專利名稱：細(xì)胞為基礎(chǔ)的vegf釋放的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及刺激干細(xì)胞分化的方法，特別涉及利用細(xì)胞為基礎(chǔ)的VEGF釋放來刺激干細(xì)胞分化的方法。
背景技術(shù)：
治療性血管再生提供了治療缺血性心肌病和其它缺血性綜合癥的可能性。已經(jīng)證明，在一些動(dòng)物模型和不適合冠狀血管再生的患者中的人體實(shí)驗(yàn)性試驗(yàn)中，治療性血管再生對于缺血心臟病的治療是有效的。在人體試驗(yàn)中檢測的血管因子包括FGF-1、FGF-2和FGF-4以及一些VEGF的多種同型異構(gòu)體。Freedman，S.B.& Isner，J.M.，Ann Intern Med 2002；136(1)54-71。理想的血管再生治療的傳輸方法仍有待于確定。持續(xù)和無規(guī)律的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的產(chǎn)生在動(dòng)物模型中產(chǎn)生不恰當(dāng)?shù)挠绊?，因此，試圖最小化系統(tǒng)作用的局部和瞬間表達(dá)是理想的。Lee et al.，Circulation 2000；102(8)898-901。
在臨床人群中進(jìn)行的用于傳輸血管因子的策略研究包括通過靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)注射的蛋白傳輸；腺病毒的冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射；或蛋白、裸DNA或用于編碼血管生成基因產(chǎn)物的腺病毒的直接的心肌內(nèi)注射。參見Udelson，J.E.，et al.，Circulation 2000；102(14)1605-1610.Simons，M.，etal.，Chronos NA.Circulation 2002；105(7)788-793.Grines，C.L.，et al.Circulation 2002；105(11)1291-1297.Laham，R.J.，et al.，Circulation 1999；100(18)1865-1871.Vale，P.R.，et al.，Circulation 2001；103(17)2138-2143.Rosengart T.K.，et al.Circulation 1999；100(5)468-474。
VEGF蛋白的冠狀內(nèi)傳輸策略被系統(tǒng)毒性限制，其包括對心肌再血管化所需高劑量的反應(yīng)發(fā)展而來的高血壓，參見Hariawala M.D.，et al.，J.Surg.Res.1996；63(1)77-82.Lopez，J.J.，et al.Am.J.Physiol.1997；273(3 Pt 2)H1317-H1323。由于循環(huán)核酸酶的快速降解作用，需要直接心肌注射裸DNA。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面涉及缺血損傷組織中刺激干細(xì)胞分化的方法。所述的缺血損傷組織含有第一濃度的干細(xì)胞和第一濃度的VEGF。在此方法中，能夠?qū)⑺龅娜毖獡p傷組織中的VEGF濃度從第一濃度增加到第二濃度。能夠?qū)⑺龅娜毖獡p傷組織中的干細(xì)胞濃度從第一濃度增加到第二濃度。當(dāng)所述的缺血損傷組織中的VEGF濃度增加時(shí)，所述的干細(xì)胞濃度能夠同時(shí)增加。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述的干細(xì)胞的數(shù)量可以通過給予能夠引起干細(xì)胞從骨髓動(dòng)員到所述缺血損傷組織的外周血中的試劑或注射干細(xì)胞到所述外周血中來增加。在本發(fā)明優(yōu)選的部分中，所述的引起干細(xì)胞從所述骨髓動(dòng)員到所述外周血中的試劑選自細(xì)胞因子、趨化因子(chemokines)和化療試劑。在更優(yōu)先的部分中，所述的試劑包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，增加VEGF濃度的步驟包括在所述的缺血損傷組織中作用細(xì)胞使其表達(dá)VEGF。利用基因治療，所述的細(xì)胞能夠被作用而表達(dá)VEGF。優(yōu)選的基因治療方法可包括利用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所述的細(xì)胞。