專利名稱：人類人工染色體(hac)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類人工染色體(HAC)載體及其制備方法。本發(fā)明還涉及使用人類人工染色體載體引入外源DNA的方法，以及表達外源DNA的細胞的制備方法。此外，本發(fā)明涉及蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
在哺乳動物細胞中引入和表達外源基因的載體，不僅是基礎(chǔ)生命科學(xué)研究的必要工具，而且在工業(yè)(例如大規(guī)模生產(chǎn)藥物)和臨床實踐(例如基因治療)上的實際應(yīng)用其成果方面起著重要作用。自從二十世紀(jì)七十年代后期，基因工程技術(shù)的進展促進了使用大腸桿菌(Escherichia coli)和酵母菌進行特定基因DNA片段的分離和擴增。已經(jīng)常規(guī)使用克隆DNA向哺乳動物細胞進行基因轉(zhuǎn)移。在常規(guī)實踐中，已經(jīng)制備了含有待表達基因的編碼區(qū)(cDNA)并連接啟動子和聚腺苷酸附加位點(它們在哺乳動物細胞中起作用)的人工表達單元，或者已經(jīng)制備了環(huán)狀或線狀的大腸桿菌質(zhì)粒(最大約為20kb，環(huán)狀)、粘粒(最大約為40kb，環(huán)狀)、細菌人工染色體(BAC，最大為200kb，環(huán)狀)和酵母人工染色體(YAC，最大約為1Mb，線狀)，它們含有基因組DNA片段，該片段含有原有的啟動子和聚腺苷酸附加位點以及編碼區(qū)，而且已經(jīng)通過轉(zhuǎn)染或注射將它們轉(zhuǎn)移到細胞中。當(dāng)引入的載體DNA沒有來自哺乳動物的復(fù)制起點時，引入基因的表達將會是瞬時的，因為它在宿主細胞中不能復(fù)制，并且在細胞分裂中被遺漏。如果載體具有復(fù)制起點，則在細胞中暫時產(chǎn)生許多拷貝數(shù)；然而，它們在沒有選擇壓力時仍會被逐漸遺漏，因為它們在細胞分裂中不均等地分配給子細胞。因此，在這種情況下，表達仍是瞬時的。可以選擇以組成型方式表達引入基因的細胞系，即通過同時引入抗藥性基因并施加藥物選擇壓力，盡管引入基因摻入到宿主細胞染色體中(整合)。整合影響引入基因和宿主染色體兩方面。宿主染色體中的基因可以被破壞(Pravtcheva等，Genomics(USA)，第30卷，第529-544頁，1995)。對于引入基因，其拷貝數(shù)可能不受控制，其拷貝可能沒有活性(Garrick等，Nature Genet.(USA)，第18卷，第56-59頁，1998)或者受宿主染色體上控制序列的影響，其中所述基因已經(jīng)整合在其上(Dobie等，P.N.A.S.(USA)，第93卷，第6659-6664，1996；Alami等，Hum.Mol.Genet，(UK)，第9卷，第631-636頁，2000)。因此，需要開發(fā)引入給定基因拷貝數(shù)而又不破壞宿主染色體的方法。對此問題的解決方法是，構(gòu)建在來自動物(包括人)的宿主細胞中能自主復(fù)制/分配的人工染色體，并且采用它作為載體，將基因?qū)雱游锛毎小?br> (1)人類人工染色體(HAC)的構(gòu)建已經(jīng)在動物細胞中嘗試進行了人類人工染色體(在下文稱為“HAC”)的構(gòu)建，以便產(chǎn)生載體來表達外源基因，并且，在生物學(xué)方面，來鑒定在細胞中自主復(fù)制/分配所需的結(jié)構(gòu)。有三種構(gòu)建HAC的方法，即(A)自底向上(bottom up)法，(B)自發(fā)染色體片段的應(yīng)用和(C)自頂向下(top-down)法(修剪天然染色體)。
(A)自底向上法在大腸桿菌和酵母中已經(jīng)鑒定了自主復(fù)制/分配所需的DNA序列，并且已經(jīng)建立了在宿主細胞中提供給定拷貝數(shù)的人工染色體(BAC或YAC)。同樣，也已經(jīng)試圖使用自底向上法來建立HAC，即通過將已知序列的克隆DNA片段導(dǎo)入動物細胞中并裝配該DNA片段。加入來自YAC的抗藥性基因(所述基因含有約100kb的白斑樣(alphoid)序列，所述序列是人類染色體著絲粒的組分)和人端粒序列，并引入到人纖維肉瘤細胞系HT1080中(Ikenno等，Nature Biotech.(USA)，第16卷，第431-439頁，1998)。對于抗藥性細胞克隆，已經(jīng)建立了能夠自主復(fù)制/分配的人工染色體；然而，并不是引入的DNA序列自身在細胞中保留，而是發(fā)生了擴增后的重組，尚不清楚細胞所保留的序列結(jié)構(gòu)。
此外，上述研究目的是建立HAC，還沒有進行插入外源基因的研究。
(B)自發(fā)染色體片段的應(yīng)用染色體本身是基因的聚集體，具有自主復(fù)制/分配所需的元件。使用染色體或其片段作為基因轉(zhuǎn)移的工具，進行微細胞介導(dǎo)的染色體轉(zhuǎn)移，以便引入Mb數(shù)量級的巨大基因，這超出了現(xiàn)有克隆載體例如YAC的容量。將含有抗體基因的14號、2號和22號人類染色體的片段轉(zhuǎn)移到小鼠胚胎干細胞中，結(jié)果顯示產(chǎn)生了嵌合體，所述抗體基因在小鼠中表達，在嵌合體中人類染色體的片段被穩(wěn)定保留并且通過種系遺傳給下一代(Tomizuka等，Nature Genet.(USA)，第16卷，第133-143頁，1997；Tomizuka等，P.N.A.S.(USA)，第97卷，第722-727頁，2000)。該實例證明了使用攜帶待表達基因的染色體作為載體的有效性。然而，對每個靶基因都修飾染色體是不現(xiàn)實的。最好是提供用作基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的染色體載體(靶基因容易插入到其中)，以便采用染色體片段作為載體并增加它們的通用性。
這樣，進行了使用天然染色體片段來表達外源基因的嘗試。已經(jīng)報道了使用來自1號人類染色體的經(jīng)輻射染色體片段(5.5Mb)作為載體，引入IL-2基因(cDNA)或CFTR基因(人類基因組DNA)并進行功能性表達(參見例如Guiducci等，Hum.Mol.Genet.(UK)，第8卷，第1417-1424頁，1999；Auriche等，EMBO Rep.(UK)，第2卷，第102-107頁，2002)。用倉鼠成纖維細胞(CHO)作為宿主。在將靶基因引入到片段化微型染色體(minichromosome)中時，使用白斑樣DNA，希望它能插入到1號人類染色體的著絲粒結(jié)構(gòu)域中；然而，沒有鑒定出具體的插入位點或拷貝數(shù)。IL-2依賴性小鼠原淋巴細胞以不依賴IL-2的方式成為可繁殖細胞，這是與保留IL-2微型染色體的CHO細胞融合的結(jié)果，表明功能性互補。此外，在保留了CFTR微型染色體的CHO細胞中觀察到用cAMP刺激釋放氯離子，而通過加入CFTR抑制劑可抑制氯離子的釋放。這表明了用染色體片段作為載體的外源基因插入/表達系統(tǒng)，但是其結(jié)構(gòu)尚不清楚，而且外源DNA的插入不受控制。
來自經(jīng)輻射的雜交細胞的染色體片段(2-3Mb)在倉鼠細胞中穩(wěn)定保留，所述片段含有1號人類染色體的著絲粒和部分長臂以及SDHC(琥珀酸脫氫酶復(fù)合體，亞基C)基因。通過在SDHC區(qū)的同源重組，插入G418抗性基因。用小鼠細胞(L和3T3)進行X-射線細胞融合，得到G418抗性雜交細胞(Au等，Cytogenet.Cell Genet，(Switzerland)，第86卷，第194-203頁，1999)。該HAC的結(jié)構(gòu)是未知的，因為它使用天然染色體片段。利用同源重組以位點專一方式將外源基因引入到HAC中，盡管該方法的插入效率低而且對通用目的來說是不適合的。因為沒有采用微核細胞融合法，所以除了靶染色體片段外，還存在宿主染色體。這僅僅說明采用染色體作為載體表達外源基因的想法。
此外，通過將loxP位點隨機插入到天然染色體片段(環(huán)狀)中，用抗藥性基因(hprt)作為指示物的重建，插入外源基因(潮霉素抗性基因)(Voet等，Genome Res.(USA)，第11卷，第124-136頁，2001)。該環(huán)狀染色體包括20號人類染色體的著絲粒和部分1號染色體(p22區(qū))；然而，其序列尚未鑒定出來，因為它是天然片段。通過與Cre/loxP系統(tǒng)的位點專一重組引入外源基因，盡管不知道其組成，因為loxP插入到染色體中是隨機發(fā)生的。同時，通過微細胞融合，已經(jīng)顯示出向小鼠ES細胞的轉(zhuǎn)移、嵌合體的產(chǎn)生和遺傳到子代。盡管將靶基因插入到人工染色體的方法是簡單的，除了采用天然染色體片段以及l(fā)oxP位點是隨機插入的以外，用來自患者(輕微智力低下)的異常染色體從安全方面來說是困難的并且是不切實際的。
(C)自頂向下法當(dāng)天然染色體片段轉(zhuǎn)移到細胞中時，來自該轉(zhuǎn)移染色體片段的許多基因(不是靶基因)將會同時表達。在小鼠ES細胞的實驗中，已知其穩(wěn)定性因所用的人類染色體不同而不同，細胞在嵌合體中保留引入的染色體片段的能力隨染色體片段大小的增加而下降。這表明額外基因表達會破壞保留染色體片段的宿主細胞的繁殖。因此認為可以通過染色體修飾去除額外基因，以較高比率保留引入的染色體片段。
已經(jīng)描述了通過引入克隆的端粒序列、通過同源重組(端粒截短)而縮短染色體的技術(shù)，作為缺失部分染色體的方法(Itzhaki等，NatureGenet.(USA)，第2卷，第283-287頁，1992)。然而，大多數(shù)種類的動物的體細胞具有極低的同源重組頻率，所以需要進行大量工作才能獲得重組體。用具有高頻同源重組的雞細胞系DT40作為宿主，可以使染色體修飾更有效(Kuroiwa等，Nucleic Acids Res.(UK)，第26卷，第3447-8頁，1998)。通過微細胞融合法，接著通過端粒截短，將人類X染色體轉(zhuǎn)移到DT40細胞系中(Mills等，Hum.Mol.Genet.(UK)，第8卷，第751-761頁，1999)。通過去除短臂和長臂，建立了2.4Mb的線狀微型染色體。倉鼠細胞和人類細胞穩(wěn)定保留微型染色體，盡管拷貝數(shù)不同。盡管證實了HAC的穩(wěn)定性，但是沒有引入外源基因而使它們成為載體。
此外，在倉鼠細胞中的人類Y染色體因端粒截短而縮短，構(gòu)建約4Mb的微型染色體，該微型染色體在宿主細胞中穩(wěn)定保留(Heller等，P.N.A.S.(USA)，第93卷，第7125-7130頁，1996)。該微型染色體通過微細胞融合法轉(zhuǎn)移到小鼠ES細胞中，但是不穩(wěn)定。當(dāng)產(chǎn)生嵌合小鼠時，因為通過染色體重建整合小鼠著絲粒序列的衍生微型染色體而在ES細胞中獲得穩(wěn)定性(Shen等，Hum.Mol.Genet.(UK)，第6卷，第1375-1382頁，1997)，證實了種系遺傳(Shen等，Curr.Biol.(UK)，第10卷，第31-34頁，2000)。在小鼠中顯示嵌合染色體被保留，但是因為染色體重建所以不清楚其結(jié)構(gòu)，而且沒有進行外源基因引入/表達的研究。
(2)將外源基因插入到HAC中與如上所述構(gòu)建HAC作為載體同等重要的是建立將靶基因引入HAC的方法。然而，如上所述，HAC自身的構(gòu)建尚未完成，而且對于外源基因的引入，僅僅表明了抗藥性基因的隨機插入；除此之外還沒有進行詳細分析。
已經(jīng)證實來自14號人類染色體的自發(fā)片段SC20在小鼠和種系遺傳中的穩(wěn)定性，該片段經(jīng)分離而產(chǎn)生保留人抗體重鏈基因的小鼠。通過相互易位，建立了Mb數(shù)量級的克隆染色體區(qū)(包括抗體輕鏈基因的2號和22號人類染色體的區(qū)域)的方法(染色體克隆)，其中利用Cre/loxP系統(tǒng)(Kuroiwa等，Nature Biotech.(USA)，第18卷，第1086-1090頁，2000)。該方法的目標(biāo)是建立不含不必要基因的限定結(jié)構(gòu)的HAC，而且當(dāng)用于大小超過其它克隆載體(例如YAC)容量的巨大基因(例如抗體基因)時，它是有效的。
在各種情況下，迄今為止尚沒有建立滿足以下條件的HAC載體系統(tǒng)1)已經(jīng)鑒定結(jié)構(gòu)并去除不必要基因，2)在培養(yǎng)細胞和個體中可以穩(wěn)定保留HAC載體，和3)可以容易地向其中引入外源DNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供人類人工染色體載體及其制備方法，所述載體在細胞中穩(wěn)定保留、允許大的外源基因插入并可導(dǎo)入細胞中。
為了解決上述問題，本發(fā)明人已經(jīng)進行了如下深入的研究1)建立不含額外基因并且可以在動物細胞中穩(wěn)定保留的染色體載體，和2)建立表達系統(tǒng)，即通過提供所述染色體載體的克隆位點并且將靶基因插入到該克隆位點作為表達盒。具體地講，通過去除其長臂的已知基因，從21號人類染色體制備修飾染色體，證實在長期傳代培養(yǎng)中保留修飾染色體的DT40雜交細胞的穩(wěn)定性，以位點專一方式將loxP序列和hCMV啟動子插入到修飾染色體的長臂近側(cè)區(qū)，利用Cre/loxP系統(tǒng)將GFP基因引入修飾染色體中并證實GFP的表達。本發(fā)明人從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，通過建立基于來自21號人類染色體片段的HAC載體，可以解決上述問題，因而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明概述如下。
在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種包含21號人類染色體片段或14號人類染色體片段的人類人工染色體載體，其中所述染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)已經(jīng)缺失。
在本發(fā)明的一個實施方案中，21號人類染色體的片段大小約為2-16Mb，優(yōu)選約為2-6Mb。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，21號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)例如在21q11區(qū)內(nèi)缺失，優(yōu)選在AL163204缺失。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，21號人類染色體的短臂遠側(cè)區(qū)例如在21p區(qū)內(nèi)缺失，優(yōu)選在AL163201缺失。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，14號人類染色體的片段大小約為20Mb，優(yōu)選約為19Mb或更小，更優(yōu)選18Mb或更小。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)例如在14q區(qū)內(nèi)缺失，優(yōu)選在AL157858缺失，更優(yōu)選在AL512310缺失。
此外，14號人類染色體的短臂遠側(cè)區(qū)例如在14p區(qū)內(nèi)缺失，優(yōu)選在14p12區(qū)內(nèi)缺失，更優(yōu)選在選自以下的位置缺失OR4H12、OR4Q4、RNR2、OR4L1、RNU6C、FDPSL3、K12T、C14orf57、OR6S1、M195、OR4K14、MGC27165、LCH、OR10G3、OR4K3、OR4E2、H1RNA、ATP5C2、OR11H6和OR4M1。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，本發(fā)明的人類人工染色體載體具有在21號人類染色體或14號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)和/或短臂近側(cè)區(qū)插入的位點專一重組酶識別位點。在一個優(yōu)選實施方案中，位點專一重組酶識別位點插入到比21號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)內(nèi)的AL163203更近的區(qū)域或者是比14號人類染色體長臂近側(cè)區(qū)內(nèi)的AL157858更近的區(qū)域，更優(yōu)選插入到比AL512310缺失位點更近的區(qū)域或者比14號人類染色體短臂近側(cè)區(qū)內(nèi)的14p12區(qū)內(nèi)缺失位點更近的區(qū)域。此外，在一個優(yōu)選實施方案中，位點專一重組酶是Cre酶，且位點專一重組酶的識別位點是loxP序列。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)的缺失是通過被人工端粒序列取代。
在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供制備人類人工染色體載體的方法，所述方法包括下述步驟(a)獲得保留21號人類染色體或14號人類染色體的細胞；(b)缺失21號人類染色體或14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)；和(c)將位點專一重組酶識別位點插入到21號人類染色體或14號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)和/或短臂近側(cè)區(qū)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，在步驟(a)中，保留21號人類染色體或14號人類染色體的細胞具有高同源重組效率。在一個優(yōu)選實施方案中，具有高同源重組效率的細胞來自雞DT40細胞。
在本發(fā)明的一個實施方案中，在步驟(b)中，21號人類染色體或14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)的缺失是通過被人工端粒序列取代。在一個優(yōu)選實施方案中，21號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)在AL163204缺失，而短臂遠側(cè)區(qū)在AL163201被去除。在另一個優(yōu)選實施方案中，14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)在14q區(qū)內(nèi)被去除，而短臂遠側(cè)區(qū)在14p12區(qū)內(nèi)缺失。在又一個優(yōu)選實施方案中，14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)在AL157858缺失，更優(yōu)選在AL512310缺失，而短臂遠側(cè)區(qū)在選自以下的位置缺失OR4H12、OR4Q4、RNR2、OR4L1、RNU6C、FDPSL3、K12T、C14orf57、OR6S1、M195、OR4K14、MGC27165、LCH、OR10G3、OR4K3、OR4E2、H1RNA、ATP5C2、OR11H6和OR4M1。
在又一個實施方案中，在步驟(c)中，位點專一重組酶是Cre酶，且位點專一重組酶的識別位點是loxP序列。
在又一個方面，位點專一重組酶的識別位點可以插入到例如比21號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)內(nèi)的AL163203更近的區(qū)域或者插入到比14號人類染色體的AL157858更近的區(qū)域，更優(yōu)選插入到比AL512310缺失位點更近的區(qū)域或者比14號人類染色體短臂近側(cè)區(qū)內(nèi)的14p12區(qū)內(nèi)缺失位點更近的區(qū)域。
在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供一種通過上述方法獲得的人類人工染色體載體。
在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供保留上述人類人工染色體載體的細胞。
在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供制備含有外源DNA的人類人工染色體載體的方法，所述方法還包括在上述方法中描述的下述步驟(d)(d)在位點專一重組酶存在下，將外源DNA插入到21號人類染色體或14號人類染色體中。
在第六方面，本發(fā)明提供一種通過上述方法獲得的含有外源DNA的人類人工染色體載體。
在第七方面，本發(fā)明提供保留包含外源DNA的人類人工染色體載體的細胞。
在第八方面，本發(fā)明提供一種藥用組合物，所述組合物包含保留含外源DNA的人類人工染色體載體的細胞。上述外源DNA可以是編碼以下蛋白的基因紅細胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、凝血因子、血管假性血友病因子(von Willebrandv factor，vWF)、肌營養(yǎng)不良蛋白、多巴胺合酶、胰島素、胰島素樣生長因子(IGF)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)、抗體、端粒酶、粒細胞集落刺激因子、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子、免疫球蛋白、生長激素、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素8、白介素9、白介素10、白介素11、白介素12、白介素15、CD40配體、干擾素、腺苷脫氨酶、α-1抗胰蛋白酶、鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶、嘌呤核苷酸磷酸化酶、生長抑制因子(GIF)、腫瘤壞死因子(TNF)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤蛋白M、Flt3配體(Flt3L)、基質(zhì)衍生因子(SDF)、干細胞生長因子(SCF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素(angiopoietin)、神經(jīng)生長因子(NGF)、骨形態(tài)發(fā)生因子(BMP)、活化素、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)和Wnt。
在第九方面，本發(fā)明提供將外源DNA導(dǎo)入受體細胞的方法，所述方法包括下述步驟(a)獲得保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞；(b)缺失21號人類染色體或14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)；(c)將位點專一重組酶識別位點插入到21號人類染色體或14號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)和/或短臂近側(cè)區(qū)中；(d)在位點專一重組酶存在下，將外源DNA插入到21號人類染色體或14號人類染色體中；(e)從保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞制備微細胞；(f)使所述微細胞和受體細胞融合；和(g)證實所述外源DNA導(dǎo)入融合的受體細胞中。
在本發(fā)明的一個實施方案中，上述受體細胞是動物細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞。此外，上述受體細胞可以是多能細胞(例如胚胎干細胞(ES細胞))和間充質(zhì)干細胞以及組織干細胞/前體細胞。
在第十方面，本發(fā)明提供制備表達外源DNA的細胞的方法，所述方法包括下述步驟(a)獲得保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞；(b)缺失21號人類染色體或14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)；(c)將位點專一重組酶識別位點插入到21號人類染色體或14號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)和/或短臂近側(cè)區(qū)中；(d)在位點專一重組酶存在下，將外源DNA插入到21號人類染色體或14號人類染色體中；(e)從保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞制備微細胞；(f)使所述微細胞和受體細胞融合；和(g)在融合的受體細胞中選擇表達所述外源DNA的細胞。
在本發(fā)明的一個實施方案中，上述受體細胞是動物細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞。此外，上述受體細胞可以是多能細胞(例如胚胎干細胞(ES細胞))和間充質(zhì)干細胞以及組織干細胞/前體細胞。
在本發(fā)明的第十一方面，本發(fā)明提供蛋白的制備方法，所述方法包括下述步驟(a)獲得保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞；(b)缺失21號人類染色體或14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)；(c)將位點專一重組酶識別位點插入到21號人類染色體或14號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)和/或短臂近側(cè)區(qū)中；(d)在位點專一重組酶表達下，將編碼蛋白的外源DNA插入到上述21號人類染色體或14號人類染色體中；(e)從保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞制備微細胞；(f)使所述微細胞和受體細胞融合；
(g)將所述融合的受體細胞在培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)；和(h)從所得培養(yǎng)物中收集所述蛋白。
在本發(fā)明的一個實施方案中，上述蛋白的實例可以包括紅細胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、凝血因子、因子VIII、因子IX、血管假性血友病因子(vWF)、肌營養(yǎng)不良蛋白、多巴胺合酶、胰島素、胰島素樣生長因子(IGF)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)、抗體、端粒酶、粒細胞集落刺激因子、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子、免疫球蛋白、生長激素、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素8、白介素9、白介素10、白介素11、白介素12、白介素15、CD40配體、干擾素、腺苷脫氨酶、α-1抗胰蛋白酶、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶、嘌呤核苷酸磷酸化酶、生長抑制因子(GIF)、腫瘤壞死因子(TNF)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤蛋白M、Flt3配體(Flt3L)、基質(zhì)衍生因子(SDF)、干細胞生長因子(SCF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素、神經(jīng)生長因子(NGF)、骨形態(tài)發(fā)生因子(BMP)、活化素、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)和Wnt。
本文所用的術(shù)語定義如下。
本文所用的術(shù)語“人類人工染色體載體”或“HAC載體”是指基于人類染色體而產(chǎn)生的人工染色體。
本文所用的術(shù)語“人類染色體”是指來自人類細胞天然DNA和蛋白的復(fù)合體。通常有23種(男性有24種)共46條染色體，每條都含有約50-300Mb DNA。術(shù)語“人類染色體的片段”或“人類染色體片段”是指能作為獨立染色體而穩(wěn)定復(fù)制和分配的染色體部分，其片段大小通常為1Mb或更大，有時為1Mb或更小。
對于染色體來說，術(shù)語“長臂”和“短臂”是指染色體著絲粒兩邊的臂，按其長度稱為長臂(q)和短臂(p)。此外，對于人類染色體來說，術(shù)語“長臂遠側(cè)區(qū)”或“長臂近側(cè)區(qū)”是指相對于著絲粒而言在長臂上遠端位置的區(qū)域(即在端粒一側(cè))或近端位置的區(qū)域。具體地講，就21號人類染色體而言，長臂遠側(cè)區(qū)是指AL163204的端粒一側(cè)，而長臂近側(cè)區(qū)是指AL163203的著絲粒一側(cè)；而就14號人類染色體而言，長臂遠側(cè)區(qū)是指AL132642的端粒一側(cè)，而長臂近側(cè)區(qū)是指AL157858的著絲粒一側(cè)。此外，術(shù)語“短臂遠側(cè)區(qū)”或“短臂近側(cè)區(qū)”是指相對于著絲粒而言在短臂上遠端位置的區(qū)域或近端位置的區(qū)域。具體地講，就21號人類染色體而言，短臂遠側(cè)區(qū)和近側(cè)區(qū)是以AL163201為分界線；而就14號人類染色體而言，它們以核糖體RNA區(qū)為分界線。
本文所用的術(shù)語“位點專一重組酶”和“位點專一重組酶的識別位點”是用來描述這種現(xiàn)象的術(shù)語其中酶識別專一識別位點并在該識別位點上以專一方式引起DNA重組，而且它們分別是指引起位點專一重組的酶和由該酶識別的位點。
本文所用的術(shù)語“人工端粒序列”是指人工添加的端粒序列。按照本發(fā)明，例如可以通過端粒截短來添加人工端粒序列。
本文所用的術(shù)語“外源DNA”是指從外面引入靶細胞內(nèi)的DNA，也指基因編碼DNA(希望所述DNA進行表達，用于制備材料、功能性修飾或功能性分析)，以及其他功能序列(例如啟動子序列)，它可以是同源或異源的。
在描述人類人工染色體載體的轉(zhuǎn)移或引入時，本文所用的術(shù)語“供體細胞”和“受體細胞”是指原來保持所述載體的細胞(供體細胞)和從供體細胞將所述載體轉(zhuǎn)移到其中的細胞(受體細胞)。
附圖簡述

