多方法可以測量兩種多核苷酸或兩種多肽序列之間的同一性和相似性，但是兩種術(shù)語都是技術(shù)人員熟知的(Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence AnalysisPrimer，Gribskov，M.和Devereux，J.，編者，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，(1988)SIAM J.Applied Math.，48，1073)。通常用于確定序列之間的同一性或相似性的方法包括，但不限于Carillo，H.，和Lipman，D.，(1988)SIAMJ.Applied Math.，48，1073中公開的那些方法。設(shè)計確定同一性的優(yōu)選方法以給出所試驗的序列之間的最大匹配。確定同一性和相似性的方法在計算機(jī)程序中編碼。確定兩個序列之間同一性和相似性的優(yōu)選的計算機(jī)程序方法包括，但不限于GCG程序包(Devereux，J.，等人，(1984)Nucleic Acids Research 12(1)，387)、BLASTP、BLASTN、和FASTA(Atschul，S.F.等人，(1990)J.Molec.Biol.215，403)。
可以從所述基因被表達(dá)的組織，如但不限于，腦、心臟、腎臟、胰腺、肝臟和皮膚分離編碼能夠調(diào)節(jié)CRH活性的蛋白質(zhì)的核酸序列或者其片段。也可以從人和小鼠之外的哺乳動物分離所述序列。如此處描述的，通過篩選細(xì)胞提取物或全細(xì)胞測定中CRH活性可以進(jìn)行適宜的細(xì)胞的選擇。在這些測定法的任一種中具有CRH調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞可適于分離根據(jù)本發(fā)明的核酸序列。
本領(lǐng)域中公知的各種方法的任一種可用于編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA的分子克隆。在一種方法中，mRNA被分離，并且實施第一條鏈cDNA合成?？梢詫嵤┑诙咲NA合成以產(chǎn)生第二條鏈。隨后通過從調(diào)節(jié)CRH信號化的純化蛋白的氨基酸序列設(shè)計簡并寡核苷酸引物對DNA片段進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增，可以得到分離的cDNA。如果希望，可將雙鏈cDNA克隆到任一適宜的載體，例如，質(zhì)粒，從而形成cDNA文庫。另一種方法是篩選用靶定SEQ ID NO1、SEQ ID NO 7或SEQ ID NO3的任一適宜區(qū)域的標(biāo)記的寡核苷酸探針在噬菌體或質(zhì)粒穿梭載體中構(gòu)建的cDNA文庫。見例如，PCRProtocolsA Guide to Method andApplication，Ed.M.Innis等人，Academic Press(1990)。
在適宜的載體如質(zhì)粒或噬菌體中構(gòu)建cDNA文庫以在原核或真核細(xì)胞中增殖的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。[見例如，Maniatis等人，如前]。適宜的克隆載體是熟知的和普遍可得到的。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是其他類型的文庫，以及從其他細(xì)胞或細(xì)胞類型構(gòu)建的文庫，可用于分離根據(jù)本發(fā)明的核酸序列。其他類型的文庫包括，但不限于，從其他細(xì)胞、從不同于人和小鼠的其他生物得到的cDNA文庫，和基因組文庫，其包括YAC(酵母人工染色體)和粘粒文庫?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實施基因組DNA文庫的構(gòu)建。在T.Maniatis等人，Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版.14章(1989)可發(fā)現(xiàn)熟知的基因組DNA文庫構(gòu)建技術(shù)。
技術(shù)人員將明白，在許多情況中，分離的cDNA序列將是不完整的，因為編碼多肽的區(qū)域在該cDNA的5’末端短。這是逆轉(zhuǎn)錄酶——具有內(nèi)在的低“持續(xù)合成能力”(酶在聚合反應(yīng)期間保持附著到模板的能力的一種測量)的一種酶在第一條鏈cDNA合成期間不能完成mRNA模板的DNA拷貝的結(jié)果。
有一些方法可利用并且是本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的，用于得到全長cDNA，或者延伸短cDNA，例如，cDNA末端的快速擴(kuò)增(RACE)方法(Frohman等人，1988，PNAS USA 85，8998-9002)，或者該技術(shù)的最近改良方法，例如MarathonTM技術(shù)(Clontech Laboratories Inc.)。
多肽在另一實施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)CRH信號化的基本純的形式的多肽，其中所述多肽被分離和純化的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子編碼。在優(yōu)選實施方案中，該多肽具有選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41和其功能類似物的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括根據(jù)本發(fā)明的核酸編碼的所有可能的氨基酸變體，包括被所述分子編碼和具有保守氨基酸變化的多肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到通過多種重組DNA技術(shù)包括，例如，雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，或者從頭DNA合成(見，例如，T.Maniatis等人.Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版.14章(1989))，可以得到調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)。
調(diào)節(jié)CRH信號化的純化的生物活性蛋白質(zhì)可以具有幾種不同的物理形式。根據(jù)本發(fā)明的多肽可以以全長新生的或者未加工的多肽，或者作為部分加工的多肽或者加工的多肽的組合存在。全長新生多肽可以是被特定蛋白質(zhì)水解切割事件翻譯后修飾的，該事件導(dǎo)致全長新生多肽的片段的形成。片段，或者片段的物理締合可以具有與根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)相關(guān)的全部生物學(xué)活性；然而，CRH調(diào)節(jié)活性的程度可以在個體片段之間變化。
在本發(fā)明的該方面還優(yōu)選的是該多肽的結(jié)構(gòu)或功能屬性所表征的片段。在這一點(diǎn)上本發(fā)明的優(yōu)選實施方案包括含有α-螺旋和α-螺旋形成區(qū)、β-折疊和β-折疊-形成區(qū)、轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)角-形成區(qū)、卷曲螺旋和卷曲螺旋-形成區(qū)、親水區(qū)、疏水區(qū)、α兩性區(qū)、β兩性區(qū)、彈性區(qū)、表面-形成區(qū)、底物結(jié)合區(qū)、本發(fā)明的多肽的高抗原性指數(shù)區(qū)的片段，和這些片段的組合。優(yōu)選的區(qū)是介導(dǎo)本發(fā)明的多肽的活性的區(qū)。在這一點(diǎn)上最高度優(yōu)選的是具有本發(fā)明的應(yīng)答調(diào)節(jié)多肽的化學(xué)、生物學(xué)或其他活性的片段，包括具有類似活性或者提高的活性，或者具有降低的不希望的活性的那些片段。
編碼調(diào)節(jié)CRH活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的重組表達(dá)在另一實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸可以通過分子克隆到含有適宜的啟動子和其他適宜的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)移到原核和真核宿主細(xì)胞以產(chǎn)生調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)，而被重組地表達(dá)。這種操作的技術(shù)在Maniatis，T，等人(如前)中完整描述，并且是本領(lǐng)域中熟知的。
因此，在另一方面，本發(fā)明提供了在重組宿主中表達(dá)調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的表達(dá)載體，其中所述載體含有編碼調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的核酸序列和其功能類似物。在本發(fā)明的更優(yōu)選的方面，該表達(dá)載體含有編碼調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的核酸分子，其具有選自SEQID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40和其功能類似物的核苷酸序列或者含有編碼調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的基因組DNA。
表達(dá)載體在此處被定義為適宜的宿主中所克隆基因拷貝的轉(zhuǎn)錄和它們的mRNA翻譯所需要的DNA序列。這些載體可用于在各種宿主中表達(dá)真核基因，該宿主為如細(xì)菌(包括大腸桿菌)、藍(lán)細(xì)菌、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、兩棲動物細(xì)胞、真菌細(xì)胞(包括酵母細(xì)胞)和動物細(xì)胞。
特別設(shè)計的載體允許宿主之間的DNA穿梭，所述宿主如細(xì)菌-酵母或細(xì)菌-動物細(xì)胞或者細(xì)菌-真菌細(xì)胞或細(xì)菌-無脊椎動物細(xì)胞。適宜構(gòu)建的表達(dá)載體可含有用于在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)、可選擇的標(biāo)記物、有限數(shù)目的有用的限制酶位點(diǎn)、高拷貝數(shù)的潛力，和活性啟動子。啟動子被定義為指導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合DNA并啟動RNA合成的DNA序列。強(qiáng)啟動子是導(dǎo)致mRNA以高頻率啟動的mRNA。表達(dá)載體可包括，但不限于，克隆載體、修飾的克隆載體、特別設(shè)計的質(zhì)?；虿《?。
編碼調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的根據(jù)本發(fā)明的分離和純化的核酸分子可被克隆到表達(dá)載體中以在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)。重組宿主細(xì)胞可以是原核或真核的，包括但不限于細(xì)菌如大腸桿菌、真菌細(xì)胞如酵母、兩棲動物細(xì)胞如爪蟾卵母細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞包括但不限于人、牛、豬、猴和嚙齒類來源的細(xì)胞系，和昆蟲細(xì)胞包括但不限于果蠅-和蠶-來源的細(xì)胞系。適宜的并且可通過商業(yè)途徑得到的來自哺乳動物種類的細(xì)胞系包括但不限于CV-1(ATCC CCL 70)、COS-1(ATCC CRL1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCCCCL 92)、NIH/3T 3(ATCC CRL 1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCCCRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)、MRC-5(ATCC CCL 171)、L-細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和HEK-293(ATCC CRL1573)。
因此，在另一實施方案中，本發(fā)明涉及重組宿主細(xì)胞，其含有編碼調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白的重組克隆的核酸分子或其功能類似物。在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞含有一種核酸分子，其或者是基因組DNA或者具有選自SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的核苷酸序列；和其功能類似物。
通過包括但不限于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、脂轉(zhuǎn)染、和電穿孔的許多技術(shù)之一可以將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。含有表達(dá)載體的細(xì)胞被克隆增殖和分析以確定它們是否產(chǎn)生介導(dǎo)CRH信號化的蛋白質(zhì)。表達(dá)通透酶的宿主細(xì)胞克隆的鑒定可通過幾種方法進(jìn)行，這些方法包括但不限于針對根據(jù)本發(fā)明的多肽的抗體的免疫反應(yīng)性，和宿主細(xì)胞相關(guān)的哺乳動物嘌呤通透酶活性的存在。
從而，本發(fā)明還涉及在重組細(xì)胞中表達(dá)調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括在允許調(diào)節(jié)來自如此處概述的表達(dá)載體的調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以通過直接表達(dá)合成或者作為融合蛋白合成，該融合蛋白含有作為與另一種蛋白質(zhì)或肽的翻譯融合的目標(biāo)蛋白，該另一種蛋白質(zhì)或肽可自身地、通過酶或化學(xué)切割除去。因此，在具體實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的蛋白，其中所述多肽是融合蛋白的部分。
在重組系統(tǒng)的某些肽的產(chǎn)生中經(jīng)常觀察到作為融合蛋白的表達(dá)延長了壽命，增加了所希望的肽的產(chǎn)率，或者提供了純化該蛋白質(zhì)的方便的方法。當(dāng)在原核宿主中表達(dá)哺乳動物蛋白時這尤其相關(guān)。公知各種肽酶(例如，腸激酶和凝血酶)，它們在特定位點(diǎn)切割多肽或者，從肽鏈的氨基或羧基末端(例如二氨基肽酶)消化肽。此外，特定化學(xué)藥品(例如溴化氰)將在特定位點(diǎn)切割多肽。技術(shù)人員將明白氨基酸序列必要的修飾(和如果使用重組方法，合成的或半合成的編碼序列)以摻入位點(diǎn)-特異的內(nèi)部切割位點(diǎn)。見例如，P.Carter，″融合蛋白的位點(diǎn)特異的蛋白酶解″，第13章，Protein PurificationFrom MolecularMechanisms to Large Scale Processes.American ChemicalSociety，Washington，D.C.(1990)。
此外，可以使用例如，已經(jīng)在其基因組中含有如上面描述的編碼調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的核酸分子，但是由于例如，弱啟動子而不表達(dá)該核酸分子或者不以適宜的方式表達(dá)該核酸分子的哺乳動物細(xì)胞，并向該哺乳動物細(xì)胞導(dǎo)入與編碼所述嘌呤通透酶多肽的內(nèi)源核酸分子緊鄰的調(diào)節(jié)序列如強(qiáng)啟動子，以便誘導(dǎo)該核酸分子的表達(dá)。
同樣，含有編碼處于異源轉(zhuǎn)錄和/或調(diào)節(jié)序列或蛋白質(zhì)控制下的調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞將是本發(fā)明的另一實施方案。