所述的表達(dá)載體可含有編碼VEGF的核酸。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述的被作用使其表達(dá)VEGF的細(xì)胞包括經(jīng)用于再回輸?shù)捏w外培養(yǎng)并被介入到所述的缺血損傷組織中的細(xì)胞。該培養(yǎng)細(xì)胞可包括自體同源細(xì)胞，其在培養(yǎng)前收集自欲進(jìn)行治療的個(gè)體。另一方面，所述的被作用使其表達(dá)VEGF的細(xì)胞包括所述缺血損傷組織中的天然細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述的缺血損傷組織能夠含有第一濃度的SDF-1，在增加所述缺血損傷組織中VEGF濃度的同時(shí)，所述缺血損傷組織中的SDF-1濃度能夠從所述的第一濃度增加到第二濃度。通過作用所述的缺血損傷組織中的細(xì)胞使其表達(dá)SDF-1，能夠增加所述的缺血損傷組織中SDF-1的濃度。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，通過向所述細(xì)胞中介入表達(dá)載體能夠作用所述細(xì)胞使其表達(dá)SDF-1，所述的表達(dá)載體能夠包括編碼SDF-1的核酸。所述的被作用而表達(dá)SDF-1的細(xì)胞能夠包括用于再回輸?shù)捏w外培養(yǎng)后并介入到所述缺血損傷組織中的細(xì)胞。所述的被作用而表達(dá)SDF-1的細(xì)胞能夠進(jìn)一步包括自體同源細(xì)胞，其在培養(yǎng)前收集自欲進(jìn)行治療的個(gè)體。可選擇地，所述的被作用表達(dá)SDF-1的細(xì)胞能夠包括缺血損傷組織中的天然細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述的在所述缺血組織中被作用表達(dá)VEGF的細(xì)胞還可進(jìn)一步在所述缺血組織中被作用表達(dá)SDF-1。通過介入表達(dá)載體到所述的細(xì)胞能夠作用所述細(xì)胞使其表達(dá)SDF-1。所述表達(dá)載體可包括編碼VEGF的核酸。
本發(fā)明的另一方面涉及在梗塞的心肌中刺激干細(xì)胞分化的方法。在此方法中，能夠介導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入所述的梗塞心肌中。所述的細(xì)胞被作用在所述的梗塞心肌中表達(dá)VEGF。能夠給予引起所述干細(xì)胞從骨髓動(dòng)員到所述梗塞心肌的外周血的試劑。當(dāng)所述的VEGF在所述的梗塞心肌中表達(dá)時(shí)，所述的干細(xì)胞同時(shí)從所述骨髓被動(dòng)員到所述外周血中。
在本發(fā)明的另一方面，所述的引起干細(xì)胞從所述骨髓動(dòng)員到所述外周血的試劑選自細(xì)胞因子、趨化因子和化療試劑。優(yōu)選地，所述的試劑能夠包括包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，利用基因治療，所述細(xì)胞能被作用使其在所述梗塞心肌中表達(dá)VEGF。所述的基因治療能夠包括利用表達(dá)載體作用所述細(xì)胞使其表達(dá)VEGF，所述的表達(dá)載體能夠包括編碼VEGF的核酸。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，在所述梗塞心肌中表達(dá)VEGF的所述細(xì)胞能夠包括在介入所述梗塞心肌中之前用于再回輸?shù)捏w外培養(yǎng)的細(xì)胞。在另一方面，所述的被作用而表達(dá)VEGF的細(xì)胞能夠包括自體同源細(xì)胞，其在培養(yǎng)前收集自欲進(jìn)行治療的個(gè)體。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述的梗塞心肌能夠含有第一濃度的VEGF。所述的被作用使其表達(dá)VEGF的細(xì)胞能夠在所述缺血損傷組織中將所述VEGF的濃度從第一濃度增加到第二濃度。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述的被作用在所述梗塞心肌中表達(dá)VEGF的細(xì)胞還可進(jìn)一步被作用在所述梗塞心肌中表達(dá)SDF-1。通過介入表達(dá)載體到所述的細(xì)胞來作用所述細(xì)胞使其表達(dá)SDF-1。所述表達(dá)載體包括編碼SDF-1的核酸。
