專利名稱：植物脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中一種與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及一種植物脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因與其在培育抗逆性提高的植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱、高鹽及低溫等逆境脅迫都會影響植物的正常生長和發(fā)育。了解植物對逆境條件的應(yīng)答與信號傳導機制，提高植物特別是作物的抗逆性是作物遺傳研究和品種改良的重要任務(wù)之一。
在逆境脅迫下植物體內(nèi)會產(chǎn)生一系列應(yīng)答反應(yīng)，伴隨著許多生理生化及發(fā)育上的變化。闡明植物對逆境的反應(yīng)機制，將為植物抗逆的分子育種提供科學的理論基礎(chǔ)。研究表明，植物在水分虧缺引起植物損傷之前，就能對干旱作出包括信號轉(zhuǎn)導、基因表達和代謝調(diào)節(jié)在內(nèi)的適應(yīng)性調(diào)整并繼續(xù)生長和發(fā)育。基因與環(huán)境是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的兩個基本因素，探索環(huán)境條件如何調(diào)控植物的基因表達，以及環(huán)境條件對植物體內(nèi)的生理功能變化的影響已成為植物遺傳育種學家的最大挑戰(zhàn)，這正是信號轉(zhuǎn)導(Signal transduction)機制研究的熱點問題。
植物的許多基因已被證明受非生物逆境脅迫的誘導，這些基因的表達產(chǎn)物有的在抗逆性中直接發(fā)揮功能，有的負責調(diào)控下游基因的表達和逆境信號的傳導。與脅迫相關(guān)的基因產(chǎn)物可以分為兩大類第一類基因編碼的產(chǎn)物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、滲透調(diào)節(jié)因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等)合成酶等直接參與植物脅迫應(yīng)答的基因產(chǎn)物；第二類基因編碼的產(chǎn)物包括參與脅迫相關(guān)的信號傳遞和基因表達調(diào)節(jié)的蛋白因子，如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等。其中，轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫應(yīng)答的基因表達調(diào)控中起著重要作用。
轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性作用的DNA結(jié)合蛋白，通過它們之間以及與其它相關(guān)蛋白之間的相互作用，激活或抑制轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)決定了它與順式作用元件結(jié)合的特異性，而轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)決定了它對基因表達起激活或是抑制作用。此外，其自身活性還受到核定位及寡聚化等作用的影響。
目前已知在植物中與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有具有AP2結(jié)構(gòu)域的AP2(APETALA2)/EREBP(乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，ethylene responsive element bindingprotein)轉(zhuǎn)錄因子家族、含有堿性區(qū)域和亮氨酸拉鏈的bZIP(basic region/leucine zipper motif transcription factors)類轉(zhuǎn)錄因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族、含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉鏈的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的MYB家族。這五個轉(zhuǎn)錄因子家族，除WRKY家族不參與植物的水脅迫反應(yīng)外，其它四個家族均參與調(diào)節(jié)植物對干旱、高鹽和低溫等的逆境脅迫反應(yīng)。其中，AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中廣泛存在，它是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，近年來，在擬南芥、煙草、玉米、水稻和油菜中均有報道，這表明AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。
Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki在對逆境應(yīng)答基因rd29A基因的啟動子區(qū)域的研究中，發(fā)現(xiàn)了一個逆境脅迫應(yīng)答順勢作用元件，即脫水應(yīng)答元件(DRE，dehydration-responsive element)。此后，發(fā)現(xiàn)許多逆境應(yīng)答基因啟動子區(qū)域含有DRE元件。Liu等人首次利用酵母單雜交系統(tǒng)，從擬南芥的cDNA表達文庫中克隆到二種編碼與DRE元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(DREB，dehydration-responsive element binding protein)cDNA，分別命名為DREB1A，DREB2A。它們在氨基酸序列上沒有顯著的相同性，但都含有一段非常保守的由58個氨基酸組成的DNA結(jié)合區(qū)域(EREBP/AP2結(jié)構(gòu)域)。