在該上下文中，術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”指可用于增加嘌呤通透酶多肽的表達(dá)的核酸分子，這是由于該核酸分子整合到細(xì)胞的基因組中并且與CRH調(diào)節(jié)蛋白-編碼基因緊鄰。這些調(diào)節(jié)序列包括啟動子、增強(qiáng)子、失活的沉默子內(nèi)含子序列、3’UTR和/或5’UTR編碼區(qū)、蛋白質(zhì)和/或RNA穩(wěn)定元件、編碼調(diào)節(jié)蛋白的核酸分子，例如，轉(zhuǎn)錄因子，這些調(diào)節(jié)序列能夠誘導(dǎo)或引發(fā)CRH調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-編碼基因的表達(dá)，或者公知活化基因表達(dá)和/或增加基因產(chǎn)物的量的其他基因表達(dá)控制元件。所述調(diào)節(jié)序列的導(dǎo)入導(dǎo)致多肽的表達(dá)的增加和/或誘導(dǎo)，該多肽調(diào)節(jié)CRH信號化，最后導(dǎo)致細(xì)胞中所述多肽的量增加。從而，本發(fā)明的目的是提供調(diào)節(jié)CRH信號化的多肽的從頭和/或增加的表達(dá)。
通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其他方法可以實現(xiàn)構(gòu)建體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入。這些方法在許多標(biāo)準(zhǔn)實驗室手冊，如Davis，Basic Methods InMolecular Biology(1986)中描述。特別預(yù)期調(diào)節(jié)CRH信號化的多肽可以實際上被缺少重組載體的宿主細(xì)胞表達(dá)。
此外，使用體外產(chǎn)生的合成mRNA也可以實施根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)。合成的mRNA或者從能夠調(diào)節(jié)CRH信號化的細(xì)胞分離的mRNA可被有效地在各種無細(xì)胞系統(tǒng)中翻譯，這些無細(xì)胞系統(tǒng)包括但不限于麥芽提取物和網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物，以及在基于細(xì)胞的系統(tǒng)有效地翻譯，其包括但不限于微注射到蛙卵母細(xì)胞，一般優(yōu)選微注射到蛙卵母細(xì)胞。
轉(zhuǎn)基因非-人動物本發(fā)明還涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動物，優(yōu)選轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，該方法包括將本發(fā)明的多核苷酸或載體導(dǎo)入生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞或卵或者從它們得到的細(xì)胞。非-人動物可以按照此處描述的本發(fā)明的篩選方法使用并且可以是非-轉(zhuǎn)基因健康動物，或者可以有磷酸攝入或再吸收失調(diào)，優(yōu)選由調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)中至少一個突變導(dǎo)致的失調(diào)。這些轉(zhuǎn)基因動物很適于，例如，與上述多肽的突變形式有關(guān)的藥物的藥理學(xué)研究。可以，例如，如A.L.Joyner編者，GeneTargeting，A Practical Approach (1993)，Oxford UniversityPress描述的實施轉(zhuǎn)基因胚胎的產(chǎn)生和這些胚胎的篩選。使用例如，DNA印跡，用適宜的探針可以分析胚胎的胚胎膜的DNA；見如前。
優(yōu)選地，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非-人動物還含有相應(yīng)哺乳動物CRH調(diào)節(jié)蛋白-編碼基因的至少一個失活的野生型等位基因；見如前。該實施方案允許例如，研究根據(jù)本發(fā)明的多肽的各種突變形式的相互作用對CRH代謝中疾病相關(guān)的失調(diào)的臨床癥狀的發(fā)作的影響。此前關(guān)于轉(zhuǎn)基因動物討論的所有應(yīng)用也應(yīng)用于攜帶兩個、三個或更多轉(zhuǎn)基因；例如編碼中性內(nèi)肽酶(NEP)的動物。還希望使調(diào)節(jié)CRH信號化表達(dá)或者處于該轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)育和/或生命的一定階段的功能失活。這可以通過使用，例如，組織特異的、發(fā)育和/或細(xì)胞調(diào)節(jié)的和/或可誘導(dǎo)的啟動子，該啟動子驅(qū)動例如，針對編碼能夠調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白的RNA轉(zhuǎn)錄物的反義或核酶的表達(dá)，來實現(xiàn)；也見上文。適宜的可誘導(dǎo)的系統(tǒng)為例如四環(huán)素-調(diào)節(jié)的基因表達(dá)，如例如，Gossen和Bujard(Proc.Natl.Acad.Sci.89 USA(1992)，5547-5551)和Gossen等人(TrendsBiotech.12(1994)，58-62)所描述的。類似地，通過這些調(diào)節(jié)元件可以控制調(diào)節(jié)CRH信號化的突變蛋白的表達(dá)。
此外，本發(fā)明還涉及含有(優(yōu)選穩(wěn)定整合到其基因組)根據(jù)本發(fā)明的核酸或者其部分的轉(zhuǎn)基因哺乳動物細(xì)胞，其中該核酸分子或者其部分的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)導(dǎo)致調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的合成的減少。
在優(yōu)選的實施方案中，通過反義、有義、核酶、共抑制和/或顯性突變體效應(yīng)實現(xiàn)減少?！胺戳x”和“反義核苷酸”指阻礙天然發(fā)生的基因產(chǎn)物的表達(dá)的DNA或RNA構(gòu)建體。
根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的提供打開了產(chǎn)生具有如上述的蛋白質(zhì)的降低的水平并，從而，具有磷酸代謝缺陷的轉(zhuǎn)基因非-人動物的可能性。怎樣實現(xiàn)該可能性的技術(shù)是本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的。這些技術(shù)包括，例如，反義-RNA、核酶或者組合反義和核酶功能的分子和/或提供共-抑制效果的分子的表達(dá)；也見上文。當(dāng)使用反義方法減少調(diào)節(jié)細(xì)胞中CRH信號化的蛋白質(zhì)的量時，編碼反義-RNA的核酸分子對于用于轉(zhuǎn)化的動物種類優(yōu)選為同源來源。然而，還可能使用表現(xiàn)出與編碼調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的內(nèi)源發(fā)生的核酸分子具有高度同源性的核酸分子。在這種情況中，同源性優(yōu)選高于80％，特別優(yōu)選高于90％，更優(yōu)選高于95％。轉(zhuǎn)基因哺乳動物細(xì)胞中根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的合成的減少可導(dǎo)致例如腺嘌呤再吸收的改變。在含有這些細(xì)胞的哺乳動物中，這可導(dǎo)致各種生理的、發(fā)育的和/或形態(tài)的改變。
從而，本發(fā)明還涉及含有上述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因非-人動物。這些動物可以表現(xiàn)出，例如，與野生型動物相比CRH代謝中的不足，這是由于外來DNA的穩(wěn)定或暫時存在導(dǎo)致至少一種下面的特征(a)編碼能夠調(diào)節(jié)CRH信號化的內(nèi)源基因的破壞；(b)針對含有本發(fā)明的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄物的反義RNA和/或核酶的至少一種的表達(dá)；(c)本發(fā)明的多核苷酸的有義和/或不翻譯的mRNA的表達(dá)；(d)本發(fā)明的抗體的表達(dá)；(e)本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列的功能或非功能拷貝的摻入；或(f)本發(fā)明的重組DNA分子或載體的摻入。
使用本發(fā)明的多肽、它們的編碼多核苷酸和載體，現(xiàn)在可能研究體內(nèi)和體外關(guān)于調(diào)節(jié)患者的CRH信號化的蛋白質(zhì)中特定突變的藥物的效率和受到影響的表型。此外，本發(fā)明的多肽的突變形式可用于確定藥物的藥理學(xué)圖譜和鑒定和制備其他藥物，這些藥物可有效治療與CRH代謝有關(guān)的失調(diào)，尤其改善CRH誘導(dǎo)的緊張或抑郁癥。
從而將明白本發(fā)明還涉及預(yù)防、治療或改善與包括CRH受體相關(guān)的失調(diào)的CRH代謝失調(diào)有關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥的方法，該方法包括對哺乳動物受試者使用治療有效量的本發(fā)明的多肽、編碼能夠調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的多核苷酸或者載體。
診斷試驗本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多核苷酸作為診斷試劑的用途。通過與功能異常相關(guān)的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ IDNo.38和SEQ ID No.40的多核苷酸為特征的基因的突變形式的檢測將提供一種診斷工具，其可輔助，或者限定疾病，或者對疾病的易感性的診斷，該疾病，或者對疾病的易感性來自該基因的表達(dá)不足、過表達(dá)或者改變的空間或時間上的表達(dá)。通過各種技術(shù)可以在DNA水平上檢測攜帶該基因突變的個體。
從而將明白本發(fā)明提供了診斷與CRH活性失調(diào)相關(guān)的受試者中的病理狀況或者對病理狀況的易感性的方法，該方法包括(a)確定根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸中突變的存在或不存在；和(b)基于所述突變的存在或不存在檢測病理狀況或者對病理狀況的易感性。
用于診斷的核酸可從受試者的細(xì)胞，如從血液、尿、唾液、組織活檢或尸檢材料得到。基因組DNA可直接用于檢測或者在分析前使用PCR或者其他擴(kuò)增技術(shù)酶促擴(kuò)增。RNA或者cDNA也可以以類似方式使用。通過與正常基因型比較擴(kuò)增產(chǎn)物的大小的改變檢測缺失和插入。將擴(kuò)增的DNA與根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記的核苷酸序列雜交可以鑒定點(diǎn)突變。通過RNA酶消化或者通過熔解溫度的差異可以將完美匹配的序列與錯配的雙鏈體區(qū)別。通過改變毛細(xì)管電泳柱或者凝膠中的DNA片段的電泳遷移率，使用或不使用變性劑，或者通過直接DNA測序(例如，Myers等人，Science(1985)2301242)也可以檢測DNA序列差異。通過特定限制性內(nèi)切酶、核酸酶保護(hù)測定法，如RNase和S1保護(hù)或者化學(xué)切割方法也可以揭示特定位置的序列變化(見Cotton等人，ProcNatl Acad Sci USA(1985)854397-4401)。在另一實施方案中，可以構(gòu)建含有編碼能夠調(diào)節(jié)CRH活性的蛋白的核酸序列或者其片段的寡核苷酸探針陣列以實施例如基因突變的有效篩選。陣列技術(shù)是熟知的并且具有普遍適用性并且可用于處理分子遺傳學(xué)中的各種問題包括基因表達(dá)、遺傳連鎖，和基因變異性(見例如M.Chee等人，Science，卷274，610-613頁(1996))。
該診斷試驗提供了通過用所描述的方法檢測CRH調(diào)節(jié)蛋白-編碼基因中的突變診斷或確定對疾病的易感性的方法。此外，通過包括從來自受試者的樣品確定多肽或者mRNA的異常減少或增加的水平，以及通過從所述樣品確定與正常結(jié)構(gòu)(見上面)相比蛋白質(zhì)衍生物的存在的方法診斷這些疾病?？梢允褂糜糜诙嗪塑账岫康谋绢I(lǐng)域中熟知的方法的任一種在RNA水平上測量減少或增加的表達(dá)，該方法為如，例如，核酸擴(kuò)增，例如，通過PCR、RT-PCR；RNA酶保護(hù)；RNA印跡和其他雜交方法?？捎糜诖_定來自宿主的樣品中蛋白質(zhì)，如本發(fā)明的多肽的水平的測定技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知的。這些測定方法包括放射免疫測定法、競爭-結(jié)合測定法、蛋白質(zhì)印跡分析和ELISA測定法?？捎糜诖_定蛋白質(zhì)衍生物或變體的存在的測定技術(shù)包括質(zhì)譜法。
從而，另一方面，本發(fā)明提供了診斷長期CRH暴露的失調(diào)有關(guān)的受試者中病理學(xué)狀況或者對病理學(xué)狀況的易感性的方法，該方法包括(a)確定生物學(xué)樣品中根據(jù)本發(fā)明的多肽或者其衍生物的存在或者表達(dá)量；和(b)基于該多肽或者其衍生物的存在或者表達(dá)量診斷病理學(xué)狀況或者對病理學(xué)狀況的易感性。
具體地，本發(fā)明提供了診斷個體中CRH誘導(dǎo)的基因表達(dá)的方法，所述方法包括a)得到所述個體的生物學(xué)樣品；和b)確定所述生物學(xué)樣品中調(diào)節(jié)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)信號化的至少一種蛋白質(zhì)的量；其中調(diào)節(jié)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)信號化的蛋白選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41。在備選實施方案中，診斷CRH誘導(dǎo)的表達(dá)譜的方法不限于根據(jù)本發(fā)明的至少一種蛋白，但是需要同時評估所鑒定為與CRH信號有關(guān)的蛋白質(zhì)組，即具有氨基酸序列SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
優(yōu)選地，在蛋白質(zhì)水平上，優(yōu)選使用結(jié)合該蛋白質(zhì)的抗體，或者在基因轉(zhuǎn)錄水平上，優(yōu)選使用結(jié)合編碼選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的多核苷酸的探針確定所述蛋白質(zhì)的量。
備選地，通過評估含有選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、S EQ ID No.38和SEQ ID No.40的核酸序列的基因的基因轉(zhuǎn)錄水平確定CRH誘導(dǎo)的基因表達(dá)譜。確定基因轉(zhuǎn)錄水平的方法已經(jīng)在上文中描述并且包括在優(yōu)選的實施方案中使用結(jié)合、優(yōu)選選擇性結(jié)合選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ IDNo.40的多核苷酸或者其互補(bǔ)序列的探針。在另一實施方案中，可以構(gòu)建含有根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列或者其片段的寡核苷酸探針陣列以實施個體樣品中基因轉(zhuǎn)錄水平的有效篩選。
在另一方面，本發(fā)明涉及診斷試劑盒，其含有(a)本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNO.5、SEQ IDNO.6、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的核苷酸序列或者其片段。
(b)與(a)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；
(c)本發(fā)明的多肽，優(yōu)選SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ IDNO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的多肽或者其片段；或(d)本發(fā)明的多肽的抗體，優(yōu)選SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的多肽和任選適宜的檢測方法。