圖1是一幅示意圖，顯示通過端粒截短而缺失21號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)的方法。
圖2顯示PCR分析結(jié)果，表明在嘌呤霉素抗性DT40克隆中21號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)的缺失。
圖3是一幅照片，顯示DNA印跡分析結(jié)果，表明在嘌呤霉素抗性DT40克隆中長臂遠側(cè)區(qū)的缺失，或者以位點專一方式引入的人工端粒序列。
圖4a和圖4b是照片，顯示FISH分析結(jié)果，表明在嘌呤霉素抗性DT40克隆中長臂遠側(cè)區(qū)的缺失。圖4a顯示21號人類染色體(箭頭)保留在DT40細胞中，而圖4b顯示21號人類染色體片段(箭頭)中的長臂已經(jīng)缺失。
圖5是一幅示意圖，顯示以位點專一方式將loxP序列插入到21號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)的方法，其中所述長臂中遠側(cè)區(qū)已經(jīng)缺失。
圖6A和圖6B是照片，顯示DNA印跡分析結(jié)果(A)和PCR分析結(jié)果(B)，用于篩選殺稻瘟素抗性DT40克隆的同源重組體(其中l(wèi)oxP序列以位點專一方式引入到21號人類染色體中的克隆)。
圖7a和圖7b是照片，顯示FISH分析結(jié)果，表明殺稻瘟素抗性CHO-K1克隆中保留了21號人類染色體(片段)。圖7a顯示在端粒截短前的全長(完整)21號人類染色體，而圖7b顯示21號人類染色體的片段，其中長臂遠側(cè)區(qū)已經(jīng)缺失。
圖8是一幅示意圖，顯示以位點專一方式將GFP構(gòu)建體插入到21號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)的loxP序列中的方法。
圖9是一幅熒光顯微鏡照片，顯示GFP在G418抗性CHO-K1克隆中表達。
圖10是一幅照片，顯示DNA印跡分析結(jié)果，表明在G418抗性CHO-K1克隆的loxP序列發(fā)生了位點專一重組。
圖11是一幅示意圖，顯示通過端粒截短而缺失21號人類染色體短臂遠側(cè)區(qū)的方法。
圖12顯示PCR分析結(jié)果，表明在潮霉素抗性DT40克隆中21號人類染色體短臂遠側(cè)區(qū)的缺失。
圖13是一幅照片，顯示DNA印跡分析結(jié)果，表明在潮霉素抗性DT40克隆中短臂遠側(cè)區(qū)的缺失，或者人工端粒序列以位點專一方式的引入。
圖14是一幅照片，顯示PCR分析結(jié)果，表明在潮霉素抗性DT40克隆中短臂遠側(cè)區(qū)的缺失，或者人工端粒序列以位點專一方式的引入。
圖15a和圖15b是照片，顯示FISH分析結(jié)果，表明在潮霉素抗性DT40克隆中短臂遠側(cè)區(qū)的缺失。圖15a顯示缺乏長臂的21號人類染色體(箭頭)保留在DT40細胞中，而圖15b顯示21號人類染色體的片段(箭頭)中長臂和短臂都已缺失。
圖16顯示這樣的結(jié)果KH21E細胞培養(yǎng)物的上清液中產(chǎn)生的人EPO具有類似于重組人EPO蛋白(rhEPO)的細胞增殖活性。
圖17是一幅照片，顯示FISH分析結(jié)果，表明殺稻瘟素抗性HT1080細胞克隆中保留了21號人類染色體的片段(箭頭)。
圖18a和圖18b是熒光顯微鏡照片(圖18a)和相差顯微鏡照片(圖18b)，顯示GFP在G418抗性HT1080克隆中表達。
圖19顯示PCR分析結(jié)果，表明將來自21號人類染色體的HAC載體引入到G418或潮霉素抗性E14克隆中。
圖20a和圖20b是照片，顯示FISH分析結(jié)果，表明在抗藥性E14細胞克隆中保留了21號人類染色體的片段。圖20a顯示缺乏長臂遠側(cè)區(qū)的染色體片段(箭頭)，而圖20b顯示染色體片段(箭頭)中短臂遠側(cè)區(qū)也已缺失。
圖21是一幅照片，顯示FISH分析結(jié)果，表明在抗藥性hiMSC細胞克隆中保留了21號人類染色體片段(箭頭)。
圖22a和圖22b是熒光顯微鏡照片，顯示當(dāng)保留HAC的ES細胞在體外被誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細胞時，GFP的表達(圖22a)和用抗β微管蛋白抗體的染色(圖22b)。
實施本發(fā)明的最佳方式下面將詳細描述本發(fā)明。本發(fā)明要求于2002年10月4日申請的日本專利申請第2002-292853號的優(yōu)先權(quán)，本發(fā)明說明書和/或其附圖通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明涉及人類人工染色體載體(在下文也稱為“HAC載體”)，所述HAC載體來自21號或14號人類染色體，并且包含21號人類染色體的片段或14號人類染色體的片段，其中所述染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)已經(jīng)缺失。
對于21號人類染色體來說，在公用數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公開了完整長臂和不包含著絲粒區(qū)的部分短臂的核苷酸序列(例如參見http//hgp.gsc.riken.go.jp/cbr21/index.html(Riken Genomic SciencesCenter，Human Genome Research Group))。通過運用這些序列信息，可以通過同源重組，以位點專一方式插入下文所述的人工端粒序列或loxP序列。此外，約48Mb的21號染色體在缺失長臂遠側(cè)區(qū)后，將會減少三分之一，至約為16Mb；在長臂和短臂遠側(cè)區(qū)均缺失后，最終將構(gòu)建不含未知基因的約2Mb的HAC載體。
在將21號人類染色體轉(zhuǎn)移到小鼠ES細胞而形成嵌合小鼠的先前的實驗中，轉(zhuǎn)移的染色體片段遺傳給下一代。人們認為，含有妨礙宿主細胞功能的轉(zhuǎn)移染色體區(qū)的消除導(dǎo)致保持穩(wěn)定(Kazuki等，J.Hum.Genet.，46，600，2001)。另一方面，就人類Y染色體而言，該染色體在小鼠ES細胞中是不穩(wěn)定的，但是通過摻入來自小鼠染色體的白斑樣DNA(該DNA是著絲粒的組分)，可以達到保持穩(wěn)定(Shen等，Hum.Mol.Genet，.61375，1997)。這表明雜交細胞中人類染色體的穩(wěn)定性隨穩(wěn)定性所涉及的染色體和著絲粒的不同而不同。因為先前的實驗證明，21號人類染色體的著絲粒(大小約為2MbTriowell等，Hum.Mol.Genet.，21639-1649，1993；Wang等，Genome Res.91059-1073，1999)在小鼠細胞/個體中起作用，所以基于21號人類染色體片段制備的含有著絲粒區(qū)的本發(fā)明HAC載體有望在雜交細胞中穩(wěn)定保留。
同樣，在公用數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公開了14號人類染色體的部分核苷酸序列。此外，人們認為，類似于21號人類染色體，HAC載體中來自14號人類染色體的自發(fā)片段(SC20；Tomizuka等，P.N.A.S.97722-727，2000)也可能降低大小。對于SC20，已經(jīng)報道了缺乏14號人類染色體長臂大部分的遠側(cè)區(qū)和近側(cè)區(qū)(Tomizuka等，P.N.A.S.97722-727，2000；Kuroiwa等，Nature Biotech.(USA)，第18卷，第1086-1090頁，2000)。具體地講，SC20保留14號人類染色體長臂從端粒序列到AL137229(GenBank登記號)的區(qū)域以及在著絲粒一側(cè)從AL121612(GenBank登記號)到AL157858(GenBank登記號)的端粒一側(cè)的區(qū)域，包括24-26kb。此外，在AL137229(GenBank登記號)和AL121612(GenBank登記號)之間的區(qū)域以及在端粒一側(cè)和著絲粒的AL157858(GenBank登記號)的位點24-26kb之間的區(qū)域缺失。另一方面，14號人類染色體的短臂區(qū)被保留。SC20在包括人類細胞和小鼠細胞在內(nèi)的細胞系中被穩(wěn)定保留(Shinohara等，Chromosome Res.，8713-725，2000)，在其中l(wèi)oxP位點插入到核糖體RNA區(qū)(位于14號人類染色體的短臂中)的修飾SC20中也被穩(wěn)定保留(Kuroiwa等，Nature Biotech.(USA)，第18卷，第1086-1090頁，2000)。此外，HAC(其中來自22號人類染色體片段的約10Mb不穩(wěn)定染色體區(qū)易位到修飾SC20的loxP位點)在小鼠ES細胞和小鼠個體中可穩(wěn)定保留。SC20的問題是，它含有來自14號染色體14q32區(qū)的許多基因，但是通過按照本文所述方法降低SC20的大小后，它可以在各種細胞類型中穩(wěn)定保留，并且可以獲得不含不必要基因的HAC載體。
下面描述本發(fā)明HAC載體的制備、將外源DNA插入到所述載體中以及HAC載體的應(yīng)用。
1.人類人工染色體(HAC)載體的制備如上所述，本發(fā)明的HAC載體是基于21號人類染色體或14號人類染色體而產(chǎn)生的。本發(fā)明HAC載體的制備包括下述步驟(a)-(c)(a)獲得保留21號人類染色體或14號人類染色體的細胞；(b)缺失21號人類染色體或14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)；和(c)將位點專一重組酶識別位點插入到21號人類染色體或14號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)和/或短臂近側(cè)區(qū)。
在此，步驟(b)和(c)的順序可以互換。
步驟(a)保留人類染色體的細胞的制備為了制備本發(fā)明HAC載體，制備保留人類染色體(例如21號人類染色體或14號人類染色體)的細胞。所述細胞最好是僅保留21號人類染色體或14號人類染色體的細胞，并且對于后面的操作來說具有高同源重組效率。因此，首先制備滿足這些條件的細胞。
例如，可以通過篩選保留人類單條染色體的已知小鼠A9雜交細胞文庫，得到保留21號人類染色體或14號人類染色體的克隆，并且將所述染色體轉(zhuǎn)移到具有高同源重組效率的細胞中，來制備保留人類染色體的細胞。小鼠A9雜交細胞文庫含有帶抗藥性基因標(biāo)記的人類單條染色體，并且已經(jīng)描述于例如WO00/10383，Tanabe，H.等，(Chromosome Res.，8319-334，2000)中。此外，保留21號人類染色體和14號人類染色體的小鼠A9雜交細胞已經(jīng)在日本研究生物資源保藏中心(the Japanese Collection of research Bioresources(JCRB))注冊，注冊號分別為JCRB2221(細胞名稱A9(Hygro21))和JCRB2214(細胞名稱A9(Hygro14))，一并提供可用的詳細信息和培養(yǎng)條件。
將如上獲得的小鼠A9雜交細胞中保留的人類染色體轉(zhuǎn)移到具有高同源重組效率的細胞中?！熬哂懈咄粗亟M效率的細胞”是指當(dāng)經(jīng)歷同源重組時，顯示出高同源重組頻率的細胞，所述細胞的實例包括雞DT40細胞(Dieken等，Nature Genetics，12174-182，1996)和小鼠ES細胞(Shinichi Aizawa，Biomanual Series 8，Gene Targeting，Yodo-sha Co.，Ltd.，1995)。為了容易操作，最好采用雞DT40細胞用于本發(fā)明的方法。
通過本領(lǐng)域已知的染色體轉(zhuǎn)移的方法，進行染色體的轉(zhuǎn)移。例如，用于引入僅一個所需染色體的方法包括微細胞法，該方法描述于Koi等(Koi等，Jpn.J.Cancer Res.，80413-418，1973)。該方法包括分離被化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的微細胞(所述化學(xué)物質(zhì)在某些細胞中抑制紡錘體的形成)，然后將這些微細胞與受體細胞融合，以引入若干染色體。對于采用該微細胞法轉(zhuǎn)移人類染色體的具體程序，參見例如WO97/07671和WO00/10383。因此，可以制備保留21號人類染色體或14號人類染色體的細胞。
或者，在本發(fā)明的另一方面，可以使用保留自發(fā)片段化染色體(例如14號人類染色體片段(SC20))而不是完整21號人類染色體或14號人類染色體的細胞。保留SC20染色體片段的雞DT-40細胞(SC20)已經(jīng)于2001年5月9日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(the National Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology，the International Patent Organism Depositary(Chuo 6，Higashi 1-1-1，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan))，保藏號為FERM BP-7583。
步驟(b)人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)的缺失為了從保留人類染色體的細胞制備HAC載體，使人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)缺失?？梢赃M行染色體的缺失，即通過本領(lǐng)域已知方法，優(yōu)選通過描述于WO00/10383的用人工端粒序列取代(端粒截短)的方法。用于缺失長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)的具體方法包括例如在保留人類染色體的細胞中構(gòu)建攜帶人工端粒序列的打靶載體，獲得其中人工端粒序列已經(jīng)通過同源重組插入到染色體上所需位點的克隆，而且通過端粒截短獲得缺失突變體(參見例如Itzhaki等，Nature Genet.，2283-287，1992；Brown，P.N.A.S.，937125，1996)。染色體上所需位點是指長臂遠側(cè)區(qū)或短臂遠側(cè)區(qū)有待缺失的切割位點，在該位點通過同源重組插入人工端粒序列，并且用人工端粒序列取代長臂或短臂的遠側(cè)區(qū)(端粒截短)。當(dāng)構(gòu)建打靶載體時，并且當(dāng)缺失長臂遠側(cè)區(qū)時，可以通過設(shè)計靶序列來設(shè)定所需位點，例如，按照21號人類染色體上21q11區(qū)內(nèi)的核苷酸序列、優(yōu)選在AL163204(GenBank登記號)的核苷酸序列，來設(shè)計靶序列，使得端粒截短將會在靶序列的端粒一側(cè)發(fā)生，因此，在用于設(shè)計靶序列的位點切下長臂遠側(cè)區(qū)(參見例如Kuroiwa等，Nucleic Acid Research，263447，1998)。此外，當(dāng)缺失短臂遠側(cè)區(qū)時，可以按照21號人類染色體上21p區(qū)內(nèi)的核苷酸序列、優(yōu)選在AL163201(GenBank登記號)的核苷酸序列，來設(shè)計靶序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計靶序列，以便適當(dāng)?shù)禺a(chǎn)生所需HAC載體，而不限于上述區(qū)域。
此外，例如當(dāng)14號人類染色體的長臂序列在靠近著絲粒的位點而不是在SC20的位點上缺失時，可以按照AL157858區(qū)內(nèi)核苷酸序列來設(shè)計靶序列，以便讓端粒截短發(fā)生在靶序列的端粒一側(cè)，因此，在用來設(shè)計靶序列的位點上切下長臂遠側(cè)區(qū)。此外，例如當(dāng)短臂遠側(cè)區(qū)缺失時，可以按照14號人類染色體的14p區(qū)內(nèi)核苷酸序列、優(yōu)選按照14p12區(qū)內(nèi)核苷酸序列、更優(yōu)選按照以下核苷酸序列來設(shè)計靶序列OR4H12、OR4Q4、RNR2、OR4L1、RNU6C、FDPSL3、K12T、C14orf57、OR6S1、M195、OR4K14、MGC27165、LCH、OR10G3、OR4K3、OR4E2、H1RNA、ATP5C2、OR11H6或OR4M1(在線基因組數(shù)據(jù)庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi？ORG＝hum&CHR＝14&BEG＝0.00&ENI)由美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計靶序列，以便適當(dāng)?shù)禺a(chǎn)生所需HAC載體，而不限于上述區(qū)域。
此外，例如當(dāng)缺失完整14號人類染色體長臂序列時，可以按照14q區(qū)內(nèi)核苷酸序列、優(yōu)選按照AL512310(GenBank登記號)的核苷酸序列，來設(shè)計靶序列，使得端粒截短將在靶序列的端粒一側(cè)發(fā)生，因此，在用于設(shè)計靶序列的位點切下長臂遠側(cè)區(qū)。此外，例如當(dāng)缺失短臂遠側(cè)區(qū)時，可以按照14號人類染色體的14p區(qū)內(nèi)核苷酸序列、優(yōu)選按照在14p12區(qū)的核苷酸序列，更優(yōu)選按照以下核苷酸序列來設(shè)計靶序列OR4H12、OR4Q4、RNR2、OR4L1、RNU6C、FDPSL3、K12T、C14orf57、OR6S1、M195、OR4K14、MGC27165、LCH、OR10G3、OR4K3、OR4E2、H1RNA、ATP5C2、OR11H6或OR4M1(在線基因組數(shù)據(jù)庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi？ORG＝hum&CHR＝14&BEG＝0.00&ENI)由美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI提供)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計靶序列，以便適當(dāng)?shù)禺a(chǎn)生所需HAC載體，而不限于上述區(qū)域。
如上所述，已經(jīng)形成了缺失長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)的人類染色體片段，并且提供了保留這些染色體片段的細胞。通過如上所述降低染色體的大小，達到在細胞中的穩(wěn)定性。此外，染色體區(qū)可以缺失，估計它對保留HAC載體的細胞和下文描述的向其中導(dǎo)入HAC載體的細胞的功能/增殖具有副作用。
步驟(c)位點專一重組酶識別位點的插入為了制備本發(fā)明HAC載體，將位點專一重組酶識別位點插入到21號人類染色體或14號人類染色體中。可以在步驟(b)之前或之后進行步驟(c)，其順序并沒有具體限制。在21號人類染色體或14號人類染色體中，可以在缺失長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)之后插入位點專一重組酶識別位點，或者，可以在插入位點專一重組酶識別位點之后缺失長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)。
在本領(lǐng)域中，已知某種酶識別特定識別位點并在所述識別位點上專一誘導(dǎo)DNA重組，本發(fā)明利用所述酶和識別位點系統(tǒng)。所述系統(tǒng)的實例包括Cre/loxP系統(tǒng)(參見例如Sauer，B.等，P.N.A.S.，855166-5170，1988)。Cre是一種來自噬菌體P1的38KD蛋白，屬于重組酶Int(整合酶)家族。該酶識別約34bp的識別位點loxP序列，并在該位點專一誘導(dǎo)DNA重組。此外，已知兩個loxP序列之間的DNA缺失和易位的發(fā)生取決于該loxP序列的定位。專一識別序列和專一重組的其它系統(tǒng)包括來自芽殖酵母的重組酶FLP(Broach等，Cell.21501-508，1980)、來自噬茵體phiC31的整合酶(Thorpe等，P.N.A.S.，955505-5510，1998)和能夠在哺乳動物細胞中誘導(dǎo)DNA重組的酶(Koch等，Gene，249135-144，2000；Thyagarajan等，Mol.Cell.Biol.，213926-3934，2000)。
本領(lǐng)域已知用于基因重組的方法，例如同源重組方法，可以用于將位點專一重組酶識別位點插入到人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)和/或短臂近側(cè)區(qū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過考慮不必要基因的位置，能適當(dāng)?shù)卦O(shè)計位點專一重組酶識別位點的插入位置。例如，將位點專一重組酶識別位點插入到21號人類染色體或14號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)和/或短臂近側(cè)區(qū)中的任何位置。插入位置包括例如21號人類染色體長臂近側(cè)區(qū)內(nèi)的AL163203，以及比14號人類染色體長臂近側(cè)區(qū)內(nèi)的AL157858(GenBank登記號)更近的區(qū)域，更優(yōu)選比14號人類染色體長臂近側(cè)區(qū)內(nèi)的AL512310(GenBank登記號)缺失位點更近的區(qū)域或者比14號人類染色體短臂近側(cè)區(qū)內(nèi)的14p12區(qū)內(nèi)缺失位點更近的區(qū)域。
按照下面描述的用于引入外源DNA的方法，隨后引入報道基因，可以檢查所述基因的表達，以證實插入人類染色體上識別位點的適當(dāng)位置。
可以插入上述類型之一的一個或多個識別位點，或者來自不同系統(tǒng)的許多識別位點。如下所述，因為可以按位點專一方式引入外源DNA，可以通過將識別位點放在所需位點，來測定外源DNA的引入位置，既然HAC載體具有位點專一重組酶識別位點，所以外源DNA的引入位置將是穩(wěn)定的，不受位置效應(yīng)的影響。此外，引入外源DNA的方法既簡單又容易。此外，隨后可以通過插入許多來自不同系統(tǒng)的識別位點來順序引入多種外源DNA。
除了位點專一重組酶識別位點以外，通常可以將插入到構(gòu)建載體(例如啟動子和抗藥性基因)中的序列或元件插入到由如上人類染色體修飾而制備的HAC載體中。可以使用如上所述的同源重組方法，將所述序列或元件插入到HAC載體的所需位點上。
此外，通過在不含任何選擇藥物的培養(yǎng)液中，在一段較長的時期內(nèi)，傳代培養(yǎng)保留如上所述制備的HAC載體(21號人類染色體或14號人類染色體)的細胞，并且通過FISH法連續(xù)檢查HAC載體的保留率，本發(fā)明人已經(jīng)證實，HAC載體可以在宿主細胞(例如DT40細胞和CHO細胞)中穩(wěn)定保留。
2.將外源DNA引入到HAC載體中(步驟(d))在上述HAC載體的制備中，在位點專一重組酶存在下，可以進行插入外源DNA的步驟(d)，以將外源DNA引入到HAC載體中。步驟(d)應(yīng)接在步驟(c)后面，但是也可以在步驟(b)前面或接在其后。因此，應(yīng)該注意，本文中并沒有限制步驟(b)-(d)的順序。
外源DNA是指來自外面并導(dǎo)入細胞中的DNA，所述DNA編碼基因和其它功能序列。在本發(fā)明的實施方案中，待引入的外源DNA可以是任何DNA，所述DNA編碼用于表達所需材料生產(chǎn)、功能性修飾和功能性分析的基因或其它功能序列。其它功能序列是指起著表達基因作用的序列，例如啟動子、增強子和信號序列。
利用位點專一重組酶系統(tǒng)引入外源DNA。例如，構(gòu)建保留loxP序列(所述序列是Cre酶的識別位點)和外源DNA的打靶載體。然后，通過在保留HAC載體(21號人類染色體或14號人類染色體)的細胞中表達Cre酶，可以將外源DNA插入到HAC載體中，即通過與loxP序列和具有上述打靶載體的人工端粒序列相鄰區(qū)域的位點專一重組(Kuroiwa等，Nature Biotech.，181086，2000)。
可以將保留位點專一重組酶識別位點(loxP序列)的環(huán)狀DNA插入到HAC載體中。因此，可以用現(xiàn)有載體(例如用于大腸桿菌的質(zhì)粒、BAC和PAC和用于酵母的環(huán)狀YAC)插入克隆DNA。此外，因為HAC載體是基于人類染色體的，所以所引入的外源DNA的大小將增加100kb數(shù)量級，使得可以引入含有基因表達調(diào)節(jié)區(qū)基因的基因組DNA以及插入到質(zhì)粒載體的cDNA，所述質(zhì)粒載體已經(jīng)常規(guī)用于表達實驗。
例如，在通過將外源DNA插入到HAC載體中而產(chǎn)生的含有外源DNA的HAC載體中，它的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)可以因插入而改變，或者含有外源DNA的HAC載體的完整大小可以不利地增加，所以待引入(插入)的外源DNA的大小通常約為10Mb至約1kb，優(yōu)選約3Mb至約2kb，更優(yōu)選約1Mb至約3kb。
因為使用載體以迫使cDNA表達的常規(guī)基因引入方法具有過量表達的副作用(例如細胞毒性和生長抑制)，所以在許多情況下沒能得到允許穩(wěn)定表達引入基因的細胞克隆。希望使用例如四環(huán)素的基因表達誘導(dǎo)系統(tǒng)來克服所述問題，并且在保持生理表達模式時人工控制表達?？梢氲牟迦際AC載體是大載體，保持穩(wěn)定拷貝數(shù)對于所述目的來說是合適的。
在從編碼基因的基因組區(qū)轉(zhuǎn)錄、剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、核外轉(zhuǎn)運和翻譯過程中，組織特異性/生理基因表達是受控的。一個基因具有許多啟動子，已知在轉(zhuǎn)錄起始位點的差異和剪接的不同會導(dǎo)致組織特異性同種型。克隆cDNA是來自基因的唯一的轉(zhuǎn)錄變異產(chǎn)物。含控制序列的基因區(qū)最好是作為基因組DNA引入，以重現(xiàn)生理基因表達。利用HAC載體達到了該目的。
因為證實當(dāng)從保留21號人類染色體片段的小鼠ES細胞產(chǎn)生嵌合體時，能遺傳給下一代，所以人們認為21號人類染色體的著絲粒被復(fù)制、分配和保留在小鼠細胞和小鼠中(Kazuki等，J.Hum.Genet.，46600，2001)。因此，很可能HAC載體同樣也在小鼠中被穩(wěn)定保留。
在人類基因組計劃中，分離基因組DNA作為BAC克隆，然后測定其核苷酸序列。因此，所述核苷酸序列已在數(shù)據(jù)庫(例如GenBank)中作為BAC注冊。分析基因功能的技術(shù)之一是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。通過將BAC插入到作為平臺的HAC載體中，可以在恒定條件下分析基因表達，而不會受到位置效應(yīng)的影響。因為許多BAC載體含有l(wèi)oxP序列，所以可以通過使用一個用于插入HAC載體的負選擇系統(tǒng)，將已知核苷酸序列的BAC容易地插入到HAC載體中作為一個盒。
也有其它用于將外源DNA引入到HAC載體中的方法和其它引入的優(yōu)點，下面是一些實例。
(1)通過相互易位引入染色體片段由Cre酶在loxP序列間的位點專一重組涉及在線狀染色體和環(huán)狀插入序列(外源DNA)情況下的插入反應(yīng)，但是相互易位反應(yīng)發(fā)生在線狀染色體間。采用此法，可以將不能克隆到環(huán)狀插入序列中的Mb級或更大的染色體片段引入到HAC載體中(Kuroiwa，Gene Ther.9708，2002)。
(2)攜帶插入序列的重組體的選擇方法在本發(fā)明的實例描述的方法中，將外源DNA插入到HAC載體中，采用了基于作為指示物的抗藥性基因重組的正選擇(參見WO00/10383關(guān)于重組體的正選擇)?；蛘撸梢圆捎眯剀占っ?更昔洛韋系統(tǒng)等負選擇，獲得攜帶插入序列的DNA(已插入了外源DNA的DNA)。在此情況下，在待插入的環(huán)狀DNA中僅能包括loxP序列。因為用于基因組計劃的BAC文庫含有l(wèi)oxP序列，所以可以容易地將已知序列的基因組克隆插入到HAC載體中，如果用于負選擇的所述系統(tǒng)能建立的話。
(3)多個插入序列的插入本發(fā)明中優(yōu)選使用的loxP序列是來自P1噬菌體的野生型序列，由Cre酶將環(huán)狀插入序列插入到HAC載體的loxP序列中的插入反應(yīng)是可逆的。在本發(fā)明的一個實例中，Cre酶是瞬時表達的，并且根據(jù)獲得的抗藥性選擇位點專一重組體，以得到攜帶插入序列的組成型DNA。一旦插入了環(huán)狀插入序列時，兩個loxP序列保留在HAC載體中。因此，如果Cre酶再表達的話，可以發(fā)生可逆反應(yīng)(環(huán)狀插入序列的切除)，這使得對于HAC載體的其它修飾(例如插入第二插入序列)難以進行。另一方面，可以限制反應(yīng)方向和特異性，這取決于變異型loxP序列與核苷酸取代的組合(Hoess等，Nucleic Acids Res.，141986；Araki等，Nucleic Acids Res.，25868，1997；Lee等，Gene，21655，1998)。通過使用這些變異型loxP序列，可以序貫地構(gòu)建插入許多環(huán)狀插入序列的系統(tǒng)，而不誘導(dǎo)如上所述的可逆反應(yīng)。
(4)拷貝數(shù)依賴性表達控制使用攜帶α-珠蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，分析隨機插入到宿主染色體中的基因拷貝數(shù)和mRNA表達水平之間的關(guān)系(Sharpe等，ProcNatl Acad Sci USA，9011262，1993)，顯示引入基因的表達水平和拷貝數(shù)之間沒有關(guān)系。這可能是因為被稱為位置效應(yīng)的現(xiàn)象引起，其中引入基因的表達水平顯著不同，它取決于所用的轉(zhuǎn)基因動物品系，而與引入基因的拷貝數(shù)不成比例關(guān)系，該現(xiàn)象在轉(zhuǎn)基因動物的基因轉(zhuǎn)移中頻繁發(fā)生。此外，將外源DNA插入到預(yù)先確定的loxP位點(該位點是引入到宿主染色體內(nèi)以排除引入基因的位置效應(yīng))，并且通過Cre-loxP重組反應(yīng)，將靶DNA單元從質(zhì)粒載體引入到轉(zhuǎn)基因小鼠中(Garrick等，Nature Genet.，1856，1998)；然而，沒有得到拷貝數(shù)依賴性表達控制。
同時，盡管在使用引入酪氨酸酶基因組區(qū)的YAC產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到酪氨酸酶在引入基因組區(qū)中的拷貝數(shù)依賴性表達(Schedl等，Nature，362258-261，1993)，但是人們認為，位置效應(yīng)是不同的，因為所采用的含有生理表達控制區(qū)的基因組不同于本發(fā)明，其中僅復(fù)制不含生理控制區(qū)的人工基因表達單元。此外，各種附加體載體是獨立于宿主染色體之外的，外源DNA插入位點是固定的，但是沒有達到嚴(yán)格控制載體拷貝數(shù)(Morlino等，ppl Environ Microbiol，654808-4013，1999；Cooper等，Proc Natl Acad Sci USA，946450-6455，1997)。
在本發(fā)明中，如實施例9所述，通過平行排列多拷貝靶基因(EPO)表達單元，并將它們引入到HAC載體上預(yù)先確定的位置(loxP位點)，可以得到拷貝數(shù)依賴性表達控制，而不引起宿主染色體的變化。
因此，按照本發(fā)明的方法，可以將作為外源DNA的多拷貝靶基因引入到所需細胞中，并且在所述細胞中以拷貝數(shù)依賴性方式表達所述靶基因，在用所述細胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物中達到先前困難的靶基因拷貝數(shù)依賴性表達，而沒有位置效應(yīng)。
3.將HAC載體轉(zhuǎn)移到細胞中可以將HAC載體或含有外源DNA的HAC載體從保留這些載體的細胞轉(zhuǎn)移到其它細胞中。待轉(zhuǎn)移這些載體的細胞包括但不限于動物細胞(哺乳動物細胞)。按照本發(fā)明，優(yōu)選使用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，該細胞已知可用于人類染色體的完整轉(zhuǎn)移(參見WO00/10383)。已知CHO細胞有效形成微細胞(參見例如Koi等，SCIENCE 260361，1993)，而HAC載體可進一步從CHO細胞轉(zhuǎn)移到其它細胞(不是CHO細胞的細胞)。此外，按照本發(fā)明，可以將HAC載體轉(zhuǎn)移到多能細胞中。術(shù)語“多能細胞”是指能通過特定過程分化成特定細胞或組織的細胞。多能細胞的實例包括能通過輸注到宿主胚胎并形成綜合胚(collective embryo)等操作，在嵌合動物中分化成兩種或多種細胞或組織類型的細胞，例如胚胎干細胞(ES細胞)、胚胎生殖細胞(EG細胞)和胚胎癌性細胞(EC細胞)。也包括能夠通過在補充了例如生長因子(不包括轉(zhuǎn)化生長因子，TGF)的誘導(dǎo)物培養(yǎng)液中培養(yǎng)而分化成骨細胞、軟骨細胞或脂肪細胞的細胞，更具體地講，包括體干細胞(不包括間充質(zhì)干細胞)。
本文所用的術(shù)語“胚胎干細胞”或ES細胞是指來自早期胚胎的培養(yǎng)細胞，其特征是能夠繁殖并同時仍保持未分化特性(全能性)。胚胎干細胞是通過在內(nèi)部細胞塊中培養(yǎng)細胞而建立的細胞系，是存在于動物原始胚胎的胚泡內(nèi)未分化干細胞，所述細胞不斷繁殖并同時保持未分化狀態(tài)。術(shù)語“胚胎生殖細胞”或EG細胞是指來自原始生殖細胞的培養(yǎng)細胞，其特征是能力幾乎相當(dāng)于以上胚胎干細胞。胚胎生殖細胞是通過培養(yǎng)得自受精后幾天至幾周(例如對于小鼠是在受精后約8.5天)的胚胎的原始生殖細胞而建立的細胞系，所述細胞不斷繁殖并同時保持未分化狀態(tài)。
此外，根據(jù)避免癌變的安全要求，用作人類基因和細胞治療和組織再生治療原料的細胞應(yīng)該是正常細胞，而不是無限增殖化細胞。盡管有大量實例是將染色體轉(zhuǎn)移到人類和其它動物的無限增殖化細胞和癌細胞中，但是迄今為止在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)在線參考文獻數(shù)據(jù)庫PubMed(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝PubMed)中搜索以下關(guān)鍵詞，沒有報道將染色體轉(zhuǎn)移到正常體細胞中的實例chromosome、transfer、human、normal、primary或somatic和cell；除了報道過轉(zhuǎn)移到正常牛胎成纖維細胞中以外(Kuroiwa等，NatureBiotech，20889，2002)。因此，通常認為，將染色體轉(zhuǎn)移到人類正常體細胞中是困難的。
本發(fā)明的實施例13和實施例14首次證明，將來自14號人類染色體片段或21號人類染色體的HAC載體轉(zhuǎn)移到人類正常成纖維細胞中的可行性。此外，按照本發(fā)明的方法，將來自14號人類染色體片段或21號人類染色體的HAC載體轉(zhuǎn)移到人類正常體細胞(而不是成纖維細胞)中是可行的。此外，用本發(fā)明方法產(chǎn)生的來自人類染色體的任何HAC載體都可以轉(zhuǎn)移到人類正常體細胞中，而不限于14號人類染色體或21號人類染色體。
可以用微細胞法將HAC載體轉(zhuǎn)移到細胞中。所述微細胞法可以按照以上“1.人類人工染色體(HAC)載體的制備”描述的方法進行。
此外，為了將HAC載體轉(zhuǎn)移到細胞中，可以在任何時期，在修飾人類染色體之前、期間或之后，將人類染色體(HAC載體)從起先保留人類染色體的細胞轉(zhuǎn)移到其它細胞中。
4.HAC載體的應(yīng)用本發(fā)明的目的是提供載體作為基本工具并提供使用所述載體的技術(shù)，預(yù)期其在從科學(xué)研究到工業(yè)等眾多領(lǐng)域中的作用。本發(fā)明HAC載體的特征為(1)它不插入到宿主染色體中而保持獨立(不用擔(dān)心宿主基因的變異或癌變)，(2)長期保持穩(wěn)定的拷貝數(shù)(不用擔(dān)心過量表達或表達不足)，和(3)有待引入的DNA長度不限(可以同時引入含有保證正常表達控制的DNA元件的基因和多基因)，這將使得用常規(guī)載體難以達到的大量工作能夠完成。HAC載體的應(yīng)用實例包括但不限于(1)用于在培養(yǎng)動物細胞中進行基因功能分析的載體，(2)用于對人類疾病進行基因治療的載體，(3)將基因轉(zhuǎn)移到人類器官干細胞和胚胎干細胞(ES細胞)的載體，和(4)用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物(例如產(chǎn)生人類疾病模型動物和將與KO動物結(jié)合的特定基因人源化)的載體。下面描述使用HAC載體的實例(1)將外源DNA導(dǎo)入受體細胞中，(2)產(chǎn)生表達外源DNA的細胞，(3)產(chǎn)生蛋白質(zhì)，(4)用于基因功能分析的載體，(5)用于將基因轉(zhuǎn)移到干細胞的載體，(6)用于產(chǎn)生培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞的載體，和(7)用于治療人類疾病的載體。
(1)將外源DNA導(dǎo)入受體細胞中因為可以將外源DNA導(dǎo)入細胞中的HAC載體，而且?guī)в胁迦胪庠碊NA的HAC載體可以轉(zhuǎn)移到其它細胞，所以外源DNA可以導(dǎo)入所需受體細胞中。將外源DNA導(dǎo)入受體細胞中包括例如下述步驟(a)獲得保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞；(b)缺失21號人類染色體或14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)；(c)將位點專一重組酶識別位點插入到21號人類染色體或14號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)和/或短臂近側(cè)區(qū)中；(d)在位點專一重組酶存在下，將外源DNA插入到21號人類染色體或14號人類染色體中；
(e)從保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞制備微細胞；(f)使所述微細胞和受體細胞融合；和(g)證實所述外源DNA導(dǎo)入融合的受體細胞中。
可以如上所述進行步驟(a)-(d)，而不限制它們的順序。
在步驟(e)和(f)中，用微細胞法將染色體片段從保留人類染色體的供體細胞轉(zhuǎn)移到受體細胞中。有待轉(zhuǎn)移的人類染色體可以是在步驟(b)-(d)中修飾染色體之前、期間或之后的任何人類染色體。因此，在步驟(d)中，例如可以采用微細胞法，在將外源DNA插入到人類染色體之前，將染色體從保留人類染色體的供體細胞轉(zhuǎn)移到受體細胞中。隨后，可以在受體細胞中進行步驟(d)的外源DNA插入步驟，以使受體細胞保留插入有外源DNA的人類染色體。這些步驟可以按任何其它順序進行，步驟(d)-(f)的順序并不限于上述順序。
按照以上“1.人類人工染色體(HAC)載體的制備”描述的方法，進行微細胞法。本文所用的受體細胞包括但不限于動物細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞(例如小鼠細胞、人類細胞)。此外，如上所述，多能細胞，例如胚胎干細胞(ES細胞)和間充質(zhì)干細胞和組織干細胞/前體細胞也可用作受體細胞。
步驟(g)是用來證實所述外源DNA是否已引入到(轉(zhuǎn)移到)受體細胞中?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知方法來進行證實這一點，例如DNA印跡分析法，所述方法使用了對應(yīng)于外源DNA限制酶位點的探針。
HAC載體的應(yīng)用使得可以將大的外源DNA導(dǎo)入細胞中并在細胞中穩(wěn)定保留。
(2)表達外源DNA的細胞的產(chǎn)生如上所述，因為可以將外源DNA導(dǎo)入細胞內(nèi)的HAC載體中，而且攜帶插入外源DNA的HAC載體可以轉(zhuǎn)移到其它細胞，所以可以產(chǎn)生表達外源DNA的細胞。產(chǎn)生表達外源DNA的細胞的過程例如包括下述步驟(a)獲得保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞；(b)缺失21號人類染色體或14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)；(c)將位點專一重組酶識別位點插入到21號人類染色體或14號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)和/或短臂近側(cè)區(qū)中；(d)在位點專一重組酶存在下，將外源DNA插入到21號人類染色體或14號人類染色體中；(e)從保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞制備微細胞；(f)使所述微細胞和受體細胞融合；和(g)從融合的受體細胞中選擇表達所述外源DNA的細胞。
可以如上所述進行步驟(a)-(f)，而不限制它們的順序。
步驟(g)是用來證實所述外源DNA是否在受體細胞中表達并且選擇表達所述外源DNA的細胞?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知方法來證實所述外源DNA的表達，例如RNA印跡分析法，所述方法使用對應(yīng)于外源DNA的探針。
HAC載體可以用于制備表達大的外源DNA的細胞。
(3)蛋白的制備如上所述，因為可以將外源DNA導(dǎo)入細胞中，而且可以通過使用HAC載體來產(chǎn)生表達外源DNA的細胞，所以可以產(chǎn)生由所述外源DNA編碼的蛋白。蛋白的制備過程例如包括下述步驟(a)獲得保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞；(b)缺失21號人類染色體或14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)；(c)將位點專一重組酶識別位點插入到21號人類染色體或14號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)和/或短臂近側(cè)區(qū)中；
(d)在位點專一重組酶表達下，將編碼蛋白的外源DNA插入到21號人類染色體或14號人類染色體中；(e)從保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞制備微細胞；(f)使所述微細胞和受體細胞融合；(g)將所述融合的受體細胞在培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)；和(h)從所得培養(yǎng)物中收集所述蛋白。
可以如上所述進行步驟(a)-(f)，而不限制它們的順序。
步驟(g)是用來在培養(yǎng)液中培養(yǎng)步驟(f)中融合的受體細胞的。用于培養(yǎng)受體細胞的培養(yǎng)液可以是含有碳源、氮源和礦物質(zhì)的任何天然或合成培養(yǎng)液(所述培養(yǎng)液能有效培養(yǎng)受體細胞)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇合適的培養(yǎng)液，并且如有必要，可對所述培養(yǎng)液進行適當(dāng)改良。設(shè)置合適的需氧條件、溫度、pH和培養(yǎng)時間，進行振蕩培養(yǎng)或需氧旋動培養(yǎng)。
培養(yǎng)后，如步驟(h)所述，從所得培養(yǎng)物中收集蛋白。術(shù)語“培養(yǎng)物”是指任何培養(yǎng)細胞或破碎的細胞和培養(yǎng)上清液。培養(yǎng)后，可以采用常規(guī)的蛋白質(zhì)純化方法，從培養(yǎng)物中收集蛋白。例如，當(dāng)?shù)鞍资羌毎麅?nèi)產(chǎn)生時，用超聲破碎、研磨和加壓粉碎等常規(guī)方法進行提取。必要時加入蛋白酶抑制劑。當(dāng)?shù)鞍资窃谏锨逡褐挟a(chǎn)生時，可以使用培養(yǎng)肉湯本身。將該溶液過濾，離心去除固體物，并且如有必要，用魚精蛋白處理，以去除核酸。
隨后，可以向溶液中加入硫酸銨、乙醇和丙酮，將其進行分級分離，收集沉淀，得到粗制蛋白溶液。將蛋白溶液進行各種層析和電泳分析，以得到純化的酶。例如，從所述分級分離方法中選用合適的方法，例如用交聯(lián)葡聚糖、ultragel或生物膠的凝膠過濾、離子交換層析、采用例如聚丙烯酰胺凝膠的電泳、親和層析和反相層析，或這些方法的組合，來得到純化的靶蛋白。所提供的這些培養(yǎng)和純化方法僅用于說明目的，并且不應(yīng)認為是對本發(fā)明的限制。
本發(fā)明的靶蛋白可以是任何所需蛋白，包括例如紅細胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、凝血因子、血管假性血友病因子(vWF)、肌營養(yǎng)不良蛋白、多巴胺合酶、胰島素、胰島素樣生長因子(IGF)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)、抗體、端粒酶、粒細胞集落刺激因子、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子、免疫球蛋白、生長激素、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素8、白介素9、白介素10、白介素11、白介素12、白介素15、CD40配體、干擾素、腺苷脫氨酶、α-1抗胰蛋白酶、鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶、嘌呤核苷酸磷酸化酶、生長抑制因子(GIF)、腫瘤壞死因子(TNF)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤蛋白M、Flt3配體(Flt3L)、基質(zhì)衍生因子(SDF)、干細胞生長因子(SCF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素、神經(jīng)生長因子(NGF)、骨形態(tài)發(fā)生因子(BMP)、活化素、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)和Wnt?？梢赃\用例如公用基因數(shù)據(jù)庫，獲得編碼這些靶蛋白的基因(即外源DNA)的序列信息。
(4)用于基因功能分析的載體插入到HAC載體中的外源DNA以拷貝數(shù)依賴性和穩(wěn)定方式在細胞內(nèi)表達，所以可以用HAC載體來分析基因功能。
RNA干擾是通過表達雙鏈RNA(dsRNA)來控制靶基因表達的已知方法，所述雙鏈RNA包含編碼所述靶基因的部分核苷酸序列的互補序列(有關(guān)短的干擾RNA(siRNA)，參見例如Elbashir等，Nature，411494，2001；McCaffrey等，Nature，41838，2002)。另外參見Shinagawa，T.等，Genes & Development，171340-1345，2003)。將編碼dsRNA的DNA與基因表達誘導(dǎo)系統(tǒng)一起引入到HAC載體中，可以對靶基因功能進行條件控制。通過利用基因組區(qū)來替代基因表達誘導(dǎo)系統(tǒng)，可以在組織特異性/生理位點進行功能控制。
可以使用其劑量依賴性用作指標(biāo)來分析靶分子效應(yīng)的方法。在該方法中，通過將編碼本發(fā)明靶分子的基因的表達單元引入到HAC載體中，通過改變拷貝數(shù)，然后轉(zhuǎn)移到細胞(包括組織和個體)中，可以在細胞中進行基于拷貝數(shù)依賴性表達控制的劑量依賴性分析。此外，用于控制基因表達的表達誘導(dǎo)系統(tǒng)或基因組區(qū)可以用于條件分析或組織特異性/生理功能分析。
(5)用于將基因轉(zhuǎn)移到干細胞中的載體如實施例20和實施例21所述，用本發(fā)明方法產(chǎn)生的HAC載體可以用作載體，用于將基因轉(zhuǎn)移到胚胎干(ES)細胞或間充質(zhì)干細胞(MSC)中。上述HAC載體可以在ES細胞或MSC中長期保持穩(wěn)定。
如實施例20和實施例21所述，HAC載體在組織細胞中保持穩(wěn)定，所述組織細胞來自保留用本發(fā)明方法產(chǎn)生的HAC載體的MSC。因為當(dāng)從保留21號人類染色體片段的小鼠ES細胞產(chǎn)生嵌合小鼠時，所述染色體片段遺傳給下一代和細胞，所述細胞從保留21號人類染色體片段的組織的ES細胞分化而來(Kazuki等，J.Hum.Genet.，46600，2000)，用本發(fā)明方法產(chǎn)生的HAC載體在組織細胞中同樣也可保持穩(wěn)定，所述組織細胞從轉(zhuǎn)移了HAC載體的ES細胞分化而來。
近年來，已經(jīng)鑒定了來自各組織的干細胞和來自骨髓的多能細胞(Yokota等，Jikken Igaku(號外)，第19卷，第15期，2001，Yodo-sha；Okano等，Jikken Igaku(號外)，第21卷，第8期，2003，Yodo-sha；Li等，Nature Med.，online2003年8月31日，doi10.1038/nm925)。用本發(fā)明方法產(chǎn)生的HAC載體可以作為載體，用于將基因轉(zhuǎn)移到組織干細胞/前體細胞，例如來自骨髓、血、神經(jīng)、肌肉、肝、胰腺、皮膚和內(nèi)耳的多能干細胞/前體細胞中。
此外，對于人類ES細胞、MSC和組織干細胞/前體細胞的臨床應(yīng)用，有必要擴增治療所需的細胞數(shù)量，并且按所需的分化狀態(tài)來提供。通常，僅大量繁殖干細胞同時又保持多能性并不容易(Hino，Jikken Igaku，第19卷，第15卷(號外)10，2001，Yodo-sha)。例如，當(dāng)從活組織收集造血干細胞和神經(jīng)干細胞并進行培養(yǎng)時，不僅干細胞、而且前體細胞以及從干細胞分化而來的成熟細胞同時繁殖，使其難以用于臨床(Okano，S.，Jikken Igaku，第19卷，第15期(號外)80-90，2001，Yodo-sha)。
在本發(fā)明中，通過制備摻入編碼涉及保持多能性的因子的DNA的HAC載體，并將其轉(zhuǎn)移到干細胞，可以繁殖干細胞，同時又保持多能性，而不使宿主染色體發(fā)生突變；所述涉及保持多能性的因子例如轉(zhuǎn)錄因子，就小鼠ES細胞而論，例如活性Stat3、Oct-3/4和Nanog(Niwa等，Genes Dev.，122048，1998；Matsuda等，EMBO J.，184261，1999；Niwa等，Nature Genet.，24373，2000；Mitsui等，Cell，113631，2003；Chambers等，Cell，113643，2003)。
此外，在控制干細胞分化中，對所涉及的分子表達水平的控制是一個重要因素。例如，在由上述Oct-3/4對小鼠ES細胞分化的控制中，當(dāng)其生理表達水平保持在100％時，可保持未分化狀態(tài)；而當(dāng)其保持在50％或更低時，則分化成滋養(yǎng)外胚層；而當(dāng)其保持在150％或更高時，則分化成原始內(nèi)胚層(Niwa等，Nature Genet.，24373，2000)。當(dāng)通過改變表達水平來控制分化時，可以通過將基因表達開/關(guān)誘導(dǎo)系統(tǒng)(例如基于四環(huán)素的表達誘導(dǎo)系統(tǒng))引入到用本發(fā)明方法產(chǎn)生的HAC載體中，來進行表達水平的嚴(yán)格控制。
此外，可以通過將基因表達開/關(guān)誘導(dǎo)系統(tǒng)(例如基于四環(huán)素的表達誘導(dǎo)系統(tǒng))和分化誘導(dǎo)因子引入到用本發(fā)明方法產(chǎn)生的HAC載體中，來進行多能狀態(tài)和誘導(dǎo)分化狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換。
當(dāng)采用干細胞進行組織再生時，移植細胞或來自供體的再生組織將在延長的周期內(nèi)(希望是終身)作為受體部分起作用。因此希望盡量避免可以成為背離生理控制的誘因(例如基因突變，例如在供體細胞中癌變)的操作。因為HAC載體可以獨立于宿主染色體，所以可以進行基因轉(zhuǎn)移，而不用修飾宿主染色體。此外，如實施例13、14、18和19所述，因為HAC載體在人類細胞中保持穩(wěn)定，所以它可以長期穩(wěn)定地表達靶分子。
通過制備其中已引入與靶基因融合的DNA的本發(fā)明HAC載體(所述DNA處于基因組序列控制下，所述基因組序列含有在分化組織中表達的基因組區(qū)或者組織特異性表達控制區(qū))，并且通過使用其中轉(zhuǎn)入了HAC載體的干細胞，可以在再生組織中以生理/組織特異性方式表達靶分子。
當(dāng)誘導(dǎo)用本發(fā)明方法產(chǎn)生的保留HAC載體的干細胞分化后，HAC載體就不需要了，除非引入基因的表達需要的話。在采用例如但不限于抗藥性在選擇性培養(yǎng)液中作為指示物時，在誘導(dǎo)分化后，通過分選遺漏了HAC載體的克隆，即可去除已成為不必要的HAC載體。
(6)用于產(chǎn)生培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞的載體已知一種方法可作為細胞培養(yǎng)方法，所述方法包括將貼壁細胞鋪在培養(yǎng)瓶床上并且向這些培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞上接種靶細胞進行共培養(yǎng)(Ed.Japanese Biochemical Society，Shin-Seikagaku-Jikken-Koza 14-generation，differentiation and aging，1992，Tokyo Kagaku Dojin)。例如，當(dāng)繁殖造血前體細胞時，制備必要的因子，例如SCF、Flt3L、TPO、IL-6和sIL-6R，作為例如重組蛋白，并加入到培養(yǎng)液中(Ueda等，J ClinInvest.，1051013-1021，2000)。盡管可以通過常規(guī)方法，將加入到培養(yǎng)物中的基因引入到培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞中，但是因為隨機插入到宿主染色體所引起的變異/位置效應(yīng)、表達失活和因多拷貝表達單元的平行排列所致的下游基因表達衰減，所以很難通過控制每種因子所需水平的表達來供應(yīng)它們。通過產(chǎn)生摻入編碼本發(fā)明方法的這些必要因子的所有(或部分)DNA的HAC載體，并將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞，可以僅僅通過簡單的共培養(yǎng)，容易地供應(yīng)所有必要因子，而無需在其后加入重組蛋白。此外，使用基因表達誘導(dǎo)系統(tǒng)能夠?qū)@些因子的表達進行條件控制。
(7)用于治療人類疾病的載體對于用于治療人類疾病的載體，已經(jīng)研究了各種病毒載體和非病毒載體，人們注意到，一些問題(例如引發(fā)免疫應(yīng)答)限制了待引入的DNA的大小、宿主染色體的插入突變、低引入/表達效率以及難以控制表達水平(Kaneta，Y.，Rinsho Menneki，第39卷551-558，2003，Kagaku Hyoron-sha，Ozawa，T.，Idennshi Chiryo編著，1997，Yodo-sha)。對于所有載體，一個常見的問題是“在恰當(dāng)?shù)臅r間、以所需的水平來控制表達”。
利用HAC載體進行基因治療和細胞治療策略的實例包括(i)補充原來缺乏的酶和蛋白，(ii)支持療法以補充后來缺乏的代謝物，(iii)將新功能加給細胞以改善其活力的方法(例如在組織再生中利用修飾細胞，可以通過將基因組DNA引入其中，使HAC載體能進行生理/組織特異性基因表達控制。這有助于避免因過量表達或表達不足等副作用所帶來的功能障礙)，和(iv)預(yù)防功能獲得性(gain-of-function)變性性疾病的方法(例如帕金森病的GDNF替代療法)。
HAC載體可以用作人類疾病治療的載體，可以將摻入治療性外源DNA的HAC載體轉(zhuǎn)移到細胞，然后將其制備成藥用組合物，給予患者。此外，用于治療人類疾病的載體可以用來預(yù)防疾病以及治療疾病。
下面提供用作治療人類疾病的載體的實例，所述實例僅僅用于說明目的，而不是用來限制本發(fā)明的范圍。
(A)端粒酶的應(yīng)用出于安全性的考慮，用作基因治療、細胞治療和組織再生治療原料的細胞應(yīng)該是正常細胞，而不是無限增殖化細胞。然而，當(dāng)正常體細胞經(jīng)歷了一定分裂次數(shù)后，已知它們會老化，或在不久以后停止繁殖/分裂，導(dǎo)致死亡(Ide，T.，Jikken Igaku，第16卷，第18期號外18-24，1998，Yodo-sha)?？梢栽谝欢ㄖ芷趦?nèi)維持治療性細胞，希望能維持到患者的終身，這樣才能保證長期的治療效果。已知正常細胞中端粒酶的過量表達將抑制細胞老化中發(fā)生的端?？s短并延長細胞壽命，所述端粒酶是存在于染色體末端重復(fù)序列端粒的修復(fù)酶(Bodnar等，Science，279349-352，1998)。此外，已經(jīng)顯示端粒酶過量表達并不會誘導(dǎo)細胞的無限增殖化或癌變(Shinkai，Y.，Jikken Igaku，第16卷，第18期號外25-30，1998，Yodo-sha；Jiang等，Nature Gent.，21111-114，1999)。因此，可以通過將攜帶編碼人類端粒酶(hTERT)基因的本發(fā)明方法的HAC載體轉(zhuǎn)移到靶細胞，延長保留HAC的細胞的壽命，并且提供長期治療效果，而不會誘導(dǎo)無限增殖化或癌變。此外，用于控制基因表達的表達誘導(dǎo)系統(tǒng)或基因組區(qū)的使用，將使端粒酶能夠進行條件表達或組織特異性/生理表達。
(B)抑制自身抗體的產(chǎn)生在開發(fā)重組蛋白制劑時，給藥后自身抗體(活性中和抗體)的產(chǎn)生是一個障礙(Li等，Blood，983241-3248，2001)。盡管不想限制給予患者的給藥方法，但是將用本發(fā)明方法產(chǎn)生的HAC載體(其中已引入編碼靶蛋白的基因組)轉(zhuǎn)移到在生產(chǎn)組織中的人類細胞(例如正常的人類細胞)，然后移植給患者。在患者體內(nèi)，HAC載體可以按生理/組織特異性方式表達并供應(yīng)靶蛋白，以抑制患者體內(nèi)自身抗體的產(chǎn)生。
(C)在細胞治療中參與免疫的基因的基因轉(zhuǎn)移用載體作為復(fù)發(fā)性白血病的療法，已知供體淋巴細胞輸注療法(Kolb等，Blood，762462，1990)，所述療法利用如下現(xiàn)象移植淋巴細胞作為腫瘤特異性細胞毒T細胞，通過移植物-白血病反應(yīng)，攻擊白血病細胞。作為針對移植物抗宿主病的方法，其中移植細胞攻擊和損害受體組織的上述療法的副作用，通過使用藥物、由逆轉(zhuǎn)錄病毒將藥物誘導(dǎo)自殺基因轉(zhuǎn)移到供體淋巴細胞，以去除供體淋巴細胞(Onodera等，Genome Medicine，第3卷45，2003，Medical Review)。該方法可以影響供體淋巴細胞的染色體。
用本發(fā)明方法產(chǎn)生的HAC載體可以作為載體，用于細胞療法中參與免疫的基因的基因轉(zhuǎn)移，所述基因轉(zhuǎn)移不會引起宿主染色體發(fā)生突變。HAC載體也可用作載體，用于在幫助啟動抗腫瘤活性的療法中的基因轉(zhuǎn)移，所述療法例如使用CD40配體并用于淋巴瘤的免疫激活療法(Kato等，Genome Medicine，第3卷53，2003，MedicalReview)。
(D)完全人類單克隆抗體的補充近年來，人們一直在嘗試使用產(chǎn)生人抗體的小鼠，來產(chǎn)生完全人類單克隆抗體藥物(Ishida等，Bio Venture，第2卷44，2002，Yodo-sha；Mori等，Cell Death and Differentiation，待出版，2003，Proceedingsof American Association for Cancer Research，第44卷，第2版，2003年7月，第1285頁，#6422)。然而，因為使用它來治療慢性病，需要不斷去醫(yī)院定期接受TPO，所以患者的QOL可以降低。此外，重組蛋白制劑生產(chǎn)所需要的成本高，導(dǎo)致昂貴的醫(yī)療費用。
通過將編碼從產(chǎn)生靶抗體的雜交瘤中分離的靶抗體的基因組區(qū)引入到用本發(fā)明方法產(chǎn)生的HAC載體中，將所述HAC載體轉(zhuǎn)移到例如患者的造血干細胞或B細胞中，然后將其再移植給所述患者，可以通過控制生理表達來補充/供應(yīng)完全人類抗體。這將減少去醫(yī)院的次數(shù)并改善患者的QOL。
(E)對單基因遺傳疾病中缺陷的代償(E-1)血友病血友病A和血友病B是分別由凝血因子VIII和凝血因子Ⅸ的突變所致的伴性隱性遺傳性血液病。盡管利用因子VIII和因子Ⅸ的濃縮制劑進行的替代療法是有效療法，但是因為在出血后給藥的情況下，它會引起嚴(yán)重并發(fā)癥，并且還有其它問題，例如濃縮制劑污染病原體、因重復(fù)給藥引起的自身抗體(活性中和抗體)的產(chǎn)生、必須持續(xù)為患者的出血而制備，從而降低患者的QOL，并且產(chǎn)生昂貴的醫(yī)療費用，所以仍需要采用基因療法的方案。使用載體進行的臨床基因治療研究并未產(chǎn)生顯著療效，因為表達無法持續(xù)足夠的時間。此外，在其中直接給予逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺伴隨病毒(AAV)載體的臨床研究中，在患者精液中檢測到載體基因，表明具有將基因轉(zhuǎn)移到生殖細胞的危險(Mochizuki等，Genome Medicine，第3卷25，2003，Medical Review)。編碼因子VIII基因的全長基因組長約1.5Mb，其cDNA長約7kb。在非病毒載體和腺病毒載體中表達水平可以降低，盡管可以引入全長cDNA，而不能將全長基因引入到AAV載體中，因為待引入DNA的長度僅限于約4.9kb或更短。
本發(fā)明的方法可以用于產(chǎn)生插入編碼凝血因子VIII或IX的DNA的HAC載體。雖然并不希望限制給予患者的給藥方法，但是可以將HAC載體轉(zhuǎn)移到例如人類細胞中并移植給患者，以補充所述因子。雖然并不希望限制給予患者的給藥方法，但是可以將摻入編碼凝血因子VIII或IX的基因組區(qū)的HAC載體轉(zhuǎn)移到例如人類細胞中并移植給患者(所述細胞正是來自該患者)，以通過生理/組織特異性表達來補充所述因子。
(E-2)X-SCID(X連鎖嚴(yán)重性聯(lián)合免疫缺陷)嚴(yán)重性聯(lián)合免疫缺陷(SCID)是其中體液介導(dǎo)免疫和細胞介導(dǎo)免疫先天缺陷的一種疾病。近半數(shù)SCID病例是X連鎖的X-SCID，已知是由γ鏈變異引起，γ鏈?zhǔn)前捉樗?家族受體共享的。已經(jīng)進行了造血干細胞的治療性移植，盡管體液免疫恢復(fù)不足，而且必須定期給予免疫球蛋白。因此，預(yù)期使用基因治療和細胞治療的方案包括將共同γ鏈導(dǎo)入造血干細胞中，然后再進行移植。自1999年進行的臨床研究中，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒進行其中導(dǎo)入了共同γ鏈的造血干細胞的移植，近年來，在法國已經(jīng)報道一些用移植細胞進行白血病治療進展的實例(Hacein-Bey-Abina等，N Engl J Med.，348255，2003；Marshall等，Science，299320，2003)。在各實例中，在LMO2基因觀察到載體序列插入突變，LMO2基因區(qū)是細胞染色體上的一個原癌基因，所述細胞中導(dǎo)入了所述基因，懷疑LMO2活化和致癌性之間有聯(lián)系(Kume等，Genome Medicine，第3卷9，2003，Medical Review)。
本發(fā)明的方法可用于產(chǎn)生摻入編碼共同γ鏈的DNA的HAC載體?？梢酝ㄟ^使用HAC載體作為基因轉(zhuǎn)移的載體，以避免宿主染色體中載體序列插入突變的危險。雖然并不希望限制給予患者的給藥方法，但是可以將所述HAC載體轉(zhuǎn)移到人類細胞(例如來自骨髓的人類正常造血干細胞)中并移植到患者體內(nèi)，通過生理/組織特異性表達來代償共同γ鏈的缺乏。
(E-3)杜興(Duchenne)型肌營養(yǎng)不良；DMD杜興型肌營養(yǎng)不良是X連鎖隱性單基因疾病，是由肌營養(yǎng)不良蛋白基因突變所致肌營養(yǎng)不良蛋白功能障礙引起的(Hoffman等，Cell，51919，1987)。因為肌營養(yǎng)不良蛋白是細胞骨架蛋白，不可以通過直接給予而補充，但預(yù)期基因治療可用于治療DMD。
肌營養(yǎng)不良蛋白基因的全長基因組約為2.3Mb，其cDNA為14kb。在非病毒載體和腺病毒載體中可以降低表達水平，盡管可引入全長cDNA(Liu等，Mol.Ther.，445，2001；Dello Russo等，Proc NatlAcad Sci USA，9712979，2002)。此外，在AAV載體中，不能引入全長基因，因為待引入的DNA大小限制在約4.9kb或更小，在將基因轉(zhuǎn)移到骨骼肌的實驗中，因為免疫應(yīng)答，所以引入基因產(chǎn)物的表達水平會下降(Yuasa等，Gene Therapy，91576，2002)。
在將基因轉(zhuǎn)移到骨骼肌的實驗中，利用摻入在CMV啟動子(所述啟動子誘導(dǎo)遍在表達)控制下的肌營養(yǎng)不良蛋白小基因的AAV載體，降低由引入基因產(chǎn)物表達水平引起的免疫應(yīng)答，盡管通過使用作為啟動子的對骨骼肌有特異性的MCK啟動子改善了免疫應(yīng)答(Yuasa等，Gene Ther.，91576，2002)。這表明，生理、組織特異性表達對肌營養(yǎng)不良蛋白的表達是必要的。
本發(fā)明的方法可用于產(chǎn)生摻入編碼肌營養(yǎng)不良蛋白基因組區(qū)的HAC載體。雖然并不希望限制給予患者的給藥方法，但是可以將所述HAC載體轉(zhuǎn)移到人類細胞(包括但不限于人類正常的自體成肌細胞)并且移植給患者，通過生理/組織特異性表達補充肌營養(yǎng)不良蛋白。
(E-4)雖然并不希望限制適應(yīng)癥，但是本發(fā)明的方法可用于產(chǎn)生其中已引入導(dǎo)致單基因疾病的基因的HAC載體，所述單基因疾病例如α-1抗胰蛋白酶缺陷、囊性纖維化(CFTR)、慢性肉芽腫病、家族性高膽固醇血癥、范科尼貧血(Fanconi’s amemia)、戈謝病(Gaucher’sdisease)、亨特綜合征(Hunter’s syndrome)、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺乏、嘌呤核苷酸磷酸化酶缺乏、ADA-SCID、白細胞粘附缺陷、卡納范病(Canavan disease)、胼胝體萎縮、法布萊病(Fabry′s disease)和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化，雖然并不希望限制給予患者的給藥方法，但是可以通過將HAC載體轉(zhuǎn)移到例如人類細胞并且移植給患者，以補充缺乏的分子。有關(guān)致病基因的信息，參見在線參考文獻數(shù)據(jù)庫美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的PubMed(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝PubMed)或者OMIMTM-Online Mendelian Inheritance in ManTM(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/ntrez/query.fcgi？db＝OMM)。
(F)其它疾病(F-1)血小板生成素(TPO)是負責(zé)控制血小板產(chǎn)生和造血干細胞/前體細胞增殖的因子，血小板生成素有望應(yīng)用于例如再生障礙性貧血等血液病，以及化療之后造血細胞的恢復(fù)。然而，在給予TPO重組蛋白后產(chǎn)生活性中和抗體，是開發(fā)藥物制劑的障礙(Li等，Blood，983241-3248，2001)。因此，因為將TPO應(yīng)用于慢性病需要不斷去醫(yī)院定期接受TPO，所以降低了患者的QOL。此外，重組蛋白制劑生產(chǎn)所需要的成本高，導(dǎo)致昂貴的醫(yī)療費用。
本發(fā)明的方法可用于產(chǎn)生其中引入了TPO基因組區(qū)的HAC載體，雖然并不希望限制給予患者的給藥方法，但是可以將所述HAC載體轉(zhuǎn)移到例如來自產(chǎn)生血小板的組織的人類細胞，按照生理/組織特異性方式表達/供應(yīng)TPO，以控制自身抗體的產(chǎn)生。這同樣可以減少去醫(yī)院的次數(shù)并改善患者的QOL。
(F-2)紅細胞生成素(EPO)是紅細胞生長因子，現(xiàn)已上市，成為用于糖尿病和腎病相關(guān)腎貧血的藥物。因為治療慢性病(例如由糖尿病所致腎貧血)需要不斷去醫(yī)院定期接受EPO，所以降低了患者的QOL。此外，重組蛋白制劑生產(chǎn)所需要的成本高，導(dǎo)致昂貴的醫(yī)療費用。如本發(fā)明實施例14所述，通過將HAC載體(其中已引入EPOcDNA)轉(zhuǎn)移到正常人類成纖維細胞，然后將其移植給患者，可以表達EPO并供應(yīng)給該患者。本發(fā)明的方法可用于產(chǎn)生HAC載體(其中已導(dǎo)入EPO基因組區(qū))，雖然并不希望限制給予患者的給藥方法，但是可以將所述HAC載體轉(zhuǎn)移到例如來自產(chǎn)生紅細胞的組織的人類細胞，按照生理/組織特異性方式表達/供應(yīng)EPO。這同樣可以減少去醫(yī)院的次數(shù)并改善患者的QOL。
(F-3)帕金森病帕金森病是一種神經(jīng)病，其中運動功能因中腦黑質(zhì)密部的多巴胺合成細胞的進行性變性而導(dǎo)致受損。一種涉及給予L-DOPA的療法旨在取代缺乏的多巴胺，所述療法的問題是，在中度到重度病例中療效降低，而且降低了患者的QOL，并且因為有副作用，所以降低了劑量。因為這些問題是由以下事實產(chǎn)生在紋狀體中多巴胺濃度是不恒定的，而且給予L-DOPA的作用不是在紋狀體的區(qū)域，所以需要在紋狀體中恒定地生理表達多巴胺(Takeda等，Medical ScienceDigest，第29卷20，2003，New Science)。盡管已經(jīng)使用AVV載體(其中已引入了參與多巴胺合成的三種酶的每一種)進行了基因治療研究，但是尚未達到生理表達的控制。對于GDNF(來自Grial cell的神經(jīng)元因子)治療，即一種旨在預(yù)防多巴胺合成細胞的變性/衰減的治療來說，使用置留于殼核下的導(dǎo)管持續(xù)給藥，產(chǎn)生療效(Gill等，NatureMed.，9589，2003)，盡管有感染的危險，而且限制了患者的QOL。用AAV載體進行的基因治療的研究在動物模型中顯示出一定療效(Wang等，Gene Ther.，9381，2002)，但是尚未達到對生理表達的控制。
本發(fā)明的方法可用于產(chǎn)生HAC載體，所述HAC載體中已摻入編碼參與多巴胺合成的一組酶或GDNF的基因組區(qū)。雖然并不希望限制給予患者的給藥方法，但是可以將所述HAC載體轉(zhuǎn)移到人類細胞(例如正常人類神經(jīng)干細胞/前體細胞)并移植給患者，通過生理/組織特異性方式來補充引入基因產(chǎn)物。
(F-4)糖尿病已經(jīng)采用重組蛋白制劑治療胰島素依賴性糖尿病。因為治療慢性病需要不斷去醫(yī)院接受定期給藥，所以可降低患者的QOL。此外，重組蛋白制劑生產(chǎn)所需要的成本高，導(dǎo)致昂貴的醫(yī)療費用。因為血胰島素濃度的最佳范圍狹窄，濃度如過高或過低都會產(chǎn)生副作用，常常會危及生命。已經(jīng)進行了在體內(nèi)控制胰島素濃度的基因治療研究(Moriya等，Tanpakushitsu Kakusan Koso，第40卷2764，1995，Kyoritsu Shuppan Co.，Ltd.)。
本發(fā)明的方法可用于產(chǎn)生其中已引入胰島素基因組區(qū)的HAC載體，雖然并不希望限制給予患者的給藥方法，但是可以將所述HAC載體轉(zhuǎn)移到人類細胞(例如在產(chǎn)生它的組織中的細胞)，按照生理/組織特異性方式來表達/供應(yīng)胰島素。這同樣可以減少去醫(yī)院的次數(shù)并改善患者的QOL。
(F-5)雖然并不希望限制適應(yīng)癥，但是本發(fā)明的方法可用于產(chǎn)生HAC載體，所述HAC載體中已引入編碼被認為是治療如下疾病所需的物質(zhì)的基因例如腦腫瘤、外周動脈病(局部缺血)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動脈再狹窄、肘管綜合征、冠狀動脈病、早老性癡呆(Alzheimerdisease)、潰瘍、盆骨骨折、腎病和惡性腫瘤，而且，雖然并不希望限制給予患者的給藥方法，但是可以將所述HAC載體轉(zhuǎn)移到例如人類細胞并移植給患者，以補充缺乏的分子。
實施例下面將通過以下實施例來詳細描述本發(fā)明，而不應(yīng)認為是對本發(fā)明范圍的限制。
通過缺失21號人類染色體長臂遠側(cè)區(qū)來制備HAC載體(1)構(gòu)建用于端粒截短的構(gòu)建體采用PBS-TEL/Puro(Kuroiwa，Nucleic Acids Res.，263347，1998)作為端粒截短載體(打靶載體)，用于缺失21號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)。根據(jù)得自GenBank數(shù)據(jù)庫的21號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)的核苷酸序列(登記號AL163204)，設(shè)計用于插入端粒截短載體的靶序列。為了擴增所述序列，采用引物寡核苷酸。插入了限制酶BamHI識別序列的所述引物寡核苷酸的序列如下所示#21telF15′-CGCGGATCCAGAGAGAGCCTGGAATGCCTGGTAGTGT(SEQ IDNo.1)#21telR15′-CGCGGATCCCCAGTGCCCTGAGATCTTGTGATTTCTC(SEQ IDNo.2)通過微細胞法，用保留21號人類染色體的小鼠A9雜交瘤細胞作為染色體供體細胞，制備保留21號人類染色體的DT40雜交瘤細胞(Shinohara，Hum Mol Genet，101163，2001)。由于染色體受體細胞DT40已經(jīng)在日本研究生物資源保藏中心(JCRB)注冊登記，保藏號為JCRB2221，因此該該細胞是可得到的。下面一般性地描述DT40雜交瘤的制備方法。
首先，制備約1×108A9(#21neo)細胞的微細胞。將A9(#21neo)細胞在12個25cm2的離心瓶(Coasters)中培養(yǎng)，直到細胞密度達到約60-70％飽和。這些A9(#21neo)細胞在含有秋水仙胺(0.05μg/ml，Demecolcine，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的培養(yǎng)液(10％CS，0.05μg/ml，G418，DMEM)再培養(yǎng)72小時，誘導(dǎo)微核。在本實施例中，使用Invitroge生產(chǎn)的DMEM。倒出培養(yǎng)液之后，向每個離心瓶中加入預(yù)熱(34℃)松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，插入到丙烯酸塑料離心管中，然后離心(34℃，8000rpm)1小時。通過將微細胞懸浮于無血清培養(yǎng)液(DMEM，Sigma)中，使其恢復(fù)，然后經(jīng)過濾純化。如此純化的微細胞重懸浮于補充了10μg/ml植物凝集素-P(Sigma)的4ml DMEM中。在50μg/ml聚-L-賴氨酸(Sigma)包被的6孔板(Nunc)中的2孔中接種DT40細胞(1×108細胞)，然后讓其靜置1小時。按此方式，讓DT40細胞提前粘附在底部。向各孔中加入微細胞懸液，讓其靜置3分鐘，然后棄去上清液。剩余物用50％w/v聚乙二醇1500(Roche Diagnostics)處理1分鐘。由此獲得的融合細胞懸浮于12ml無血清DMEM中，接種于6孔板中的4孔并培養(yǎng)24小時，然后在含有1.5μg/mlG418的培養(yǎng)液中進行選擇性培養(yǎng)約2周。分離所形成的抗藥性集落。
培養(yǎng)以上獲得的DT40雜交細胞，然后通過使用Puregene DNA分離試劑盒(Gentra System)，從所述細胞中提取基因組DNA。用該基因組DNA作為模板，使用上述引物，通過PCR法擴增用于重組的靶序列。按照Innis等(PCR experiment manual，HBJ publisher，1991)，使用大約0.1μg基因組DNA作為模板，通過熱循環(huán)儀GeneAmp9700(Applied Biosystems)，進行PCR。通過使用LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)作為Taq聚合酶，進行反應(yīng)，反應(yīng)條件包括95℃反應(yīng)2分鐘，然后95℃變性30秒以及68℃退火/延伸6分鐘的循環(huán)共35次。擴增產(chǎn)物用限制酶BamH I(Nippon Gene)消化，然后分離出具有粘端的約5kb的DNA片段，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化。該片段克隆到PBS-TEL/Puro質(zhì)粒的BamH I位點。最終獲得的PBS-TEL/Puro構(gòu)建體的大小約為10.6kb。端粒截短載體、靶序列和經(jīng)同源重組而得到的染色體等位基因示于圖1。
(2)轉(zhuǎn)染和Puro-抗性克隆的分離PBS-TEL/Puro構(gòu)建體用限制酶EcoR I消化后，得到線狀DNA，將其導(dǎo)入保留21號人類染色體的DT40雜交細胞中。將DT40雜交細胞(1×107)懸浮于0.75ml PBS中，然后使用Gene Pulser(Biorad)，在25μg DNA存在下，進行電泳。將750V電壓施加于電容為25μF的電容器，通過使用具有以4mm間距放置的電極的電穿孔細胞，讓其放電。將電穿孔細胞懸浮于補充了10％胎牛血清(FBS)、1％雞血清(ChS)和50μM 2-巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)液(Invitrogen)中，然后接種到兩個96孔板(Falcon)中。2天后，加入嘌呤霉素二鹽酸鹽(Sigma)，使其終濃度為0.3μg/ml。在2-3周內(nèi)形成抗性集落。集落形成頻率是每1×107個DT40雜交細胞中平均為17.8個集落。進行20次轉(zhuǎn)染，共分離出356個抗藥性集落。使所得集落增殖并進行以下分析。
(3)重組體的選擇和端粒截短的證實(3-1)PCR分析用嘌呤霉素抗性株的基因組DNA作為模板，通過PCR法，檢測21號人類染色體上的基因標(biāo)記和STS標(biāo)記(D21S265，CBR，SIM2，D21S268，D21S266，D21S1259)的存在。
通過進入以下在線數(shù)據(jù)庫，可得到用于這些STS標(biāo)記的引物寡核苷酸的序列美國國立生物技術(shù)信息中心的UniSTS(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝unists)。上述6種STS標(biāo)記的注冊號依次為UniSTS76223，45641，54124，22625，54266和53746。除此之外，用于所述基因的引物寡核苷酸序列如下所示，所述引物寡核苷酸序列是根據(jù)得自GenBank數(shù)據(jù)庫的核苷酸序列而設(shè)計的PRED65F5′-GCCTGGCATCTTCCTCAATA(SEQ ID No.3)；PRED65R5′-TTGCATGCCTGTGGTACTGT(SEQ ID No.4)；PRED3F5′-TCACAATCATGGGCTTTGAA(SEQ ID No.5)；PRED3R5′-CACGCAACCATTTGTTCATT(SEQ ID No.6).
使用約0.1μg基因組DNA作為模板，通過PCR擴增上述8種標(biāo)記中的3種，即通過同源重組位于缺失位點近側(cè)的PRED 3基因、位于其遠側(cè)區(qū)的D21S265標(biāo)記和D21S266標(biāo)記(Innis等，參見上文)。在長臂遠側(cè)區(qū)通過端粒截短而缺失的情況下，預(yù)期基因組DNA可具有PRED 3基因，但沒有D21S265標(biāo)記和D21S266標(biāo)記。結(jié)果，可以如預(yù)期所述，對354個抗性克隆中的24個進行擴增。通過使用其余7種標(biāo)記，對這24個克隆進行PCR擴增，以確定其中攜帶21號人類染色體的區(qū)域。代表性結(jié)果示于圖2。在圖2中，左手邊的圖給出了示意性的染色體圖譜，該圖譜是基于21號人類染色體的G帶圖像。此外，也顯示了標(biāo)記存在于哪個條帶上。在3種嘌呤霉素抗性DT40克隆中，用■表示在預(yù)期PCR擴增產(chǎn)物中檢測的標(biāo)記，而□表示在預(yù)期PCR擴增產(chǎn)物中沒有檢測的標(biāo)記。DT40(21#)代表在受到端粒截短之前的細胞。
(3-2)DNA印跡分析設(shè)計的探針位于用于同源重組的靶序列內(nèi)(圖1)。用以下所示的寡核苷酸引物對作為探針。通過使用保留21號人類染色體的DT40雜交細胞的基因組DNA作為模板，進行PCR。然后，分離并純化PCR擴增片段。
#21qtelF5′-TCACAGCCAGCAGAGGATTC(SEQ ID No.7)#21qtelR5′-CACCTGCACAATGGCTCAAC(SEQ ID No.8)通過初步篩選得到24個克隆，從這24個克隆提取約10μg基因組DNA，用限制酶Kpn I(Takara Shuao Co.，Ltd.)進行消化，然后按照下文描述的方法進行DNA印跡分析Ausubel等(Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，1994)。用圖像分析儀BAS2000(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)，檢測與32P標(biāo)記探針雜交的DNA信號。代表性結(jié)果示于圖3。根據(jù)核苷酸序列預(yù)測限制酶片段的長度。在同源重組體的情況下為13.6kb，而在野生型(非同源重組體)的情況下為9.0kb。已證實24個候選克隆中有2個克隆是同源重組體。
(3-3)熒光原位雜交(FISH)按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人類特異性探針Cot1(Gibco BRL)進行FISH分析。結(jié)果，在所觀察的幾乎所有的有絲分裂圖像中，都檢測到截短的21號人類染色體。代表性FISH圖像示于圖4a和圖4b。在圖4a中，白色箭頭指示端粒截短之前的全長21號人類染色體。在圖4b中，白色箭頭指示長臂遠側(cè)區(qū)缺失的21號人類染色體片段。根據(jù)與宿主DT40細胞的染色體大小進行相對比較，證實21號人類染色體被截短。
根據(jù)上述實驗，證實2個嘌呤霉素抗性克隆保留缺乏長臂的截短的21號人類染色體。
將loxP序列插入到HAC載體中的21號人類染色體近側(cè)區(qū)(1)構(gòu)建用于插入loxP的構(gòu)建體使用基礎(chǔ)質(zhì)粒pSF1(Lifetech)，用于將loxP序列插入到實施例1制備的人類人工染色體(HAC)中。LoxP插入位點的核苷酸序列，即21號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)，得自GenBank數(shù)據(jù)庫(登記號AL163203)。用于擴增同源重組的2個靶序列的引物寡核苷酸序列如下所示
#21qEcoF5′-CCGGAATTCCTCTGGGTTTCTGGTGAAGC(SEQ ID No.9)；#21qEcoR5′-CCGGAATTCTGTAGATCCTGCCATTGTGG(SEQ ID No.10)；#21qBaF5′-CGCGGATCCTTGGCTCCAAAAGGTACCAC(SEQ ID No.11)；#21qBaR5′-CGCGGATCCCTATCCTCGCCACTGTGTCC(SEQ ID No.12).
用從保留21號人類染色體的DT40雜交瘤細胞中提取的基因組DNA作為模板，通過PCR擴增兩個靶序列。它們分別用限制酶EcoRI(Nippon Gene)或BamH I(Nippon Gene)消化并進行瓊脂糖凝膠電泳，因而分離并純化具有粘端的約3kb DNA片段。所述片段各自連接pSF1質(zhì)粒的EcoR I位點或BamH I位點。通過用限制酶Xho I(Nippon Gene)和Sal I(Nippon Gene)消化，從pCMV/Bsd(Invitrogen)切下約1.3kb片段的用于篩選同源重組體的殺稻瘟素抗性基因，然后克隆到以上獲得的pSF1構(gòu)建體的Xho I位點。
最終得到的pSF1構(gòu)建體的大小約為12.4kb。打靶載體、靶序列和經(jīng)同源重組而得到的染色體等位基因示于圖5。
(2)轉(zhuǎn)染和bsr抗性克隆的分離pSF1構(gòu)建體用限制酶Apa I(Nippon Gene)消化，得到線狀DNA，將其引入到保留21號人類染色體(其長臂遠側(cè)區(qū)已缺失)的DT40細胞株(DT40(#21)puro-339)中。將DT40雜交細胞(1×107)懸浮于0.75ml PBS中，然后使用Gene Pulser(Biorad)，在10μg DNA存在下，進行電穿孔。將750V電壓施加于電容為25μF的電容器，通過使用具有以4mm間距放置的電極的電穿孔細胞，讓其放電。將電穿孔細胞懸浮于補充了10％胎牛血清(FBS)、1％雞血清(Chs)和50μM 2-巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)液(Invitrogen)中，然后接種到三個96孔板(Falcon)中。2天后，加入殺稻瘟素S鹽酸鹽(Funakoshi)，使其終濃度為8μg/ml。在2-3周內(nèi)形成抗性集落。集落形成頻率是每1×107個DT40雜交細胞中平均為5.8個集落。進行14次轉(zhuǎn)染，共分離出82個抗藥性集落。使所得集落增殖并進行以下分析。
(3)重組體的選擇(3-1)DNA印跡分析進行DNA印跡分析，以篩選同源重組體。在靶序列外設(shè)計探針，用于同源重組。一對寡核苷酸引物如下所示，用作探針。通過使用保留21號人類染色體的DT40雜交細胞的基因組DNA作為模板，進行PCR。然后，分離并純化PCR擴增片段。
21LOX4869F5′-GTTGCAGAAAAGTAGACTGTAGCAA(SEQ ID No.13)21LOX5682R5′-TCTAAGGAACAAATCTAGGTCATGG(SEQ ID No.14)從殺稻瘟素抗性克隆提取約10μg基因組DNA，用限制酶Xha I(Nippon Gene)進行消化，然后進行DNA印跡分析(圖6A和圖6B)。探針用32P標(biāo)記，用圖像分析儀BAS2000(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)檢測信號。在圖6A中，左起第一泳道顯示引入loxP位點之前的保留21號人類染色體的DT40克隆；第二泳道顯示宿主DT40細胞克隆；第三泳道和后面各泳道顯示殺稻瘟素抗性DT40克隆。根據(jù)核苷酸序列預(yù)測限制酶片段的長度。在同源重組體的情況下為7.6kb，在野生型(非同源重組體)的情況下為8.5kb。已證實82個殺稻瘟素抗性克隆中有3個克隆是同源重組體(#60，#78，#79)。
(3-2)PCR分析對于兩個靶序列，即左序列和右序列(在圖5中分別用A和B表示)，設(shè)計一對寡核苷酸引物，使之鄰接每個靶序列。在染色體和打靶載體上設(shè)計這些寡核苷酸引物對。引物對的位置在圖5中如箭頭所指。引物對序列如下左455F5′-GGGCTAGCCATTAAAGCTGA(SEQ ID No.15)；左638R5′-AAAGGGAATAAGGGCGACAC(SEQ ID No.16)；右958F5′-GGTTTGTCCAAACTCATCAATGTA(SEQ ID No.17)；右1152R5′-GTCAATTCACTAATTCCTATTCCCAGT(SEQ ID No.18).
從得自DNA印跡分析的候選克隆中提取基因組DNA，并進行PCR。證實在左邊(A)的情況下擴增產(chǎn)物為3283bp，而在右邊(B)的情況下擴增產(chǎn)物為3114bp，正如核苷酸序列所預(yù)測的。結(jié)果示于圖6B。
根據(jù)上述實驗(1)-(3)，證實所獲得的82個殺稻瘟素抗性DT40克隆中有3個克隆保留21號人類染色體的部分片段(HAC載體)，該片段具有通過同源重組插入其中的loxP序列。
將來自21號人類染色體的HAC載體轉(zhuǎn)移到倉鼠細胞系(1)微細胞融合和抗藥性克隆的分離用得自實施例1和實施例2的DT40細胞(DT40(#21)bsd-79)作為染色體供體細胞，該DT40細胞(DT40(#21)bsd-79)保留來自通過缺失長臂遠側(cè)區(qū)并插入loxP序列的21號人類染色體的HAC載體。用來源于中國倉鼠卵巢的細胞系CHO-K1(可得自ATCC，保藏號JCRB9018)作為染色體受體細胞。
首先，從約109DT40(#21)bsd-79細胞制備微細胞。將DT40(#21)bsd-79細胞在含有秋水仙胺(0.075μg/ml，Demecolcine，wako PureChemical Industries，Ltd.)的培養(yǎng)液(10％FBS，1％ChS，50μM 2-巰基乙醇，DMEM)中培養(yǎng)12-15小時，直到細胞密度相當(dāng)于約60-70％飽和，以誘導(dǎo)微核。離心收集細胞，懸浮于無血清DMEM中，接種到12個25cm2的聚-L-賴氨酸預(yù)先包被的離心瓶(Coasters)中。讓瓶子在37℃靜置1小時。當(dāng)細胞貼壁后，取出培養(yǎng)液。向每個離心瓶中加入預(yù)熱(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，插入到丙烯酸塑料離心管中，然后離心(34℃，8000rpm)1小時。通過將微細胞懸浮于無血清培養(yǎng)液(DMEM)中，使其恢復(fù)，然后經(jīng)過濾純化。將純化的微核細胞加入到直徑6cm的培養(yǎng)皿中，在該皿中培養(yǎng)CHO-K1細胞直到80％飽和。用PEG溶液使其融合。48小時后，融合細胞經(jīng)胰酶處理而分散，然后在含有殺稻瘟素(8μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(10％FBS，F(xiàn)12)中進行培養(yǎng)。選擇培養(yǎng)進行約2周后，分離所形成的抗藥性集落并進行以下分析。微細胞融合12次，共得到4個殺稻瘟素抗性CHO克隆。
(2)轉(zhuǎn)移染色體的證實(2-1)PCR法染色體是否轉(zhuǎn)移，可通過PCR法加以證實。更具體地講，檢測標(biāo)記基因PRED 65基因和PRED 3基因(參見實施例1，(3))，該基因位于21號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)。證實在所有4個殺稻瘟素抗性CHO細胞克隆中有2個標(biāo)記序列被擴增。
(2-2)熒光原位雜交(FISH)分析按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人類特異性探針Cot1(Gibco BRL)進行FISH分析。當(dāng)分析殺稻瘟素抗性CHO細胞克隆中有2個克隆(CHO(#21)bsd79-1和CHO(#21)bsd79-3)時，在幾乎所有觀察的有絲分裂圖像中，都檢測到截短的21號人類染色體。代表性FISH圖像示于圖7a和圖7b。圖7a顯示端粒截短之前的全長21號人類染色體。圖7b顯示長臂遠側(cè)區(qū)缺失后的21號人類染色體片段。根據(jù)與宿主CHO細胞的染色體大小進行相對比較，證實截短的21號人類染色體轉(zhuǎn)移到CHO細胞中。
根據(jù)上述實驗(1)和(2)，證實所得殺稻瘟素抗性CHO克隆保留缺失長臂遠側(cè)區(qū)并插入loxP序列的21號人類染色體部分片段(HAC載體)。
將來自21號人類染色體的HAC載體轉(zhuǎn)移到人類細胞系并且證實來自21號人類染色體的HAC載體在培養(yǎng)細胞中的穩(wěn)定性(1)微細胞融合和抗藥性克隆的分離用得自實施例3的CHO細胞(CHO(#21)bsd-79-1)作為染色體供體細胞，該CHO細胞(CHO(#21)bsd-79-1)保留來自通過缺失長臂遠側(cè)區(qū)并插入loxP序列的21號人類染色體的HAC載體。用人纖維肉瘤細胞系HT1080(可得自ATCC，保藏號CCL-121)作為染色體受體細胞。首先，從約109CHO(#21)bsd-79-1細胞制備微細胞。更具體地講，將CHO(#21)bsd-79-1細胞在6個25cm2離心瓶(Coasters)中培養(yǎng)到細胞密度相當(dāng)于約60-70％飽和，然后在含有秋水仙胺(0.075μg/ml，Demecolcine，wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的培養(yǎng)液(10％FBS，8μg/ml殺稻瘟素，F(xiàn)12)中再培養(yǎng)48小時，以誘導(dǎo)微核。取出培養(yǎng)液后，向每個離心瓶中加入預(yù)熱(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，插入到丙烯酸塑料離心管中，然后離心(34℃，8000rpm)1小時。通過將微細胞懸浮于無血清培養(yǎng)液(DMEM)中，使其恢復(fù)，然后經(jīng)過濾純化。將純化的微核細胞加入到盛有培養(yǎng)到至多80％飽和的HT1080細胞的直徑6cm的培養(yǎng)皿中。用PEG溶液使其融合。48小時后，融合細胞經(jīng)胰酶處理而分散，然后在含有殺稻瘟素(8μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(10％CS，F(xiàn)12)中進行培養(yǎng)。選擇性培養(yǎng)進行約2周后，分離所形成的抗藥性集落并進行以下分析。微細胞融合2次，共得到12個殺稻瘟素抗性HT1080克隆。
(2)轉(zhuǎn)移染色體的證實(2-1)PCR法染色體是否轉(zhuǎn)移，可通過PCR法擴增殺稻瘟素抗性基因加以證實。本文使用的寡核苷酸引物序列如下所示Bsd2687F5′-CAACAGCATCCCCATCTCTG(SEQ ID No.19)；Bsd2891R5′-GCTCAAGATGCCCCTGTTCT(SEQ ID No.20).
證實在所有12個殺稻瘟素抗性HT1080細胞克隆中，抗藥性基因序列均被擴增。
(2-2)染色體分析按照Kuroki等(Cell engineering handbook，Yodosha，1992)描述的方法，通過吉姆薩(Giemsa)染色，進行染色體分析。分析了殺稻瘟素抗性HT1080細胞克隆中的4個克隆(HT1080(#21)bsd-79-1-3，6，11，14)的約20幅中期染色體圖像。在殺稻瘟素抗性克隆中，觀察到比內(nèi)源21號染色體小且在親代細胞系HT1080中未觀察到的微型染色體。
根據(jù)上述實驗(1)和(2)，證實所得殺稻瘟素抗性HT1080克隆保留缺失長臂遠側(cè)區(qū)并插入loxP序列的21號人類染色體部分片段(HAC載體)。
(3)在非選擇性培養(yǎng)條件下的長期傳代培養(yǎng)為了證實缺失長臂遠側(cè)區(qū)的21號人類染色體在培養(yǎng)細胞中的穩(wěn)定性，在非選擇性培養(yǎng)條件下進行長期傳代培養(yǎng)。采用上述雞細胞系(DT40(#21)bsd-79)和人細胞克隆(HT1080(#21)bsd-79-1-3，6，11，14)。對于雞細胞系，應(yīng)用補充了10％FBS、1％ChS和50μM 2-巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)液作為非選擇性培養(yǎng)液。通過向非選擇性培養(yǎng)液中加入8μg/ml(在DT40(#21)bsd-79的情況下)殺稻瘟素，制備選擇性培養(yǎng)液。對于人細胞克隆，應(yīng)用補充了10％CS的DMEM培養(yǎng)液作為非選擇生培養(yǎng)液。通過向非選擇性培養(yǎng)液中加入4μg/ml殺稻瘟素，制備選擇性培養(yǎng)液。就雞細胞系而言，將1.5×107細胞接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿中。1天后，測定細胞數(shù)，然后再將1.5×107細胞接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿中。就人細胞克隆來說，將5.0×105細胞接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿中。3天后，測定細胞數(shù)，然后再將5.0×105細胞接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)開始后21天、42天、63天、84天、105天和126天，收集雞細胞系；而在10天和20天后收集人細胞系。制備染色體制備物。
(4)染色體分析按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人類特異性探針Cot1(Gibco BRL)對雞細胞中的人工染色體進行檢測。觀察在500個中期核中是否存在人類染色體，并計算人類染色體的保留率。按照Kuroki等(Cell engineering handbook，Yodosha，1992)描述的方法，通過吉姆薩染色，對人類細胞中人工染色體進行檢測。觀察在20幅中期染色體圖像中是否存在微型染色體，并計算微型染色體的保留率。求出4個克隆的平均值。結(jié)果見下表1。
表1#21ΔqHAC的穩(wěn)定性