蛋白質(zhì)三維分析表明，該區(qū)域含有3個β-折疊，對識別各類順式作用元件起關(guān)鍵作用。其中位于第二個β-折疊中的第14、19位的兩個氨基酸殘基的差異，決定這類轉(zhuǎn)錄因子與不同順式作用元件的特異結(jié)合。DREB類轉(zhuǎn)錄因子第14位氨基酸是纈氨酸(V14)，第19位氨基酸是谷氨酸(E19)，其中第19位的氨基酸并不保守，例如水稻的OsDREB1轉(zhuǎn)錄因子的第19位氨基酸就是纈氨酸。在DREB類蛋白中決定DNA結(jié)合的特異性方面，V14的作用明顯要比E19重要；而ERF類轉(zhuǎn)錄因子第14位氨基酸是甘氨酸，第19位是天冬氨酸，因而DREB特異結(jié)合DRE/CRT順式元件，ERF特異結(jié)合GCC-盒。AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的C-端區(qū)還包含1個由18個氨基酸殘基組成的核心序列，該序列形成雙親性的α-螺旋，該α-螺旋可能參與同其它轉(zhuǎn)錄因子及DNA間的相互作用。
目前，在許多植物中都發(fā)現(xiàn)這種含有EREBP/AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，并分別與抗病、抗逆等信號傳遞有關(guān)。劉強等認為，一個DREB基因可以調(diào)控多個與植物干旱、高鹽及低溫耐性有關(guān)的功能基因的表達。Kasuga等的研究證實，導入到擬南芥的DREB1A基因可以同時促進與逆境脅迫耐性有關(guān)的基因rd29、rd17、kin1、cor6.6、cor15a以及erd10的表達，轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性大大增強。同樣，低溫耐性轉(zhuǎn)錄因子CBF1的轉(zhuǎn)基因植株的耐低溫能力有顯著提高。由于植物的逆境耐性是由多基因調(diào)控的復雜性狀，依靠導入單個功能性蛋白基因很難實現(xiàn)植物抗逆性的綜合提高。因此，利用一個關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子促進多個功能基因的表達，從而增強植物的綜合抗逆性，已經(jīng)成為植物抗逆基因工程的研究熱點。
研究人員最早發(fā)現(xiàn)，在干旱、高鹽及低溫等逆境脅迫下，體內(nèi)脫落酸(ABA)大量積累，許多與逆境脅迫耐性有關(guān)的基因是受ABA誘導的。在轉(zhuǎn)錄水平上研究ABA誘導基因表達調(diào)控，發(fā)現(xiàn)在功能基因的啟動子區(qū)域內(nèi)都有一個相當保守的序列(PyACGTGGC)，作為ABA應(yīng)答元件(ABA responsive element，ABRE)。與ABRE特異結(jié)合的反式作用因子也相繼被克隆。此外，還發(fā)現(xiàn)另外一些順式作用元件參與ABA的應(yīng)答反應(yīng)，如在大麥HVA22基因中鑒定的偶聯(lián)元件(Coupling element，CE)CE1，其核心序列是TGCCACCGG。
與此同時，研究也發(fā)現(xiàn)許多與逆境耐性有關(guān)的基因的表達與ABA無關(guān)，其中，有些基因受干旱和低溫同時誘導，有些基因只對干旱或低溫有應(yīng)答反應(yīng)。說明植物體內(nèi)存在多條信號傳遞途徑，負責逆境脅迫信號的感應(yīng)、傳遞和基因表達的調(diào)控。Yamaguchi-Shinozaki等利用示差篩選法從干旱處理的擬南芥中，克隆了一批受干旱誘導的基因，其中，rd29基因編碼與LEA蛋白非常相似的蛋白，它對干旱、高鹽及低溫脅迫均可產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，對其啟動子的研究發(fā)現(xiàn)有二個不依賴于ABRE的DRE順式作用元件(dehydration responsive element，DRE)。其核心序列是TACCGACAT。目前已分離克隆的與逆境耐性有關(guān)的基因，如rd17，kin1，cor6.6等基因的啟動子區(qū)域內(nèi)也都發(fā)現(xiàn)了DRE元件或DRE核心序列元件，此外，在低溫應(yīng)答元件CRT(C-repeat)、LTRE(Low temperature responsive element)也存在CCGAC保守序列，說明DRE元件普遍存在于逆境脅迫應(yīng)答基因的啟動子中，并對逆境脅迫應(yīng)答起重要作用。
綜合目前的研究結(jié)果，植物在逆境脅迫條件下的信號傳遞途徑至少有以下六條途徑依賴于ABA的信號傳遞途徑有三條1)受干旱、高鹽誘導，激活MYB、MYC類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有MYBR或MYCR順式作用元件的靶基因。
2)受干旱、高鹽誘導，激活A(yù)BF/AREB類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有ABRE順式作用元件的靶基因。
3)受干旱、高鹽誘導，激活CBF4，DREB1類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因。
不依賴于ABA的信號傳遞途徑有三條
1)受干旱、高鹽誘導，激活DREB2類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因。
2)受低溫誘導，激活CBF1-3/DREB1A-C類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因。
3)受干旱、高鹽或乙烯誘導，激活EREB類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因。
目前，在水稻、玉米等主要農(nóng)作物中已有DREB轉(zhuǎn)錄因子基因克隆的報道，從大豆中克隆DREB轉(zhuǎn)錄因子基因還未見報道。