將明白在任何這種試劑盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可以含有實質(zhì)性組分。這種試劑盒將用于診斷疾病或?qū)膊〉囊赘行?，尤其CRH代謝相關(guān)的失調(diào)如CRH誘導(dǎo)的緊張或抑郁癥。
本發(fā)明的核苷酸序列對于染色體定位也是有價值的。這些序列特異靶定，并可以與個人染色體上的特定位置雜交。根據(jù)本發(fā)明的染色體相關(guān)的序列的作圖是將這些序列與基因-相關(guān)的疾病相互關(guān)聯(lián)的重要的第一步。一旦序列被映射到精確的染色體位置，那么染色體上該序列的物理位置可以與遺傳圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)在例如，V.McKusick，Mendelian Inheritance in Man(可通過Johns HopkinsUniversity Welch Medical Library在線獲得)中發(fā)現(xiàn)。然后通過連鎖分析(物理上相鄰的基因的共遺傳)鑒定已經(jīng)被映射到相同的染色體區(qū)域的基因和疾病之間的關(guān)系。本發(fā)明的基因映射到人15號染色體。
也可以確定受影響和未受影響的個體之間cDNA或基因組序列的差異。如果在一些或者所有受影響的個體中但是沒有在任一正常個體中觀察到突變，那么該突變可能是該疾病的病因。
本發(fā)明的核苷酸序列對于組織定位也是有價值的。這些技術(shù)允許通過檢測編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的mRNA來確定這些多肽的表達(dá)模式。這些技術(shù)包括原位雜交技術(shù)和核苷酸擴(kuò)增技術(shù)，例如，PCR。這些技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知的。來自這些研究的結(jié)果指出生物中這些多肽的正常功能。
本發(fā)明的多肽或者它們的片段或它們的類似物，或者表達(dá)它們的細(xì)胞，也可用作免疫原以產(chǎn)生對本發(fā)明的多肽免疫特異的抗體。術(shù)語“免疫特異的”指抗體具有對本發(fā)明的多肽比它們對現(xiàn)有技術(shù)中其他相關(guān)多肽大得多的親和性。
從而在另一實施方案中，本發(fā)明提供了與哺乳動物嘌呤通透酶具有免疫反應(yīng)性的單特異抗體。在優(yōu)選的實施方案中，所述抗體與具有選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的多肽和其功能類似物具有免疫反應(yīng)性或者所述抗體封閉調(diào)節(jié)CRH信號的蛋白質(zhì)的活性。
針對本發(fā)明的多肽的抗體可以通過使用常規(guī)方案，將該多肽或者含有表位的片段、類似物或者表達(dá)這些的細(xì)胞施用于動物，優(yōu)選非人哺乳動物得到。對于單克隆抗體的制備，可以使用通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)產(chǎn)生的抗體。實例包括雜交瘤技術(shù)(Kohler，G.和Milstein，C.，Nature(1975)256495-497)、trioma技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，Immunology Today(1983)472)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等人，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，77-96頁，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
產(chǎn)生單鏈抗體，如美國專利號4,946,778中所描述的那些單鏈抗體的技術(shù)也可適用于產(chǎn)生針對本發(fā)明多肽的單鏈抗體。而且，轉(zhuǎn)基因小鼠，或者其他生物，包括其他哺乳動物，也可以用于表達(dá)人源化抗體。
上述抗體可用于分離或鑒定表達(dá)表達(dá)該多肽的克隆或者通過親和層析純化這些多肽。
針對本發(fā)明多肽的抗體也可用于治療CRH代謝相關(guān)的失調(diào)。
另一方面，本發(fā)明涉及基因工程化的可溶的融合蛋白，其包括本發(fā)明的多肽，或者其片段，和各種亞類(IgG、IgM、IgD、IgE)的免疫球蛋白的重鏈或輕鏈恒定區(qū)的各種部分。優(yōu)選作為免疫球蛋白的是人IgG，特別是IgG I的重鏈的恒定部分，其中在鉸鏈區(qū)發(fā)生融合。在具體實施方案中，通過切割序列的摻入可以簡單地除去Fc部分，該切割序列可以用例如血液凝固因子Xa切割。此外，本發(fā)明涉及通過基因工程制備這些融合蛋白的方法，還涉及它們用于藥物篩選、診斷和治療的用途。本發(fā)明的另一方面還涉及編碼這些融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術(shù)的實例可以在國際專利申請?zhí)朩O 94/29458和WO 94/22914中發(fā)現(xiàn)。
治療效用本發(fā)明的另一方面涉及免疫/疫苗制劑(組合物)，其當(dāng)導(dǎo)入哺乳動物宿主時，在該哺乳動物中誘導(dǎo)針對本發(fā)明的多肽的免疫應(yīng)答，其中該組合物含有本發(fā)明的多肽或者多核苷酸。疫苗制劑可以還含有適宜的載體。因為多肽可以在胃中分解，所以其優(yōu)選腸胃外(例如，皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)，或者皮內(nèi)注射)施用。適于腸胃外施用的制劑包括水性和非水性無菌注射液，其可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑茵劑和使得制劑與接受者的血液等滲的溶質(zhì)；和水性和非水性無菌懸浮液，其可以包括懸浮劑或增稠劑。該制劑可以在單劑量或者多劑量容器，例如，密閉的安瓿和小瓶中提供并且可以保存在冰凍干燥的條件中，僅需要在使用前加入無菌液體載體。該疫苗制劑還可包括用于增強(qiáng)制劑的免疫原性的佐劑系統(tǒng)，如水包油系統(tǒng)和本領(lǐng)域中公知的其他系統(tǒng)。劑量將依賴于疫苗的特異活性并且可通過常規(guī)實驗方法容易地確定。
在再一個方法中，可以使用表達(dá)阻斷技術(shù)抑制編碼調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)。公知的這些技術(shù)包括使用反義序列，其或者是內(nèi)部產(chǎn)生的或者是外部施用的(見，例如，O′Connor，J.Neurochem(1991)56560；寡脫氧核糖核苷酸作為基因表達(dá)的反義抑制劑，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。備選地，可以提供與基因形成三螺旋(“三鏈體”)的寡核苷酸(見，例如，Lee等人，Nucleic Acids Res(1979)63073；Cooney等人，Science(1988)241456；Dervan等人，Science(1991)2511360)。這些寡聚體本身可被施用或者可以體內(nèi)表達(dá)相關(guān)的寡聚體。合成的反義和三鏈體寡核苷酸可含有修飾的堿基或者修飾的主鏈。修飾的主鏈的實例包括甲基磷酸酯、硫代磷酸酯或肽核酸主鏈。這些主鏈被摻入反義和三鏈體寡核苷酸中以提供保護(hù)防止核酸酶降解并且是本領(lǐng)域中熟知的。用這些和/或其他修飾的主鏈合成的反義和三鏈體分子也形成本發(fā)明的部分。
在用于抑制細(xì)胞中靶基因表達(dá)的另一方法中，具有部分和完全雙鏈特征的RNA被導(dǎo)入細(xì)胞或者胞外環(huán)境。抑制是特異的，因為選擇來自靶基因的一部分的核苷酸序列產(chǎn)生抑制性RNA。該RNA可含有聚合的核糖核苷酸的一條或多條鏈；其可以包括對磷酸酯-糖主鏈或者核苷的修飾。通過單條自身-互補(bǔ)RNA鏈或者兩條互補(bǔ)鏈可以形成雙鏈結(jié)構(gòu)。抑制是序列-特異的，因為相應(yīng)于RNA的雙鏈體區(qū)的核苷酸序列被靶定用于基因抑制。優(yōu)選含有與靶序列的一部分相同的核苷酸序列的RNA?？梢栽趪H專利申請WO 99/32619中發(fā)現(xiàn)RNA抑制技術(shù)的實例。
此外，調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的表達(dá)可以通過使用對編碼所述蛋白質(zhì)的mRNA序列特異的核酶來防止。核酶是具有催化活性的RNA，其可以是天然的或合成的(見例如Usman，N，等人，Curr.Opin.Struct.Biol(1996)6(4)，527-33)?？梢栽O(shè)計合成的核酶以在所選的位置特異切割前述mRNA，從而防止所述mRNA翻譯成功能多肽?？梢院铣删哂刑烊缓颂橇姿狨ブ麈満吞烊粔A基的核酶，如通常在RNA分子中發(fā)現(xiàn)的。備選地，可以合成具有非天然主鏈的核酶，例如，2’-0-甲基RNA以提供對核糖核酸酶降解的保護(hù)，并且可以含有修飾的堿基。
對于治療與調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的表達(dá)不足有關(guān)的異常病癥，也可以利用幾種方法。一種方法包括對受試者施用治療有效量的激活本發(fā)明的多肽的化合物，例如，如上述的激動劑，結(jié)合藥學(xué)上可接受的載體，從而減輕異常病癥。備選地，可以使用基因治療來影響受試者的相關(guān)細(xì)胞內(nèi)源產(chǎn)生哺乳動物嘌呤通透酶。例如，可以將本發(fā)明的多核苷酸工程化以在復(fù)制-缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中表達(dá)，如上面討論的。然后逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體可被分離并導(dǎo)入用含有編碼本發(fā)明的多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的包裝細(xì)胞中，從而該包裝細(xì)胞產(chǎn)生含有目標(biāo)基因的感染性病毒微粒。這些生產(chǎn)者細(xì)胞可被施用于受試者以體內(nèi)工程化細(xì)胞并體內(nèi)表達(dá)多肽。對于基因治療的綜述，見Human Molecular Genetics，T Strachan和A P Read，BIOSScientific Publishers Ltd(1996)中第20章基因治療和其他基于分子遺傳學(xué)的治療方法(和其中引用的參考文獻(xiàn))。另一種方法是施用治療量的本發(fā)明的多肽與適宜的藥物載體相組合。
另一方面，本發(fā)明提供了含有治療有效量的多肽，如本發(fā)明多肽的可溶形式，激動劑/拮抗劑肽或者小分子化合物，與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑相組合的藥物組合物。這些載體包括，但不限于，鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇和它們的組合。本發(fā)明還涉及藥物包裝和試劑盒，它們含有裝有一種或多種本發(fā)明的前述組合物的成分的一個或多個容器。本發(fā)明的多肽和其他化合物可以單獨(dú)使用或者與其他化合物，如治療性化合物聯(lián)合使用。
該組合物將被適應(yīng)于施用途徑，例如，通過全身的或者口服途徑。全身性施用的優(yōu)選形式包括注射，通常通過靜脈內(nèi)注射?？梢允褂闷渌⑸渫緩?，如皮下、肌內(nèi)或者腹膜內(nèi)注射。全身性使用的備選方法包括使用滲透劑如膽汁鹽或者梭鏈孢酸或者其他去污劑透粘膜和透皮施用。此外，如果本發(fā)明的多肽和其他化合物可以制備成腸或者膠囊化制劑，那么經(jīng)口施用也是可能的。這些化合物的施用也可以是局部和/或局部化的，為貼劑、藥膏、糊劑、凝膠劑等的形式。
所需要的劑量范圍依賴于本發(fā)明的多肽和其他化合物的選擇、施用途徑、制劑的性質(zhì)、受試者病癥的性質(zhì)，和主治醫(yī)生的判斷。然而，適宜的劑量為0.1-100μg/kg受試者。然而，考慮到可利用的化合物的多樣性和各種施用途徑的不同效率，可以預(yù)期所需劑量的寬的變化。例如，口服施用預(yù)期比通過靜脈內(nèi)注射施用需要更高的劑量。使用用于優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗常規(guī)可以判斷這些劑量水平的變化，如本領(lǐng)域中所熟知的。
也可以在受試者內(nèi)內(nèi)源地產(chǎn)生用于治療的多肽，這在治療模式中通常被稱為如上述的“基因治療”。從而，例如，來自個體的細(xì)胞可被多核苷酸，如DNA或RNA工程化以體外編碼多肽，以及例如，通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒治療載體。然后將細(xì)胞導(dǎo)入受試者中。
通過參考下面的實驗細(xì)節(jié)可以更好地理解本發(fā)明，但是本領(lǐng)域中技術(shù)人員將容易明白這些實驗細(xì)節(jié)僅用于闡明本發(fā)明，其在后面的權(quán)利要求書中更完全地描述。此外，在該申請書的全文中，應(yīng)用了各種出版物。這些出版物的公開在此處被并入本申請的參考文獻(xiàn)中以更完整地描述本發(fā)明所屬的本領(lǐng)域的狀態(tài)。
實驗程序動物舍飼和處理-CRF過表達(dá)C57BL/6J轉(zhuǎn)基因雄性小鼠(CRF-OE或TG)和它們的野生型同窩出生仔畜(WT)被維持在特定無病原的設(shè)施中，該設(shè)施滿足對于動物照管的所有國際和歐洲要求。實驗開始前動物單獨(dú)居住在環(huán)境-受控的動物群體中4周，具有12h黑暗-白天循環(huán)(在700EST照亮)，可以自由接近食物和水。處理前，3月齡的小鼠被隨機(jī)化成三組，每組含有4只野生型和4只轉(zhuǎn)基因動物。一個組不接受處理，第二組接受媒介物注射5天，每天2次(10％環(huán)葡聚糖(CD)，pH 4)，第三組按照相同的方案接受10％CD中的10mg/kg CRH-R1特異拮抗劑R121919。最后處理16小時后，動物被處死以解剖腦區(qū)并隨后分離RNA。
樣品制備-從轉(zhuǎn)基因和野生型動物宏觀地解剖下面的腦區(qū)域垂體、小腦、顳區(qū)、海馬、額葉皮質(zhì)，和伏隔核。使用Ultra-turrax T25研磨機(jī)(IKA-labortechnik)將腦組織在Trizol(Invitrogen LifeTechnologies)中勻漿。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書用Trizol提取總RNA。使用Rneasy試劑盒(Qiagen)，在柱上用DNAseI處理進(jìn)一步純化總RNA。
微陣列雜交-如下制備cRNA。使用T7-oligo(dT)24-引物和SuperscriptII RT(Invitrogen Life Technologies)對10μg總RNA在42℃實施逆轉(zhuǎn)錄1h。用大腸桿菌DNA聚合酶I、DNA連接酶和RNAseH(Invitrogen Life Technologies)在16℃進(jìn)行2h的第二條鏈cDNA合成。用相-鎖定凝膠(Eppendorf)進(jìn)行苯酚-氯仿萃取后，使用Bioarray高產(chǎn)率RNA轉(zhuǎn)錄物標(biāo)記試劑盒與生物素標(biāo)記的核糖核苷酸(Enzo Diagnostics)在37℃實施體外轉(zhuǎn)錄6h。CRNA產(chǎn)物在QiagenRneasy柱上純化并在95℃片段化35分鐘。cRNA產(chǎn)率為50到100μg。在GeneChips(Affymetrix，Santa Clara，CA)上處理樣品。為了檢查每個樣品的質(zhì)量，將5μg標(biāo)記的cRNA在Test 2-陣列上運(yùn)行。實際的實驗在鼠基因組U74Av2陣列上實施，該陣列含有檢查約12,000個全長小鼠基因和來自UniGene database(Build 74)的EST簇的探針組。在持續(xù)旋轉(zhuǎn)下用15μg cRNA于45℃實施雜交16h。將陣列在Affymetrix Fluidics工作臺(station)中用鏈霉抗生物素蛋白/藻紅蛋白(SAPE)染色，然后用抗-鏈霉抗生物素蛋白的抗體染色并進(jìn)行第二次SAPE染色。隨后，用HP-激光掃描儀掃描陣列并用MicroarraySuite Software(Affymetrix)分析數(shù)據(jù)。在該階段不進(jìn)行分級或者標(biāo)準(zhǔn)化?；诋?dāng)前調(diào)用(present calls)百分?jǐn)?shù)(見表)評估實驗的質(zhì)量。
具有RNA的低產(chǎn)率或者低百分比當(dāng)前調(diào)用或者偏離的3’/5’比例的樣品從隨后的分析中省略。用于分析的動物的數(shù)目在表中顯示。