在非選擇性培養(yǎng)條件下，當(dāng)細胞分裂超過200次時，21號人類染色體的部分片段在DT40細胞中仍穩(wěn)定保留。通過觀察100幅中期染色體圖像，統(tǒng)計每個細胞中人類染色體數(shù)目。在所有圖像中，毫無例外地都觀察到單個染色體。盡管仍在繼續(xù)培養(yǎng)HT1080細胞克隆，但是在選擇性培養(yǎng)條件下，在細胞分裂數(shù)為22次的時間點時，仍穩(wěn)定地保留了21號人類染色體部分片段。此外，當(dāng)觀察中期染色體圖像時，觀察到每個細胞中有一個或兩個染色體部分。
根據(jù)上述實驗(3)和(4)，清楚地證明在非選擇性培養(yǎng)條件下，缺失長臂遠側(cè)區(qū)的21號人類染色體部分片段在DT40細胞系和HT1080細胞克隆中穩(wěn)定保留，并且保持每個細胞中的拷貝數(shù)。
將GFP基因插入到來自21號人類染色體的HAC載體中圖8顯示將GFP基因插入到來自21號人類染色體的HAC載體中的方法。如實施例1-4所述，通過端粒截短而缺失長臂遠側(cè)區(qū)并且在其長臂近側(cè)區(qū)引入loxP位點，制備來自21號人類染色體的HAC載體。另一方面，制備含有l(wèi)oxP序列的GFP表達質(zhì)粒。通過采用由瞬時表達Cre重組酶在loxP序列之間進行的位點專一重組反應(yīng)，將所述質(zhì)粒引入到人工染色體中。根據(jù)G418抗性獲得與否(因破壞啟動子而重建neo基因表達單元)，來篩選具有插入序列的重組產(chǎn)物。
(1)構(gòu)建含有l(wèi)oxP序列的GFP表達質(zhì)粒GFP表達載體PEGFP-C1(Clontech)用限制酶GbLII和BamH I(Nippon Gene)消化，分離/純化4.7kb的DNA片段，該片段通過使用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo Co.，Ltd.)而自我連接成環(huán)狀。通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α來分離重組質(zhì)粒，獲得缺乏多克隆位點內(nèi)從GbL II到BamH I的51bp的質(zhì)粒PEGFP-C1Δ。用PEGFP-C1Δ作為模板，通過PCR擴增EGFP基因表達單元。
根據(jù)得自GenBank數(shù)據(jù)庫的核苷酸序列(登記號U55763)制備的引物寡核苷酸序列如下所示EcoGFP55′-GGCCGAATTCCGTATTACCGCCATGCAT(SEQ ID No.21)；BamGFP35′-CCGGGATCCCACAACTAGAATGCAGTG(SEQ ID No.22).
如此擴增的EGFP基因表達單元的兩端用限制酶EcoR I和BamHI(Nippon Gene)消化，產(chǎn)生粘端。將所得構(gòu)建體克隆到具有l(wèi)oxP序列和hCMV啟動子的質(zhì)粒載體pBS226(Lifetech)的EcoR I/BamH I位點。
(2)轉(zhuǎn)染和G418抗性克隆的分離將實施例3中制備的保留來自21號人類染色體的HAC載體的CHO細胞(CHO(#21)bsd-79-1)用胰蛋白酶處理，將5×106細胞懸浮于0.8ml磷酸緩沖液(PBS)中。使用Gene Pulser(Biorad)，在10μgpBS226/EGFP質(zhì)粒和20μg Cre酶表達載體pBS185(Lifetech)存在下，進行電穿孔。將750V電壓施加于電容為25μF的電容器，通過使用具有以4mm間距放置的電極的電穿孔細胞，讓其放電。將電穿孔細胞接種在裝有補充了10％胎牛血清(FBS)的Eagle F12培養(yǎng)液(在下文稱為“F12”，Invitrogen)的100mm塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中。2天后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入含有800μg/ml G418(GENETICIN，Sigma)和8μg/ml殺稻瘟素S鹽酸鹽(Funakoshi)的培養(yǎng)液。在2-3周內(nèi)形成抗藥性集落。集落形成頻率是每5×106個CHO細胞為20個集落。所得集落進行分離、增殖并進行以下分析。
(3)插入在來自21號人類染色體的HAC載體中的GFP基因的表達通過熒光顯微鏡，觀察所分離的G418/殺稻瘟素抗性CHO克隆。結(jié)果，證實在19個克隆中表達了GFP。代表性的熒光圖像示于圖9。
(4)同源重組體的證實進行DNA印跡分析，以證實同源重組體。在DNA印跡中，部分G418抗性基因和GFP基因用作探針，約5μg基因組DNA用限制酶EcoR I或BamH I(Nippon Gene)處理。采用經(jīng)限制酶Nhe I和GbL II(Nippon Gene)消化質(zhì)粒PEGFP-C1(Clontech)而得到的849bp片段作為GFP探針。G418抗性基因探針是用限制酶GbL II和Sma I(Nippon Gene)消化質(zhì)粒pSV2neo而得到的1000bp片段。探針用32P標(biāo)記，用圖像分析儀BAS2000(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)，檢測信號。代表性結(jié)果作為實例示于圖10。在圖10中，用neo探針檢測經(jīng)EcoRI消化的DNA。第一泳道顯示插入之前的DT40系；第二泳道和后面各泳道顯示G418抗性DT40克隆。在插入前的等位基因中，檢測來自5.7kb片段的信號；而在插入后的等位基因中，檢測來自6.9kb片段的信號。
根據(jù)上述實驗(1)和(4)，在19個G418抗性克隆中有18個檢測出了通過同源重組獲得的等位基因。其中的5個克隆中，除了檢測到同源重組后的等位基因外，還檢測到重組前的等位基因，而且，在一個克隆中還檢測到了隨機插入的等位基因。因此，得到所需重組體，其頻率為12/19(63％)。
21號人類染色體短臂的缺失(1)構(gòu)建用于端粒截短的構(gòu)建體通過改變PBS-TEL/Puro，構(gòu)建用于缺失21號人類染色體短臂遠側(cè)區(qū)的端粒截短載體(Kuroiwa，Nucleic Acids Res.，263347，1998)。從PBS-TEL/Puro取出嘌呤霉素抗性基因的1.7kb表達單元，作為NotI片段，用T4 DNA聚合酶(DNA平端試劑盒，Takara Shuzo Co.，Ltd.)形成平端，產(chǎn)生PBS-TEF載體。PGKhyrgo/ΔLT20用限制酶Cla I和Sma I(Nippon Gene)消化，分離/純化潮霉素抗性基因的表達單元，該單元為1.8kb片段，且處于PGK啟動子的控制之下。將該片段克隆到PBS-TEL載體中，得到PBS-TEL/hygro。
根據(jù)得自GenBank數(shù)據(jù)庫的21號人類染色體長臂近側(cè)區(qū)的核苷酸序列(登記號AL163201)，設(shè)計用于插入端粒截短載體的靶序列。用于擴增靶序列的引物寡核苷酸序列如下所示，所述引物寡核苷酸中添加了限制酶Spe I或BamH I識別序列Spe312035′-GCACTAGTCTGGCACTCCTGCATAAACA(SEQ ID No.23)；Bam361925′-CTAAGGATCCATTTCAGCCTGTGGGAATCA(SEQ ID No.24).
使用從保留21號人類染色體的DT40雜交細胞中提取的基因組DNA作為模板，通過PCR擴增靶序列。擴增產(chǎn)物用限制酶Spe I或BamH I(Nippon Gene)消化。分離具有粘端的約5kb的DNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化。將該DNA片段克隆到PBS-TEL/Hyrgo質(zhì)粒的Xba I/BamH I位點。最終得到的PBS-TEL/Hyrgo構(gòu)建體的大小約為5.8kb。端粒截短載體、靶序列和經(jīng)同源重組而得到的染色體等位基因示于圖11。
(2)轉(zhuǎn)染和潮霉素抗性克隆的分離PBS-TEL/Hyrgo構(gòu)建體用限制酶BamH I(Nippon Gene)消化，得到線狀構(gòu)建體，將其導(dǎo)入保留其長臂遠側(cè)區(qū)已缺失并插入loxP位點的21號人類染色體的DT40雜交細胞(DT40(#21)bsd79)中。將DT40雜交細胞(1×107)懸浮于0.75ml PBS中，使用Gene Pulser(Biorad)，在25μg DNA存在下，進行電穿孔。將750V電壓施加于電容為25μF的電容器，通過使用具有以4mm間距放置的電極的電穿孔細胞，讓其放電。將電穿孔細胞懸浮于補充了10％胎牛血清(FBS)、1％雞血清(ChS)和50μM 2-巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)液(Invitrogen)中，然后接種到五個96孔板(Falcon)中。2天后，加入潮霉素B(Wako Pure ChemicalIndustries.Ltd.)，使其終濃度為1.5mg/ml。在2-3周內(nèi)形成抗性集落。進行2次轉(zhuǎn)染，共分離出63個抗藥性集落。使所得集落增殖并進行以下分析。
(3)同源重組體的篩選和端粒截短的證實(3-1)PCR分析進行PCR，用于從潮霉素抗性DT40克隆中初步篩選同源重組體。使用從潮霉素抗性克隆中提取的約0.1μg基因組DNA作為模板，擴增位于21號人類染色體短臂近側(cè)區(qū)的STS標(biāo)記(pCHB，D21S188，D21S275)。代表性結(jié)果示于圖12。在圖12中，左邊給出的是根據(jù)21號人類染色體的G帶圖像的示意性染色體圖譜。此外，顯示出各標(biāo)記存在于哪條帶上。對于潮霉素抗性DT40克隆，檢測到其預(yù)期PCR擴增產(chǎn)物的標(biāo)記，用■表示；未檢測到其預(yù)期PCR擴增產(chǎn)物的標(biāo)記，用□表示。DT40(#21)代表經(jīng)歷端粒截短前的細胞。在短臂遠側(cè)區(qū)通過端粒截短而缺失的情況下，可以想像到，D21S275可能存在，而D21S188和pCHB可能不存在。因此，選擇45個克隆(其中D21S188或pCHB都沒有擴增)，進行DNA印跡分析。
(3-2)DNA印跡分析設(shè)計的探針位于用于同源重組的靶序列內(nèi)。采用以下所示的寡核苷酸引物對作為探針。通過使用保留21號人類染色體的DT40雜交細胞的基因組DNA作為模板，進行PCR。分離并純化PCR擴增產(chǎn)物。
#21p912035′-CTGGCACTCCTGCATAAACA(SEQ ID No.25)#21p919765′-TCTGTGTTCCCCTTCTCTGA(SEQ ID No.26)從潮霉素抗性集落中提取的約10μg基因組DNA用限制酶HindIII(Nippon Gene)消化，然后進行DNA印跡分析。根據(jù)核苷酸序列預(yù)測限制性片段的長度。在同源重組體的情況下，長度為5.8kb，而在野生型(非同源重組體)的情況下，長度為1.9kb。已證實在初步篩選中，45個候選克隆中篩選出2個克隆是同源重組體(圖13)。
(3-3)PCR法鄰接重組靶序列的序列經(jīng)PCR擴增。根據(jù)21號人類染色體和打靶載體而設(shè)計的引物寡核苷酸序列如下所示Hyg9685′-AAGTACTCGCCGATAGTGGAAACC(SEQ ID No.27)；#21p967055′-AGTTAGCCTACCTTTTGGCCATCC(SEQ ID No.28).
擴增產(chǎn)物的大小為5.9kb。擴增產(chǎn)物用限制酶Nsi I消化，預(yù)計會產(chǎn)生1.4kb、2.6kb和1.9kb的片段(圖11)。證實PCR擴增發(fā)生在2個克隆中，其中用DNA印跡分析觀察到同源重組等位基因，并且證實了產(chǎn)生用限制酶消化的部分片段。
(3-4)熒光原位雜交(FISH)按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人類特異性探針Cot1(Gibco BRL)進行FISH分析。結(jié)果，在所觀察的幾乎所有的有絲分裂圖像中，都檢測到截短的21號人類染色體(圖15a和圖15b)。
根據(jù)上述實驗(1)-(3)，證實63個潮霉素抗性克隆中有2個保留了缺失短臂的截短的21號人類染色體。
將EPO基因插入到來自21號人類染色體的HAC載體中按照與實施例5中描述的用于GFP基因的情況相同的方式，將人EPO基因插入到來自21號人類染色體的HAC載體中。如實施例1-4所述，制備來自21號人類染色體并通過端粒截短而缺失長臂遠側(cè)區(qū)且在其長臂近側(cè)區(qū)引入loxP位點的HAC載體。另一方面，制備含有l(wèi)oxP序列的人EPO表達質(zhì)粒。通過采用由瞬時表達Cre重組酶在loxP序列之間進行的位點專一重組反應(yīng)，將所述質(zhì)粒整合到人工染色體中。根據(jù)G418抗性獲得與否(因破壞啟動子而重建neo基因表達單元)，來篩選具有插入序列的重組產(chǎn)物。
(1)用于構(gòu)建含有l(wèi)oxP序列的人EPO表達質(zhì)粒pLN1-EPO的引物寡核苷酸序列如下所示SV40polyANp15′-CGG GAT CCC TCG AGC GAG ACA TGA TAA GAT ACA TTGATG-3′(SEQ ID No.29)；SV40polyARp15′-GGA AGA TCT TCC TAA TCA GCC ATA CCA CAT TTG TAG AGG-3′(SEQ ID No.30)，根據(jù)質(zhì)粒載體pSTneoB的核苷酸序列，制備這些引物(Kato等，Cell Struct Funct，12575-580，1987)；CMVNp35′-CGG AAT TCC GGA CAT TGA TTA TTG ACT AGT TAT TAA TAG-3′(SEQ ID No.31)；CMVRp15′-CGG GAT CCC GGG TGT CTT CTA TGG AGG TCA AAA CAG-3′(SEQID No.32)，根據(jù)pBS226的CMV啟動子的核苷酸序列，制備這些引物；和hEPONp15′-CGG GAT CCC GGC CAC CAT GGG GGT GCA CGA ATG TC-3′(SEQ IDNo.33)；hEPORp15′-CGC TCG AGC GCT ATC TGT CCC CTG TCC TGC AGG-3′(SEQ ID No.34)，根據(jù)得自GenBank的核苷酸序列(登記號I05397)，制備這些引物。
采用pSTneoB作為模板經(jīng)PCR擴增的SV40聚腺苷酸附加單元的兩端，以及SV40polyANp1(SEQ ID No.29)和SV40polyARp1(SEQID No.30)用限制酶BamH I和Bgl II(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到粘端。將所得構(gòu)建體克隆到具有l(wèi)oxP序列和hCMV啟動子的質(zhì)粒載體pBS226(Lifetech)的BamH I位點。所得質(zhì)粒稱為pBS226-pA。
其次，采用pBS226作為模板經(jīng)PCR擴增的CMV啟動子單元的兩端，以及CMVNp3(SEQ ID No.31)和CMVRp1(SEQ ID No.32)用限制酶EcoR I和BamH I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到粘端。將所得構(gòu)建體克隆到pBS226-pA的EcoR I-BamH I位點。所得質(zhì)粒稱為pLN1。
最后，采用EPO cDNA作為模板經(jīng)PCR擴增的EPO編碼區(qū)的兩端，以及hEPONp1(SEQ ID No.33)和hEPORp1(SEQ ID No.34)用限制酶BamH I和Xho I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到粘端。將所得構(gòu)建體克隆到pLN1的BamH I-Xho I位點。所得質(zhì)粒稱為pLN1-EPO。
(2)轉(zhuǎn)染和G418抗性克隆的分離將實施例3中制備的保留來自21號人類染色體的HAC載體的CHO細胞(CHO(#21)bsd79-1)用胰蛋白酶處理，將5×106細胞懸浮于0.8ml Hank平衡鹽溶液(HBSS)中，使用Gene Pulser(Biorad)，在10μgpLN1-EPO載體(按上節(jié)(1)制備)和10μg Cre酶表達載體pBS185(Lifetech)存在下，進行電穿孔。將450V電壓施加于電容為500μF的電容器，通過使用具有以4mm間距放置的電極的電穿孔細胞，讓其放電。將電穿孔細胞接種在裝有補充了10％胎牛血清(FBS)的EagleF12培養(yǎng)液(在下文稱為“F12”，Invitrogen)的4個48孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中。2天后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入含有800μg/ml G418(GENETICIN，Invitrogen)和8μg/ml殺稻瘟素S鹽酸鹽(Funakoshi)的培養(yǎng)液。在2-3周內(nèi)形成抗性集落。集落形成頻率是每5×106個CHO細胞為28個集落。所得集落進行分離、增殖并進行以下分析。如此獲得的細胞在下文稱為“KH21E”細胞。
(3)插入在來自21號人類染色體的HAC載體中的EPO基因的表達按照酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，通過定量測定培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的人EPO蛋白，確定人EPO基因的表達。
對于分離的19個G418/殺稻瘟素抗性KH21E細胞克隆中的6個，將每個克隆(1×105細胞)分別接種到裝有2ml F12培養(yǎng)液的6孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中，所述培養(yǎng)液中補充了10％FBS并含有800μg/ml G418和8μg/ml殺稻瘟素。當(dāng)細胞長滿后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入補充了10％FBS的2ml F12培養(yǎng)液。培養(yǎng)6天，收集上清液。使用人EPO ELISA試劑盒(Quantikine IVD人EPO免疫測定，R&D系統(tǒng))，定量測定培養(yǎng)上清液中人EPO的含量。結(jié)果見下表2。
表2