DNA遷移率變動試驗(DNA mobility shift assay，EMSA)，又叫凝膠阻滯(gelretardation)試驗，是一種體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的特殊的凝膠電泳技術(shù)?；驹頌樵谀z電泳中，由于電場的作用，小分子DNA片段比其結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA片段向陽極移動的速度快，因此，可標記短的雙鏈DNA片段，將其與蛋白質(zhì)混合，對混合物進行凝膠電泳，若目的DNA與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合，其向陽極移動的速度受到阻滯，對凝膠進行放射性自顯影，就可證實特異性DNA與相應(yīng)蛋白結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的植物脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，名稱為GmDREB3，來源于大豆屬大豆(Glycine max(L.))，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)控植物抗逆性的蛋白質(zhì)。
其中，序列表中的序列1由313個氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第104位-105位氨基酸殘基為核定位序列，自氨基端第120位-177位氨基酸殘基序列為保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。
上述植物脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白編碼基因(GmDREB3)，也屬于本發(fā)明的保護范圍。它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №2由939個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1到第939位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID№1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；自5’端第358到第531位堿基為AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域的編碼序列，編碼58個氨基酸，自5’端第397到第399位堿基為纈氨酸的編碼序列，自5’端第412到第414位堿基為亮氨酸的編碼序列。
含有本發(fā)明基因的表達載體、細胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
擴增GmDREB3中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
Northern blot實驗證明GmDREB3基因受高鹽誘導表達，而不受干旱、冷脅迫、ABA誘導表達；EMSA(凝膠阻滯實驗)證明GmDREB3在體外與DRE具有結(jié)合特異性；酵母轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)證明了GmDREB3的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活功能。本發(fā)明的GmDREB3基因為人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達提供了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物(特別是大豆)中發(fā)揮重要的作用。


圖1A-圖1D為GmDREB3受脅迫誘導表達的情況圖2為GmDREB3的EMSA具體實施方式
實施例1、GmDREB3基因的克隆將生長14天左右的鐵豐8號(抗鹽堿大豆品種)大豆幼苗的根系置于200mM NaCl溶液中處理12小時，采用Trizol法提取大豆總RNA，利用3’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends Kit(GIBCOBRL，CAT.NO.18373-019)按照其說明書的步驟操作獲得GmDREB3基因的全長序列。其中，3’RACE的特異引物為GSP15’GGTCGCTGAAATCAGACT 3’；GSP25’GACTCCCAAAGAACCGCACGCGCCTCTG 3’。GmDREB3基因具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。序列1的自氨基端第104位-105位氨基酸殘基為核定位序列，該核定位序列的編碼序列為序列2的自5′端第310位堿基-315位堿基；序列1的自氨基端第120位-177位氨基酸殘基為AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，自氨基端第133位(AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域中的第14位)為纈氨酸，自氨基端第138位(AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域中的第19位)為亮氨酸。該AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的編碼序列為序列2的自5′端第358位堿基-531位堿基。GmDREB3是一個DREB蛋白。
GmDREB3基因的序列在Genabnk上進行比對，未發(fā)現(xiàn)與GmDREB3基因同源的大豆DREB基因，證明GmDREB3基因是一個新的基因。
實施例2、Northern bolt檢測GmDREB3基因的表達特性