數(shù)據(jù)分析和基因的選擇使用下面的算法將每個陣列上的原始強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化
基本上該校準(zhǔn)將一個陣列的平均強(qiáng)度設(shè)定為所測的平均值，該標(biāo)準(zhǔn)化彌補(bǔ)了雜交、洗滌和染色中陣列與陣列的差異，最終允許陣列之間合理的比較。標(biāo)準(zhǔn)化后，使用加權(quán)光譜作圖分析(SMA)(7)分析數(shù)據(jù)。加權(quán)光譜作圖是一種無監(jiān)督的多變量分析方法，其包括與代表解釋數(shù)據(jù)集內(nèi)方差的大多數(shù)的兩種最高的主要組分的專門的可視化相組合的數(shù)據(jù)的雙中心化。盡管雙中心化除去了陣列數(shù)據(jù)的“大小”成分，但是通過代表各自樣品(通過正方形描繪)和基因(通過圓圈描繪)的大小的符號的面積，該信息在可視化中被再次導(dǎo)入。所剩下的是不同基因之間的對比和數(shù)據(jù)表的不同樣品的對比。這些對比可表達(dá)為由于通過該算法實施的對數(shù)轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的比。該對比可被理解為不同樣品的不同基因的特異性。相反地，它們還指對于這些基因的一些的不同樣品的特異性和優(yōu)選性。因此，可以聲明SMA提供了基因和樣品之間相互作用的可視化。該方法允許減小大的微陣列數(shù)據(jù)集和提供可視地檢查從而鑒定數(shù)據(jù)中的基因簇和/或受試者。從而，在光譜圖樣品中，群集在一起的樣品可被解釋為相似的。相應(yīng)地，位于軸和中心的相反位置的樣品可被解釋為不相似的。
除了該總的分析，還使用微陣列數(shù)據(jù)的顯著性分析(SAM)(8)鑒定了組間具有不同表達(dá)水平的個別基因。SAM通過吸收一組基因-特異的t-檢驗鑒定在表達(dá)中具有統(tǒng)計學(xué)顯著的改變的基因。與經(jīng)典t-檢驗相比，該基因特異的t-檢驗不僅考慮對特定基因所觀察的方差，而且還包括覆蓋測量的所有基因的總方差的通常所說的誤差系數(shù)(fudgefactor)。具有高于閾值的得分的基因被認(rèn)為是潛在顯著的。為了估計這些潛在顯著變化的基因之間的假陽性數(shù)目，SAM使用排列來估計假發(fā)現(xiàn)率。為此，對測量的排列迭代計算t-值?？梢哉{(diào)整閾值以鑒定更小或更大的基因組，并計算相應(yīng)的FDRs。除了影響顯著改變的基因的數(shù)目和相應(yīng)FDR的閾值delta，可以使用成倍改變閾值以拋棄在樣品之間的表達(dá)中僅表現(xiàn)出有限差異的基因。這些改變可能來自幾乎無顯著性的生物學(xué)觀點(diǎn)。
用OmniViz程序?qū)嵤┝嗽诮o定腦區(qū)域上得到的表達(dá)數(shù)據(jù)的K-方法聚類。除了所有樣品中缺乏的所有記錄并將小于20的所有信號設(shè)為20。這允許具有相似行為的基因的聚類。
定量RT-PCR-使用實時PCR分析證實微陣列數(shù)據(jù)。使用隨機(jī)六聚物引物和SuperscriptII RT(Invitrogen Life Technologies)對0.5μg總RNA實施第一條鏈cDNA合成。用Taqman PCR試劑盒在ABIPrism 7700循環(huán)儀(Applied Biosystems)上實施定量PCR。cDNA的連續(xù)稀釋液被用于產(chǎn)生相對β-肌動蛋白、CRH受體1(Crh-R1)、CRH受體2(Crh-R2)、神經(jīng)降壓肽受體1(Ntsr1)、神經(jīng)降壓肽受體2(Ntsr2)、神經(jīng)降壓肽受體3(Ntsr3)、11β-羥基類固醇脫氫酶1(Hsd11B1)、血清/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)的激酶(Sgk)和目的基因(見引物序列表)的濃度的對數(shù)的循環(huán)閾值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的線性回歸線容許確定來自每個腦區(qū)不同治療組的RNA樣品中的轉(zhuǎn)錄水平。
放射自顯影-如以前由Moyse等人(12)描述的實施對成年雄性C57BL/6J小鼠和它們的野生型同窩出生仔畜的腦實施神經(jīng)降壓肽結(jié)合和膜放射顯影。將20微米厚的切片與含有0.1％牛血清白蛋白、1mMEDTA、5×10-5M桿菌肽、2μg/ml胰凝乳蛋白酶抑制劑和4μg/ml亮肽素的50mM Tris-HCl，pH7.4中的0.1nM單碘代[125I]Tyr3-神經(jīng)降壓肽(2200Ci/mmol，Perkin Elmer)孵育。在1μM天然神經(jīng)降壓肽存在下孵育額外的切片評估非特異染色。在1μM左卡巴斯汀——一種Nts2拮抗劑存在下對海馬切片實現(xiàn)了[125I]神經(jīng)降壓肽結(jié)合與Nts2封閉。用MCID M4數(shù)字分析儀(Imaging Research，St Catharines，ON，加拿大)實施了膜放射顯影的光密度分析。在每張切片上結(jié)構(gòu)被交互地描繪并在所描繪的區(qū)域內(nèi)測量了象素灰色水平。用共-暴露的125I-標(biāo)準(zhǔn)將象素灰色水平轉(zhuǎn)化成每毫克組織的放射性并將其在所測量區(qū)域內(nèi)平均。用SPSS 11.0軟件通過雙向ANOVA和伴隨的Bonferroni′s事后檢驗統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。
結(jié)果與討論為了研究長期CRH施用對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，發(fā)明人將來自CRH過表達(dá)小鼠的腦區(qū)中的基因表達(dá)譜與它們的野生型同窩出生仔畜的相比較。此外，我們研究了CRH-R1拮抗劑施用對這些表達(dá)譜的影響。在該研究中研究的腦區(qū)包括垂體、伏隔核、額葉皮質(zhì)、顳區(qū)、海馬和小腦。使用定量實時RT-PCR(RTq)測量了CRH受體1(CRH-R1)和2(CRH-R2)的表達(dá)。盡管可以容易地檢測CRH-R1，但是對于這些腦區(qū)中的CRH-R2沒有得到可靠的測量。這些腦區(qū)中CRH受體的所觀測的表達(dá)水平符合以前報導(dǎo)的小腦和額葉皮質(zhì)中CRH-R1的高水平和CRH-R2的低表達(dá)水平，CRH-R2主要是外周受體(見圖1)(9)。
在含有12000個鼠EST的陣列上分別處理了從來自不同動物的不同腦區(qū)分離的RNA。標(biāo)準(zhǔn)化后，分析每個腦區(qū)的數(shù)據(jù)。用光譜圖分析(SMA)實施數(shù)據(jù)的第一次通過檢查，使得可以對與處理組和基因型相關(guān)的基因表達(dá)應(yīng)答進(jìn)行總的圖像解釋。SMA指出對于除了垂體之外的所有區(qū)域，治療組之間的表達(dá)沒有總的改變。在所有腦區(qū)中，來自轉(zhuǎn)基因動物(Tg)的多數(shù)樣品與來自野生型動物(WT)的樣品相比在不同位置聚集。這在垂體水平上是最明顯的，其中在光譜圖中在Tg和WT動物之間觀察到表達(dá)模式的明顯不同，樣品聚集在相反的位置。一起考慮，這些數(shù)據(jù)表明終生暴露于CRH誘導(dǎo)所有研究的腦區(qū)中基因表達(dá)譜的改變，在垂體中觀察到最顯著的影響。用CRH-R1拮抗劑處理5天對表達(dá)譜的這些改變沒有影響(或僅限于有限程度)，如通過垂體光譜圖所示例的。
為了鑒定顯著變化的基因，應(yīng)用了微陣列數(shù)據(jù)的顯著性分析(SAM)算法。按照SMA，僅僅發(fā)現(xiàn)有限數(shù)目的基因在大多數(shù)腦區(qū)中顯著變化(見補(bǔ)充信息)。然而，在垂體中，WT和TG動物有300種以上的基因差別表達(dá)。CRH過表達(dá)小鼠的所研究的腦區(qū)中基因表達(dá)譜闡明了存在于這些動物中的以前未認(rèn)識到的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定機(jī)制。一般地，所觀察的表達(dá)譜指出在轉(zhuǎn)基因動物(TG)中受到影響的一些途徑。
TG動物的血漿糖皮質(zhì)激素水平高于WT動物6-8倍(見圖3)。結(jié)果，基因表達(dá)譜表現(xiàn)出對皮質(zhì)酮的這些高水平的適應(yīng)。這通過糖皮質(zhì)激素受體信號化的增強(qiáng)子如海馬中I型11β-羥基類固醇脫氫酶(11B-HSD1)的下調(diào)和該信號途徑的假定抑制劑如FK506結(jié)合蛋白5(Fkbp5)的上調(diào)來實現(xiàn)(見圖4)。
組織糖皮質(zhì)激素濃度不僅由血漿激素水平?jīng)Q定，而且由兩種胞內(nèi)11β-羥基類固醇脫氫酶(1和2型)決定，這兩種胞內(nèi)11β-羥基類固醇脫氫酶局部互變活性糖皮質(zhì)激素和惰性11-酮形式。11β-HSD1(腦中的主要同種型)似乎作為主要的11β-還原酶，從11-酮形式再生活性糖皮質(zhì)激素。通過研究11β-HSD1缺陷小鼠，闡明了通過11β-HSD1的糖皮質(zhì)激素的胞內(nèi)再生在HPA-軸控制中起重要作用。相應(yīng)抑制壓力，這些小鼠表現(xiàn)出放大的ACTH和皮質(zhì)酮水平。此外，11β-HSD1缺陷小鼠對于HPA活化的外源皮質(zhì)醇抑制較不敏感，表明這些動物中減小的糖皮質(zhì)激素反饋?？紤]到CRH過表達(dá)者的海馬中11β-HSD1的顯著下調(diào)，可以想象這些小鼠具有改變的糖皮質(zhì)激素反饋。
發(fā)現(xiàn)在試驗的所有腦區(qū)中Fbp5被上調(diào)，盡管在一些中顯著，所有其他的表現(xiàn)出類似的傾向(圖4)。觀察到親免素Fkbp5和Fkbp4的交換是糖皮質(zhì)激素受體(GR)活化的重要的第一步，這一觀察是有趣的。在松鼠猴和一般地New World靈長類屬中，F(xiàn)kbp5已經(jīng)被鑒定為糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合的強(qiáng)烈抑制劑。我們對Fkbp5的誘導(dǎo)的觀察可被解釋為對循環(huán)的糖皮質(zhì)激素持久高水平應(yīng)答中GR的減弱。
改變的糖皮質(zhì)激素信號化的另一指征是小腦、伏隔核和顳區(qū)中血清/糖皮質(zhì)激素激酶(Sgk)的上調(diào)(圖4)。Sgk是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶，其轉(zhuǎn)錄被糖皮質(zhì)激素和血清誘導(dǎo)并且受到不等滲和等滲細(xì)胞體積變化的調(diào)節(jié)。在大鼠腦中，已經(jīng)表明顳葉(包括海馬)中脫水增加Sgk mRNA水平。在同一研究中，闡明Sgk顯著增加了神經(jīng)元K+通道Kvl.3的活性，表明Sgk可能參與神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)。有趣的是Sgk促進(jìn)大鼠中空間學(xué)習(xí)的記憶鞏固。表明Sgk在快速學(xué)習(xí)者對緩慢學(xué)習(xí)者中差別表達(dá)，此外還闡明Skg轉(zhuǎn)染到海馬的CA1區(qū)導(dǎo)致水迷宮成績提高(10)。在該方面，顯著的是盡管該研究闡明CRH過表達(dá)者表現(xiàn)出高水平Sgk mRNA，但是已經(jīng)報導(dǎo)這些動物表現(xiàn)出高度學(xué)習(xí)不足(11)。
發(fā)現(xiàn)在除了垂體之外的包括海馬和伏隔核的一些腦組織中神經(jīng)降壓肽受體2(Ntsr2)被下調(diào)(見圖5)。神經(jīng)降壓肽(NT)是一種十三肽，其被發(fā)現(xiàn)以高濃度存在于CNS的許多區(qū)域，其中其發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的角色。當(dāng)NT被通過腦室內(nèi)注射施用時，觀察到各種CNS效應(yīng)，包括低行動、低溫、痛覺消失和食物消耗減少。已經(jīng)鑒定了NT的三種受體(Ntsr1、2和3)。Ntsr1缺陷小鼠的研究表明該受體是NT對體溫、進(jìn)食行為和低行動的效應(yīng)的原因。Ntsr2另一方面似乎是NT的痛覺消失效應(yīng)的原因，如通過在小鼠腦中應(yīng)用反義策略所闡明的。Ntsr2下調(diào)的觀察促使我們通過RTq研究NT受體家族的其他成員的表達(dá)水平。在所有試驗的區(qū)域中Ntsr3不表現(xiàn)出表達(dá)變化。相比，Ntsr1在CRH過表達(dá)中被顯著下調(diào)，該效果在海馬中最明顯(圖5)。下調(diào)水平對于Ntsr1比對Ntsr2更高。顯著的是與未處理的動物相比媒介物處理的動物(tg和Wt)中Ntsr1和Ntsr2都被上調(diào)。表達(dá)水平的這種增加在R121919處理的動物中被消除，表明反復(fù)緊張誘導(dǎo)的Ntsr1的表達(dá)(Ntsr2程度較小)并且該誘導(dǎo)可以被CRH-R1拮抗劑逆轉(zhuǎn)(甚至最后處理后16小時)。我們的數(shù)據(jù)第一次表明CRH過表達(dá)動物中CRH和NT系統(tǒng)之間的聯(lián)系并提出這些NT受體在反復(fù)緊張中的角色。
為了評價蛋白質(zhì)表達(dá)水平上Nts1和Nts2mRNA的變化，我們通過結(jié)合在腦切片上的[125I]NT的放射自顯影評估了受體表達(dá)(Nts1-3)。所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)闡明了在CRF-OE對WT動物中與海馬的CA1-CA2區(qū)(21.8±3.0％，p＜0.05)和前扣帶皮質(zhì)(-22.2±2.7％，p＜0.05％)接近的放射層中總體上非選擇的(Nts1-3)、遺傳確定的[125I]NT結(jié)合能力的下調(diào)(圖6)。在嗅球、伏隔核和隔膜中沒有觀察到變化。
WT和CRF-OE動物中，與未處理的動物相比，媒介物處理的動物[125I]NT結(jié)合能力沒有改變。然而，CRF1拮抗劑R121919的亞慢性施用導(dǎo)致在WT和CRF-OE動物中與媒介物處理的動物相比，對鄰接CA1-CA2區(qū)域的放射層的[125I]NT結(jié)合能力的向上的趨勢(p＝0.057)。此外，R121919處理的CRF-OE動物中[125I]NT結(jié)合水平等于在未處理的WT-動物中測量的水平(圖6)。
為了區(qū)別不同的受體，在飽和濃度的左卡巴斯汀(一種Nts2特異拮抗劑)存在下實施[125I]NT結(jié)合實驗。基于前面的結(jié)合實驗的結(jié)果，我們集中于海馬腦切片(圖7)。與WT動物相比，在CRF-OE中，放射層(-63.8±6.5％，p＜0.001％)、retroslenial粒狀皮質(zhì)(-49.4±7.5％，p＜0.001％)和額葉皮質(zhì)(-34.8±3.5％，p＜0.001％)中[125I]NT結(jié)合能力被下調(diào)。
盡管在WT和CRF-OE媒介物處理的小鼠的海馬中，Nts1 mRNA水平被上調(diào)(圖5)，但是在[125I]NT結(jié)合水平上在載體處理的動物中沒有觀察到這種改變(圖6和7)。當(dāng)與WT動物相比時，CRF-OE中海馬和前扣帶皮質(zhì)的放射層中對Nts1-3的總體[125I]NT結(jié)合能力被下調(diào)(圖6)。此外，當(dāng)我們用Nts2特異拮抗劑左卡巴斯汀封閉Nts2受體時，與WT-同窩出生仔畜相比，CRF-OE動物中海馬、retrosplenial粒狀皮質(zhì)和額葉皮質(zhì)的放射層中[125I]NT結(jié)合能力被下調(diào)地甚至更顯著(圖7)。雖然Nts3也在所提及的區(qū)域中表達(dá)，但是Nts3對NT的親和性比Nts1對NT的親和性的低的多，表明[125I]NT主要結(jié)合到Nts1。此外，由于在Rtq中沒有看到Nts3 mRNA中的變化，我們將該下調(diào)完全歸因于Nts1。
驚人地，在載體處理的CRF-OE和WT動物中Nts1(Nts2較不顯著)mRNA表達(dá)被上調(diào)。該mRNA增加可能被反復(fù)注射壓力所誘導(dǎo)并且通過CRF1拮抗劑R121919的亞慢性施用可以抵消。然而，這沒有在受體水平上被翻譯。在未處理的和載體處理的WT和CRF-OE小鼠中[125I]NT表現(xiàn)出對Nts1的相當(dāng)結(jié)合(圖6，7)。然而，在總NT結(jié)合水平上，R121919抵消了[125I]NT結(jié)合的下調(diào)。在CRF-OE中，R121919將放射層中[125I]NT結(jié)合水平增加到等于未處理的動物中的水平(圖6)。這可以暗示CRF1受體與NT受體的表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)。