本發(fā)明的另一方面涉及在梗塞的心肌中刺激干細(xì)胞分化來促進(jìn)該梗塞心肌組織再生的方法。在此方法中，能夠?qū)⒐趋兰〕杉〖?xì)胞(skeletalmyoblast)介入到所述梗塞心肌中，所述的骨骼肌成肌細(xì)胞能夠被表達(dá)載體轉(zhuǎn)染從而在所述梗塞心肌中表達(dá)VEGF。能夠給予使干細(xì)胞從骨髓動(dòng)員到所述梗塞心肌外周血的集落刺激因子。在所述的梗塞心肌中所述VEGF被表達(dá)的同時(shí)，所述的干細(xì)胞能夠從所述骨髓中動(dòng)員到所述外周血中。所述的從所述骨髓動(dòng)員的干細(xì)胞可分化為心肌細(xì)胞。
附圖簡要說明通過閱讀本發(fā)明以下的說明并參考相關(guān)的附圖，本發(fā)明進(jìn)一步的特征對于本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域所屬的技術(shù)人員是顯而易見的

圖1(a和b)所示分別為給予鹽水或G-CSF 4周后(LAD結(jié)扎后12周)梗塞區(qū)域中BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量(a)和縮短分?jǐn)?shù)(b)。
圖2(a和b)所示為骨骼肌成肌細(xì)胞(SKMB)移植在細(xì)胞移植4周后(LAD結(jié)扎后12周)對梗塞區(qū)域中BrdU+細(xì)胞計(jì)數(shù)的作用。
圖3(a和b)所示為BrdU給藥5天后針對BrdU染色的骨髓(a)及未處理的心肌(b)的照片。
圖3c所示為通過本發(fā)明治療評價(jià)的梗塞區(qū)域中增加的BrdU+細(xì)胞。
圖4所示為顯示基質(zhì)衍生因子-1(SDF-1)表達(dá)作為心肌梗塞后的時(shí)間函數(shù)的RT-PCR的照片。
圖5(a和b)所示為經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染SDF-1表達(dá)載體的心肌成纖維細(xì)胞在移植4周后、及在心肌成纖維細(xì)胞移植后進(jìn)行或未進(jìn)行5天的G-CSF給藥，梗塞區(qū)域中BrdU+細(xì)胞數(shù)(a)和CD 117+細(xì)胞數(shù)(b)。
圖5c所示為經(jīng)SDF-1/G-CSF處理動(dòng)物CD 117+染色的照片。
圖6(a和b)所示為梗塞區(qū)域的免疫組織化學(xué)照片，其顯示LAD結(jié)扎12周后，進(jìn)行(a)SKMB或(b)VEGF-表達(dá)SKMB細(xì)胞移植后，用G-CSF進(jìn)行干細(xì)胞動(dòng)員之后的BrdU+細(xì)胞和心肌肌球蛋白表達(dá)細(xì)胞。
圖6c所示為相對于沒有VEGF過度表達(dá)的細(xì)胞治療左心室功能的改善。
圖7(a和b)所示為SKMB移植前后的血管密度(a)與左心室功能(b)的比較。
圖8所示為在直接腺病毒注射和表達(dá)VEGF-165的細(xì)胞移植后血管密度的比較。
圖9(a-f)所示分別為通過用AdLUC(a，d)、1×107pfu AdVEGF-165(b，e)轉(zhuǎn)染的1百萬SKMB，及AdVEGF-165(c，f)轉(zhuǎn)染的1百萬SKMB對所述梗塞區(qū)域周圍進(jìn)行5次等量分開注射4周后所述梗塞區(qū)域切片照片。
圖10(a和b)所示為通過1×107pfu AdVEGF-165(a)和1百萬用1×107pfu AdVEGF-165轉(zhuǎn)染的SKMB(b)進(jìn)行5次等量分開注射4周后所述梗塞區(qū)域周圍炎癥浸潤的照片。
圖11(a和b)所示為VEGF-165表達(dá)SKMB的移植對左心室(LV)功能的影響，(a)表示縮短分?jǐn)?shù)(％)，(b)指相對于鹽水對照。
實(shí)施方案的描述除非有其它定義，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解相同的含義。分子生物學(xué)術(shù)語的通?？衫斫獾亩x可參見例如Rieger et al.，Glossary of GeneticsClassical and Molecular，5thedition，Springer-VerlagNew York，1991；及Lewin，Genes V，OxfordUniversity PressNew York，1994。