1、植物材料的準備取14天左右的大豆幼苗，進行以下處理(1)干旱處理將大豆幼苗從土中取出吸干根上的水分，置于干燥的濾紙上，干旱培養(yǎng)0.5小時、1小時、3小時、6小時和24小時后取出材料，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)鹽漬處理將大豆幼苗的根系置于200mM NaCl溶液中，光照培養(yǎng)0.5小時、1小時、3小時、6小時和24小時后取出材料，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)冷害處理將小麥幼苗置于4℃培養(yǎng)箱，光照培養(yǎng)0.5小時、1小時、3小時、17小時和72小時后分別取出并用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (4)ABA處理給大豆幼苗噴灑200μM的ABA溶液中，光照培養(yǎng)0.5小時、1小時、3小時、17小時和72小時后分別取出并用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (5)對照的處理直接取未經(jīng)任何處理的大豆幼苗-80℃凍存作為對照。
采用Trizol法分別提取上述植物材料的大豆總RNA。
2、轉(zhuǎn)膜(1)電泳及轉(zhuǎn)膜用具的處理0.1N NaOH/1mM EDTA浸泡1h，用清水沖洗干凈備用；(2)準備甲醛變性凝膠在一個三角燒瓶中加入10ml 10×MOPs，73ml DEPC處理的水和1g瓊脂糖，加熱融化；當冷卻到55℃左右時加入17ml甲醛，混勻，倒入RNA專用的膠槽中；(3)在DEPC處理的0.5ml離心管中加入RNA+DEPC處理水4μl(大豆總RNA約為30μg)甲酰胺12.5μl甲醛 4.0μl10×MOPs 2.5μl溴酚蘭(10×) 2.5μl(4)樣品在65℃水浴處理5min，然后點樣，開始電泳，緩沖液為1×MOPs。當溴酚蘭到達凝膠1/3-1/2位置時，停止電泳；(5)用蒸餾水沖洗凝膠，用20×SSC轉(zhuǎn)膜。將凝膠翻轉(zhuǎn)后放在濾紙橋上，放上一張與凝膠大小相當?shù)哪猃埬?Hybond-N+，Amarsharm)，趕除氣泡，在膜上放3層濾紙，與尼龍膜大小相同，趕除氣泡，將凝膠周圍用膠片封好，放上大小相當?shù)奈垼瑝荷霞s500g的重物，轉(zhuǎn)膜24h，其間更換吸水紙。轉(zhuǎn)膜完成后，用2×SSC洗膜10min，用濾紙吸干，保鮮膜包好，紫外燈照射3min，4℃存放至雜交；3、探針的制備在GmDREB3基因的3’設(shè)計特異引物GmDREB3F和GmDREB3R(避開AP2/EREBP區(qū)域)，以克隆的GmDREB3基因為模板進行PCR擴增，程序及體系如下引物序列GmDREB3F5’CATCTAAGACACCACGGA 3’GmDREB3R5’CCAATCAATCTCCACAGA 3’反應(yīng)體系(50μl)模板(60ng/ul) 0.5μldNTP(每種10mM) 1μl引物(各25μM) 1μl10×緩沖液 5μlddh2O 42.1μlTaq(5U/μl)0.4μl其中，10×緩沖液來自于TaKaRa Taq試劑盒(TaKaRa公司，Code No.DR100A)。擴增條件(PTC-200)先94℃2min；然后按如下條件進行30個循環(huán)94℃30sec，58℃45sec，72℃45sec；最后72℃5min。
取擴增產(chǎn)物2ul在1.2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測，溴化乙啶染色，紫外凝膠成像儀掃描，在600bp左右的位置處有一條亮帶。
4、探針的回收采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.DV807A)回收純化探針。
5、探針標記探針標記為隨機六聚體引物法，每1-2張膜加入步驟4的探針DNA約50-100ng和DNA分子量標記，加水14.5μl，100℃煮沸變性5min后立即置于冰浴中5min，瞬時離心，然后加入下列成分，終體積25μl，于37℃反應(yīng)5h以上。
5×Oligo緩沖液5μlKlenow Fragment(5U/μl) 0.7μl10×緩沖液2.5ulBSA(10mg/ml) 1μlα-32P-dCTP(10mCi/ml)1.5μl
附1ml 5×Oligo緩沖液中含有160μl H2O250μl 1M Tris-HCl25μl1M MgCl25μl 1M巰基乙醇500μl 2M HEPES20μl100mM dATP20μl100mM dGTP20μl100mM dTTP10×緩沖液來自于Random Primer DNA Labeling Kit Ver 2.0(TaKaRa公司，Code No.D6045)6、預(yù)雜交和雜交反應(yīng)根據(jù)要雜交的膜的數(shù)量配制預(yù)雜交液，每10ml預(yù)雜交液的成分組成如下。
ddH2O 6.5ml5×HSB2mlDenHardt’sIII1ml*ssDNA(10mg/ml) 0.5ml*ssDNA為鮭魚精DNA(Sigma)加入之前需變性煮沸10min后立即放冰上10min。
附5×HSB(pH6.8)分子量(MW)g/200mlNaCl(3M)58.44 35.064PIPES(0.1M) 302.4 6.048EDTA(20mM) 372.241.488Denhardt’sIIIg/100ml2％Gelatin22％Ficoll-400 22％PVP-360210％SDS 105％Na4P2O·10H2O 5將預(yù)雜交液混勻，于65℃預(yù)熱至澄清后放入尼龍膜，65℃預(yù)雜交5-6h(新膜)；探針標記完后，加入等體積的0.4N NaOH溶液，混勻后于室溫靜置10min使探針變性，然后加入到預(yù)雜交液中，65℃雜交過夜；
7、洗脫將雜交完的膜從雜交管中取出放入洗脫盒中，加入少量洗液I(2×SSC/0.1％SDS)漂洗除去過量雜交液，然后用洗液I于45℃洗兩次，每次20min；再用洗液II(0.2×SSC/0.2％SDS)于45℃洗兩次，每次15min。洗液I洗過后，檢測雜交信號與背景情況，再決定是否繼續(xù)洗脫。用濾紙吸干洗好的膜，保鮮膜包好(注意除去氣泡)；8、放射自顯影在X-射線攝影暗盒中，將雜交膜置于增感屏上，在暗室中將X-光片放在雜交膜上，再放上另一張增感屏，壓緊X-射線攝影暗盒，-70℃冰箱曝光7-15天。
Northern blot分析結(jié)果如圖1A-圖1D所示，表明在干旱條件下GmDREB3基因表達不受影響；受高鹽(200mM NaCl)脅迫的誘導表達；不受冷脅迫、ABA(200uM)脅迫誘導GmDREB3基因表達。說明該基因受高鹽誘導，不受干旱、冷脅迫、ABA誘導。