以前的報導(dǎo)表明糖皮質(zhì)激素增加原代下丘腦神經(jīng)元培養(yǎng)物和室周下丘腦核(PVN)中NT mRNA表達(dá)(+92％)和NT-釋放(+100％)(Nicot等人，1995；Scarceriaux等人，1995；Souaze等人，1997)。有趣地，不同的應(yīng)激子像在冷水中強(qiáng)迫游泳一樣，固定壓力和尾巴振動壓力也引起大鼠的PVN和中央扁桃體核中NT mRNA的增加。輪到NT時，其可以導(dǎo)致HPA-軸活化，如通過腦室內(nèi)施用所闡明的。該活化可被α-螺旋CRF(一種非特異的CRF拮抗劑)和SR-48450(一種Nts1-2拮抗劑)所封閉(Azzi等人，1998；Lepee-Lorgeoux等人，2000；Nicot等人，1994；Rowe等人，1995)。高NT水平也下調(diào)Nts1和Nts2(Hermans和Maloteaux，1998)。可以提出CRF-OE中Nts1-2的所觀察的下調(diào)與它們上升的糖皮質(zhì)激素水平有關(guān)。該觀點(diǎn)可被如下觀察支持皮質(zhì)醇過多癥或者地塞米松施用導(dǎo)致PVN中Nts1 mRNA的選擇性下調(diào)(40-70％)(Nicot等人，1995)并且地塞米松減少了原代下丘腦神經(jīng)元培養(yǎng)物中[125I]NT結(jié)合(Scarceriaux等人，1996)。從而，Nts1-2下調(diào)可能因此防止進(jìn)一步NT-誘導(dǎo)的CRF釋放。一并考慮，這些數(shù)據(jù)證明了邊緣腦區(qū)中HPA-軸和NT-系統(tǒng)之間明顯的聯(lián)系。因此NT-系統(tǒng)除了以前提出的在精神分裂癥和疼痛抑制中的角色，在反復(fù)壓力和焦急中也有調(diào)節(jié)作用。
受影響的其他途徑包括細(xì)胞內(nèi)鈣信號/感覺(hippocalcin樣1、鈣周期蛋白，...)、成髓鞘(髓磷脂、髓鞘相關(guān)糖蛋白，...)、細(xì)胞增殖和神經(jīng)發(fā)生(Edg2、Id2、GAB1，...)和胞外基質(zhì)形成(核心蛋白聚糖、brevican，...)。
Hippocalcin樣1(Hpcall)屬于神經(jīng)元鈣傳感家族的Ca2+-結(jié)合蛋白，它們在各種過程中起作用，這些過程包括神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)、環(huán)核苷酸代謝的控制、磷酸肌醇的生物合成和離子通道的間接調(diào)節(jié)。已經(jīng)闡明hippocalcin可能加強(qiáng)保護(hù)以防止神經(jīng)元凋亡抑制劑(IAPs)蛋白施加的凋亡。
在編碼與髓鞘形成、細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)形成有關(guān)的蛋白質(zhì)的基因中觀察到的表達(dá)的改變暗示CRH過表達(dá)者中神經(jīng)發(fā)生的動力學(xué)中的改變。支持該觀點(diǎn)的是主要在伏隔核中觀察到的表達(dá)的改變，包括內(nèi)皮分化溶血磷脂酸G-蛋白-偶聯(lián)的受體2(Edg2)、生長因子受體結(jié)合的蛋白質(zhì)2-相關(guān)的蛋白質(zhì)1(Gab1)、DNA結(jié)合2的抑制劑(Id2)和成纖維細(xì)胞生長因子受體2(Fgfr2)。
由于垂體是CRH的主要靶器官，預(yù)期如存在于CRH表達(dá)者中CRH的長期上升的水平誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因動物的垂體中表達(dá)譜的較大改變。垂體的活化狀態(tài)由一些激肽釋放酶的高表達(dá)水平例證，這些激肽釋放酶在從垂體分泌的各種激素的加工中作為原蛋白質(zhì)協(xié)同酶(proproteinconcerting enzymes)發(fā)揮作用。顯著的是前腦啡肽原A水平的升高(Tg中比Wt中高10倍)和強(qiáng)啡肽原水平較低程度地升高(Tg中比Wt中高2倍)。該發(fā)現(xiàn)，即CRH過表達(dá)者中內(nèi)源阿片樣物質(zhì)的升高的水平符合如下觀點(diǎn)，即這些阿片樣物質(zhì)代表生物適應(yīng)慢壓力的主要調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其平衡應(yīng)激物置于腦上的應(yīng)答，持續(xù)的壓力應(yīng)答可能產(chǎn)生潛在有害的效果。垂體中其他有趣的發(fā)現(xiàn)包括Bdnf mRNA水平的升高，Bdnf是腦中最普遍的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，和囊狀抑制性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Viaat)的升高。該Bdnf的升高與急性和慢性壓力降低海馬中Bdfn水平的報導(dǎo)(11)形成對比。
總之，CRH過表達(dá)小鼠的一些腦區(qū)的基因表達(dá)譜闡明了存在于這些動物中的以前未認(rèn)識到的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定機(jī)制。
與野生型同窩出生仔畜相比CRH過表達(dá)小鼠中變化的基因的鑒定容許該慢性垂體-腎上腺活化的動物模型的進(jìn)一步分子表征。我們提供了在基因表達(dá)水平上評價長期暴露于CRH的后果的工具，其可以最終導(dǎo)致動物和人類中緊張、焦慮和抑郁癥中新的標(biāo)記物的使用。此外，我們闡明CRH-R1拮抗劑的施用不導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)水平的總的“正態(tài)化”，盡管檢測量垂體水平上該化合物的一些影響。此外，該治療造成的反復(fù)壓力似乎在特定基因如神經(jīng)降壓肽受體1的基因表達(dá)中引起應(yīng)答。該效應(yīng)可通過CRH-R1特異拮抗劑逆轉(zhuǎn)，表明神經(jīng)降壓肽和CRH之間的密切聯(lián)系。
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序列表序列表SEQ ID NO.1tttttttttttttttttaccaaaaatatcattttattctttaatggaaaaaggcattaatattcaaacaaaggaatcacattttaataaccctatagataagaaacaggctccaggaacattcaagcagcagtcatgagggaaaaatgtttcaatagcccagttttcttcaSEQ ID No.2tttttttttttttttttccaaacttaacgttttttttaatttagaatataatttttaacacaaaagcagttcattttattcagcaaaataaatttaacaagttcatttaaataaggtaaattctagactctgtaactttttttttccttagctacttgcttttctgccccttggaatccatagctgctatactaggttgctttccaaggtaacacagctgtaagggaaggaactgttcattcattcatatatatatatatatatatatatatatatatatatatataatttgaatgactcaaatacacccacgttctcattcaaccaccagtgtgtttagtgaagcagaaggagggagcacagggaSEQ ID No.3tttttttttttttttttggacatgaagtgtgtttattaggaagaacactccaagcactcacaaatggctttcacaaacacttagcctaggctggaacacaaaaggatatcacaacagagtccattgggttttacttgcttacatcaccaaagaatgttcatggcagttaattttcaggctgtaaaaactacatctatggcaccaacatggSEQ ID No.4atatttaactcaaggcagaggaaagattatcccagctaataattccattcagctgatgaaatacttgattattagagagcagtcccaataagcagctttaagttttccgtattcattttaaacatcagtgcattaccttcaatatggtaaagatgtttttttcagttgaatggttcatattttggtgcagtgtttgatgttcacaaaaaaaatgttacaataataaactaacataSEQ ID No.5gaaggcaaagatcatttgcatgttttatttaaaagtaaacagctgttaagataagagggcagatgttttctttattgtaaagacagcagttacaaaagagttacaagttacaagtcaaataaatatgacattaagaatttttggttttggttttgttaaaaaatacaacacccccctccccaggtatttgtgagaagtcccaagaaactcaagatacaaaaatctgtctcatgggcgagaatacatttctttcagttctctggaactgnttgtcagacacgggaatttggtcatgatttcaaaagaSEQ ID No.6tttttttttttttttttggntttatcacatttattgttacatttatttaattttttttgcagtaatagatgaggcacaaacacctcctgcttctccatcactgcaacagaaaggacaatagtcaagggtaacagtgaaattaaaaaaaaaaaaaaaaatacaaacgcctaaggtctgggagaaacctgactacaatctacgtggagaaacttgtaaatgactccagcctggtcttccgattgcaccacttcacagaccacagaggaggggtgtcccagcagaaaggacacagccaggctcagctcgccagggtggtgggcctctgcccatccacctgcgttctgctcagctagctcaagttcacatcttgctactcacatgctgccttctggttttcaaagtgactggacaaacggtcagtctcctcgtgccgSEQ ID No.7gtggcaacacaggaaactcacagaccttggtttattagattattttaatatgccagaccaatagaaaggaaggacggagcacacaggaacacctgtgtttgcaggacagagggcagatgtccacagccttgggcatgcatgtatctcctgtgtaattaggcaaatgaatacttaaataccacacaaccgccagacttgggggtggggagaatcacaggccacaggggaccatgctttaaaggcagtcagaggctttaaatacaggggctgaaaccttctcactttatacaaaacttatatattaaaagtaaggataccacggtatatacatgcaagcagctttggttggagaaaaatgaccaagggaggtggagcctgaataggaagggcntgccatataatgtctatcttcttcatcctcacaaagtcacctgggattatagaataaatcagctggtctcagtaagatattgaaaagtccngtctggtgtcctaagtgcttaaangccnccgtnggcagggaagggnccttttncgagatactgaaacctngaaggaacagctggactnngattgtgggtgactSEQ ID No.8tttatttgatcattttaatatgccaggtcaatggaaaggaaggacagagcacacaggaacacctgtatttgcaggacggagggcagatgtccacagccttgggcatgcatgtatctcctgtgtaattaggcaaataaatacttaaataccacagcacagccagacttgggggtgggggggaatcacaggccacaggggaccatgctttaagSEQ ID No.9
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SEQ ID No.19ggatgagacagaaggatagagaggaggagagagagagagagaagagaagcaaccagaaataggcagccaataaaaaggagccgcacttatctgaagcctcaaggggcctgagccaggtccctgtttgatggcagttatgaaaaattacctcctcccgatcctggtgctctccctggcctactactactattctacaaatgaagagttcagaccagaaatgctccagggaaagaaagtgattgtcactggggccagcaaagggattggaagagaaatggcatatcatctgtcaaaaatgggagcccatgtggtattgactgccaggtcggaggaaggtctccagaaggtagtgtctcgctgccttgaactcggagcagcctctgctcactacattgctggcactatggaagacatgacatttgcggagcaatttattgtcaaggcgggaaagctcattgggcggactggacatgcttattctaaaccacatcactcagacctcgctgtctctcttccatgacgacatccactctgtgcgaagagtcatggaggtcaacttcctcagctacgtggtcatgagcacagccgccttgcccatgctgaagcagagcaatggcagcattgccgtcatctcctccttggctgggaaaatgacccagcctatgattgctccctactctgcaagcaagtttgctctggatgggttcttttccaccattagaacagaactctacataaccaaggtcaacgtgtccatcactctctgtgtccttggcctcatagacacagaaacagctatgaaggaaatctctgggataattgacgccctagcttctcccaaggaggagtgcgccctggagatcatcaaaggcacagctctacgcaaaagcgaggtgtactatgacaaattgcctttgactccaatcctgcttgggaacccaggaaggaagatcatggaattttttcattacgatattataataaggacatgtttgtaagtaactaggaactcctgagccctggtgagtggtcttagaacagtcctgcctcatacttcagtaagccctacccacaaaagtatctttccagagatacacaaattttggggtacaccttcattcatgagaaattcttgcaacacttgcacagtgaaaatgtaattgtaataaatgtcacaaaaccactttgggcctgcagttgtgaacttgattgtaactatggatataaacacatagtggttgtatcggctttacctcacactgaatgaaacaatgataactaatgtaacattaaatataataaaggtaatatcaacttcgtaaatgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaSEQ ID No.20MAVMKNYLLPILVLSLAYYYYSTNEEFRPEMLQGKKVTVTGASKGIGREMAYHLSKMGAHVVLTARSEEGLQKVVSRCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFIVKAGKLMGGLDMLILNHITQTSLSLFHDDIHSVRVMEVNFLSYVVMSTAALPMLKQSNGSIAⅥSSLAGKMTQPMIAPYSASKFALDGFFSTIRTELYITKVNVSITLCVLGLIDTETAMKEISGIIDALASPKEECALEIIKKGTALRKSEVYYDKLPLTPILLGNPGRKIMEFFSLRYYNKDMFVSNSEQ ID