根據(jù)上述結(jié)果，證實所有6個克隆中都表達人EPO。
(4)KH21E細胞產(chǎn)生的人EPO的生物學(xué)活性根據(jù)人類白血病細胞系UT7-EPO細胞(得自Norio Komatsu教授，Jichi Medical School，該細胞以人EPO依賴性方式增殖)的增殖活性，分析所產(chǎn)生的人EPO的生物學(xué)活性。對于2個KH21E細胞克隆(#C2和#C18)，將培養(yǎng)上清液加入到補充了10％FBS的IMDM培養(yǎng)液(Invitrogen)中，根據(jù)表2的定量值使其終濃度為0.01、0.1、1、5、20和100mIU/ml EPO。向裝有0.1ml所述IMDM培養(yǎng)液的96孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中，加入5×103UT7-EPO細胞。培養(yǎng)3天后，用細胞增殖測定試劑盒(Cell Titer 96 AQueous One Solution CellProliferation Assay，Promega)，分析細胞增殖。
結(jié)果示于圖16。在2種情況下的每一種中，當(dāng)加入2個克隆的培養(yǎng)上清液時，觀察到吸光度以劑量依賴方式上升(圖16，C2和C18)，與加入重組人EPO蛋白(rhEPO；Kirin brewery Co.，Ltd)的情況類似。
根據(jù)上述結(jié)果，證實培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的人EPO具有與重組人EPO蛋白相同的生物學(xué)活性。
證實在KH21E細胞中的轉(zhuǎn)移染色體在本實施例中，通過PCR和FISH分析，證實實施例7(2)中制備的每個KH21E細胞克隆中染色體是否轉(zhuǎn)移。
(1)PCR分析對于標(biāo)記PRED 65基因和PRED 3基因以及D21S265標(biāo)記，進行PCR擴增，其中PRED 65基因和PRED 3基因位于21號人類染色體長臂近側(cè)區(qū)并位于loxP位點附近，而D21S265標(biāo)記位于其遠側(cè)區(qū)(參見實施例1(3)和圖2)。通過在loxP序列之間進行的位點專一重組而引入的人EPO基因插入序列預(yù)計具有PRED 65基因和PRED 3基因，但沒有D21S265標(biāo)記。結(jié)果，在22個G418抗性CHO細胞克隆中有21個中得到預(yù)期的擴增產(chǎn)物。對于這21個克隆，通過PCR擴增位于21號人類染色體短臂近側(cè)區(qū)的STS標(biāo)記(pCHB，D21S187，D21S275)(參見實施例6，(3)，圖12)。因為允許保留來自21號人類染色體的短臂的HAC載體，可以想像所有標(biāo)記都會存在。結(jié)果，證實擴增與15個克隆中所預(yù)計的一樣進行。
(2)熒光原位雜交(FISH)分析按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人類特異性探針Cot1(Gibco BRL)進行FISH分析。分析了8個克隆，其中所有標(biāo)記都如同以上(1)小節(jié)進行的PCR分析所預(yù)計的一樣進行擴增；在進行分析時，在所觀察的所有有絲分裂圖像中，都檢測到截短的21號人類染色體。結(jié)果見下表3。請注意，表3中列出的克隆KH21代表如實施例3制備的保留來自21號人類染色體的HAC載體的CHO細胞(CHO(#21)bsd-79-1)。
表3