實施例3、EMSA檢測GmDREB3的體外結(jié)合特異性1、GmDREB3基因的原核表達將GmDREB3基因的全長序列插入原核表達載體pGEX-4T-1(購自AmershamPharmacia Biotech公司)的多克隆位點EcoRI和XhoI中，由于pGEX-4T-1的多克隆位點前面有GST(谷胱苷肽)基因，這樣GmDREB3與GST蛋白就形成了融合蛋白，將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化受體大腸桿菌BL21，37℃培養(yǎng)6小時后，向培養(yǎng)基中添加IPTG至終濃度為0.5mM誘導表達12h，收集菌體，超聲裂解后于4℃、12000rpm離心20分鐘，取上清進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果檢測到64.43KD的條帶，表明融合蛋白(GmDREB3-GST)已表達。
使用MicroSpin GST Purification Module Kit(Amersham，product code27-4570-03)按說明書的步驟純化GmDREB3-GST融合蛋白。
2、DRE探針的標記根據(jù)GmDREB3基因序列，合成如下DRE探針序列(以下探針序列中帶下劃線的堿基為DRE的核心堿基)DRE15’＞ATT TCA TGGCCGACCTGC TTT CATGGCCGACCT GCT T＜3’DRE25’＞AAG CAGGTCGGCCAT GAA AGC AGGTCGGCC ATG AAA T＜3’DREm1(1)5’＞ATT TCA TGGAAGACCTGC TTT CATGGAAGACCT GCT T＜3’DREm1(2)5’＞AAG CAGGTCTTCCAT GAA AGC AGGTCTTCC ATG AAA T＜3’DREm2(1)5’＞ATT TCA TGGCCTCACTGC TTT CATGGCCTCACT GCT T＜3’DREm2(2)5’＞AAG CAGTGAGGC CAT GAA AGC AGTGAGGCC ATG AAA T＜3’
DREm3(1)5’＞ATT TCA TGGTTTTTCTGC TTT CATGGTTTTTCT GCT T＜3’DREm3(2)5’＞AAG CAGAAAAAC CAT GAA AGC AGAAAAACCATGAAA T＜3’其中，DRE1和DRE2為野生型的DRE探針，DREm1、DREm2、DREm3為各種突變的DRE探針。
使用T4多聚核苷酸激酶(T4-Polynucleotide Kinase，T4-PNK)對DRE探針進行(γ-32P)dATP標記，標記體系如下H2O 18.6μL10×T4-PNK緩沖液(Promega公司)2.5μLDRE探針(濃度為1ug/ul)1μLT4-PNK(Promega公司)(5U/μL) 1μL(γ-32P)dATP(濃度為10u Ci/ul) 2μL37℃標記30分鐘，加入1μL 0.5M EDTA終止反應(yīng)，65℃10分鐘滅活酶，4℃?zhèn)溆谩?br> 3、標記的DRE探針與純化的GmDREB3-GST融合蛋白進行結(jié)合反應(yīng)以GST蛋白為對照。
結(jié)合反應(yīng)體系如下5×結(jié)合緩沖液 4uL純化的GmDREB3-GST融合蛋白(濃度為0.5mg/ml)或GST蛋白(濃度為0.5mg/ml) 10uL一種標記的DRE探針 2uL50％甘油 2uLH2O 2uL其中，5×結(jié)合緩沖液成分如下12.5mMHEPES-KOH(pH 7.6)250mM KCl2.5mM DTT2.5mM EDTA。
結(jié)合反應(yīng)在冰上進行30分鐘，反應(yīng)的同時配好的SDS-PAGE膠200V進行1小時的預(yù)電泳，結(jié)合反應(yīng)后加入1μL上樣緩沖液(0.025％溴酚蘭)進行SDS-PAGE電泳，170V電泳1-2小時后卸下電泳板，將膠放到水中，在將膠上的水吸干后壓X光片檢測GmDREB3-GST融合蛋白與標記的DRE探針的結(jié)合特性。結(jié)果如圖2所示，表明野生型DRE探針都可以和純化的GmDREB3-GST融合蛋白結(jié)合，而突變型DRE探針都不能和GmDREB3-GST融合蛋白結(jié)合，結(jié)果證明純化的GmDREB3-GST融合蛋白與DRE具有結(jié)合特異性，GmDREB是DREB類轉(zhuǎn)錄因子。圖2中，m1為DREm1(1)和DREm1(2)突變探針，m2為DREm2(1)和DREm2(2)突變探針，m3為DREm3(1)和DREm3(2)突變探針，pro為野生型DRE1和DRE2探針，prob為不加蛋白的自由探針(DRE1和DRE2)。
實施例4、GmDREB3的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活特性一、將GmDREB3基因構(gòu)建到表達載體YEP-GAP上1、獲得GmDREB3基因編碼氨基酸部分的全序列根據(jù)已克隆的GmDREB3基因的序列設(shè)計引物，引物末端分別加EcoRI和XhoI酶切位點，以實施例1中鹽處理的鐵豐8號的基因組DNA為模板，PCR擴增獲得編碼氨基酸部分的全序列，程序及體系如下引物序列GmDREB3FF5’TATCCCGGGACCCCAGACCAAATTGTTCAG 3’GmDREB3FR5’GCAGAGCTCGCGGCCGCTTGCAGAAGCAGCCAAAGACA 3’反應(yīng)體系(50μl)模板(60ng/ul)0.5μldNTP(每種10mM) 1μl引物(每種25μM) 1ul10×緩沖液 5μlddh2O 42.1μlTaq(5U/μl) 0.4μl其中，10×緩沖液來自于TaKaRa Taq試劑盒(TaKaRa公司，Code No.DR100A)。
擴增條件(PTC-200)先94℃2min；然后按如下條件進行30個循環(huán)94℃30sec，58℃45sec，72℃70sec；最后72℃5min。
取擴增產(chǎn)物2ul在1.2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測，溴化乙啶染色，紫外凝膠成像儀掃描，結(jié)果在939bp左右的位置處有一條亮帶。
采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.DV807A)回收純化PCR產(chǎn)物。