No.21ggagatcaggccaccacgagacagagatggagaccagcagcctgtggcccccgaggcccagccccagtgcagggctgagcctggaggcgcggctgggcgtggacactcgcctctgggccaaggtgctgttcaccgcgctctattcgctcatcttcgcgcttggcacagccggcaatgcgctgtccgtgcacgtggtgctgaaggcgcggacgggtcgccccgggcgcctgcgctaccacgtgctcagcctggcactgtcagccctgctgctactgctgatcagcgtgcccatggagctctacaacttcgtgtggtcccactacccctgggtcttcggcgatctcggctgtcgtggctattacttcgtgcgcgagctgtgcgcctacgccacggtgctgagcgtggccagcctgagcgcagagcgctgcctggccgtgtgccagccgctgcgcgcccgccgcctgctcaccccgcgccgcacctgccgcctgctgtcactggtctgggtcgcctctctgggccttgccctgcccatggcggttatcatgggacagaagcacgaaatggagagggccgacggggagcctgagcctgcctcgcgtgtgtgcacggtgctagtaagtcgcgccagctccaggtctacattccaggtgaaacgtgctggtctccttcgttctcccctttgggaactcactgctattctgaatgggatcactgtcaaccacctggtggccctctactcccaggtaccatcagcttctgcccaagtcaactccatccccagccgcctggagctcctgagtgaggaaggcctcctgggcttcatcacatggagaaagaccctctccctgggggtccaagccagcctggtgagacacaaggatgccagccagatccgcagcctccagcacagcgcccaggttctcagagccatcgtggctgtgtatgtcatctgctggctgccgtaccatgcccgcaggctcatgtactgctacatccccgatgatggatggactgatgagctctatgacttctatcactatttctacatggtgaccaacacgctcttctatgtcagctcggcagtgaccccagtcctctacaatgccgtgtcttcctccttcagaaagctctttctggaatctctcagttccctgtgtggtgaacagcgctccgtggtgcccttaccccaagaagccccagagtcaactactagtacgtacagtttccggctttggggatccccaagaaaccccagcctgggtgaaatacaagtgtgaagagaacaaacaatggctgcttgggacacacccatcagataagccatgccattactaacagtctaagcggacctactgacccagcgcagtcattgaccagtgcatactgcaggcaagccacgtaacacctcctgccctcagcttcccacctgtgcaaccaaggtgtagaataggacaaattgcctagtgatgaaggtgcccagtgccagcctggtacagaaccagtactccataaatttttagctggtgctatttttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaSEQ ID No.22METSSLWPPRPSPSAGLSLEARLGVDTRLWAKVLFTALLYSLIFALGTAGNALSVHVVLKARTGRPGRLRYHVLSLALSALLLLLISVPMELYNFVWSHYPWVFGDLGCRGYYFVRELCAYATVLSVASLSAERCLAVCQPLRARRLLTTPRRTCRLLSLVWVAASLGLALPMAVIMGQKHEMERADGEPEPASRVCTVLVSSRASSRSTFQVKRAGLLRSPLWELTAILNGITVNHLVALYSQVPSASAQVNSIPSRLELLSEEGLLGFTTWRKTLSLGVQASLVRHKDASQIRSLQHSAQVLRAIVAVYⅥCWLPYHARRLMYCYIPDDDGWTDELYDFYHYFYMVTNTLFYVSSAVTPVLYNAVSSSFRKLFLESLSSLCGEQRSVVPLPQEAPESTTSTYSFRLWGSPRNPSLGEIQVSEQ ID No.23
ggcgctcgccctcgctcgccatggagaagaccgagctgatccagaggccaagctggccgagcaggccgagcgctacgacgacatggccacctgcatgaaagccgtgacggagcagggcgccgagctgtccaacgaggagcgcaacctgctgtcggtggcctacaaaaacgtggtagggggccgcaggtccgcctggagggtcatctcgagcattggagcagaagaccgacacctctgacaagaagttgcagctgatcaaggactatcgggagaaagtggagtcggagctgaggtccatctgcaccacggtcctggaattgttggataagtatttaatagccaatgcaactaatccagagagtaaggtcttctatctgaaaatgaagggagattatttccggtatcttgctgaagtagcttgtggcgatgatcgaaaacaaacaatagaaaattcccaaggagcctaccaagaggcgtttgatataagcaagaaggagatgcagcctacgcatccaatccgcctggggctggctctttaacttttctgtattttactatgagatccttaataattccagagcttgcctgcacactggctaaaacggcttttgatgaggccatcgcagagcttgatacactgaacgaagactcctacaaagacagcaccctcatcatgcagttgcttagagacaacttaacattatggacatcagacagtgcaggagaagaatgtgatgcagcagagggggccgaaaactaaaccSEQ ID No.24MEKTELIQKAKLAEQAERYDDMATCMKAVTEQGAELSNEERNLLSVAAYKNVVGGRRSAWRVISSIEQKTDTSDKKLQLIKDYREKVESELRSICTTVLELLDKYLIANATNPESKVFYLKMKGDYFRYLAEVACGDDRKATIENSQGAYQEAFDISKKEMQPTHPIRLGLALNFSVFYYEILNNPELACTLAKTAFDEAIAELDTLNEDSYKDSTLIMMQLLRDNLTLWTSDSAGEECDAAEGAENSEQ ID No.25tttttttttttttttttcccatcccctgctggctttattactgggcaggggaaacagatccttggcagtggtaggactgagagtacaagagttggaagccctggggctcagctttcactaggcagggtgggcacactagcaagtgcagagaggaggcctgtatatatgtcaaccccacggagaaatatatcctcatgcagccgttcattatggtcatgtagcaggacaggtgtgcggttcatgggcgagaagcccagagctgggatccccaccgcccggataaagcggctgtcagtggcagcaggaaagatctctggctccagagtgaggttcattgccttgcaggctccgctgaaagctgcccaccagggatctgaatcatccgtgggtgtcattcgaggctctgtaaacttctgaSEQ ID No.26gccatcaatgctttattccttcatctctgtcctgtccaacactagtgaacacacacctctggctcattaaggaagtgacatgcagatgagcaactaggatagaaacatcattcacacactctttctcaggtgttttcctccggtgcacactcacacgagtttgcacatactataagcctgaataatgatgcccattatctgcacagggtaaaactgattccatactggtgcaacctggtggaagtcttcaggacacttaacaaaattatattctgattatttcattttctagatttggggatgaaaatagaaaagaatataaacaaagcatgctttttgaggtttcttgggtcagttagtagaaaaataggtgttttctttgagaggtttttttaattgtttatcttattttatttttaagtggagaactgtgaaactggaattcctgaggtttttttttccccacttcatcagtctttaagagagtggtaggctttggcagtcccgctgttgacaaagtctgttttcttaaactgagccttcttataggcgtgatgcagctctgtatgtgcccacagagagtaaaggaggacagaagctgctttgcttgccttngtggggcatagcctttccctatgctgatgtcatattttctgcaaaacctcgggtccagagggctcgtgcattctggtaactattttgcattaaatgttcaacSEQ ID No.27gtgacaggacgcctcccccacacccatattctaagctttatcttctagtagcctgagggctggagagaggtagtttctgccggattgtgtcatctggagtcgttcctgtggcctcctttttctctggtttttgcattttttcttggtccgatgaaagcatttcctttttctaaccaataaagtgatcgctttcagcaatggSEQ ID No.28agcaatgaatgtggaacatgaagttaacctcctggtggaggaaattcatcgcctgggttccagaaatgctgatggaaaattaagtgtgaagtttggggtcctcttccaggatgacagatgtgccaatctctttgaagcgttggtaggaactctgaaagctgcaaaacgaaggaagattgttacatacgcaggggaactacttttgcaaggtgttcatgatgatgttgacattgtattgctgcaagattaatgtggtttgcatggcttggtgtatctgataaactggaataactaagttaagagactagcgtgaatttccttatgtattttttagaactttgtaaacaaaggggggcttgttgagaagtcctgttttataaccttgaagcaaaacattacaatgtaaaatgagacaaacctattatttttcttaagaaggtaatttgggaaatgtaggtaatgaaacatttttttgggaggtgtgaaaaagcSEQ ID No.29attggtgcatgtgtgtttgctagctcacttgtccatgagaatattttatgatattaaagaaaacctttttgaaatggctgcttttcaaagaagataattcatggcttctcatttttcagtctcttcaaaagtgtggctggcctgttttatgactgcagagttgttatgttttttaattttgaatattgcctattaaagataggacaaacttggagattatgatgttgcttggcacagactgtattaaaacaacactcccgtgaSEQ ID No.30
ctggcacggacatggctgtcttctgtctgctgtgtgggaaacgctttcaggcacaaagcgcactccagcagcacatggaggtccacgcaggcgtgcgcagctatatttgcagtgagtgcaaccgcaccttccccagccacacggctctcaagcgccaccttcgctcacatacaggtttttttctccatgtgtcaccaagtgaagtttgtgccttctatagcaaagagaatattttttacatcctactaacagtagatttttttgtagtgaacattttttgtatttttatttataagtctcataagaaaaatagcgatgttcagttgtataccttgaatctgcagttagaagagaataaagttaactcSEQ ID No.31tttttttttttttttttgcaagagtaaaagtctttaatttactgtgcacctcagaaagctacaagtaaaatgtttgtaagaatatacacaaagaattcagagtataaaattctccatgtaattagtagtcatattaatattagaactacagtagaaaaaaatagctgtctcctagattctcccaggagcctaactgtgtggctttgagaaggtggagttgttctgagtgagcgggaagtcaaagctcactcctccagttctcccagcagctccacgaagtcagtgatgtaccacttggcgttgtccttaacctgctgcctgatcacattgcctccaaagccaatgaaagcatcagSEQ ID No.32ggggcgggacgacggcgggcgctgcccggcgcactagccggcttgcgggcgctgccagtctccggcggcggtgtccggcgcgcggctgagcgaccgagcgtgcggacggagcggcggcctgctgggcgggctgagcggcgcgcgcggcggcggagagacgcggagcgagggacgcggcggcggcggacgcggcgacaggtcttctacttacaaaggaccaatgactactgatgagggcaccagtaacaatggagagaacccagcagccaccatgactgagcagggtgaagatatcactacgaagaaagacagaggagtattaaagattgtcaaaagagtggggactagtgacgaggccccaatgtttggtgacaaagtttatgtccactacaaagggatgttgtcagatggaaagaagtttgattccagtcatgacagaaagaagccatttgcctttaagccttggccaaggccaggttatcaaagcctgggacattggggtgtctactatgaagaaaggcggaatctgccatttattatgtaaaccagaattatgcttattggctcggctggccacctccaaaaaattccatcaaatgcaactctcttttttgagattgagctccttgatttcaaaggtgaggatttatttgaagattcaggcgttatccgtagaatcaaacggaaaggcgagggatactcaaacccaaacgaaggagcaacggtaaaagtccacctggaaggctgctgtggtggaaggacatttgattgccgagatgtggtgttcgttgttggggaaggagaagaccacgacattccgattgggatcgacaaagcccctggtgaagatgcagagagaagaacagtgtattctatatcttggaccacgctatggttttggagaagccgggaagcctaagtttggcattgaccccaatgctgagcttatgtacgaggtcacccttaagagcttcgagaaggccaaagaatcttgggagatggacaccaaagaaaagctgacgcaggctgccatcgtgaaagagaagggaactgtgtacttcaagggaggcaagtacacgcaggccgtgattcagtacaggaagatagtgtcctggctggagatggaatacggcctgtcagagaaggagtccaaagcctcagagtcgttcctcctcgcagccttcctgaacctggccatgtgctacctgaagctccgagagtacaacaaagccgtggagtgctgcgacaaggcccttggactggacagtgccaatgagaaaggcttgtacagaaggggcgaggcccagctgctcatgaatgactttgagtcggccaagggcgacttcgagaaggtgttggcagtcaatcctcagaacagggccgctcgcctgcagatctccatgtgccagaggaaggcgaaggagcacaacgagcgggaccgcagggtgtacgccaacatgttcaagaagttcgcagagcgggacgcaaaggaggaagccagcaaagctgggagcaagaaggctgtagaaggagccgctggcaaacaacacgagagtcaggccattggaagaaggaaaggccaaaggccatgtatgacgctgcgccacggagggaagagagtcctaatgaactcggccctcctcgctgggctcgcctccaactcaggactgaacagtgtttagtgtaaggtttgttacagtctctgtgattctggaagcaaatggcataccagtagcttcccaaatgaccacctgctgctgcgggggggtgggggtgggggacatgccaggaaacagcagagaaggccgctggtgtgaagagaccaggccagcagctcagtccagcccatttcagtttgtcacctttcagtgtccagcacagcatccctgtgaacctagggcccagctgctgtgggttctacatcggcactagggtcacactgcagaaaccgttgataaaacaaactcagtgatctctgctttccctattggtgggcatggcaggggcgggtgatgagatttgcttagcactgactgactggcctgctaagaacacaagcccacagccaggggctccctggtccacagctgggtctcaggccccttacctgccttccaagtcctttcgcagactcttgagtgtggctttctgtcctagcagcatgtcccacagactctgttgttcctccaacgcccgtcattagtgacagctttctctctgagtttctgtggtgtggagagtgggtagaagtaggtttatctttcccgctgtctgccccactcaaggacgatSEQ ID No.33MTTDEGTSNNGENPAATMTEQGEDITTKKDRGVLKIVKRVGTSDEAPMFGDKVYVHYKGMLSDGKKFDSSHDRKKPFAFSLGQGQVIKAWDIGVSTMKKGEICHLLCKPEYAYGSAGHLQKIPSNATLFFEIELLDFKGEDLFEDSGVIRRIKRKGEGYSNPNEGATVKVHtEGCCGGRTFDCRDVVFVVGEGEDHDIPIGIDKALVKMQREEQCILYLGPRYGFGEAGKPKFGIDPNAELMYEVTLKSFEKAKESWEMDTKEKLTQAAIVKEKGTVYFKGGKYTQAVIQYRKIVSWLEMEYGLSEKESKASESFLLAAFLNLAMCYLKLREYNKAVECCDKALGLDSANEKGLYRRGEAQLLMNDFESAKGDFEKVLAVNPQNRAARLQISMCQRKAKEHNERDRRVYANMFKKFAERDAKEEASKAGSKKAVEGAAGKQHESQAMEEGKAKGHVSEQ ID No.34atggcgtggtccaggctgatgctggcagcttgcctcctcgtgatgccctctaatgttatggcggactgcctgtccctgtgctccctgtgtgcagtgaggattcaggatgggccccgtcccatcaaccccctgatttgctccctggagtgccaggacctggtgccgccctcagaggagtgggagacatgccggggcttctcatcttttctcaccctgacggtctctgggctccgtggcaaggatgacttggaagatgaggttgctttggaagaaggcatcagtgcacatgccaagctcttggaacccgtcctgaaggagctggagaaaagccgactccttaccagcgtcccagaggaaaagttcaggggtctctccagcagctttggcaacgg