根據(jù)上述結(jié)果，并與宿主CHO細胞的染色體大小進行相對比較，證實截短的21號人類染色體轉(zhuǎn)移到CHO細胞中。
根據(jù)上述實驗(1)和(2)，證實所獲得的G418抗性CHO克隆(KH21E細胞)保留缺乏其長臂遠側(cè)區(qū)的截短的21號人類染色體。
將多個EPO基因插入到來自21號人類染色體的HAC載體中在本實施例中，按照與實施例7描述的人EPO基因的情況相同的方式，將多個人EPO基因插入到來自21號人類染色體的HAC載體中。如實施例1-4所述，通過端粒截短而缺失長臂遠側(cè)區(qū)且在其長臂近側(cè)區(qū)引入loxP位點，制備來自21號人類染色體的HAC載體。另一方面，制備含有l(wèi)oxP序列的人EPO表達質(zhì)粒。通過采用由瞬時表達Cre重組酶在loxP序列之間進行的位點專一重組反應(yīng)，將所述質(zhì)粒引入到人工染色體中。根據(jù)G418抗性獲得與否(因破壞啟動子而重建neo基因表達單元)，來篩選具有插入序列的重組產(chǎn)物。
(1)含有l(wèi)oxP序列的2拷貝EPO表達質(zhì)粒(pLN1-EOP2)的構(gòu)建質(zhì)粒構(gòu)建中使用的引物寡核苷酸序列如下所示EPOnF5′-GGA ATT CCG GGC CCA CGC GTG ACA TTG ATT ATT GA-3′(SEQID No.35)；SVpAR5′-GGA ATT CCT GAT CAT AAT CAG CCA TAC CAC ATT TG-3′(SEQID No.36).
EPOnF引物(SEQ ID No.35)自5′一側(cè)起依次具有EcoR I、ApaI、Mlu I限制酶識別序列和CMV啟動子5′一側(cè)部分序列，根據(jù)pBS226中的CMV啟動子核苷酸序列，制備EPOnF引物。SVpAR引物(SEQ ID No.36)自5′一側(cè)起依次具有EcoR I、Bcl I限制酶識別序列和SV40聚腺苷酸附加單元3′一側(cè)部分互補序列，根據(jù)質(zhì)粒載體pSTneoB制備SVpAR引物(Kato等，Cell Struct Funct，12575-580，1987)。
使用含有CMV啟動子的DNA片段(所述片段是將實施例7中制備的質(zhì)粒載體pLN1-EPO經(jīng)EcoR I和Xba I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化而獲得)、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加單元作為模板，通過使用EPOnF(SEQ ID No.36)和SVpAR引物(SEQ ID No.37)以及KOD-Plus-(Toyobo)，進行PCR擴增。使用GeneAmp9700(AppliedBiosystems)作為熱循環(huán)儀。PCR循環(huán)包括94℃反應(yīng)2分鐘，再進行以下循環(huán)共30次94℃變性15秒，60℃退火30秒，68℃延伸90秒。所得DNA片段的兩端用限制酶EcoR I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到粘端。將所得構(gòu)建體克隆到質(zhì)粒載體pLN1-EPO的EcoR I位點。如此克隆的DNA片段插入序列的核苷酸序列用DNA測序儀(PRISM 3700，Applied Biosystems)分析，并證實與用作模板的pLN1-EPO的核苷酸序列相應(yīng)部分是相同的。如此獲得的克隆中，具有按正向排列由CMV啟動子、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加單元的插入序列組成的2拷貝克隆，被稱為質(zhì)粒載體pLN1-EPO2。
(2)含有l(wèi)oxP序列的4拷貝EPO表達質(zhì)粒(pLN1-EOP4)的構(gòu)建將以上(1)小節(jié)中制備的質(zhì)粒載體pLN1-EPO2用Xba I(TakaraShuzo Co.，Ltd.)消化，得到線狀載體，然后用KOD聚合酶(Toyobo)處理，產(chǎn)生平端。然后，將所述線狀片段用Apa I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到DNA片段，用于插入含有2拷貝的由CMV啟動子、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加單元組成的片段。將質(zhì)粒載體pLN1-EPO2用Mlu I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，然后用KOD聚合酶(Toyobo)處理，產(chǎn)生平端。將該片段用Apa I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到Apa I-平端Mlu I位點。將用于如上獲得的插入的DNA片段克隆在該位點。所獲得的含有4拷貝人EPO基因的質(zhì)粒載體被稱為pLN1-EPO4。
(3)轉(zhuǎn)染和G418抗性克隆的分離將實施例3中制備的保留來自21號人類染色體的HAC載體的CHO細胞(CHO(#21)bsd79-1)用胰蛋白酶處理，將5×106細胞懸浮于0.8ml Hank平衡鹽溶液(HBSS)中。使用Gene Pulser(Biorad)，在在以上(1)小節(jié)或(2)小節(jié)中制備的10μg pLN1-EPO2載體或10μgpLN1-EPO4載體和10μg Cre酶表達載體pBS185(Lifetech)存在下，進行電穿孔。將450V電壓施加于電容為500μF的電容器，通過使用具有以4mm間距放置的電極的電穿孔細胞，讓其放電。將電穿孔細胞接種在5個裝有補充了10％胎牛血清(FBS)的Eagle F12培養(yǎng)液(在下文稱為“F12”，Invitrogen)的48孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中。2天后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入含有800μg/ml G418(GENETICIN，Invitrogen)和8μg/ml殺稻瘟素S鹽酸鹽(Funakoshi)的培養(yǎng)液。在2-3周內(nèi)形成抗性集落。集落形成頻率是每5×106個CHO細胞在pLN1-EPO2的情況下為14個集落，而在pLN1-EPO4的情況下為24個集落。所得集落進行分離、增殖并進行以下分析。用pLN1-EPO2制備的細胞在下文被稱為“KH21E2細胞”，而用pLN1-EPO4制備的細胞在下文被稱為“KH21E4細胞”。
(4)人EPO重組體插入序列的證實篩選具有插入序列的重組體，也就是說，采用根據(jù)來自人EPO基因供體載體的序列和HAC載體而設(shè)計的引物(使之鄰接loxP序列位點)，通過PCR擴增來證實插入序列是否引入到來自21號人類染色體的HAC載體上的loxP序列位點中。采用根據(jù)質(zhì)粒載體pBS226和HAC載體而設(shè)計的引物，通過PCR擴增來證實人EPO基因插入序列的拷貝數(shù)。
PCR中所用的寡核苷酸引物序列如下所示SVpANp15’-TTT GCA TGT CTT TAG TTC TAT GAT GA-3’(SEQ ID No.37)，該引物是根據(jù)質(zhì)粒載體pSTneoB的核苷酸序列制備的(Kato等，Cell Struct Funct，12575-580，1987)；Neo Rp25’-AGG TCG GTC TTG ACA AAA AGA AC-3’(SEQID No.38)，該引物是根據(jù)質(zhì)粒載體pSF1(Lifetech)的neo基因的核苷酸序列來制備的；M13RV5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’(SEQ ID No.39)，該引物是根據(jù)質(zhì)粒載體pBS226(Lifetech)的核苷酸序列來制備的。
通過使用SVpANp1引物(SEQ ID No.37)和Neo Rp2引物(SEQ IDNo.37)，進行PCR擴增；其中SVpANp1引物是根據(jù)來自pLN1-EPO2或pLN1-EPO4載體的SV40聚腺苷酸附加序列區(qū)而設(shè)計的，而NeoRp2引物是根據(jù)來自HAC載體的pSF1的新霉素抗性基因而設(shè)計的。在具有插入序列的重組體的情況下，預(yù)計獲得約1.0kb的片段，該片段包括從具有SV40聚腺苷酸附加序列的部分到來自pLN1-EPO2或pLN1-EPO4載體的loxP序列的區(qū)域，以及從loxP序列到來自pSF1的neo基因部分的區(qū)域。結(jié)果，擴增與在所有6個KH21E2細胞克隆和6個KH21E4細胞克隆中預(yù)測的一樣進行。
根據(jù)上述結(jié)果，證實所有這12個克隆都是在loxP序列中引入插入序列的重組體。
其次，對于6個KH21E2細胞克隆，通過使用來自質(zhì)粒載體pBS226的Neo Rp2引物(SEQ ID No.38)和M13RV(SEQ ID No.39)，進行PCR擴增。在具有插入序列的重組體的情況下，預(yù)計獲得約3.8kb的片段，該片段包括具有從CMV啟動子、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加序列的2拷貝部分，到來自pLN1-EPO2的loxP序列的區(qū)域，以及從loxP序列到來自pSF1的neo基因部分的區(qū)域。結(jié)果，擴增與在所有克隆中預(yù)測的一樣進行。
根據(jù)上述結(jié)果，證實6個KH21E2細胞克隆含有包括CVM啟動子、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加序列在內(nèi)的2拷貝DNA插入片段。
(5)插入在來自21號人類染色體的HAC載體中的EPO基因的表達按照酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，通過定量測定培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的人EPO蛋白，來確定人EPO基因的表達。
(5-1)EPO基因在KH21E2細胞中的表達對于所分離的14個G418/殺稻瘟素抗性KH21E2細胞克隆中的6個，將每個克隆(1×105細胞)分別接種到裝有2ml F12培養(yǎng)液的6孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中，所述培養(yǎng)液中補充了10％FBS并含有800μg/ml G418和8μg/ml殺稻瘟素。當(dāng)細胞長滿后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入補充了10％FBS的2ml F12培養(yǎng)液。培養(yǎng)6天后，收集上清液。通過人EPO ELISA試劑盒(Quantikine IVD人EPO免疫測定，R&D系統(tǒng))，按2×10-5的稀釋度定量測定培養(yǎng)上清液中人EPO的含量。結(jié)果見下表4。
表4

(5-2)EPO基因在KH21E4細胞中的表達對于所分離的24個G418/殺稻瘟素抗性KH21E4細胞克隆中的6個，將每個克隆(1×105細胞)分別接種到裝有2ml F12培養(yǎng)液的6孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中，所述培養(yǎng)液中補充了10％FBS并含有800μg/ml G418和8μg/ml殺稻瘟素。當(dāng)細胞長滿后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入補充了10％FBS的2ml F12培養(yǎng)液。培養(yǎng)6天，收集上清液。通過人EPO ELISA試劑盒(Quantikine IVD人EPO免疫測定，R&D系統(tǒng))，按2×10-5的稀釋度定量測定培養(yǎng)上清液中人EPO的含量。結(jié)果見下表5。
表5

(5-3)EPO基因在KH21E細胞中的表達在實施例7中分離的5個G418/殺稻瘟素抗性KH21E細胞克隆(所述克隆在來自21號人類染色體的HAC載體上具有單拷貝的人EPO基因)用作參比對照。對于這5個克隆，將每個克隆(1×105細胞)分別接種到裝有2ml F12培養(yǎng)液的6孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中，所述培養(yǎng)液中補充了10％FBS并含有800μg/ml G418和8μg/ml殺稻瘟素。當(dāng)細胞長滿后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入補充了10％FBS的2ml F12培養(yǎng)液。培養(yǎng)6天，收集上清液。通過人EPO ELISA試劑盒(Quantikine IVD人EPO免疫測定，R&D系統(tǒng))，定量測定培養(yǎng)上清液中人EPO的含量。結(jié)果見下表6。請注意，C1和C4按1×10-4的稀釋度來定量測定，而C9、C11和C21按1×10-5的稀釋度來定量測定。
表6

根據(jù)上表4-6所示結(jié)果，證實在所有6個KH21E2細胞克隆和6個KH21E4細胞克隆中都表達人EPO。此外，人EPO的表達與來自21號人類染色體的HAC載體中插入的人EPO基因拷貝數(shù)有關(guān)。因此，說明可以根據(jù)插入其中的基因拷貝數(shù)來控制來自21號人類染色體的HAC載體的表達。
將EPO基因插入到來自缺失長臂遠側(cè)區(qū)和短臂近側(cè)區(qū)的21號人類染色體的HAC載體中按照與實施例7描述的人EPO基因相同的方式，將人EPO基因插入到來自21號人類染色體的HAC載體中。如實施例1-4和實施例6所述，通過端粒截短而缺失長臂遠側(cè)區(qū)、并在其長臂近側(cè)區(qū)引入loxP位點、以及通過端粒截短而缺失短臂遠側(cè)區(qū)，制備來自21號人類染色體的HAC載體。另一方面，制備含有l(wèi)oxP序列的人EPO表達質(zhì)粒。通過采用由瞬時表達Cre重組酶在loxP序列之間進行的位點專一重組反應(yīng)，將所述質(zhì)粒引入到人工染色體中。根據(jù)G418抗性獲得與否(因破壞啟動子而重建neo基因表達單元)，來篩選具有插入序列的重組體。
(1)轉(zhuǎn)染和G418抗性克隆的分離將實施例17(下文有描述)中制備的保留來自21號人類染色體的HAC載體的2個CHO細胞克隆即CHO(#21)hyg4和CHO(#21)hyg8(在下文分別稱為“H4”和“H8”)用胰蛋白酶處理。將每個克隆(5×106細胞)分別懸浮于0.8ml Hank平衡鹽溶液(HBSS)中，并使用GenePulser(Biorad)，在10μg實施例7(1)中制備的pLN1-EPO載體和10μgCre酶表達載體pBS185(Lifetech)存在下，進行電穿孔。將450V電壓施加于電容為500μF的電容器，通過使用具有以4mm間距放置的電極的電穿孔細胞，讓其放電。將電穿孔細胞接種在5個裝有補充了10％胎牛血清(FBS)的Eagle F12培養(yǎng)液(在下文稱為“F12”，Invitrogen)的48孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中。2天后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入含有800μg/ml G418(GENETICIN，Invitrogen)和8μg/ml殺稻瘟素S鹽酸鹽(Funakoshi)的選擇性培養(yǎng)液。在2-3周內(nèi)形成G418和殺稻瘟素抗性集落。從每種宿主H4和H8細胞中分離出24個集落，使其增殖并進行以下分析。從H4制備的細胞在下文被稱為“H4E細胞”，而從H8制備的細胞在下文被稱為“H8E細胞”。
(2)轉(zhuǎn)移染色體的證實(2-1)PCR分析對于標(biāo)記PRED 65基因和PRED 3基因，進行PCR擴增，其中PRED 65基因和PRED 3基因位于21號人類染色體長臂近側(cè)區(qū)并位于loxP位點附近，而D21S265標(biāo)記位于其遠側(cè)區(qū)(實施例1(3)，圖2)。通過在loxP序列之間進行的位點專一重組而引入的人EPO基因插入序列的產(chǎn)物預(yù)計具有PRED 65基因和PRED 3基因，但沒有D21S265標(biāo)記。結(jié)果，擴增與22個H4E細胞克隆中的21個中預(yù)測的一樣進行。對于這21個克隆，通過PCR擴增位于21號人類染色體短臂近側(cè)區(qū)的STS標(biāo)記(pCHB，D21S187，D21S275)(參見實施例6，(3)，圖12)。因為21號人類染色體的短臂遠側(cè)區(qū)在短臂近側(cè)區(qū)上缺失，預(yù)測pCHB和D21S187標(biāo)記不存在，而D21S275會存在。結(jié)果，證實擴增象15個克隆中所預(yù)計的一樣進行。
(2-2)熒光原位雜交(FISH)分析按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人類特異性探針Cot1(Gibco BRL)進行FISH分析。分析了其中的6個克隆，其中所有標(biāo)記都如同以上(2-1)小節(jié)進行的PCR分析所預(yù)計的一樣進行擴增。結(jié)果，在所觀察的幾乎所有有絲分裂圖像中，都檢測到截短的21號人類染色體。結(jié)果見下表7。根據(jù)上述結(jié)果，并與宿主CHO細胞的染色體大小進行相對比較，證實截短的21號人類染色體轉(zhuǎn)移到CHO細胞中。
表7

根據(jù)上述實驗(2-1)和(2-2)，證實所獲得的G418抗性和殺稻瘟素抗性CHO克隆保留來自21號人類染色體且通過缺失其長臂遠側(cè)區(qū)和短臂遠側(cè)區(qū)并插入loxP序列而制備的HAC載體。
(3)插入在來自21號人類染色體的HAC載體中的EPO基因的表達按照酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，通過定量測定培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的人EPO蛋白，來確定人EPO基因的表達。
(3-1)EPO基因在H4E細胞中的表達對于所分離的24個G418/殺稻瘟素抗性H4E細胞克隆中的10個，將每個克隆(1×105細胞)分別接種到裝有2ml F12培養(yǎng)液的6孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中，所述培養(yǎng)液中補充了10％FBS并含有800μg/ml G418和8μg/ml殺稻瘟素。當(dāng)細胞長滿后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入補充了10％FBS的2ml F12培養(yǎng)液。培養(yǎng)6天，收集上清液。通過人EPO ELISA試劑盒(Quantikine IVD人EPO免疫測定，R&D系統(tǒng))，定量測定培養(yǎng)上清液中人EPO的含量。結(jié)果見下表8。
表8

(3-2)EPO基因在H8E細胞中的表達對于所分離的24個G418/殺稻瘟素抗性H8E細胞克隆中的6個，將每個克隆(1×105細胞)分別接種到裝有2ml F12培養(yǎng)液的6孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中，所述培養(yǎng)液中補充了10％FBS并含有800μg/ml G418和8μg/ml殺稻瘟素。當(dāng)細胞長滿后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入補充了10％FBS的2ml F12培養(yǎng)液。培養(yǎng)6天，收集上清液。通過人EPO ELISA試劑盒(Quantikine IVD人EPO免疫測定，R&D系統(tǒng))，定量測定培養(yǎng)上清液中人EPO的含量。結(jié)果見下表9。
表9