2、將GmDREB3基因構(gòu)建到表達載體YEP-GAP上將步驟1中純化的PCR產(chǎn)物和表達載體YEP-GAP(Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，Abe H，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.，1998)，用EcoRI(Takara)和XhoI(Takara)分別酶切4-6hr。采用Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(TaKaRa公司，Code No.DV807A)回收純化酶切產(chǎn)物。將純化的酶切PCR產(chǎn)物和酶切載體YEP-GAP連接4-8hr，取0.5μl連接產(chǎn)物，電擊轉(zhuǎn)化JM109菌株，37℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆，測序分析序列是否正確，得到含有GmDREB3基因的重組表達載體YEP-GAP-GmDREB3。
二、GmDREB3的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活特性的驗證1、酵母報道子的構(gòu)建將含有4個DRE元件的片段5’-GAATTC-DRE-DRE-DRE-DRE-GTCGAC-3’(DRE的核心序列TACCGACAT)分別構(gòu)建到pHis-1載體(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)的PminHIS3啟動子和pLacZi載體(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)PCYCI啟動子上游，分別得到重組載體pHis-1-DRE和pLacZi-DRE，用Xho I和Nco I內(nèi)切酶分別將pHis-1-DRE和pLacZi-DRE載體切成線狀。先將線狀pHis-1-DRE載體轉(zhuǎn)化到酵母細胞(YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)內(nèi)，獲得能在SD/His-培養(yǎng)基上正常生長的酵母轉(zhuǎn)化子(Yeast transformant)。接著以這種酵母轉(zhuǎn)化子為寄主細胞，繼續(xù)轉(zhuǎn)化含有4個重復DRE元件的pLacZi-DRE載體。這樣在同時缺乏組氨酸和尿嘧啶的SD/His-/Ura-培養(yǎng)基上，選擇獲得含有pHis-1-DRE和pLacZi-DRE的正常雙重酵母報道子；將4個DRE元件的核心序列CCGAC突變成TTTTT(MDRE)，即5’-GAATTC-MDRE-MDRE-MDRE-MDRE-GTCGAC-3’，按正常的雙重酵母報道子構(gòu)建方法，再構(gòu)建一個含4個MDRE盒的突變體雙重酵母報道子。
2、PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化酵母及結(jié)果分析(1)接種酵母菌株(YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)到1ml YPD液體培養(yǎng)基中，劇烈震蕩2分鐘，分散團塊后將懸浮液轉(zhuǎn)至含有50ml YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃/250rpm搖過夜，測OD600＝1.7-1.8(計數(shù)約4×107個/mL)；(2)取30ml步驟(1)過夜培養(yǎng)物接到300ml新鮮的YPD培養(yǎng)基中，30℃/250rpm培養(yǎng)，約3小時至OD600＝0.5±0.1，室溫1000g離心5min，收集菌體，棄上清，用1/2體積1×TE懸浮，1000g/5min離心；(3)吸棄上清，用1.5ml新鮮配制的1×TE/LiAc溶液懸浮，振蕩混勻備用；(4)取出0.1ml酵母感受態(tài)進行轉(zhuǎn)化，依次加下列溶液0.1μg表達載體YEP-GAP-GmDREB3、0.1mg ssDNA(鮭魚精DNA，Sigma)、0.6mlPEG/LiAc高速振蕩1分鐘，30℃/200rpm振蕩培養(yǎng)30分鐘；
(5)加入70ul DMSO(sigma#D8779)，輕輕倒置混勻，42℃熱激30分鐘，其間輕輕振蕩，冰浴2分鐘，室溫1000g離心5min；(6)吸棄上清，加入0.5ml 1×TE buffer懸浮細胞；(7)用接種環(huán)蘸取懸浮液，分別在含有0,15mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-選擇性培養(yǎng)基上畫線培養(yǎng)。
(8)平板的一半培養(yǎng)步驟1構(gòu)建的正常雙重酵母報道子，另一半培養(yǎng)步驟1構(gòu)建的突變體雙重酵母報道子，以便做對照分析。
(9)顛倒放置于培養(yǎng)箱中，30℃培養(yǎng)3-4天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-的培養(yǎng)基平板上正常的酵母報道子和突變的酵母報道子都有生長，但突變的酵母報道子的直徑明顯小；而在15mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-的培養(yǎng)基平板上正常的酵母報道子能正常生長，但突變的酵母報道子被抑止沒有生長。
3、半乳糖苷酶活性檢測(1)從0mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-的培養(yǎng)基平板上分別挑取正常的酵母報道子和突變的酵母報道子菌落。轉(zhuǎn)至YPD液體培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)，待長至對數(shù)生長后期，取1.5ml菌液，3000rpm離心30s；(2)棄上清，控干管中液體，將離心管置于液氮中速凍10min，取出使其自然融解，加50ul Z/X-gal溶液，30℃溫育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常的酵母報道子在6-8h內(nèi)變藍，而突變的酵母報道子在12h內(nèi)沒有變化，仍為白色。說明轉(zhuǎn)錄因子GmDREB3能與DRE順式作用元件結(jié)合，且具有激活功能，激活了Pmin啟動子(包括PminHIS3啟動子和PCYCI啟動子)，促使報道基因表達。從而證明了GmDREB3的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活功能。