aaaagaatctgagctggcgggtgctgaccggatgaatgatgaagccgcacaggggcgcaccgtccattttaatgaggaggacttgagaaaacaggccaaacgctatggcggctttttgcgcaaataccccaagaggagttccgagatggcccgggatgaggacgggggccaggatggggatcaggtagggcatgaggacctgtacaaacgctatgggggcttcctgcggcgcattcgccccaagctgaagtgggacaaccagaagcgctatggtggtttcctgcggcgtcagttcaaggtggtgacgcggtcccaggagaaccccaatacctattctgaagatttagatgtttgaSEQ ID No.35MAWSRLMLAACLLVMPSNVMADCLSLCSLCAVRIQDGPRPINPLICSLECQDLVPPSEEWETCRGFSSFLTLTVSGLRGKDDLEDEVALEEGISAHAKLLEPVLKELEKSRLLTSVPEEKFRGLSSSFGNGKESELAGADRMNDEAAQGRTVHFNEEDLRKQAKRYGGFLRKYPKRSSEMARDEDGGQDGDQVGHEDLYKRYGGFLRRIRPKLKWDNQKRYGGFLRRQFKVVTRSQENPNTYSEDLDVSEQ ID No.36gacagggcgccctcggaaggacaggatgtcatcaggaaaacaggactccccgtgggaagataggatacctccaggaagatagaatagtcccaggcatcactagaacagcaggaaacactagggtccaagctctcattgaggcacccggggaggttgttgggttgtgggcggggctcaggaaagactgtccctgctggtcctgatccacgaccacccacccggcaaggttctctctaagagaaccttgtcagagacagaacgggtccctacaggcgcgttcttctctcctacagcccatggcgcggttcctgaggctttgcacctggctgctggcgcttgggtcctgcctcctggctacagtgcaggcggaatgcagccaggactgcgctaaatgcacgtaccgcctggttcgcccaggcgacatcaatttcctggcgtgcacactggaatgtgaaggtcagctgccttctttcaaaatctgggagacctgcaaggatctcctgcaggtgtccaggcccgagttcccttgggataacatcgacatgtacaaagacagcagcaaacaggatgagagccacttgctagccaagaagtacggaggcttcatgaaacggtacggaggcttcatgaagaagatgggacgagctatatcccatggagccagaagaagaagcgaacggaggagagatccttgccaagaggtatggcggcttcatgaagaaggatgcagatgagggagacaccttggccaactcctccgatctgctgaaagagctactgggaacgggagacaaccgtgcgaaagacagccaccaacaagagagcaccaacaatgacgaagacatgagcagcaagaggtatgggggcttcatgagaagcctcaaaagaagcccccaactggaagatgaagcaaaagagctgcagaagcgctacgggggcttcatgagaagggtgggacgccccgagtggtggatggactaccagaagaggtatgggggcttcctgaagcgctttgctgagtctctgccctccgatgaagaaggcgaaaattactcgaaagaagttcctgagatagagaaaagatacgggggctttatgcggttctgaagcccttttccagcaggaccccgacccccactagcctgctccatcccccatgagcaactgccttgtcaatgatgtttcttgtcacatgctgctttgtgctgtacagttgcccccgtggtctagataactacactgcctgaaagctgtgattttagggtctgtgttctttttgagtcttgaagctcagtattggtctcttatggctatgttgttatcaatagtttgttacctcatctctcctgacgaaacatcaataaatgcttatttgtataaatataataaacccgtgaccccaactgcSEQ ID No.37MARFLRLCTWLLALGSCLLATVQAECSQDCAKCTYRLVRPGDINFLACTLECEGQLPSFKIWETCKDLLQVSRPEFPWDNIDMYKDSSKQDESHLLAKKYGGFMKRYGGFMKKMDELYPMEPEEEANGGEILAKRYGGFMKKDADEGDTLANSSDLLKELLGTGDNRAKDSHQQESTNNDEDMSSKRYGGFMRSLKRSPQLEDEAKELQKRYGGFMRRVGRPEWWMDYQKRYGGFLKRFAESLPSDEEGENYSKEVPEIEKRYGGFMRFSEQ ID No.38acccacgcgtccggccggtttcactgctcccctcagtctcttttgggctctttccgggcatcgggacgatgaccgtcaaagccgaggctgctcgaagcacccttacctactccagaatgaggggaatggtagcgattctcatcgcttttatgaaacagagaaggatgggcctgaacgattttattcagaagattgccagcaacacctatgcatgcaaacacgctgaagttcagtccattttgaaaatgtcccatcctcaggagccggagcttattgaacgctaacccctctcctccgccaagtccctctcaacaaatcaacctgggtccgtcctccaaccctcacgccaaaccctccgactttcacttcttgaaagtgatcggaaagggcagttttggaaaggttcttctggctaggcacaaggcagaagaagtattctatgcagtcaaagttttacagaagaaagccatcctgaagaagaaagaggagaagcatattatgtcagcggaatgttctgttgaaaggaatgtgaagcaccctttcctggtgggccttcacttctcattccagaccgctgacaaactctactttgtcctggactacattaatggtggagagctgttctaccatctccagagggagcgctgcttcctggaaccacgggctcgattctacgcagctgaaatagccagtgccttgggctatctgcactccctaaacatcgtttatagagacttaaacctgagaatattctcctagactcccaggggcacatcgtcctcactgactttgggctctgcaaagagaatattgagcataacgggacaacatctaccttctgtggcacgcctgagtatctggctcctgaggtcctccataagcagccgtatgaccggacggtggactggtggtgtcttggggctgtcctgtatgagatgctctacggcctgcccccgttttatagccggaacacggctgagatgtacgacaatattctgaacaagcctctccagttgaaaccaaatattacaaactcggcaaggcacctcctggaaggcctcctgcagaaggaccggaccaagaggctgggtgccaaggatgactttatggagattaagagtcatattttcttctctttaattaactgggatgatctcatcaataagaagattacacccccatttaacccaaatgtgagtgggcccagtgaccttcggcactttgatcccgagtttaccgaggagccggtccccagctccatcggcaggtcccctgacagcatccttgtcacggccagtgtgaaggaagcagcagaagccttcctcggcttctcctatgcacctcctgtggattccttcctctgagtgctcccgggatggttctgaaggacttcctcagcgtttcctaaagtgttttccttaccctttggtggaggttgccagctgacagaacattttaaaagaatttgcacacctggaagcttggcagtct
cgcctgcccggcgtggcgcgacgcagcgcgcgctgcttgatgggagctttccgaagagcacaccctcctctcaatgagcttgtgaggtcttcttttcttctcttccttccaacgtggtgctagctccaggcgagcgagcgtgagagtgccgcctgagacagacaccttggtctcagttagaaggaagatgcaggtctaagaggaatccccgcagtctgtctgagctgtgatcaagaatattctgcaatgtgccttttctgagatcatgttagctccaaagctttttcctatcgcagagtgttcagtttgtgtttgtttgtttttgttttgttttgtttttcccttggcggatttcccgtgtgtgcagtggcgtgagtgtgctatgcctgatcacagacggttttgttgtgagcatcaatgtgacacttgcaggacactacaatgtgggacattgtttgtttcttccacattttggaagataaatttatgtgtapctgttttgtaagatatagttaataactaaaacctattgaaacggtcttgcaatgacgagcattcagatgcttaaggaaagcattgctgctacaaatatttctatttttagaaagggtttttatggaccaatgccccagttgtcagtcaaagccgttggtggtttcattgtttaaaatgtcacctataaaacgggcattatttatgttttttttccctttgttcatattcttttgcattcctgattattgtatgtatcgtgtaaaggaagtctgtacattgggttataacactagatattttaaacttacaggcttatttgtaaaccatcattttaatgtactgtaattaacatgggttataatatgtacaattcctcctccttaccacacaactttttttgtgtgcgataaaccaattttggtttgcaataaaatcttgaaacctSEQ ID No.39MTVKAEAARSTLTYSRMRGMVAILIAFMKQRRMGLNDFIQKIASNTYACKHAEVQSILKMSHPQEPELMNANPSPPPSPSQQINLGPSSNPHAKPSDFHFLKVIGKGSFGKVLLARHKAEEVFYAVKVLQKKAILKKKEEKHIMSERNVLLKNVKHPFLVGLHFSFQTADKLYFVLDYINGGELFYHLQRERCFLEPRARFYAAEIASALGYLHSLNIVYRDLKPENILLDSQGHIVLTDFGLCKENIEHNGTTSTFCGTPEYLAPEVLHKQPYDRTVDWWCLGAVLYEMLYGLPPFYSRNTAEMYDNILNKPLQLKPNITNSARHLLEGLLQKDRTKRLGAKDDFMEIKSHIFFSLINWDDLINKKITPPFNPNVSGPSDLRHFDPEFTEEPVPSSIGRSPDSILVTASVKEAAEAFLGFSYAPPVDSFLSEQ ID No.40gaagcagaagagggagaacgagggtgagcacgctgggcagccgtgcgtgcgctcctctctgcgccacaggctcgcccaacgaagcacaagccagcagggtcgcggtcctgaggacatcgctgccacccaggagtgcagagaaccaaccacagaatctggaggtcggtagcagccccgatctaggcaggctcggagccagggggggtgccgaggaagaaccggaaagcagatcccagactctgaaggagaaagaagagtggatccctgagccggcacgtctcgagccccagagctcccaggatctcctggatagctggcttcgccgccggacggcacgccccccttagcttccacaccctctcctctgagcgcctcctcatctgcccctggagggactttcaccttcaaaggtgcaggacaaagccgcatatctggcgcccaccatgcacctcaacagctccgtgcagcagggagccccaagtgaacccggtgcccagcccttcccacatccacagttcggactggagacgatgctcctggcgctcagcttgagcaatggttctggcaattcctcagaatccatcctggagcccaacagcaacctggacgtgaacactgacatttattccaaggtgctggtgaccgctgtatacctggcactttttgtggtgggcactgtgggcaactcggtgacagccttcactctagcgcggaagaagtcgctgcagagcctgcagagcactgtgcattaccacctgggtagcctggcactgtctgacctgctcatcctgctgctggccatgcccgtggagctgtacaacttcatctgggtgcaccatccctgggcctttggggatgctggctgccgtggctactatttcctgcgagatgcctgcacctatgccacagccctcaatgtagccagcctgagtgtggagcgctacttggccatatgccatcccttcaaggccaagaccctcatgtcccgcagccgcaccaagaaattcatcagtgccatatggctagcctcggcgctgctggctgtacccatgcttttcaccatgggcctgcagaaccgcagtgccgatggccagcaccctggtggcctggtgtgcacacccacggtggacacagccaccgtcaaggtcgtcatccaggttaacaccttcatgtccttcctgtttcccatgctgatcatctccatcctaaacactgtgatagccaacaaactgaccgtcatggtgcaccaggctgccgagcagggccgtggtgtgtgcaccgtgggcacccacaacagtttagagcacccacaacagcacgttcaacatgtccatcgagccaggccgtgtccaggccctgcgccatggagtcctcgtcttacgtgctgtggtaatcgcctttgtggtctgctggctgccctaccacgtgcggcgcctcatgttctgctatatctcagatgaacagtgagctacgttcctcttcgacttctaccactatttctatatgctgaccaacgctctcttctacgtcagctcagccatcaatcccatcctttacaacctcgtctccgccaacttccgccaggtcttcctgtccacactggcttgcctctgtcctgggtggcgccgccgccgaaagaagaggccaacgttctccaggaagccaaacagcatgtccagcaaccatgcgttttccaccagcgccacccgggaaaccctgtactaggccatgaggaggtagcctgtgcacagggcagcaactcccccaaccccccacccccaccccaaagcctcccaaggttaagtagtggcccatctaagccatgccggtgaggctggggcaccctcagcggaggcttctttcttcccagtttctctttcttcccttcctctggttctcccctccctagtcctttattcttgccccttatccctctcctacctccacctttaaaaacagaaaagaggcggtttctctcctggccctacaaaaggcctttaacaagaagaaattagcactcaccaaggacggtctcctttgttcccagactaatggatgttttagagcaagaaatgaaagcaccacattgggcctggacagatgagctgttgtaaccataacagcaccttggaactgcactggcagggcgagacagtgtctgatgttggacttgggttcagagacacaggctccatctcagcccctttatgcctctactcctgccctggtccagcagataccatagcactctctgagccttatgtccagaccctttcttggcaggctggtacactgcccttcccagagtggtccagagaagccccaaaattactgtgtaaggtccagggcccacagctggaagctgtgggaatccatgccacacctggatggctatggcccactaaagagaccccaattcccacatgcccaggaaggataaaagggctggcctggaatcaacacaggacaagcttcaagtggctttgcacggggaccttcacctcttggatctgcagaaggatggaagataagtggggtccagcctccccagtccaggtggctttgctggggacatgcatggttctgcgtctcatatacagatgtatagactaaggtctgacagcagctggcttcaggctgggacttctgagaaggggcactgagccaggtcctcagcaagatgccagtgtctgagactccacaggtaaggggaggccaagcaccccagcatctagctggccagcagccctggactgaggcatatgtcaatttgttaaccagccgccaagcagccaccctggcccaggttctaggcgcctggaaaagcaggcacccttcatctctgggagctgtctccaaacaagacaggcccattcagcctccagccaaccaagctggctgggcacttggagacagtcccaggatgccatgcaccaacaaggtagaagtagcaggagagtcaagtgtagccttttgcaaaagagccttagctctgttgtctgggagagagatggctggacatgcagctgctctgtaaggatgaaattgccacgggacatgggaggctcagtcacagcccaggctagcctctgctccctctgaacttaaaacaatgggtgaaaagtcagggtatctgtggtcacccagagaaatggggagggtgttcaagtacttgaaccccacaaaaacactgccactagtaatgtgattcctcaggccatcaag
ggcaggacctgggtgagtccggatcaaggctgacaccaggaagatgtgatcacccaagagggaagcccctcctcctaagaaatgtctgcatgggagcccctcacagccaccttgcccagtgagtgggtcaaaggctagcggttggtcatgaggattttgacttagactcaagccaggcagcccagccccaggactctaccctgggtttctagaccttaagccattcttctgagccttgatttcctcatctcggcggaccgggactgtcttgaaggactcagcctggagtacacagaagtgggacacctgaggctgggtagagccaatgccctctttacatgattcctcagaaatgtggtggcctcattataggggtggtccaggcagtcaccagaagtctctgctgtagtctatagcatcttgtctgtgtgcttggtgtaattagggacatacatccatgcaccaccagacacacctgtgaccctggctgggtatcctatgctctgggccaagtgaagatgaaaatagttctggaggctgtcctgagcatcctggctagagtctcatgagcccagtcgtgatgtggaaacaagtcgtgtgccccaaatatctgtcagaatgccacccaccctccacacttcaataaaagaacaccctcctcatatgtctcaataaagaataaaggaagctgtgtatatcgSEQ ID No.41MHLNSSVQQGAPSEPGAQPFPHPQFGLETMLLALSLSNGSGNSSESILEPNSNLDVNTDIYSKVLVTAVYLALFVVGTVGNSVTAFTLARKKSLQSLQSTVHYHLGSLALSDLLILLLAMPVELYNFIWVHHPWAFGDAGCRGYYFLRDACTYATALNVASLSVERYLAICHPFKAKTLMSRSRTKKFISAIWLASALLAVPMLFTMGLQNRSADGQHPGGLVCTPTVDTATVKVⅥQVNTFMSFLFPMLIISILNTVIANKLTVMVHQAAEQGRGVCTVGTHNSLEHSTFNMSIEPGRVQALRHGVLVLRAVVIAFVVCWLPYHVRRLMFCYISDEQWTTFLFDFYHYFMLTNALFYVSSAINPILYNLVSANFRQVFLSTLACLCPGWRRRRKKRPTFSRKPNSMSSNHAFSTSATRETLY
權(quán)利要求
1.診斷個體中CRH誘導(dǎo)的基因表達(dá)譜的方法，所述方法包括a)得到所述個體的生物學(xué)樣品；和b)確定含有選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的核酸序列的基因的基因轉(zhuǎn)錄水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中生物學(xué)樣品是體液或組織樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中為具有由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID 11、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40組成的核酸序列的基因確定基因轉(zhuǎn)錄的水平。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中使用結(jié)合含有選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的核酸序列的多核苷酸的探針評估基因轉(zhuǎn)錄的水平。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4任一項的方法，其中使用微陣列技術(shù)確定基因表達(dá)的水平。
6.診斷個體中CRH誘導(dǎo)的基因表達(dá)譜的方法，所述方法包括a)得到所述個體的生物學(xué)樣品；和b)確定所述生物學(xué)樣品中調(diào)節(jié)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)信號化的至少一種蛋白質(zhì)的量；其中調(diào)節(jié)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)信號化的蛋白選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中生物學(xué)樣品是體液或組織樣品。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法，其中使用結(jié)合含有選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的多肽的抗體確定調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的量。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法，其中通過評估編碼選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的基因的基因轉(zhuǎn)錄水平來確定調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的量。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中使用結(jié)合編碼選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的多核苷酸的探針評估基因轉(zhuǎn)錄的水平。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中使用微陣列技術(shù)確定基因表達(dá)水平。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中使用結(jié)合編碼具有氨基酸序列SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQID No.41的多肽組的多核苷酸的寡核苷酸探針的陣列分析基因轉(zhuǎn)錄水平。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中使用結(jié)合具有核酸序列SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的多核苷酸的寡核苷酸探針的陣列分析基因轉(zhuǎn)錄水平。
14.鑒定能夠改變細(xì)胞中CRH信號化應(yīng)答的化合物的方法，所述方法包括a)在所述化合物存在和不存在時將所述細(xì)胞與CRH接觸；b)確定調(diào)節(jié)所述細(xì)胞中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)信號化的至少一種蛋白質(zhì)的量；和c)比較在所述化合物存在和不存在時所述蛋白質(zhì)的量；其中，調(diào)節(jié)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)信號化的蛋白質(zhì)選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中細(xì)胞是真核細(xì)胞如鼠垂體促腎上腺皮質(zhì)激素細(xì)胞來源的腺瘤細(xì)胞系A(chǔ)tT-20。
16.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中使用結(jié)合含有選自SEQ IDNO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的多肽的抗體確定調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的量。
17.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中通過評估編碼選自SEQ IDNO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的基因的基因轉(zhuǎn)錄水平確定調(diào)節(jié)CRH信號化的蛋白質(zhì)的量。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中使用結(jié)合編碼選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的多核苷酸的探針評估基因轉(zhuǎn)錄的水平。
19.根據(jù)權(quán)利要求16或17的方法，其中使用微陣列技術(shù)分析基因表達(dá)的水平。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中使用結(jié)合編碼具有SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的多肽組的多核苷酸的寡核苷酸探針的陣列分析基因轉(zhuǎn)錄的水平。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中使用結(jié)合具有核酸序列SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID No.38和SEQ ID No.40的多核苷酸的寡核苷酸探針的陣列分析基因轉(zhuǎn)錄的水平。
22.鑒定能夠改變細(xì)胞中CRH信號化應(yīng)答活性的化合物的方法，所述方法包括a)將表達(dá)含有選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的至少一種蛋白質(zhì)的細(xì)胞與所述受試化合物接觸；和b)比較所述化合物存在和不存在時所述細(xì)胞中CRH應(yīng)答活性。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中細(xì)胞是能夠表達(dá)具有選自SEQ IDNO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的至少一種蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中用含有調(diào)節(jié)序列的至少一種載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中用含有編碼選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID No.39和SEQ ID No.41的氨基酸序列的多核苷酸序列的至少一種載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。
26.含有選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ D No.8、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31的核酸序列的分離的多核苷酸，其用作細(xì)胞中CRH信號化的標(biāo)記物。
27.根據(jù)權(quán)利要求21的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸是mRNA、DNA或cDNA。
28.由選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ D No.8、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31的核酸序列組成的分離的多核苷酸，其用作細(xì)胞中CRH信號化的標(biāo)記物。
29.含有根據(jù)權(quán)利要求25到27任一項的分離的多核苷酸的載體。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的載體，其中多核苷酸可操作地連接到表達(dá)控制序列。
31.用根據(jù)權(quán)利要求28或29的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及抑郁癥的治療和診斷。具體地，本發(fā)明涉及多肽以及編碼這些多肽的多核苷酸，其中所述多肽表現(xiàn)出在介導(dǎo)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的內(nèi)分泌應(yīng)答中起主要作用。這些多肽和多核苷酸可用于抑郁癥的診斷、治療和/或預(yù)防。
文檔編號C12Q1/68GK1708589SQ200380102533
公開日2005年12月14日 申請日期2003年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月31日
發(fā)明者P·J·彼得斯, H·W·H·格爾曼, S·M·A·斯瓦格馬克斯, S·U·卡斯, T·H·W·斯特克勒, F·L·P·費(fèi)倫斯 申請人:詹森藥業(yè)有限公司