本文描述了包括常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)的方法。此類技術(shù)是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員一般通曉的并在方法學(xué)文獻(xiàn)中有詳細(xì)的描述，例如，MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Vol.1-3，ed.Sambrook et al.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；及CurrentProtocols in Molecular Biology，ed.Ausubel et al.，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York，1992(定期更新)。化學(xué)合成核酸的方法例如Beaucage and Carruthers，Tetra.Letts.221859-1862，1981，及Matteucci etal.，J.Am.Chem.Soc.1033185，1981中所述。核酸的化學(xué)合成可在例如商業(yè)銷售的自動(dòng)寡核苷酸合成儀中進(jìn)行。免疫學(xué)方法(例如，抗原特異抗體的制備、免疫共沉淀及免疫印記)參見例如Current Protocols inImmunology，ed.Coligan et al.，John Wiley & Sons，New York，1991；及Methods of Immunological Analysis，ed.Masseyeff et al.，John Wiley & Sons，New York，1992所述。基因轉(zhuǎn)移和基因治療的常規(guī)方法也在本發(fā)明中采用，參見例如Gene TherapyPrinciples and Applications，ed.T.Blackenstein，Springer Verlag，1999；Gene Therapy Protocols(Methods in MolecularMedicine)，ed.P.D.Robbins，Humana Press，1997；及Retro-vectors forHuman Gene Therapy，ed.C.P.Hodgson，Springer Verlag，1996所述。
本發(fā)明涉及在缺血損傷組織中刺激干細(xì)胞分化的方法用來再生所述的缺血損傷組織。本發(fā)明的方法可用于所述缺血較長時(shí)間(即多周)后的缺血損傷組織的治療。
所述的方法包括在哺乳動(dòng)物個(gè)體中動(dòng)員多潛能干細(xì)胞遷移到缺血損傷組織中。本發(fā)明所述的多潛能干細(xì)胞可以是任何能夠被本發(fā)明所述的方法刺激從而分化為另一種細(xì)胞類型的細(xì)胞。多潛能干細(xì)胞的一個(gè)例子包括能夠分化為心肌細(xì)胞的造血干細(xì)胞。
哺乳動(dòng)物個(gè)體包括任何哺乳動(dòng)物，例如人、大鼠、小鼠、貓、狗、綿羊、山羊、馬、猴子、猿、兔子、牛等等。所述哺乳動(dòng)物個(gè)體可處于任何發(fā)育階段，包括成年、青年動(dòng)物及新生兒。哺乳動(dòng)物個(gè)體還可包括胚胎發(fā)育階段的動(dòng)物。
所述的缺血損傷組織包括由血液對所述組織供應(yīng)不足引起損傷的任何組織。血液供應(yīng)動(dòng)脈的阻塞或狹窄或引流所述組織的靜脈阻塞或狹窄能夠引起血液供應(yīng)的不足。
本發(fā)明的一個(gè)方面，所述缺血損傷組織包括梗塞的心肌。本發(fā)明所述的梗塞心肌指梗塞的心肌組織、所述的梗塞的心肌組織的周圍組織(例如，周圍血管組織情況下的骨骼肌組織)、及同時(shí)包括梗塞的心肌組織和所述的梗塞的心肌組織的周圍組織。
在距缺血后較長時(shí)間的某一時(shí)間點(diǎn)上，第一數(shù)量的多潛能干細(xì)胞進(jìn)入所述的缺血損傷組織。能夠增加該第一數(shù)量的干細(xì)胞使得更多數(shù)量的干細(xì)胞進(jìn)入到所述的缺血損傷組織中。通過增加進(jìn)入所述的缺血損傷組織中的干細(xì)胞數(shù)量，由于在所述的缺血損傷組織中將會(huì)有更多數(shù)量的多潛能干細(xì)胞，其可分化為能夠進(jìn)行再定居(repopulate)(即植入)及部分或全部恢復(fù)缺血損傷組織正常功能的細(xì)胞，該缺血損傷組織能夠再生。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述的方法包括將所述的缺血損傷組織的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)從第一濃度增加到基本上高于第一濃度的第二濃度的步驟。所述的缺血損傷組織中的VEGF第一濃度為在缺血后較長的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)(即多周)的缺血損傷組織中通常發(fā)現(xiàn)的VEGF濃度。通過將缺血損傷組織中的VEGF表達(dá)從缺血后較長的一個(gè)時(shí)間的缺血損傷組織中通常發(fā)現(xiàn)的VEGF量上調(diào)，能夠增加缺血損傷組織中的VEGF的濃度。