三、藥劑配制(1)YPD液體培養(yǎng)基細菌培養(yǎng)用酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract)10g/L細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(Bacto-Peptone) 20g/L調(diào)節(jié)pH至5.8，121℃/15min滅菌，降至60℃以后加入40％的葡萄糖，使其終濃度為20g/L。
(2)SD/His-/Ura-/Trp-選擇性培養(yǎng)基不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogen base) 6.7g/L營養(yǎng)缺陷型混合物(drop-out media without His/Ura/Trp) 100ml瓊脂粉(Bacteriological agar) 20g/L調(diào)節(jié)pH至5.8，121℃/15min滅菌，降至60℃后加入40％Glucose，使其終濃度為20g/L。
(3)營養(yǎng)缺陷型混合物(Drop-out mix)(10X)L-Isoleucine(異亮氨酸)300mg/LL-Valine(纈氨酸) 1500mg/L
L-Adenine(腺嘌呤) 200mg/LL-Arginine(精氨酸) 200mg/LL-Histidine Hcl monohydrate(組氨酸)200mg/LL-Leucine(亮氨酸) 1000mg/LL-Lysine Hcl(賴氨酸) 300mg/LL-Methionine(甲硫氨酸) 200mg/LL-Phenylalanine(苯丙氨酸) 500mg/LL-Threonine(蘇氨酸)2000mg/LL-Tyrosine(酪氨酸) 300mg/L(4)1×PEG/LiAc50％(w/v)PEG3350 8ml10×TE buffer 1ml10×LiAc 1ml(5)10×TE Buffer100mM Tris-Hcl10mM EDTA，pH＝7.5121℃高壓滅菌，室溫保存。
(6)1×TE/LiAc10×TE buffer 1ml10×LiAc1mlddH2O 8ml(7)Z BufferNa2HPO4·7H2O 16.1g/LNaH2PO4·H2O5.5g/LKCl 0.75g/LMgSO4·7H2O 0.246g/L調(diào)節(jié)pH至7.0，121℃/15min滅菌，4℃保存。
(8)X-gal儲存液(X-gal Stock Solution)用N，N-dimethyl-formamide(DMF)溶解X-gal，使其終濃度為20mg/ml，-20℃貯存。
(9)含有X-gal的Z buffer緩沖液100ml(Z buffer with X-gal)，注意現(xiàn)用現(xiàn)配Z buffer 98mlβ-巰基乙醇(β-mercaptoethanol) 0.27mlX-gal儲存液(X-gal stock solution)1.67ml
序列表<210>1<211>312<212>PRT<213>大豆屬大豆(Glycine max(L.))<400>1Met Gly Thr Ala Ile Asp Met Tyr Asn Ser Ser Asn Ile Val Ala Asp1 5 10 15Phe Leu Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Leu Met Lys Ala Leu Lys Pro Phe20 25 30Met Lys Ser Asp Tyr Phe Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser35 40 45Gln Pro Cys Ser Phe Ser Ser Asn Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Pro Ser50 55 60Ser Asn Gln Ile Lys Leu Asn Gln Leu Thr Pro Asp Gln Ile Val Gln65 70 75 80Ile Gln Ala Gln Ile His Ile Gln Gln Gln Gln Gln His Val Thr Gln85 90 95Thr Gln Thr His Leu Gly Pro Lys Arg Val Pro Met Lys His Ala Gly100 105 110Thr Ala Ala Lys Pro Thr Lys Leu Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg His115 120 125Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Pro Lys Asn Arg Thr Arg130 135 140Leu Trp Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Glu Ala Ala Leu Ala Tyr145 150 155 160Asp Asn Ala Ala Phe Lys Leu Arg Gly Glu Phe Ala Arg Leu Asn Phe165 170 175Pro His Leu Arg His His Gly Ala Phe Val Phe Gly Glu Phe Gly Asp180 185 190