根據(jù)表8和表9的結(jié)果，證實在所有10個H4E細胞克隆和6個H8E細胞克隆中都表達人EPO。
將來自21號人類染色體的HAC載體轉(zhuǎn)移到小鼠A9細胞中(1)微細胞融合和抗藥性克隆的分離用得自實施例17的CHO#21hyg4和CHO#21hyg8(在下文分別稱為“H4細胞”和“H8細胞”)作為染色體供體細胞，“H4細胞”和“H8細胞”都保留來自通過缺失長臂遠側(cè)區(qū)并插入loxP序列后又通過端粒截短并缺失短臂遠側(cè)區(qū)的21號人類染色體的HAC載體。采用小鼠A9細胞作為染色體受體細胞(Oshimura等，Environ.HealthPerspect.9357，1991，保藏號JCRB0211)。首先，從約107H4細胞制備微細胞。更具體地講，將H4細胞或H8細胞在24個25cm2的離心瓶(Nunc)中培養(yǎng)至細胞密度相當(dāng)于約60-70％飽和，然后在含有秋水仙胺(0.1μg/ml，Demecolcine，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的培養(yǎng)液(20％FBS，800μg/ml G418，F(xiàn)12)中再培養(yǎng)5天，以誘導(dǎo)微核。取出培養(yǎng)液后，向每個離心瓶中加入預(yù)熱(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，插入到丙烯酸塑料離心管中，然后離心(34℃，8000rpm)1小時。通過將微細胞懸浮于無血清培養(yǎng)液(DMEM)中，使其恢復(fù)，然后采用裝有孔徑為8μm、5μm和3μm濾器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)進行過濾純化。將純化的微細胞重懸于2ml補充了50μg/ml植物凝集素-P(Difco)的DMEM中。向其中小鼠A9細胞已培養(yǎng)到至多90％飽和的25cm2培養(yǎng)瓶(Falcon)中加入純化的微核細胞。讓細胞混合物在37℃靜置15分鐘，然后細胞融合在如下制備的溶液中進行1分鐘將PEG 1000(終濃度為50％(w/v)，Sigma)和DMSO(終濃度為7％(w/v)，Sigma)溶于DMEM中并經(jīng)孔徑0.22μm的濾器(Saltrius)過濾。當(dāng)細胞在含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時后，細胞經(jīng)胰酶處理而分散，然后接種在2個48孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中。2天后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入含有殺稻瘟素(4μg/ml)或潮霉素(700μg/ml，Invitrogen)的選擇性培養(yǎng)液(10％FBS，DMEM)。選擇性培養(yǎng)約3周后，分離所形成的抗藥性集落并進行以下分析。微細胞融合7次，共得到22個抗藥性集落。以上所獲得的細胞在下文稱為“A9Δ細胞”。
(2)轉(zhuǎn)移染色體的證實(2-1)PCR法分析了以上(1)小節(jié)所得集落中的21個克隆。對于標(biāo)記PRED 65基因和PRED 3基因以及D21S265標(biāo)記，進行PCR擴增；其中PRED65基因和PRED 3基因位于21號人類染色體長臂近側(cè)區(qū)并位于loxP位點附近，而D21S265標(biāo)記位于其遠側(cè)區(qū)(參見實施例1，(3)和圖2)。預(yù)測具有插入序列的HAC載體可具有PRED 65基因和PRED 3基因，但沒有D21S265標(biāo)記。結(jié)果，證實擴增與20個克隆中所預(yù)計的一樣進行。
然后，對STS標(biāo)記(pCHB，D21S187，D21S275)進行PCR擴增，所述標(biāo)記位于21號人類染色體短臂近側(cè)區(qū)(參見實施例6，(3)和圖12)。因為在21號人類染色體短臂近側(cè)區(qū)的位置缺失短臂遠側(cè)區(qū)，預(yù)計pCHB和D21S187標(biāo)記不會存在，但D21S275標(biāo)記會存在。結(jié)果，證實擴增與18個克隆中所預(yù)計的一樣進行。
(2-2)在選擇性藥物存在下的培養(yǎng)根據(jù)來自21號人類染色體的HAC載體上存在的抗藥性基因(即潮霉素抗性基因(在短臂遠側(cè)區(qū))和殺稻瘟素抗性基因(在長臂近側(cè)區(qū))在選擇性藥物存在下是否起作用的結(jié)果，證實是否存在含每種抗藥性基因的區(qū)域。
將表現(xiàn)出與上(2-1)小節(jié)預(yù)計的擴增一樣的9個克隆在6孔組織培養(yǎng)板(Falcon)中培養(yǎng)至細胞密度相當(dāng)于約60-70％飽和，其中每孔裝有含殺稻瘟素(4μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(10％FBS，DMEM)。用PBS(Invitrogen)洗滌2次后，將克隆細胞在僅含潮霉素(700μg/ml)的培養(yǎng)液或者含殺稻瘟素(4μg/ml)和潮霉素(700μg/ml)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)1周。結(jié)果見下表10。
表10

R；抗藥性-；沒有實驗數(shù)據(jù)根據(jù)上述結(jié)果，證實所有克隆都是殺稻瘟素抗性和潮霉素抗性克隆。
(2-3)熒光原位雜交(FISH)分析按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人類特異性探針Cot1(Gibco BRL)進行FISH分析。分析了2個克隆，其中所有標(biāo)記都如同以上(2-1)小節(jié)進行的PCR分析所預(yù)計的一樣進行擴增，并且所述克隆在以上(2-2)小節(jié)中都表現(xiàn)出殺稻瘟素抗性和潮霉素抗性。結(jié)果，在所觀察的幾乎所有有絲分裂圖像中，都檢測到截短的21號人類染色體。結(jié)果見下表11。
表11

根據(jù)上述結(jié)果，并與宿主小鼠A9細胞的染色體大小進行相對比較，證實截短的21號人類染色體轉(zhuǎn)移到小鼠A9細胞中。在下文中，2個細胞克隆分別被稱為“A9Δ11”和“A9Δ12”。
根據(jù)上述實驗(2-1)和(2-3)，證實2個殺稻瘟素抗性和潮霉素抗性克隆保留來自缺失其長臂和短臂的截短的21號人類染色體的HAC載體。
將具有人EPO基因的來自21號人類染色體的HAC載體轉(zhuǎn)移到小鼠A9細胞中(1)微細胞融合和抗藥性克隆的分離用得自實施例10的具有高微核形成能力的CHO細胞克隆(H4EC10、H4E C15或H4E C16細胞)作為染色體供體細胞，該細胞克隆保留來自通過缺失長臂遠側(cè)區(qū)并插入loxP序列后又通過端粒截短并缺失短臂遠側(cè)區(qū)再插入單拷貝人EPO基因的21號人類染色體的HAC載體。用小鼠A9細胞作為染色體受體細胞(Oshimura等，Environ.Health Perspect.9357，1991，保藏號JCRB0211)。首先，從約108H4EC15細胞或H4E C16細胞制備微細胞。將H4E C15細胞或H4E C16細胞在24個25cm2的離心瓶(Nunc)中培養(yǎng)至細胞密度相當(dāng)于約60-70％飽和，然后在含有秋水仙胺(0.1μg/ml，Demecolcine，Wako PureChemical Industries，Ltd.)的培養(yǎng)液(20％FBS，800μg/ml G418，F(xiàn)12)中再培養(yǎng)4天，以誘導(dǎo)微核。取出培養(yǎng)液后，向每個離心瓶中加入預(yù)熱(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，插入到丙烯酸塑料離心管中，然后離心(34℃，8000rpm)1小時。通過將微細胞懸浮于無血清培養(yǎng)液(DMEM)中，使其恢復(fù)，然后采用裝有孔徑為8μm、5μm和3μm濾器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)進行過濾純化。將純化的微細胞重懸于2ml補充了50μg/ml或100μg/ml植物凝集素-P(Difco)的DMEM中。向其中小鼠A9細胞已培養(yǎng)至90％飽和的25cm2培養(yǎng)瓶(Falcon)中加入純化的微核細胞。讓細胞混合物在37℃靜置15分鐘后，細胞融合在如下制備的溶液中進行1分鐘將PEG 1000(終濃度為50％(w/v)，Sigma)和DMSO(終濃度為7％(w/v)，Sigma)溶于DMEM中并經(jīng)孔徑0.22μm的濾器過濾。當(dāng)細胞在含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時后，細胞經(jīng)胰酶處理而分散，然后接種在2個48孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中。2天后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入含有殺稻瘟素(6μg/ml)或G418(600μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(10％FBS，DMEM)。選擇性培養(yǎng)約3周后，分離所形成的抗藥性集落并進行以下分析。微細胞融合12次，共得到39個G418抗性集落。以上所獲得的細胞在下文稱為“AΔE細胞”。
(2)轉(zhuǎn)移染色體的證實(2-1)PCR法分析了以上(1)小節(jié)所得集落中的25個克隆。對于標(biāo)記PRED 65基因和PRED 3基因以及D21S265標(biāo)記，進行PCR擴增；其中PRED65基因和PRED 3基因位于21號人類染色體長臂近側(cè)區(qū)并位于loxP位點附近，而D21S265標(biāo)記位于其遠側(cè)區(qū)(參見實施例1(3)和圖2)。預(yù)測通過在loxP序列之間的位點專一重組而插入的人EPO基因可具有PRED 65基因和PRED 3基因，但沒有D21S265標(biāo)記。結(jié)果，證實擴增如同在24個克隆中預(yù)計的一樣進行。對于STS標(biāo)記(pCHB，D21S187，D21S275)進行PCR擴增，所述標(biāo)記位于21號人類染色體短臂近側(cè)區(qū)(參見實施例6，(3)和圖12)。因為在21號人類染色體短臂近側(cè)區(qū)的位置缺失短臂遠側(cè)區(qū)，預(yù)計pCHB和D21S187標(biāo)記不會存在，但D21S275標(biāo)記會存在。結(jié)果，證實擴增與19個克隆中所預(yù)計的一樣進行。
(2-2)在選擇性藥物存在下的培養(yǎng)根據(jù)來自21號人類染色體的HAC載體上存在的抗藥性基因(即潮霉素抗性基因(在短臂遠側(cè)區(qū))、殺稻瘟素抗性基因(在長臂近側(cè)區(qū))和新霉素抗性基因(在長臂近側(cè)區(qū))在選擇性藥物存在下是否起作用的結(jié)果，證實是否存在含每種抗藥性基因的區(qū)域。
將表現(xiàn)出與上(2-1)小節(jié)預(yù)計的擴增一樣的7個克隆在6孔組織培養(yǎng)板(Falcon)中培養(yǎng)至細胞密度相當(dāng)于約60-70％飽和，其中培養(yǎng)板裝有含G418(600μg/ml)或殺稻瘟素(6μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(10％FBS，DMEM)。用PBS(Invitrogen)洗滌2次后，將細胞克隆在含殺稻瘟素、潮霉素(700μg/ml)和G418的培養(yǎng)液中培養(yǎng)1周或10天。結(jié)果見下表12。
表12

R；抗藥性-；沒有實驗數(shù)據(jù)根據(jù)上述結(jié)果，證實7個克隆都是三藥抗性克隆，即殺稻瘟素抗性、潮霉素抗性和G418抗性。
(2-3)熒光原位雜交(FISH)分析按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人類特異性探針Cot1(Gibco BRL)進行FISH分析。分析了7個克隆，其中所有標(biāo)記都如同以上(2-1)小節(jié)PCR分析所預(yù)計的一樣進行擴增。結(jié)果，在所觀察的幾乎所有有絲分裂圖像中，都檢測到截短的21號人類染色體。結(jié)果見下表13。
表13

根據(jù)上述結(jié)果，并與宿主小鼠A9細胞的染色體大小進行相對比較，證實截短的21號人類染色體轉(zhuǎn)移到小鼠A9細胞中。
根據(jù)上述實驗(2-1)和(2-3)，證實以上所獲得的AΔE細胞保留來自具有人EPO基因插入序列并缺失其長臂和短臂的截短的21號人類染色體的HAC載體。
(3)具有人EPO基因插入序列的重組體的證實篩選具有插入序列的重組體，也就是說，采用根據(jù)來自人EPO基因供體載體的序列而設(shè)計的引物和根據(jù)HAC載體而設(shè)計的引物(使之鄰接loxP序列位點)，通過PCR擴增來證實插入序列是否引入到來自21號人類染色體的HAC載體的loxP序列位點中。
對于AΔE細胞的12個克隆，通過使用Neo Rp2引物(SEQ ID No.38)(如實施例9(4)所述)和來自質(zhì)粒載體pBS226的M13RV引物(SEQID No.39)，進行PCR。在具有插入序列的重組體的情況下，預(yù)計擴增約2.3kb的片段，該片段包括從具有CMV啟動子、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加序列的部分到loxP序列的區(qū)域，以及來自pSF1的loxP序列到neo基因部分的區(qū)域。結(jié)果，擴增與在所有12個克隆中預(yù)測的一樣進行。
根據(jù)上述結(jié)果，證實所有AΔE細胞克隆都保留來自21號人類染色體的HAC載體，其中插入了一個含有CMV啟動子、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加序列的DNA插入片段的拷貝。
(4)插入在來自21號人類染色體的HAC載體中的EPO基因的表達按照酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，通過定量測定培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的人EPO蛋白，來確定人EPO基因的表達。
對于所分離的4個AΔE克隆，將每個克隆(1×105細胞)分別接種到裝有2ml DMEM培養(yǎng)液的6孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中，所述培養(yǎng)液中補充了10％FBS并含有600μg/ml G418和6μg/ml殺稻瘟素。當(dāng)細胞長滿后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入補充了10％FBS的2ml F12培養(yǎng)液。培養(yǎng)4天或5天后，收集上清液。通過人EPO ELISA試劑盒(Quantikine IVD人EPO免疫測定，R&D系統(tǒng))，不用稀釋即可定量測定培養(yǎng)上清液中人EPO的含量。結(jié)果見下表14。
表14

AΔE51、AΔE4和AΔE18的培養(yǎng)上清液中人EPO濃度均高于人EPO ELISA試劑盒(Quantikine IVD人EPO免疫測定，R&D系統(tǒng))的檢出限。
根據(jù)上述結(jié)果，證實AΔE細胞產(chǎn)生人EPO蛋白。
將14號人類染色體的片段(SC20)轉(zhuǎn)移到正常人類成纖維細胞中(1)將SC20轉(zhuǎn)移到正常人類成纖維細胞(HFL-1)中(1-1)微細胞融合(平板法)和抗藥性克隆的分離用含有14號人類染色體片段(SC20)的小鼠A9細胞(C11-SC20細胞，Tomizuka等，Nature Genet.(USA)，第16卷，第133-143頁，1997)作為染色體供體細胞。用正常人類成纖維細胞HFL-1(得自RIKEN的細胞材料開發(fā)實驗室，保藏號RCB0521)作為染色體受體細胞。首先，從約107細胞制備微細胞。具體地講，將C11-SC20細胞在12個25cm2的離心瓶(Nunc)中培養(yǎng)至細胞密度相當(dāng)于約80-90％飽和，然后在含有秋水仙胺(0.05μg/ml，Demecolcine，Wako PureChemical Industries，Ltd.)的培養(yǎng)液(20％FBS，800μg/ml G418，DMEM)中再培養(yǎng)48小時，以誘導(dǎo)微核。取出培養(yǎng)液后，向每個離心瓶中加入預(yù)熱(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，插入到丙烯酸塑料離心管中，然后離心(34℃，8000rpm)1小時。通過將微細胞懸浮于無血清培養(yǎng)液(DMEM)中，使其恢復(fù)，然后采用裝有孔徑為8μm、5μm和3μm濾器(Whatman)的WEINNEX-25(Millipore)進行過濾純化。將純化的微細胞重懸于2ml補充了50μg/ml植物凝集素-P(Difco)的DMEM中。向其中HFL-1細胞已培養(yǎng)至90％飽和的25cm2培養(yǎng)瓶(Falcon)中加入純化的微核細胞。讓細胞混合物在37℃靜置15分鐘后，細胞融合在如下制備的溶液中進行1分鐘將PEG1500(終濃度為45％(w/v)，Roche Diagnostics)和DMSO(終濃度為10％(w/v)，Sigma)溶于DMEM中并經(jīng)孔徑0.22μm的濾器過濾除菌。當(dāng)細胞在含15％FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時后，細胞經(jīng)胰酶處理而分散，然后接種在1個膠原蛋白I包被的48孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中。2天后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入含有G418(300μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(15％FBS，DMEM)。選擇性培養(yǎng)約3周后，分離所形成的抗藥性集落并進行以下分析。微細胞融合3次，共得到21個G418抗性集落。
(1-2)微細胞融合(懸浮法)和抗藥性克隆的分離按照與以上(1-1)小節(jié)類似的方式，制備和純化微細胞，并重懸于6ml DMEM中。將HFL-1在175cm2的培養(yǎng)瓶(Nunc)中培養(yǎng)至細胞密度到至多90％飽和。細胞經(jīng)胰酶處理而分散后，用DMEM洗滌2次，然后懸浮于7ml DMEM中。將HFL-1細胞懸液覆蓋在所獲得的微細胞懸液上并進行離心。棄去上清液后，通過吹打使沉淀懸浮。向所得懸浮液中加入0.5ml PEG 1500(終濃度為50％(w/v)，RocheDiagnostics)，進行細胞融合達120秒。向所得溶液中按1ml/分鐘的速率加入5m1 DMEM，然后再加入5ml DEME。讓溶液在37℃靜置10分鐘后，進行離心，重懸于含有15％FBS的DMEM培養(yǎng)液中，并接種到2個膠原蛋白I包被的48孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中。2天后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入含有G418(300μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(15％FBS，F(xiàn)12)。選擇性培養(yǎng)約3周后，分離所形成的抗藥性集落并進行以下分析。微細胞融合1次，得到2個G418抗性集落。
(1-3)轉(zhuǎn)移染色體的證實(1-3-1)PCR法通過SC20上存在的neo基因的PCR擴增，證實轉(zhuǎn)移的染色體。此時所用的引物寡核苷酸序列如下所示421F5′-TTT GCA TGT CTT TAG TTC TAT GAT GA-3′(SEQ ID No.40)；778R5′-AGG TCG GTC TTG ACA AAA AGA AC-3′(SEQ ID No.41).
根據(jù)質(zhì)粒載體pSTneoB的核苷酸序列，制備這些引物(Kato等，Cell Struct Funct，12575-580，1987)。
對于以上(1-1)小節(jié)和(1-2)小節(jié)所得G418抗性細胞的12個克隆，通過使用421F引物(SEQ ID No.40)和778R引物(SEQ ID No.41)進行PCR擴增。預(yù)計保留具有插入序列的HAC載體的克隆可具有neo基因。結(jié)果，證實擴增如同在所有克隆中預(yù)計的一樣進行。
(1-3-2)染色體分析按照Kuroki等(Cell engineering handbook，Yodosha，1992)描述的方法，通過吉姆薩染色，進行染色體分析。分析了G418抗性HFL-1細胞中的2個克隆的約20幅中期染色體圖像。在G418抗性克隆中，觀察到在親代細胞系HFL-1中未觀察到的、比內(nèi)源14號染色體小的微型染色體。
根據(jù)上述實驗(1-3-1)和(1-3-2)，證實所得G418抗性HFL-1克隆保留SC20。
(2)將SC20轉(zhuǎn)移到正常人類成纖維細胞HUC-F2中(2-1)微細胞融合(平板法)和抗藥性克隆的分離用含有14號人類染色體片段(SC20)的小鼠A9細胞(C11-SC20細胞，Tomizuka等，Nature Genet.(USA)，第16卷，第133-143頁，1997)作為染色體供體細胞。用正常人類成纖維細胞HUC-F2(得自RIKEN的細胞材料開發(fā)實驗室，保藏號RCB0436)作為染色體受體細胞。首先，從約107細胞制備微細胞。更具體地講，將C11-SC20細胞在12個25cm2的離心瓶(Nunc)中培養(yǎng)至細胞密度相當(dāng)于約80-90％飽和，然后在含有秋水仙胺(0.05μg/ml，Demecolcine，Wako PureChemical Industries，Ltd.)的培養(yǎng)液(20％FBS，800μg/ml G418，DMEM)中再培養(yǎng)48小時，以誘導(dǎo)微核。取出培養(yǎng)液后，向每個離心瓶中加入預(yù)熱(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，插入到丙烯酸塑料離心管中，然后離心(34℃，8000rpm)1小時。通過將微細胞懸浮于無血清培養(yǎng)液(DMEM)中，使其恢復(fù)，然后采用裝有孔徑為8μm、5μm和3μm濾器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)進行過濾純化。將純化的微細胞重懸于2ml補充了50μg/ml植物凝集素-P(Difco)的DMEM中。向其中HUC-F2細胞已培養(yǎng)至90％飽和的25cm2培養(yǎng)瓶(Falcon)中加入純化的微核細胞。讓細胞混合物在37℃靜置15分鐘后，細胞融合在如下制備的溶液中進行1分鐘將PEG1500(終濃度為45％(w/v)，Roche Diagnostics)或PEG 1000(終濃度為45％(w/v)，Sigma)和DMSO(終濃度為10％(w/v)，Sigma)溶于DMEM中并經(jīng)孔徑0.22μm的濾器過濾除菌。當(dāng)細胞在含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時后，細胞經(jīng)胰酶處理而分散，然后接種在1個膠原蛋白I包被的48孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中。2天后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入含有G418(400μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(15％FBS，DMEM)。選擇性培養(yǎng)約3周后，分離所形成的抗藥性集落并進行以下分析。微細胞融合4次，共得到8個G418抗性集落。
(2-2)微細胞融合(懸浮法)和抗藥性克隆的分離按照與以上(1-1)小節(jié)類似的方式，制備和純化微細胞，并重懸于6ml DMEM中。將HUC-F2細胞在175cm2的培養(yǎng)瓶(Nunc)中培養(yǎng)至細胞密度相當(dāng)于90％飽和。細胞經(jīng)胰酶處理而分散后，用DMEM洗滌2次，然后懸浮于7ml DMEM中。將HUC-F2細胞懸液覆蓋在所獲得的微細胞懸液上并進行離心。棄去上清液后，通過吹打使沉淀懸浮。向所得懸浮液中加入0.5ml PEG 1500(終濃度為50％(w/v)，Roche Diagnostics)，進行細胞融合達120秒。向所得溶液中按1ml/分鐘的速率加入5ml DMEM，然后再加入5ml DEME。讓溶液在37℃靜置10分鐘后，進行離心。沉淀重懸于含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)液中，并接種到2個膠原蛋白I包被的48孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中。2天后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入含有G418(400μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(10％FBS，DMEM)。選擇性培養(yǎng)約3周后，分離所形成的抗藥性集落并進行以下分析。微細胞融合1次，得到6個G418抗性集落。
(2-3)轉(zhuǎn)移染色體的證實通過SC20上存在的neo基因的PCR擴增，證實轉(zhuǎn)移的染色體。對于(2-1)和(2-2)小節(jié)所獲得的G418抗性細胞的7個克隆，通過使用421F引物(SEQ ID No.40)和778R引物(SEQ ID No.41)進行PCR擴增。預(yù)計HAC載體中的插入序列可具有neo基因。結(jié)果，證實擴增如同在所有克隆中預(yù)計的一樣進行。根據(jù)上述結(jié)果，證實所獲得的G418HUC-F2克隆保留SC20。
(3)將SC20轉(zhuǎn)移到正常人類成纖維細胞HF-19中微細胞融合和抗藥性克隆的分離用含有14號人類染色體片段(SC20)的小鼠A9細胞(C11-SC20細胞，Tomizuka等，Nature Genet.(USA)，第16卷，第133-143頁，1997)作為染色體供體細胞。用正常人類成纖維細胞HF-19(得自RIKEN的細胞材料開發(fā)實驗室，保藏號RCB0210)作為染色體受體細胞。首先，從約107細胞制備微細胞。將C11-SC20細胞在12個25cm2的離心瓶(Nunc)中培養(yǎng)至細胞密度相當(dāng)于約80-90％飽和，然后在含有秋水仙胺(0.05μg/ml，Demecolcine，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的培養(yǎng)液(20％FBS，800μg/ml G418，DMEM)中再培養(yǎng)48小時，以誘導(dǎo)微核。取出培養(yǎng)液后，向每個離心瓶中加入預(yù)熱(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，插入到丙烯酸塑料離心管中，然后離心(34℃，8000rpm)1小時。通過將微細胞懸浮于無血清培養(yǎng)液(DMEM)中，使其恢復(fù)，然后采用裝有孔徑為8μm、5μm和3μm濾器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)進行過濾純化。將純化的微細胞重懸于2ml補充了50μg/ml植物凝集素-P(Difco)的DMEM中。向其中HF-19細胞已培養(yǎng)至90％飽和的25cm2培養(yǎng)瓶(Falcon)中加入純化的微核細胞。讓細胞混合物在37℃靜置15分鐘后，細胞融合在如下制備的溶液中進行1分鐘將PEG 1500(終濃度為45％(w/v)，Roche Diagnostics)和DMSO(終濃度為10％(w/v)，Sigma)溶于DMEM中并經(jīng)孔徑0.22μm的濾器過濾除菌。當(dāng)細胞在含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時后，細胞經(jīng)胰酶處理而分散，然后接種在1個膠原蛋白I包被的48孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中。2天后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入含有G418(400μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(10％FBS，DMEM)。選擇性培養(yǎng)約3周后，分離所形成的抗藥性集落并進行以下分析。微細胞融合1次，得到1個G418抗性集落。
將來自21號人類染色體的HAC載體轉(zhuǎn)移到正常人類成纖維細胞中(1)微細胞融合和抗藥性克隆的分離(1-1)通過使用保留來自21號人類染色體的HAC載體的CHO細胞作為染色體供體細胞來進行微細胞融合將得自實施例10的CHO細胞中能高頻形成微核的克隆(H4E C10細胞)作為染色體供體細胞，所述克隆保留來自21號人類染色體的并含有單拷貝人EPO基因的HAC載體，所述載體制備如下缺失長臂遠側(cè)區(qū)并插入loxP序列、隨后又通過端粒截短而缺失短臂遠側(cè)區(qū)、并通過瞬時表達Cre重組酶在loxP序列之間進行位點專一重組反應(yīng)而引入人EPO基因。用正常人類成纖維細胞HFL-1(得自RIKEN的細胞材料開發(fā)實驗室，保藏號RCB0521)作為染色體受體細胞。首先，從約108H4E C10細胞制備微細胞。更具體地講，將H4E C10細胞在48個25cm2的離心瓶(Nunc)中培養(yǎng)至細胞密度相當(dāng)于約60-70％飽和，然后在含有秋水仙胺(0.1μg/ml，Demecolcine，Wako Pure Chemica1Industries，Ltd.)的培養(yǎng)液(20％FBS，800μg/ml G418，F(xiàn)12)中再培養(yǎng)4天，以誘導(dǎo)微核。取出培養(yǎng)液后，向每個離心瓶中加入預(yù)熱(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，插入到丙烯酸塑料離心管中，然后離心(34℃，8000rpm)1小時。通過將微細胞懸浮于無血清培養(yǎng)液(DMEM)中，使其恢復(fù)，然后采用裝有孔徑為8μm、5μm和3μm濾器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)進行過濾純化。將純化的微細胞重懸于2ml補充了50μg/ml植物凝集素-P(Difco)的DMEM中。向其中HFL-1細胞已培養(yǎng)至90％飽和的25cm2培養(yǎng)瓶(Falcon)中加入純化的微核細胞。讓細胞混合物在37℃靜置15分鐘后，細胞融合在如下制備的溶液中進行1分鐘將PEG 1500(終濃度為45％(w/v)，Roche Diagnostics)和DMSO(終濃度為10％(w/v)，Sigma)溶于DMEM中并經(jīng)孔徑0.22μm的濾器過濾除菌。當(dāng)細胞在含20％FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時后，細胞經(jīng)胰酶處理而分散，然后接種在1個膠原蛋白I包被的48孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中。2天后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入含有G418(300μg/ml)或殺稻瘟素(6μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(20％FBS，DMEM)。選擇性培養(yǎng)約3周后，分離所形成的抗藥性集落并進行以下分析。微細胞融合5次，共得到3個抗藥性集落。所述細胞被稱為“HCΔE細胞”。
(1-2)通過使用保留來自21號人類染色體的HAC載體的小鼠A9細胞作為染色體供體細胞來進行微細胞融合將得自實施例12的小鼠A9細胞中能高頻形成微核的克隆(AΔ51或AΔE5細胞)作為染色體供體細胞，所述小鼠A9細胞保留來自21號人類染色體的并含有單拷貝人EPO基因的HAC載體，所述載體制備如下缺失長臂遠側(cè)區(qū)并插入loxP序列、隨后又通過端粒截短而缺失短臂遠側(cè)區(qū)、并通過瞬時表達Cre重組酶在loxP序列之間進行位點專一重組反應(yīng)而引入人EPO基因。用正常人類成纖維細胞HFL-1(得自RIKEN的細胞材料開發(fā)實驗室，保藏號RCB0521)作為染色體受體細胞。首先，從約107細胞制備微細胞。更具體地講，將AΔ51或AΔE5細胞在12個25cm2的離心瓶(Nunc)中培養(yǎng)至細胞密度相當(dāng)于約80-90％飽和，然后在含有秋水仙胺(0.1μg/ml，Demecolcine，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的培養(yǎng)液(20％FBS，600μg/mlG418，DMEM)中再培養(yǎng)72小時，以誘導(dǎo)微核。取出培養(yǎng)液后，向每個離心瓶中加入預(yù)熱(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，插入到丙烯酸塑料離心管中，然后離心(34℃，8000rpm)1小時。通過將微細胞懸浮于無血清培養(yǎng)液(DMEM)中，使其恢復(fù)，然后采用裝有孔徑為8μm、5μm和3μm濾器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)進行過濾純化。將純化的微細胞重懸于2ml補充了50μg/ml植物凝集素-P(Difco)的DMEM中。向其中HFL-1細胞已培養(yǎng)至90％飽和的25cm2培養(yǎng)瓶(Falcon)中加入純化的微核細胞。讓細胞混合物在37℃靜置15分鐘后，細胞融合在如下制備的溶液中進行1分鐘將PEG 1500(終濃度為45％(w/v)，Roche Diagnostics)和DMSO(終濃度為10％(w/v)，Sigma)溶于DMEM中并經(jīng)孔徑0.22μm的濾器過濾除菌。當(dāng)細胞在含20％FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時后，細胞經(jīng)胰酶處理而分散，然后接種在1個膠原蛋白I包被的48孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中。2天后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入含有G418(300μg/ml)或殺稻瘟素(6μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(20％FBS，DMEM)。選擇性培養(yǎng)約3周后，分離所形成的抗藥性集落并進行以下分析。微細胞融合10次，共得到27個抗藥性集落。所述細胞被稱為“HΔE細胞”。
(2)轉(zhuǎn)移染色體的證實通過對于來自21號人類染色體的HAC載體上是否存在neo基因的PCR擴增，來證實轉(zhuǎn)移的染色體。PCR擴增所使用的引物寡核苷酸序列如下所示1291F5′-CTA CCC GTG ATA TTG CTG AAG AG-3′(SEQ ID No.42)；1667R5′-ATT TGC ACT GCC GGT AGA ACT-3′(SEQ ID No.43).
根據(jù)質(zhì)粒載體pSTneoB的核苷酸序列，制備這些引物(Kato等，Cell Struct Funct，12575-580，1987)。
使用1291F引物(SEQ ID No.42)和1667R引物(SEQ ID No.43)，進行PCR擴增。在來自21號人類染色體的HAC載體存在的情況下，預(yù)計擴增含有neo基因部分的0.4kb片段。結(jié)果，證實擴增如同在所有5個HΔE克隆中預(yù)計的一樣進行。
根據(jù)上述結(jié)果，證實HΔE細胞保留了來自21號人類染色體的HAC載體。
(3)插入在來自21號人類染色體的HAC載體中的EPO基因的表達按照酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，通過定量測定培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的人EPO蛋白，確定人EPO基因的表達。
對于分離的3個殺稻瘟素抗性HCΔE細胞克隆和8個G418或殺稻瘟素抗性HCΔE細胞克隆，將細胞接種到裝有0.5ml DMEM培養(yǎng)液的48孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中，所述培養(yǎng)液中補充了20％FBS并含有300μg/ml G418或6μg/ml殺稻瘟素。當(dāng)細胞培養(yǎng)2天、3天或4天后，收集上清液。通過人EPO ELISA試劑盒(Quantikine IVD人EPO免疫測定，R&D系統(tǒng))，無需稀釋即可定量測定培養(yǎng)上清液中人EPO的含量。結(jié)果見下表15。
表15

在HΔE51-1、HΔE5-1、HΔE5-2、HΔE5-3和HΔE5-4克隆中，培養(yǎng)上清液中的人EPO濃度高于人EPO ELISA試劑盒(QuantikineIVD人EPO免疫測定，R&D系統(tǒng))的檢出限。
根據(jù)上述結(jié)果，證實HCΔE細胞克隆和HΔE細胞克隆中都產(chǎn)生人EPO蛋白。
構(gòu)建用于將EPO基因和人類端粒酶(hTERT)基因插入來自21號人類染色體的HAC載體中的載體(1)構(gòu)建含有l(wèi)oxP序列的hTERT表達質(zhì)粒pLN1-hTERT人類端粒酶(hTERT)基因編碼區(qū)為3399bp并且在其5’區(qū)含有富含G/C的序列。由于這個原因，預(yù)計難以通過設(shè)計在編碼區(qū)兩端的引物來擴增完整基因。因此，編碼區(qū)分為3個區(qū)1-800bp(在下文稱為“5′hTERT”)、679-1993bp(在下文稱為“M-XhTRET”)和1952-3339bp(在下文稱為“3′hTERT”)。請注意，在核苷酸中的位置用起始密碼子“ATG)的首字母“A”來表示。當(dāng)通過PCR擴增各個區(qū)并克隆后，將這些區(qū)彼此連接。以此方式，進行hTERT基因的克隆。該方法將在下文進行詳細描述。
(1-1)5′hTERT的克隆用于構(gòu)建質(zhì)粒載體的引物寡核苷酸序列如下所示hTERT Fw65′-CTG CTG CGC ACG TGG GAA G-3′(SEQ ID No.44)hTERT Rv65′-GGT CTG GCA GGT GAC ACC AC-3′(SEQ ID No.45)hTERT Fw15′-GAA GAT CTT CAT CGA TCG GCC ACC ATG CCG CGC GC-3′(SEQ ID No.46)hTERT Rv75′-TCA CTC GGT CCA CGC GTC CT-3′(SEQ ID No.47)這些引物是根據(jù)得自GenBank的核苷酸序列(登記號NM003219)而制備。
用1ng HL-60 cDNA(Marathon-Ready cDNA，CLONTECH)作為模板，在50μl含有終濃度分別為0.4μM的hTERT Fw6(SEQ ID No.44)和hTERT Rv6(SEQ ID No.45)的反應(yīng)液中，使用2.5單位LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，進行PCR擴增。使用GeneAmp9600(AppliedBiosystems)作為熱循環(huán)儀。PCR擴增如下進行首先置于98℃10分鐘，然后重復(fù)以下循環(huán)98℃變性30秒，72℃退火/延伸5分鐘，共3次；98℃變性30秒，70℃退火/延伸5分鐘，共2次；98℃變性30秒，68℃退火/延伸5分鐘，共35次。此外，用2μl所得PCR產(chǎn)物作為模板，使用終濃度分別為0.4μM的hTERT Fw1(SEQ ID No.46)和hTERT Rv7(SEQ ID No.47)，使用2.5單位LA Taq(Takara ShuzoCo.，Ltd.)，在50μl反應(yīng)液中，進行PCR擴增。PCR擴增如下進行首先置于98℃10分鐘，然后重復(fù)以下循環(huán)98℃變性30秒，72℃退火/延伸5分鐘，共3次；98℃變性30秒，70℃退火/延伸5分鐘，共2次；98℃變性30秒，68℃退火/延伸5分鐘，共35次。結(jié)果得到約0.8kb的DNA片段。
約0.8kb的DNA片段通過QIAQUICK PCR純化試劑盒(QIAGEN)進行純化，其兩端用KOD DNA聚合酶(Toyobo)消化，得到平端，然后用Bgl II(Takara Shuzo Co.，Ltd.)進一步消化，得到5’粘端。結(jié)果，得到用于5′hTERT插入序列的DNA片段。當(dāng)質(zhì)粒載體pLN1-EPO用Xho I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化后，其兩端用KOD DNA聚合酶(Toyobo)消化，得到平端。所得片段再用BamH I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)進一步消化后，去除人EPO基因。對于所得BamH I平端位點，克隆用于5′hTERT插入序列的DNA片段。用大腸桿菌XL-10 Gold(Stratagene)作為宿主。用DNA測序儀(PRISM3700，Applied Biosystems)分析如此克隆的用于5′hTERT插入序列的DNA片段的核苷酸序列，證實與得自GenBank的核苷酸序列相應(yīng)部分相同。由上所述，所得質(zhì)粒載體被命名為pLN1-5′hTERT。
(1-1)M-XhTERT的克隆用于構(gòu)建質(zhì)粒載體的引物寡核苷酸序列如下所示
hTERT Fw8-25′-AGT GCC AGC CGA AGT CTG CC-3′(SEQ ID No.48)hTERT 5′XhoIRv35′-GCA GCT GAA CAG TGC CTT C-3′(SEQ ID No.49)hTERT Fw8-15′-AGG ACG CGT GGA CCG AGT GA-3′(SEQ ID No.50)這些引物是根據(jù)得自GenBank的核苷酸序列(登記號NM003219)而制備。
用0.25ng HL-60cDNA(Marathon-Ready cDNA，CLONTECH)作為模板，在25μl含有終濃度分別為0.4μM的hTERT Fw8-2(SEQ IDNo.48)和hTERT 5′XhoIRv3(SEQ ID No.49)的反應(yīng)液中，使用2.5單位LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，進行PCR擴增。PCR擴增如下進行首先置于98℃5分鐘，然后重復(fù)以下循環(huán)98℃15秒，55℃30秒，72℃90秒，共40次。此外，用1μl所得PCR產(chǎn)物作為模板，在25μl含有終濃度分別為0.4μM的hTERT Fw8-1(SEQ ID No.50)和hTERT 5′XhoIRv3(SEQ ID No.49)的反應(yīng)液中，使用2.5單位LATaq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，進行PCR擴增。使用GeneAmp9700(Applied Biosystems)作為熱循環(huán)儀。PCR擴增如下進行首先置于98℃5分鐘，然后重復(fù)以下循環(huán)98℃變性15秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，共40次。結(jié)果得到約1.2kb的DNA片段。
約1.2kb的DNA片段通過QIAQUICK PCR純化試劑盒(QIAGEN)進行純化，其兩端用Mlu I和Xho I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到粘端，然后克隆到質(zhì)粒載體pLN1-EPO2的Mlu I-Xho I位點。用大腸桿菌XL-10 Gold(STRATAGENE)作為宿主。用DNA測序儀(PRISM3700，Applied Biosystems)分析如此克隆的用于M-XhTERT插入序列的DNA片段的核苷酸序列，證實與得自GenBank的核苷酸序列相應(yīng)部分相同。由上所述，所得質(zhì)粒載體被命名為pLN1-M-XhTERT。
(1-3)3′hTERT的克隆用于構(gòu)建質(zhì)粒載體的引物寡核苷酸序列如下所示
AP15’-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3’(SEQID No.51)該引物是用于與Marathon-Ready cDNA(CLONTECH)連接的一個引物。
hTERT 3′XhoIFw5′-CCG AGC GTC TCA CCT CGA GGG TGA AGG CAC TGTTC-3′(SEQ ID No.52)hTERT 3’XhoIFw25′-ATG GAC TAC GTC GTG GGA GCC AGA-3′(SEQ ID No.53)hTERT Rv15′-GTC GAC GCT AGC TCA GTC CAG GAT GGT CTT GAA GT-3′(SEQ ID No.54)這些引物是根據(jù)得自GenBank的核苷酸序列(登記號NM003219)而制備。
用0.1ng HL-60cDNA(Marathon-Ready cDNA，CLONTECH)作為模板，在25μl含有終濃度分別為0.3μM的hTERT 3′XhoIFw2(SEQID No.53)和AP1(SEQ ID No.51)的反應(yīng)液中，使用0.5單位KOD-Plus-(Toyobo)，進行PCR擴增。使用GeneAmp9700(Applied Biosystems)作為熱循環(huán)儀。PCR擴增如下進行首先置于94℃2分鐘，然后重復(fù)以下循環(huán)94℃變性15秒，60℃退火30秒，68℃延伸3分鐘，共30次。此外，用1μl所得PCR產(chǎn)物作為模板，使用終濃度分別為0.3μM的hTERT 3′XhoIFw(SEQ ID No.52)和hTERT Rv1(SEQ IDNo.54)，使用0.5單位KOD-Plus-(Toyobo)，在25μl反應(yīng)液中進行PCR擴增。PCR擴增如下進行首先置于98℃5分鐘，然后重復(fù)以下循環(huán)98℃變性15秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，共40次。結(jié)果得到約1.4kb的DNA片段。
約1.2kb的DNA片段通過QIAQUICK PCR純化試劑盒(QIAGEN)進行純化，其兩端用Xho I和Sal I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到粘端，然后克隆到質(zhì)粒載體pLN1-EPO的Xho I位點。用大腸桿菌XL-10 Gold(STRATAGENE)作為宿主。用DNA測序儀(PRISM3700，Applied Biosystems)分析如此克隆的3′-hTERT插入序列的DNA片段的核苷酸序列，證實與得自GenBank的核苷酸序列相應(yīng)部分相同，并且證實其插入方向與pLN1-EPO上的CMV啟動子轉(zhuǎn)錄方向相反。所得質(zhì)粒載體被命名為pLN1-3′hTERT。
(1-4)5′hTERT、M-XhTRET和3′hTERT的連接用以上(1-3)小節(jié)得到的質(zhì)粒載體pLN1-3′hTERT作為模板，在50μl含有終濃度分別為0.3μM的hTERT 3′XhoIFw(SEQ ID No.52)和hTERT Rv1(SEQ ID No.54)的反應(yīng)液中，使用0.5單位KOD-Plus-(Toyobo)，進行PCR擴增。使用GeneAmp9700(Applied Biosystems)作為熱循環(huán)儀。PCR擴增如下進行首先置于94℃2分鐘，然后重復(fù)以下循環(huán)94℃變性15秒，60℃退火30秒，68℃延伸2分鐘，共30次。結(jié)果得到約1.4kb的DNA片段。
約1.4kb的DNA片段通過QIAQUICK PCR純化試劑盒(QLAGEN)進行純化，然后用DNA測序儀(PRISM3700，ABI)測序，證實與得自GenBank的核苷酸序列相應(yīng)部分相同。然后，將約1.4kb的DNA片段用Xho I和Sal I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到粘端。得自以上(1-2)小節(jié)的質(zhì)粒載體pLN1-XhTERT與經(jīng)Mlu I和Xho I消化所獲得的M-XhTERT區(qū)一起克隆到質(zhì)粒載體pLN1-EPO2的Mlu I-Xho I位點區(qū)(該區(qū)所含的人EPO基因已去除)。用大腸桿菌XL-10 Gold(STRATAGENE)作為宿主。
用DNA測序儀(PRISM3700，Applied Biosystems)分析如此克隆的DNA插入片段的核苷酸序列。結(jié)果，證實該DNA插入片段具有點突變和3′-hTERT區(qū)，所述點突變在M-XhTERT區(qū)內(nèi)因核苷酸取代而引起，而3′-hTERT區(qū)與得自GenBank的核苷酸序列相應(yīng)部分相同，并且證實該DNA插入片段的方向與pLN1-EPO上的CMV啟動子的轉(zhuǎn)錄方向相反。以上所獲得的質(zhì)粒載體用EcoR I和Xho I消化，去除M-XhTERT區(qū)。將CMV啟動子、pLN1-5′hTERT區(qū)以及M-XhTERT區(qū)一起克隆到缺乏M-XhTERT區(qū)的區(qū)域；其中CMV啟動子是由得自(1-1)小節(jié)的pLN1-5′hTERT經(jīng)EcoR I和Mul I消化(使之具有粘端)而制備，而M-XhTERT區(qū)是由pLN1-M-XhTERT經(jīng)Mul I和Xho I消化(使之具有粘端)而制備。用大腸桿菌XL-10 Gold(STRATAGENE)作為宿主。如此獲得的質(zhì)粒載體被命名為pLN1-hTERT。
(2)構(gòu)建表達人EPO和hTERT并含有l(wèi)oxP序列的質(zhì)粒pLN1-EPO-hTERT將一段DNA片段、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加單元一起克隆到實施例11制備的質(zhì)粒載體pLN1-hTERT的EcoR I位點；其中所述DNA片段含有CMV啟動子，該CMV啟動子是由實施例9中制備的質(zhì)粒載體pLN1-EPO2經(jīng)EcoR I消化而制備。該質(zhì)粒被命名為pLN1-EPO-hTERT。
(3)構(gòu)建表達2拷貝人EPO和hTERT并含有l(wèi)oxP序列的質(zhì)粒pLN1-EPO2-hTERT將一段DNA片段、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加單元一起克隆到以上(1)小節(jié)制備的質(zhì)粒載體pLN1-hTERT的EcoR I位點；其中所述DNA片段含有2拷貝的CMV啟動子序列，該CMV啟動子是由實施例9(1)中制備的質(zhì)粒載體pLN1-EPO2經(jīng)EcoR I消化而制備。該質(zhì)粒被命名為pLN1-EPO2-hTERT。
(4)構(gòu)建表達4拷貝人EPO和hTERT并含有l(wèi)oxP序列的質(zhì)粒pLN1-EPO4-hTERT將一段DNA片段、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加單元一起克隆到以上(1)小節(jié)制備的質(zhì)粒載體pLN1-hTERT的EcoR I位點；其中所述DNA片段含有4拷貝的CMV啟動子序列，該CMV啟動子是由實施例9(2)中制備的質(zhì)粒載體pLN1-EPO4經(jīng)EcoR I消化而制備；使得其中4拷貝按照轉(zhuǎn)錄方向相繼排列。該質(zhì)粒被命名為pLN1-EPO4-hTERT。
將EPO基因和hTERT基因插入到來自21號人類染色體的HAC載體中按照與實施例7中描述的用于人EPO基因的相同的方式，將人EPO基因和hTERT基因插入到來自21號人類染色體的HAC載體中。如實施例1-4和實施例6所述，通過端粒截短而缺失長臂遠側(cè)區(qū)、并在其長臂近側(cè)區(qū)引入loxP位點、以及通過端粒截短而缺失短臂遠側(cè)區(qū)，制備來自21號人類染色體的HAC載體。另一方面，制備含有l(wèi)oxP序列的人EPO和hTERT表達質(zhì)粒。通過采用由瞬時表達Cre重組酶在loxP序列之間進行的位點專一重組反應(yīng)，將EPO和hTERT表達質(zhì)粒引入到人工染色體中。根據(jù)G418抗性獲得與否(因破壞啟動子而重建neo基因表達單元)，來篩選具有插入序列的重組體。
(1)轉(zhuǎn)染和G418抗性克隆的分離將得自實施例11的保留來自21號人類染色體的HAC載體的小鼠A9細胞(A9Δ12細胞)在1個裝有含殺稻瘟素(4μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(10％FBS，DMEM)的6孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中培養(yǎng)至細胞密度相當(dāng)于約60-70％飽和。在實施例15(2)所制備的pLN1-EPO-hTERT載體以及Cre酶表達載體pBS185(Lifetech)的存在下，按照所附的方案使用Fugene 6(Roche Diagnostics)，進行轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)48小時后，所得細胞用胰蛋白酶處理而分散。將6孔的細胞都懸浮于含G418(600μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(補充了10％FBS的DMEM)中，并接種在5個48孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中。在2-3周內(nèi)形成抗性集落。集落形成頻率是每5×106個A9Δ12細胞為4個集落。分離所得集落并進行進一步培養(yǎng)。結(jié)果使單集落增殖。以上獲得的細胞在下文稱為A9ΔET1細胞。
(2)轉(zhuǎn)移染色體的證實(2-1)PCR法分析了A9ΔET1細胞。對于標(biāo)記PRED 65基因和PRED 3基因，進行PCR擴增；其中PRED 65基因和PRED 3基因位于21號人類染色體長臂近側(cè)區(qū)并位于loxP位點附近(參見實施例1，(3)和圖2)。預(yù)測因在loxP序列之間位點專一重組而引入的人EPO基因插入序列可具有PRED 65基因和PRED 3基因。結(jié)果，擴增與所預(yù)計的一樣進行。然后，對STS標(biāo)記D21S275進行PCR擴增，所述標(biāo)記位于21號人類染色體短臂近側(cè)區(qū)(參見實施例6(3)和圖12)。因為在21號人類染色體短臂近側(cè)區(qū)的位置缺失短臂遠側(cè)區(qū)，預(yù)計D21S275標(biāo)記會存在。結(jié)果，證實擴增與所預(yù)計的一樣進行。
(2-2)用藥物進行選擇性培養(yǎng)根據(jù)來自21號人類染色體的HAC載體上是否有抗藥性基因(更準(zhǔn)確地講是潮霉素抗性基因(短臂遠側(cè)區(qū))和殺稻瘟素抗性基因)在選擇性藥物的存在下起作用，來證實含每種藥物抗性基因的區(qū)域是否存在。
將A9ΔET1細胞在各孔裝有含G418(600μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(10％FBS，DMEM)的6孔培養(yǎng)板(Falcon)中培養(yǎng)至細胞密度相當(dāng)于約60-70％飽和。用PBS(Gibco BRL)洗滌2次后，將細胞在僅含潮霉素(700μg/ml，Gibco BRL)的培養(yǎng)液、僅含殺稻瘟素(4μg/ml)的培養(yǎng)液或者含殺稻瘟素、潮霉素和G418的培養(yǎng)液中培養(yǎng)1周。結(jié)果見下表16。
表16

根據(jù)上述結(jié)果，證實A9ΔET1細胞具有殺稻瘟素抗性、潮霉素抗性和G418抗性。
(2-3)具有人EPO基因插入序列的重組體的證實通過PCR擴增來證實具有插入序列的重組體，也就是說，插入序列是否引入到來自21號人類染色體的HAC載體的loxP序列中；在PCR中，引物構(gòu)建在來自人EPO基因供體載體的序列和HAC載體上，使之鄰接loxP位點。
通過使用來自示于實施例9(4)的質(zhì)粒載體pBS226的Neo Rp2引物(SEQ ID No.38)和M13RV(SEQ ID No.39)，進行A9ΔET1的PCR擴增。預(yù)計獲得具有插入序列的重組體可獲得約2.3kb的片段，該片段包括從含有來自pLN1-EPO載體的CMV啟動子、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加序列的區(qū)域，到loxP序列的區(qū)域，以及從loxP序列到來自pSF1的neo基因部分的區(qū)域。結(jié)果，證實擴增與所預(yù)計的一樣進行。
根據(jù)上述結(jié)果，證實A9ΔET1細胞保留來自21號人類染色體的HAC載體，其中引入了含有CVM啟動子、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加序列的單拷貝DNA插入片段。
根據(jù)上述實驗(2-1)到(2-3)，證實A9ΔET1細胞保留來自缺乏長臂和短臂的21號人類染色體的HAC載體。
將來自缺乏短臂的21號人類染色體的HAC載體轉(zhuǎn)移到倉鼠細胞系中(1)微細胞融合和抗藥性克隆的分離用實施例6中獲得的DT40細胞(DT40(#21)hyg4)作為染色體供體細胞，其中該DT40細胞(DT40(#21)hyg4)保留來自缺失長臂遠側(cè)區(qū)、插入loxP序列且缺失短臂遠側(cè)區(qū)的21號人類染色體的HAC載體。用來自中國倉鼠卵巢的細胞系CHO-K1(可得自ATCC，保藏號JCRB9018)作為染色體受體細胞。按照與實施例3(1)相同的方法，制備微細胞并與CHO細胞進行融合。細胞融合進行4次，從選擇性培養(yǎng)開始約2周后，得到5個潮霉素抗性CHO克隆。
(2)轉(zhuǎn)移染色體的證實(2-1)PCR法轉(zhuǎn)移的染色體是否存在，可通過PCR法加以證實。更具體地講，檢測是否存在位于21號人類染色體短臂近側(cè)區(qū)的標(biāo)記pCHB、D21S187和D21S275(實施例6(3-1)，圖12)。證實在5個潮霉素抗性CHO細胞克隆中有2個克隆(CHO#21hyg4和CHO#21hyg8)擴增了位于從缺失位點起的近側(cè)區(qū)D21S275。
(2-2)PCR法擴增鄰接重組靶位點的序列(參見實施例6，(3-3)，圖12)。僅在2個CHO#21hyg4和CHO#21hyg8克隆中得到了擴增產(chǎn)物。此外證實，如預(yù)計的一樣，從限制酶Nsi I消化中得到部分片段。
(2-3)熒光原位雜交(FISH)按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人類特異性探針Cot1(Gibco BRL)進行FISH分析。分析了潮霉素抗性CHO克隆中的2個克隆(CHO#21hyg4和CHO#21hyg8)。結(jié)果，在幾乎所有觀察的有絲分裂圖像中，都檢測到截短的21號人類染色體。根據(jù)與宿主CHO細胞的染色體大小進行相對比較，證實截短的21號人類染色體轉(zhuǎn)移到CHO細胞中。
根據(jù)上述實驗(1)和(2)，證實潮霉素抗性CHO克隆具有來自通過缺失長臂遠側(cè)區(qū)、插入loxP序列且缺失短臂遠側(cè)區(qū)而獲得的21號人類染色體的部分片段(HAC載體)。
將來自缺乏短臂遠側(cè)區(qū)的21號人類染色體的HAC載體轉(zhuǎn)移到人類細胞系中并證實其穩(wěn)定性(1)微細胞融合和抗藥性克隆的分離用得自實施例17的CHO細胞(CHO(#21)hyg4和CHO(#21)hyg8)作為染色體供體細胞，其中該CHO細胞(CHO(#21)hyg4和CHO(#21)hyg8)保留來自缺失長臂遠側(cè)區(qū)、插入loxP序列且缺失短臂遠側(cè)區(qū)的21號人類染色體的HAC載體。用來自人纖維肉瘤細胞系HT1080(得自ATCC，保藏號CCL-121)作為染色體受體細胞。按照與實施例4(1)相同的方法，制備微細胞并與HT1080細胞進行融合。在CHO(#21)hyg4的情況下，將細胞融合進行1次，得到7個殺稻瘟素抗性HT1080克隆。在CHO(#21)hyg8的情況下，將細胞融合進行2次，共得到20個殺稻瘟素抗性HT1080克隆。
(2)轉(zhuǎn)移染色體的證實(2-1)PCR法染色體是否轉(zhuǎn)移，可通過PCR擴增殺稻瘟素抗性基因(參見實施例4，(2-1))和潮霉素抗性基因加以證實。此時所用的寡核苷酸引物序列如下所示HygroF5′-GCGAAGAATCTCGTGCTTTC(SEQ ID No.55)；HygroR5′-ATAGGTCAGGCTCTCGCTGA(SEQ ID No.56).
證實在所有殺稻瘟素抗性HT1080克隆中，擴增了殺稻瘟素抗性基因。另一方面，證實在7個CHO(#21)hyg4克隆中有5個、在30個CHO(#21)hyg8克隆中有27個都擴增了潮霉素抗性基因。
(2-2)染色體分析按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人類特異性探針Cot1(Gibco BRL)來分析染色體。代表性FISH圖像示于圖17。在殺稻瘟素抗性克隆中，觀察到比內(nèi)源21號染色體小且在親代細胞系HT1080中未觀察到的染色體片段。
根據(jù)上述實驗(1)和(2)，證實殺稻瘟素抗性HT1080克隆保留通過缺失長臂遠側(cè)區(qū)、插入loxP序列且缺失短臂遠側(cè)區(qū)而制備的21號人類染色體部分片段(HAC載體)。
(3)在非選擇性培養(yǎng)條件下進行長期傳代培養(yǎng)為了證實其中缺失長臂遠側(cè)區(qū)的21號人類染色體以及其中缺失短臂遠側(cè)區(qū)的21號人類染色體在培養(yǎng)細胞中的穩(wěn)定性，采用實施例4中所用的人類細胞克隆(HT1080(#21)bsd-79-1-1，3，6，11，14；HT1080(#21)bsd-H4-1，3，6；HT1080(#21)bsd-H8-4，9，2)，在非選擇性培養(yǎng)條件下，進行長期傳代培養(yǎng)。應(yīng)用補充了10％CS的DMEM作為人類細胞克隆的非選擇性培養(yǎng)液。通過向非選擇性培養(yǎng)液中加入4μg/ml殺稻瘟素，制備選擇性培養(yǎng)液。對于人類細胞克隆，將5.0×105細胞接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿中。3天后，測定細胞數(shù)，然后再將5.0×105細胞接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿中。在每個細胞群體倍增水平時，即25、50、100水平，收集人類細胞系，制備染色體制備物。
(4)染色體分析按照Kuroki等(Cell engineeing handbook，Yodosha，1992)描述的方法，通過吉姆薩染色，對人類細胞中人工染色體進行檢測。觀察在約20幅中期染色體圖像中是否存在微型染色體，并計算保留率。得到5個克隆的微型染色體平均保留率。結(jié)果見下表17。
表17#21HAC在HT1080細胞中的穩(wěn)定性

在第100次細胞分裂時，21號人類染色體部分片段在HT1080中仍穩(wěn)定保留。此外，當(dāng)觀察中期染色體圖像時，觀察到每個細胞中有1-2個部分染色體。
根據(jù)上述實驗(3)和(4)，證實在非選擇性培養(yǎng)條件下，通過缺失長臂遠側(cè)區(qū)制備的21號人類染色體部分片段、以及通過缺失短臂遠側(cè)區(qū)制備的人類染色體部分片段在HT1080細胞克隆中可穩(wěn)定保留，并且保持每個細胞中所述染色體的拷貝數(shù)。
將GFP基因插入到來自21號人類染色體的HAC載體中進而插入到人類細胞克隆中(1)轉(zhuǎn)染和G418抗性克隆的分離在實施例18中制備的保留來自21號人類染色體的HAC載體的人類HT1080細胞克隆(HT1080(#21)bsd-79-1-6，14；HT1080(#21)bsd-H4-1，6；HT1080(#21)bsd-H8-2)用胰蛋白酶處理，并按4×105細胞/孔的密度接種到6孔板(Nunc)中，培養(yǎng)1天。將2μg含有l(wèi)oxP序列的GFP表達質(zhì)粒(在實施例5(1)中制備的)和1μg Cre酶表達質(zhì)粒pBS185(Lifetech)與7.5μl脂質(zhì)體溶液(Lipofectamine2000，Invitrogen)混合。將所得溶液加入到培養(yǎng)液中，5小時后更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)1天后，進行胰酶消化。將細胞懸浮于補充了10％CS的DMEM培養(yǎng)液中，并接種在2個10mm培養(yǎng)皿中。翌日，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入含400μg/ml G418(GENETICIN，Sigma)的培養(yǎng)液。約2周內(nèi)，形成抗性集落。集落形成頻率是每4×105個HT1080細胞中為3-14個集落。對集落進行分離、增殖并進行以下分析。
(2)插入在來自21號人類染色體的HAC載體中的GFP基因的表達通過熒光顯微鏡，觀察所分離的G418抗性HT1080細胞克隆。結(jié)果，證實在21ΔqHAC的情況下，21個克隆中有14個表達了GFP；而在21ΔpqHAC的情況下，31個克隆中有28個表達了GFP。代表性的熒光顯微鏡圖像和光學(xué)顯微鏡圖像示于圖18a和圖18b。
(3)同源重組體的證實為了證實同源重組體，鄰接重組靶位點的序列經(jīng)PCR擴增。根據(jù)pBS226和pSF1質(zhì)粒而設(shè)計的引物寡核苷酸序列如下所示CMVneo6895′-GCCATCCACGCTGTTTTGAC(SEQ ID No.57)CMVneo9105′-GCATCAGAGCAGCCGATTGT(SEQ ID No.58)盡管表達GFP基因，但是在所有G418抗性克隆中都觀察到PCR擴增。因此，所有克隆均證實是同源重組體。
根據(jù)上述實驗(1)到(3)，證實基因可以插入到人類細胞克隆中來自21號人類染色體的HAC載體中，而且具有插入序列的基因可以表達。
(4)長期傳代培養(yǎng)后GFP基因的表達從G418抗性HT1080細胞克隆中隨機挑取7個克隆，在沒有選擇性藥物的情況下進行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)開始后1個月(細胞群體倍增水平30)，在每個克隆中都觀察到GFP基因的表達。
根據(jù)上述實驗(4)，證實插入在來自21號人類染色體的HAC載體的基因可以維持表達，而不會因插入位點的位置效應(yīng)而減少。更具體地講，發(fā)現(xiàn)基因插入在HAC載體的位點不在異染色質(zhì)區(qū)。
將來自21號人類染色體的HAC載體轉(zhuǎn)移到小鼠ES細胞系中并證實其穩(wěn)定性(1)微細胞融合和抗藥性克隆的分離用得自實施例5的CHO細胞克隆(CHO(#21)ΔqGFP7-2)以及得自實施例17的CHO細胞克隆(CHO(#21)Hyg8)作為染色體供體細胞，其中CHO細胞克隆(CHO(#21)ΔqGFP7-2)保留來自缺失長臂遠側(cè)區(qū)并插入loxP序列且插入GFP基因的21號人類染色體的HAC載體，而CHO細胞克隆(CHO(#21)Hyg8)保留來自缺失長臂遠側(cè)區(qū)并插入loxP序列且缺失短臂遠側(cè)區(qū)的21號人類染色體的HAC載體。用來自小鼠ES細胞系E14(Hooper等，Nature，326292，1987)作為染色體受體細胞。按照文獻(Shinichi Aizawa，biomanual series 8，gene targeting，Yodosha，1995)描述的方法，使用經(jīng)絲裂霉素C處理的小鼠胚胎原代培養(yǎng)細胞(Invitrogen)作為飼養(yǎng)細胞，培養(yǎng)E14細胞。首先，從約108供體細胞制備微細胞，懸浮于5ml DMEM中。約107E14細胞用DMEM洗滌3次，懸浮于5ml DMEM中，然后與微細胞混合，以1250rpm離心10分鐘。棄去上清液，將沉淀吹打至松散。向其中加入0.5ml的1∶1.4 PEG溶液(將5g PEG 1000(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)和1ml DMSO(Sigma)溶于6ml DMEM中)，并將其在室溫下靜置1.5分鐘。向所得混合物中小心加入10ml DMEM。將所得混合物立即于1250rpm離心10分鐘。棄去上清液后，將沉淀懸浮于用于ES細胞的30ml培養(yǎng)液中，并接種在3個直徑100mm的塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中。24小時后，在CHO細胞克隆CHO(#21)ΔqGFP7-2用作供體細胞的情況下，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入補充了300μg/ml G418(GENETICIN，Sigma)的培養(yǎng)液；在CHO細胞克隆CHO(#21)Hyg8用作供體細胞的情況下，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入補充了150μg/ml潮霉素(Wato PureChemical Industries，Ltd.)的培養(yǎng)液。此后，每天都用新鮮培養(yǎng)液更換原培養(yǎng)液。在1周至10天內(nèi)，形成抗性集落。集落形成頻率是每107個E14細胞為2-5個集落。所得集落進行分離、增殖，將每5×107個集落懸浮于1ml保存培養(yǎng)液(用于ES細胞的培養(yǎng)液+10％DMSO(Sigma))中，并且于-80℃冷凍。同時，從每個抗性克隆的約106個細胞制備基因組DNA(Puregene DNA分離試劑盒(Gentra System))。
(2)PCR分析轉(zhuǎn)移的染色體和所述染色體所含有的區(qū)域經(jīng)PCR擴增加以證實。以下引物寡核苷酸是新設(shè)計的。
#21p769575′-ACACTTTTGACAAACACACCAG(SEQ ID No.59)#21p775555′-TCAACAATGAAAGGGGATGTC(SEQ ID No.60)
這些引物是根據(jù)得自GenBank的核苷酸序列(登記號AL163201)而制備。分析中所用的寡核苷酸引物見下表18。
表18