Tyr Lys Pro Leu Pro Ser Ser Val Asp Ser Lys Leu Gln Ala Ile Cys195 200 205Glu Ser Leu Ala Lys Gln Glu Glu Lys Pro Cys Cys Ser Val Glu Asp210 215 220Val Lys Pro Val Ile His Ala Ala Glu Leu Ala Glu Val Glu Ser Asp225 230 235 240Val Ala Lys Ser Asn Ala Glu Tyr Val Tyr Pro Glu Phe Glu Asp Phe245 250 255Lys Val Glu His Glu Asn Pro Met Phe Ser Gly Glu Ser Ser Ser Pro260 265 270Glu Ser Ser Val Thr Phe Leu Asp Phe Ser Asp Phe Ser Asp Ser Asn275 280 285Asn Gln Trp Asp Glu Met Glu Asn Phe Gly Leu Glu Lys Phe Pro Ser290 295 300Val Glu Ile Asp Trp Glu Ala Ile305 310<210>2<211>939<212>DNA<213>大豆屬大豆(Glycine max(L.))<400>2atgggaactg ctatagacat gtacaacagc agcaacatcg tagcggattt cctagatccg 60tatagtgaag agctgatgaa agcacttaag ccttttatga aaagtgatta tttctctgcc 120tcttcttctt cttcactcga atcacagcct tgttcttttt catctaattc tctccccact 180tcgtatccct cttccaacca aatcaagctc aaccaactca ccccagacca aattgttcag 240attcaggccc aaatccacat tcagcagcag cagcagcacg tgacccaaac ccaaacccac 300ctgggcccaa aacgcgtccc catgaagcac gctggcacgg ccgcgaaacc cacgaagctc 360taccgcgggg tgcggcaacg gcattggggc aagtgggtcg ctgaaatcag actcccaaag 420aaccgcacgc gcctctggct aggaacattc gacaccgcag aggaagcagc attagcgtac 480
gacaacgcag cgtttaagct cagaggcgag ttcgcgcgtc tcaattttcc tcatctaaga 540caccacggag ccttcgtttt cggcgagttc ggagattaca agcctctacc ttcttccgtg 600gattccaaac tgcaagctat ttgcgaaagc ttagcgaaac aagaggaaaa gccgtgttgc 660tccgtcgaag acgtgaagcc cgtgatacac gctgctgagc tggcagaggt cgagtctgac 720gtggcaaaat cgaacgctga atatgtttat cccgagttcg aggattttaa ggtcgagcac 780gagaacccaa tgttttctgg tgaatcttct tcgcctgaat ccagtgttac tttcttggat 840ttctcggact tctcggattc taataatcag tgggatgaaa tggagaattt tgggttggag 900aagttccctt ctgtggagat tgattgggaa gctatatga939
權(quán)利要求
1.植物脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)控植物抗逆性的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述序列表中SEQ ID №1的自氨基端第120-177位為AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述植物脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于它具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.含有權(quán)利要求3或4所述植物脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白基因的植物表達載體。
6.含有權(quán)利要求3或4所述植物脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白基因的細胞系。
7.含有權(quán)利要求3或4所述植物脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白基因的宿主菌。
8.擴增權(quán)利要求3或4所述基因中任一片段的引物。
9.權(quán)利要求1或2所述的植物脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白在培育抗逆性提高的植物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求3或4所述的植物脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白基因在培育抗逆性提高的植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該結(jié)合蛋白為具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或為將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)控植物抗逆性的蛋白質(zhì)。其編碼基因為序列表中SEQ ID №2的DNA序列；或編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。該蛋白及其編碼基因可用于培育抗逆性提高的植物。
文檔編號C12N15/63GK1796407SQ20041010347
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者陳明, 馬有志, 李連城, 王巧燕, 徐兆師, 程憲國 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物育種栽培研究所