上述結(jié)果示于圖19。所獲得的抗藥性克隆缺乏部分轉(zhuǎn)移染色體區(qū)。
(3)熒光原位雜交(FISH)按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人類特異性探針Cot1(Gibco BRL)進行FISH分析。結(jié)果，在所觀察的幾乎所有的有絲分裂圖像中，都檢測到截短的21號人類染色體。代表性FISH圖像示于圖20a和圖20b。在5個來自CHO(#21)ΔqGFP7-2的G418抗性克隆中的1個(E14(#21)neo1)中，觀察到人類染色體的片段；而在2個來自CHO(#21)Hyg8的潮霉素抗性克隆中，也觀察到人類染色體的片段。其中，在E14(#21)Hyg1中觀察到兩個人類染色體的片段，而在E14(#21)Hyg2中觀察到一個人類染色體的片段。觀察到人類染色體的上述3個克隆經(jīng)證實具有小鼠中所具有的正常染色體數(shù)(40條)。
根據(jù)上述(2)和(3)的結(jié)果，證實G418抗性克隆或潮霉素抗性E14克隆保留來自21號人類染色體的HAC載體。
(4)在非選擇性培養(yǎng)條件下的長期傳代培養(yǎng)為了證實來自21號人類染色體的HAC載體在小鼠ES細胞中的穩(wěn)定性，在非選擇性培養(yǎng)條件下進行選擇性培養(yǎng)。采用上述(3)小節(jié)中制備的人類細胞克隆E14(#21)neo1、E14(#21)Hyg1、E14(#21)Hyg2。采用含有下列組分的DMEM培養(yǎng)液作為小鼠ES細胞的非選擇性培養(yǎng)液18.2％FBS(Invitrogen)、3.5g/l葡萄糖(Sigma)、0.125mM MEM非必需氨基酸(Invitrogen)、1000U/ml LIF(ESGRO，Wako PureChemical Industries，Ltd.)和0.1mM 2-巰基乙醇(Sigma)。將小鼠ES細胞系的1×107細胞接種到直徑10cm培養(yǎng)皿中的飼養(yǎng)細胞上。2天后，將細胞的1/15接種到直徑10cm培養(yǎng)皿中的飼養(yǎng)細胞上。從培養(yǎng)開始后14天、28天和42天收集細胞，制備染色體制備物。
(5)染色體分析按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人類特異性探針Cot1(Gibco BRL)對小鼠ES細胞中來自21號人類染色體的HAC載體進行檢測。檢查200幅中期圖像中是否存在人類染色體的片段，并計算人類染色體的保留率。結(jié)果見下表19。對每個克隆，進行長期傳代培養(yǎng)(一式三份)，所給出的保留率是其平均值。
表19

在非選擇性條件下，通過缺失21號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)而制備的部分片段在進行長期傳代培養(yǎng)的過程中往往會減少。相反，通過缺失21號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和短臂遠側(cè)區(qū)而制備的部分片段，甚至在細胞分裂超過75次時仍保持穩(wěn)定，而不會減少。此外，當(dāng)長期傳代培養(yǎng)開始時，在每個細胞中染色體片段拷貝數(shù)為1的克隆中，其拷貝數(shù)也沒有增加。在長期傳代培養(yǎng)開始時，在每個細胞中主要具有2拷貝片段的克隆中，其拷貝數(shù)可能會略微減少。
根據(jù)上述實驗(4)和(5)，證明在非選擇性培養(yǎng)條件下，通過缺失21號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和短臂遠側(cè)區(qū)而制備的部分片段可以在小鼠ES細胞系中穩(wěn)定保留，并且每個細胞中部分片段的拷貝數(shù)可以保持穩(wěn)定。
將來自21號人類染色體的HAC載體轉(zhuǎn)移到人類干細胞中并證實其穩(wěn)定性(1)微細胞融合和抗藥性克隆的分離用得自實施例17的CHO細胞克隆(CHO(#21)hyg4和CHO(#21)hyg8)作為染色體供體細胞，其中該CHO細胞克隆(CHO(#21)hyg4和CHO(#21)hyg8)保留來自缺失長臂遠側(cè)區(qū)、插入loxP序列且缺失短臂遠側(cè)區(qū)的21號人類染色體的HAC載體。用源于人類骨髓的間充質(zhì)干細胞系hiMSC(得自Junya Toguchida教授，KyotoUniversity，Okamoto等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，295354，2002)作為染色體受體細胞，所述細胞是由人hTERT基因和人乳頭瘤病毒E6/E7基因而建立的。應(yīng)用補充了10％FBS的DMEM培養(yǎng)液來培養(yǎng)hiMSC細胞系。首先，從約107CHO(#21)hyg4/8細胞制備微細胞。更具體地講，CHO(#21)hyg4/8細胞在6個25cm2的離心瓶(Coasters)中培養(yǎng)至細胞密度相當(dāng)于約60-70％飽和，然后在含有秋水仙胺(0.075μg/ml，Demecolcine，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的培養(yǎng)液(10％FBS，8μg/ml殺稻瘟素，F(xiàn)12)中再培養(yǎng)48小時，以誘導(dǎo)微核。取出培養(yǎng)液后，向每個離心瓶中加入預(yù)熱(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，插入到丙烯酸塑料離心管中，然后離心(34℃，8000rpm)1小時。通過將微細胞懸浮于無血清培養(yǎng)液(DMEM)中，使其恢復(fù)，然后進行過濾純化。向其中hiMSC細胞已培養(yǎng)至80％飽和的直徑6cm的培養(yǎng)皿(Falcon)中加入純化的微核細胞。細胞用PEG溶液融合。48小時后，細胞經(jīng)胰酶處理而分散，然后在含殺稻瘟素(8μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(10％CS，DMEM)中培養(yǎng)。選擇性培養(yǎng)約2周后，分離所形成的抗藥性集落并進行以下分析。在CHO(#21)hyg4的情況下，得到1個殺稻瘟素抗性hiMSC克隆。在CHO(#21)hyg8的情況下，得到4個殺稻瘟素抗性hiMSC克隆。
(2)轉(zhuǎn)移染色體的證實(2-1)PCR法通過殺稻瘟素抗性基因(參見實施例4(2-1)和潮霉素基因(參見實施例18(2-1)的PCR擴增，來證實轉(zhuǎn)移的染色體。經(jīng)證實在5個殺稻瘟素抗性HT1080克隆中都擴增了殺稻瘟素抗性基因和潮霉素基因。
(2-2)染色體分析按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人類特異性探針Cot1(Gibco BRL)，通過FISH法，進行染色體分析。代表性FISH圖像示于圖21。在殺稻瘟素抗性克隆中，觀察到比內(nèi)源21號染色體小且在親代細胞系hiMSC細胞中未觀察到的染色體片段。
根據(jù)上述實驗(1)和(2)，證實殺稻瘟素抗性hiMSC克隆保留通過缺失長臂遠側(cè)區(qū)、插入loxP序列且缺失短臂遠側(cè)區(qū)而制備的21號人類染色體部分片段(HAC載體)。
(3)在非選擇性培養(yǎng)條件下進行長期傳代培養(yǎng)為了證實來自21號人類染色體的HAC載體在具有多能性的體干細胞中的穩(wěn)定性，在非選擇性培養(yǎng)條件下進行長期傳代培養(yǎng)。采用以上(1)和(2)小節(jié)制備的人類間充質(zhì)細胞克隆(hiMSC(#21)bsd-H4-1、hiMSC(#21)bsd-H8-1，2，3，4)。采用含10％FBS的DMEM作為人類細胞克隆的非選擇性培養(yǎng)液。通過向非選擇性培養(yǎng)液中加入4μg/ml殺稻瘟素，制備選擇性培養(yǎng)液。將人類細胞克隆(5.0×105細胞)接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿中。3天后，測定細胞數(shù)，然后再將5.0×105細胞的人類細胞克隆接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿中。從培養(yǎng)開始，在細胞群體倍增水平達到15、40和90的時間點，收集細胞，制備染色體樣品。
(4)染色體分析按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，通過FISH法，用來自21號人類染色體的白斑樣特異性探針p11-4(得自Hiroshi Masumoto教授，Nagoya University，Ikeno等，Hum.Mol.Genet.，31245，1994)對人類間充質(zhì)細胞中來自21號人類染色體的HAC載體進行檢測。檢查在50幅中期圖像中是否存在微型染色體上的熒光信號，計算保留率。結(jié)果見下表20。
表20#21HAC在hiMSC細胞中的穩(wěn)定性

在細胞分裂第90次時，21號人類染色體部分片段在hiMSC細胞中仍穩(wěn)定保留。當(dāng)觀察中期染色體圖像時，發(fā)現(xiàn)每個細胞中的單拷貝部分染色體片段。
根據(jù)上述實驗(3)和(4)，證明在非選擇性培養(yǎng)條件下，來自21號人類染色體的HAC載體可以在hiMSC細胞中穩(wěn)定保留，并且每個細胞中的拷貝數(shù)可以保持穩(wěn)定。
通過體外誘導(dǎo)分化證實保留了轉(zhuǎn)移的來自21號人類染色體的HAC載體的人類體干細胞的多能性按照Okamoto等(Biochem.Biophys.Res.Commun.，295354，2002)描述的方法，誘導(dǎo)實施例21中制備的、其中轉(zhuǎn)移了來自21號人類染色體的HAC載體的人類間充質(zhì)干細胞的分化，然后證實干細胞分化成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞的能力。在本實施例中，采用實施例21描述的人類間充質(zhì)干細胞克隆(hiMSC(#21)bsd-H8-1)及其親代細胞系(hiMSC)。
(1)誘導(dǎo)分化成骨細胞將hiMSC細胞以3×103/cm2的密度接種并在含10％FBS并補充了100nM地塞米松(Sigma)、50μM抗壞血酸2-磷酸酯(Sigma)和10mMβ-甘油磷酸(Sigma)的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)21天。培養(yǎng)期間，每2天用新鮮培養(yǎng)液更換原培養(yǎng)液1次。
(2)誘導(dǎo)分化成軟骨細胞首先，將2.5×105hiMSC細胞收集在15ml聚丙烯管(Corning)中，在室溫下以800rpm離心5分鐘。將細胞沉淀重懸于高濃度葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液(其中補充了10ng/ml人TGF-β3(Invitrogen)、100nM地塞米松(Sigma)、6μg/ml胰島素(Roche)、100μM抗壞血酸2-磷酸酯(Sigma)、1mM丙酮酸鈉(Sigma)、6μg/ml運鐵蛋白(Sigma)、0.35mM脯氨酸(Sigma)和1.25mg/ml牛血清白蛋白(Invitrogen))中，然后離心。將細胞以細胞集合狀態(tài)培養(yǎng)21天。培養(yǎng)期間，每2天用新鮮培養(yǎng)液更換原培養(yǎng)液1次。
(3)誘導(dǎo)分化成脂肪細胞首先，以3×103/cm2的密度將hiMSC細胞接種在培養(yǎng)皿中。當(dāng)細胞培養(yǎng)至長滿時，重復(fù)3次誘導(dǎo)培養(yǎng)和維持培養(yǎng)。在含10％FBS并補充了1μM地塞米松(Sigma)、0.2mM吲哚美辛(Sigma)、10μg/ml胰島素(Sigma)和0.5mM 3-異丁基-甲基黃嘌呤(Sigma)的DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)液中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)達3天。在含10％FBS并補充了10μg/ml胰島素(Roche)的DMEM培養(yǎng)液中進行維持培養(yǎng)達2天。
(4)組織染色培養(yǎng)21天后，細胞用PBS洗滌2次并用10％福爾馬林固定。在骨細胞分化的情況下，用5％硝酸銀(Nakarai)進行染色。在脂肪細胞分化的情況下，用0.3％油紅O(Nakarai)進行染色。在軟骨細胞分化的情況下，固定的細胞聚集物用乙醇脫水，用二甲苯洗滌，用石蠟包埋并切片。將切片用愛茜藍(Nakarai)染色。
當(dāng)保留轉(zhuǎn)移了來自21號人類染色體的HAC載體的間充質(zhì)干細胞系hiMSC(#21)bsd-H8-1經(jīng)歷誘導(dǎo)分化時，對骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞特異性組織染色顯示出陽性結(jié)果，與其親代細胞hiMSC的情況類似。
根據(jù)上述實驗結(jié)果(1)到(4)，證實其中保留轉(zhuǎn)移了來自21號人類染色體的HAC載體的間充質(zhì)干細胞系保持了分化成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞的多能性。
將14號人類染色體片段導(dǎo)入獼猴(cynomolgus monkey)ES細胞中用攜帶14號人類染色體片段SC20的小鼠A9細胞系(在下文稱為“A9/SC20)作為染色體供體細胞(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，722-727，2000)。使用獼猴ES細胞系CMK6.4(Suemori等，Dev.Dyn.222，273-279，2001)作為染色體受體細胞。按照Suemori等(出處同上)描述的方法培養(yǎng)CMK6.4細胞。培養(yǎng)液是由補充了20％KSR(血清替代品(knock out serum replacement)，GIBCO BRL)的DMEM/F12(Sigma D-6421)、非必需氨基酸溶液(×100，Sigma，M7145)和L-谷氨酰胺溶液(×100，Sigma，M7522)組成。首先，按照Shimizu等(Cell engineering handbook，Yodosha，1992)描述的方法，從在24個25cm2瓶(Nunc 152094)中培養(yǎng)至約70-80％長滿的A9/SC20細胞，制備微細胞。將所得全部微細胞懸浮于5ml DMEM(Sigma，D-5796)中。將1×106至5×106CMK6.4細胞用胰蛋白酶溶液(0.25％胰蛋白酶，20％KSR)分散后，用DMEM洗滌2次，懸浮于5ml DMEM中，與微細胞混合，以1500rpm離心7分鐘，然后棄去上清液。用于細胞融合的溶液為1∶1.4的PEG溶液，所述溶液是通過將1g PEG(Sigma)溶于1.2ml DMEM、然后向所得溶液中加入0.2ml DMSO(Sigma)而制備。沉淀經(jīng)吹打而松散。向其中加入1.0ml預(yù)熱(37℃)的1∶1.4的PEG溶液，將所得溶液在室溫下靜置2分鐘，然后向該溶液中小心加入10ml DMEM。所得混合物立即以1500rpm離心7分鐘。棄去上清液后，將沉淀懸浮于用于ES細胞的4ml培養(yǎng)液中，并接種在2個直徑35mm的塑料組織培養(yǎng)板(其中事先已經(jīng)接種了G418抗性飼養(yǎng)細胞)并且在CO2培養(yǎng)箱(37℃，5％CO2)中孵育。24小時后，更換培養(yǎng)液，即棄去原培養(yǎng)液，加入補充了50μg/ml G418的培養(yǎng)液。此后，每天都用新鮮培養(yǎng)液更換原培養(yǎng)液1次。在1周至10天內(nèi)，形成抗藥性集落。挑取抗藥性ES細胞集落，接種在4孔板(其中事先已接種了G418抗性飼養(yǎng)細胞)并且在50μg/ml G418存在下培養(yǎng)10天。再次挑取所得活的ES細胞集落，接種在4孔板(其中事先已接種了飼養(yǎng)細胞)并且在非選擇性條件下再培養(yǎng)10天。證明增殖的ES細胞對堿性磷酸酶染色呈陽性反應(yīng)(Suemori等，出處同上)并且保持未分化的能力。此外，按照標(biāo)準(zhǔn)方法提取基因組DNA，如下證實插入的染色體是否存在。
用抗藥性克隆的基因組DNA作為模板，通過PCR方法，檢測14號人類染色體片段中所含有的Neo基因(pSTneoB，Tomizuka等，NatureGenet.16，133-143，1997)是否存在。此時使用的引物寡核苷酸的核苷酸序列如下所示。用約0.1μg基因組DNA作為模板，用Takara Ex Taq作為Taq聚合酶，如下進行PCR94℃反應(yīng)5分鐘，然后重復(fù)以下循環(huán)94℃反應(yīng)15秒，59℃反應(yīng)15秒，72℃反應(yīng)20秒，共35次。
neoFTGAATGAACTGCAGGACGAG(SEQ ID No.61)neoRATACTTTCTCGGCAGGAGCA(SEQ ID No.62)對所得G418抗性猴ES細胞克隆中的1個克隆，進行PCR分析。結(jié)果，檢測到表明Neo基因存在的特異性擴增產(chǎn)物(pSTneoB)。由這些實驗證明，14號人類染色體片段SC20通過微細胞法已轉(zhuǎn)移到獼猴ES細胞系中。已知包括獼猴、恒河猴(Rhesus monkey)在內(nèi)的靈長類ES細胞的特性與人類ES細胞非常類似(Suemori等，ExperimentalMedicine，第21卷，第8期，第46-51頁，2003；Yodosha)。因此，該結(jié)果顯示，帶有抗藥性標(biāo)記的人類染色體和人類人工染色體(HAC)可以通過本實施例描述的方法導(dǎo)入包括獼猴ES細胞在內(nèi)的靈長類ES細胞中。
證實保留了轉(zhuǎn)移在其中的來自21號人類染色體的HAC載體的小鼠ES細胞克隆的分化潛力進行了分化小鼠ES細胞的嘗試，所述細胞按照實施例20、通過將具有插入其中的GFP基因的來自21號人類染色體的HAC載體轉(zhuǎn)移到神經(jīng)細胞中而制備，并且檢測了神經(jīng)細胞的分化能力。用實施例20描述的小鼠ES細胞系E14(#21)neo1作為小鼠ES細胞。
(1)GFP表達細胞的制備性分離將E14(#21)neo1細胞接種在直徑100mm的塑料組織培養(yǎng)板中的經(jīng)絲裂霉素C處理的小鼠胚胎原代培養(yǎng)細胞(Invitrogen)上，在含20％FBS且補充了2mM L-谷氨酸(Invitrogen)、0.2mM 2-巰基乙醇(Sigma)、1mM丙酮酸鈉(Invitrogen)、0.1mM MEM非必需氨基酸和1000U/ml LIF(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的DMEM中進行培養(yǎng)。細胞經(jīng)0.1％胰蛋白酶和0.04％EDTA處理而分散，收集在培養(yǎng)液中，用PBS洗滌2次，懸浮于PBS中，得到密度為1×106細胞/ml，然后用細胞分選儀(EPICS ELITE，Beckman coulter)選擇GFP表達細胞。
(2)誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細胞用作誘導(dǎo)分化的飼養(yǎng)細胞的PA6細胞來自小鼠骨髓，將該細胞在含10％FBS并補充了2mM L-谷氨酸(Invitrogen)的DMEM培養(yǎng)液(Invitrogen)中進行培養(yǎng)。將選自(1)小節(jié)的1×103細胞的GFP表達ES細胞懸浮于既無血清也無LIF的誘導(dǎo)分化用培養(yǎng)液中，然后接種到玻片小室(Nunc)內(nèi)的PA6細胞上。誘導(dǎo)分化用培養(yǎng)液是通過向含有10％血清替代品(Invitrogen)的G-MEM(Invitrogen)中加入以下成分而制備的2mM L-谷氨酸(Invitrogen)、0.2mM 2-巰基乙醇(Sigma)、1mM丙酮酸鈉(Invitrogen)和0.1mM MEM非必需氨基酸。細胞培養(yǎng)10天后，將其用4％低聚甲醛固定，用抗β微管蛋白(該蛋白在神經(jīng)細胞中特異性表達)的抗體(TUJI，Berkeley Antibody Company)進行免疫染色，再通過聚焦熒光顯微鏡觀察。所述細胞使神經(jīng)細胞的形態(tài)呈現(xiàn)神經(jīng)炎的形態(tài)。因此，證實被抗β微管蛋白抗體染色的細胞表達GFP。通過聚焦熒光顯微鏡觀察的代表性圖像示于圖22a和圖22b。
根據(jù)實驗(1)和(2)，證實保留了轉(zhuǎn)移在其中的來自21號人類染色體的HAC載體的ES細胞在神經(jīng)細胞中保持分化潛力。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供了人類人工染色體(HAC)載體。因為HAC載體尺寸減小，從中缺失了不必要的基因，所以它在細胞中可以穩(wěn)定存在。本發(fā)明的HAC載體是基于人類染色體來制備的。因此，可以通過HAC載體，插入大的外源DNA。此外，本發(fā)明的HAC載體具有針對位點專一重組酶的識別位點。因此，外源DNA可以作為一個盒而容易地插入。因為所述位點是為引入外源DNA而適當(dāng)?shù)卦O(shè)計的，所以HAC載體沒有位置效應(yīng)。通過使用本發(fā)明的HAC載體，可以將大的外源DNA導(dǎo)入細胞中并在其中表達。因此，本發(fā)明的HAC載體可用于通過高水平表達編碼蛋白的基因而生產(chǎn)所需要的蛋白、用于功能不明基因或蛋白的體內(nèi)功能分析以及用于克隆大的DNA。因此，本發(fā)明的HAC載體可用于基因工程等相關(guān)領(lǐng)域。
序列表的獨立文本SEQ ID No.1-62合成寡核苷酸序列表<110>麒麟麥酒株式會社(KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA)<120>人類人工染色體載體<130>PH-1899-PCT<150>JP 2002-292853<151>2002-10-04<160>62<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成寡核苷酸<400>39caggaaacag ctatgac17<210>40<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>40tttgcatgtc tttagttcta tgatga 26<210>41<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>41aggtcggtct tgacaaaaag aac 23<210>42<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>42ctacccgtga tattgctgaa gag 23<210>43<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>43atttgcactg ccggtagaact21<210>44<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>44ctgctgcgca cgtgggaag 19<210>45<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>45ggtctggcag gtgacaccac 20<210>46<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>46gaagatcttc atcgatcggc caccatgccg cgcgc35<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>47tcactcggtc cacgcgtcct 20<210>48<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>48agtgccagcc gaagtctgcc 20<210>49<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>49gcagctgaac agtgccttc 19<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>50aggacgcgtg gaccgagtga 20<210>51<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>51ccatcctaat acgactcact atagggc 27<210>52<211>35
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>52ccgagcgtct cacctcgagg gtgaaggcac tgttc35<210>53<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>53atggactacg tcgtgggagc caga24<210>54<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>54gtcgacgcta gctcagtcca ggatggtctt gaagt35<210>55<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>55gcgaagaatc tcgtgctttc 20<210>56<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>56ataggtcagg ctctcgctga 20<210>57<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>57gccatccacg ctgttttgac 20<210>58<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>58gcatcagagc agccgattgt 20<210>59<211>22
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>59acacttttga caaacacacc ag 22<210>60<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>60tcaacaatga aaggggatgt c 21<210>61<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>61tgaatgaact gcaggacgag 20<210>62<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>62atactttctc ggcaggagca 20
權(quán)利要求
1.一種包含21號人類染色體片段或14號人類染色體片段的人類人工染色體載體，其中所述染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)已經(jīng)缺失。
2.權(quán)利要求1的人類人工染色體載體，其中所述21號人類染色體的片段或14號人類染色體的片段約為2-16Mb。
3.權(quán)利要求1或2的人類人工染色體載體，其中所述21號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)在21q11區(qū)內(nèi)缺失。
4.權(quán)利要求3的人類人工染色體載體，其中所述21號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)在AL163204缺失。
5.權(quán)利要求1或2的人類人工染色體載體，其中所述21號人類染色體的短臂遠側(cè)區(qū)在21p區(qū)內(nèi)缺失。
6.權(quán)利要求5的人類人工染色體載體，其中所述21號人類染色體的短臂遠側(cè)區(qū)在AL163201缺失。
7.權(quán)利要求1或2的人類人工染色體載體，其中所述14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)在14q區(qū)內(nèi)缺失。
8.權(quán)利要求7的人類人工染色體載體，其中所述14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)在AL157858或AL512310缺失。
9.權(quán)利要求1或2的人類人工染色體載體，其中所述14號人類染色體的短臂遠側(cè)區(qū)在14p區(qū)內(nèi)缺失。
10.權(quán)利要求9的人類人工染色體載體，其中所述14號人類染色體的短臂遠側(cè)區(qū)在至少一個選自以下的位置缺失OR4H12、OR4Q4、RNR2、OR4L1、RNU6C、FDPSL3、K12T、C14orf57、OR6S1、M195、OR4K14、MGC27165、LCH、OR10G3、OR4K3、OR4E2、H1RNA、ATP5C2、OR11H6和OR4M1。
11.權(quán)利要求1-10中任一項的人類人工染色體載體，其中位點專一重組酶識別位點插入到21號人類染色體或14號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)和/或短臂近側(cè)區(qū)。
12.權(quán)利要求11的人類人工染色體載體，其中所述位點專一重組酶是Cre酶。
13.權(quán)利要求11或12的人類人工染色體載體，其中所述位點專一重組酶識別位點是loxP序列。
14.權(quán)利要求11-13中任一項的人類人工染色體載體，其中所述位點專一重組酶識別位點插入到21號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)內(nèi)的AL163203。
15.權(quán)利要求11-13中任一項的人類人工染色體載體，其中所述位點專一重組酶識別位點插入到比14號人類染色體長臂近側(cè)區(qū)內(nèi)的AL157858或AL512310缺失位點更近的位置。
16.權(quán)利要求11-13中任一項的人類人工染色體載體，其中所述位點專一重組酶識別位點插入到比14號人類染色體短臂近側(cè)區(qū)內(nèi)的14p12區(qū)內(nèi)缺失位點更近的位置。
17.權(quán)利要求1-16中任一項的人類人工染色體載體，其中所述長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)的缺失是通過被人工端粒序列取代。
18.一種制備人類人工染色體載體的方法，所述方法包括下述步驟(a)獲得保留21號人類染色體或14號人類染色體的細胞；(b)缺失21號人類染色體或14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)；和(c)將位點專一重組酶識別位點插入到21號人類染色體或14號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)和/或短臂近側(cè)區(qū)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中在步驟(a)中，保留21號人類染色體或14號人類染色體的細胞具有高同源重組效率。
20.權(quán)利要求19的方法，其中具有高同源重組效率的細胞來自雞DT40細胞。
21.權(quán)利要求18-20中任一項的方法，其中在步驟(b)中，所述長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)的缺失是通過被人工端粒序列取代。
22.權(quán)利要求18-21中任一項的方法，其中在步驟(b)中，所述21號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)在AL163204缺失。
23.權(quán)利要求18-21中任一項的方法，其中在步驟(b)中，所述21號人類染色體的短臂遠側(cè)區(qū)在AL163201缺失。
24.權(quán)利要求18-21中任一項的方法，其中在步驟(b)中，所述14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)在AL157858或AL512310缺失。
25.權(quán)利要求18-21中任一項的方法，其中在步驟(b)中，所述14號人類染色體的短臂遠側(cè)區(qū)在至少一個選自以下的位置缺失OR4H12、OR4Q4、RNR2、OR4L1、RNU6C、FDPSL3、K12T、C14orf57、OR6S1、M195、OR4K14、MGC27165、LCH、OR10G3、OR4K3、OR4E2、H1RNA、ATP5C2、OR11H6和OR4M1。
26.權(quán)利要求18-25中任一項的方法，其中在步驟(c)中，所述位點專一重組酶是Cre酶。
27.權(quán)利要求18-26中任一項的方法，其中在步驟(c)中，所述位點專一重組酶的識別位點是loxP序列。
28.權(quán)利要求18-27中任一項的方法，其中所述位點專一重組酶的識別位點插入到21號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)內(nèi)的AL163203。
29.權(quán)利要求18-27中任一項的方法，其中所述位點專一重組酶的識別位點插入到比14號人類染色體長臂近側(cè)區(qū)內(nèi)的AL157858或AL512310缺失位點更近的位置。
30.權(quán)利要求18-27中任一項的方法，其中所述位點專一重組酶的識別位點插入到比14號人類染色體短臂近側(cè)區(qū)內(nèi)的14p12區(qū)內(nèi)缺失位點更近的位置。
31.通過權(quán)利要求18-30中任一項的方法而獲得的人類人工染色體載體。
32.一種保留權(quán)利要求31的人類人工染色體載體的細胞。
33.一種制備包含外源DNA的人類人工染色體載體的方法，所述方法除包括權(quán)利要求18-30中任一項的方法之外，還包括下述步驟(d)在位點專一重組酶存在下，將外源DNA插入到21號人類染色體或14號人類染色體中。
34.一種包含外源DNA的人類人工染色體載體，所述載體是通過權(quán)利要求33的方法獲得的。
35.一種細胞，所述細胞保留權(quán)利要求34的包含外源DNA的人類人工染色體載體。
36.一種藥用組合物，所述組合物包含權(quán)利要求35的細胞。
37.一種將外源DNA導(dǎo)入受體細胞的方法，所述方法包括下述步驟(a)獲得保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞；(b)缺失21號人類染色體或14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)；(c)將位點專一重組酶識別位點插入到21號人類染色體或14號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)和/或短臂近側(cè)區(qū)中；(d)在位點專一重組酶存在下，將外源DNA插入到21號人類染色體或14號人類染色體中；(e)從保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞制備微細胞；(f)使所述微細胞和受體細胞融合；和(g)證實所述外源DNA導(dǎo)入融合的受體細胞中。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述受體細胞是動物細胞。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述動物細胞是哺乳動物細胞。
40.權(quán)利要求37-39中任一項的方法，其中所述受體細胞是多能細胞。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述多能細胞是胚胎干細胞即ES細胞，或者是間充質(zhì)干細胞或組織干細胞/前體細胞。
42.一種制備表達外源DNA的細胞的方法，所述方法包括下述步驟(a)獲得保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞；(b)缺失21號人類染色體或14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)；(c)將位點專一重組酶識別位點插入到21號人類染色體或14號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)和/或短臂近側(cè)區(qū)中；(d)在位點專一重組酶存在下，將外源DNA插入到21號人類染色體或14號人類染色體中；(e)從保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞制備微細胞；(f)使所述微細胞和受體細胞融合；和(g)在融合的受體細胞中選擇表達所述外源DNA的細胞。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述受體細胞是動物細胞。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述動物細胞是哺乳動物細胞。
45.權(quán)利要求42-44中任一項的方法，其中所述受體細胞是多能細胞。
46.權(quán)利要求40的方法，其中所述多能細胞是胚胎干細胞即ES細胞，或者是間充質(zhì)干細胞或組織干細胞/前體細胞。
47.一種制備蛋白的方法，所述方法包括下述步驟(a)獲得保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞；(b)缺失21號人類染色體或14號人類染色體的長臂遠側(cè)區(qū)和/或短臂遠側(cè)區(qū)；(c)將位點專一重組酶識別位點插入到21號人類染色體或14號人類染色體的長臂近側(cè)區(qū)和/或短臂近側(cè)區(qū)中；(d)在位點專一重組酶表達下，將編碼蛋白的外源DNA插入到21號人類染色體或14號人類染色體中；(e)從保留21號人類染色體或14號人類染色體的供體細胞制備微細胞；(f)使所述微細胞和受體細胞融合；(g)將所述融合的受體細胞在培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)；和(h)從所得培養(yǎng)物中收集所述蛋白。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述蛋白選自紅細胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、凝血因子、血管假性血友病因子(vWF)、肌營養(yǎng)不良蛋白、多巴胺合酶、胰島素、胰島素樣生長因子(IGF)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)、抗體、端粒酶、粒細胞集落刺激因子、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子、免疫球蛋白、生長激素、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素8、白介素9、白介素10、白介素11、白介素12、白介素15、CD40配體、干擾素、腺苷脫氨酶、α-1抗胰蛋白酶、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶、嘌呤核苷酸磷酸化酶、生長抑制因子(GIF)、腫瘤壞死因子(TNF)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤蛋白M、Flt3配體(Flt3L)、基質(zhì)衍生因子(SDF)、干細胞生長因子(SCF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素、神經(jīng)生長因子(NGF)、骨形態(tài)發(fā)生因子(BMP)、活化素、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)和Wnt。
全文摘要
人類人工染色體(HAC)載體及其構(gòu)建方法；通過使用所述人類人工染色體載體轉(zhuǎn)移外源DNA的方法，表達外源DNA的細胞的構(gòu)建方法；以及蛋白的制備方法。
文檔編號C12N1/21GK1717483SQ200380104590
公開日2006年1月4日 申請日期2003年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月4日
發(fā)明者押村光雄, 加藤基伸, 富塚一磨, 黑巖義巳, 掛田實 申請人:麒麟麥酒株式會社