與鹽水對照比較，所述缺血損傷組織中血管內(nèi)皮生長因子濃度的升高增加了缺血損傷組織中血管密度。所述在缺血損傷組織中表達(dá)的VEGF也能刺激干細(xì)胞分化和所述缺血損傷組織的再生。例如發(fā)現(xiàn)在梗塞心肌中表達(dá)的VEGF將動(dòng)員的干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。
本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將干細(xì)胞動(dòng)員到所述缺血損傷組織的步驟，其使所述缺血損傷組織外周血中多潛能干細(xì)胞的濃度(即數(shù)量)從第一濃度增加到基本上高于第一濃度的第二濃度的步驟。所述的干細(xì)胞的第一濃度可以為在缺血后較長的一個(gè)時(shí)間(即多周)的外周血中通常發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞濃度。只要所述的缺血損傷組織中的VEGF濃度增加的同時(shí)所述的外周血中的干細(xì)胞濃度也增加，所述的外周血中干細(xì)胞濃度就能在所述的缺血損傷組織中的VEGF濃度上調(diào)前或后增加。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述的方法包括誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞歸巢到缺血損傷組織中的步驟。通過將所述的缺血損傷組織中的SDF-1蛋白濃度從第一濃度增加到基本高于第一濃度的第二濃度來使多潛能干細(xì)胞歸巢到所述的缺血損傷組織中。所述SDF-1蛋白的第一濃度可以為在缺血(如心肌梗塞)后較長的一個(gè)時(shí)間(即多周)的缺血損傷組織(如梗塞的心肌)中通常發(fā)現(xiàn)的SDF-1蛋白濃度。所述的SDF-1蛋白的第二濃度基本上高于所述的SDF-1蛋白的第一濃度。
通過將SDF-1蛋白的表達(dá)從距心肌梗塞后較長時(shí)間點(diǎn)的缺血損傷組織中通常表達(dá)的SDF-1蛋白量上調(diào)，能夠增加SDF-1蛋白的濃度。所述的缺血損傷組織中的VEGF濃度、外周血中干細(xì)胞濃度增加的同時(shí)，所述缺血損傷組織中的SDF-1濃度也增加。
VEGF根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)在缺血損傷組織中的VEGF為血管內(nèi)皮生長因子家族成員之一，其可誘導(dǎo)新的側(cè)枝血管(collateral blood vessels)的生長。VEGF為特異性促血管生長因子，其具有血管通透性并幾乎無例外地作用在內(nèi)皮細(xì)胞上。
在缺血損傷組織中表達(dá)的VEGF可以是VEGF基因的表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明使用的優(yōu)選的VEGF包括VEGF-1(也稱VEGF-A)及其它結(jié)構(gòu)同源的VEGF類，例如VEGF-2(VEGF-C)、VEGF-3(VEGF-B)、VEGF-D、VEGF-E及胎盤生長因子。已知的VEGF-1異構(gòu)體包括例如121、138、162、165、182、189及206個(gè)氨基酸。這些異構(gòu)體分別確定為VEGF-121、VEGF-165、VEGF-162、VEGF-182、VEGF-189及VEGF-206。這些異構(gòu)體的促有絲分裂和肝素結(jié)合活性是不同的。本發(fā)明使用的優(yōu)選的VEGF-1異構(gòu)體為VEGF-165。沒有列出的VEGF-1的其它異構(gòu)體和VEGF其它的同源物也可用于本發(fā)明。
本發(fā)明的VEGF可以與上述的VEGF之一具有氨基酸序列同一性。本發(fā)明的VEGF也可以是上述VEGF之一的變體，例如VEGF的片段、類似物和衍生物。這種變體包括例如，由天然VEGF基因(即編碼自然發(fā)生的哺乳動(dòng)物VEGF的自然發(fā)生的核酸)的自然發(fā)生的等位基因變體編碼的多肽，天然VEGF基因的可選擇拼接形式編碼的多肽，天然VEGF基因的同源物編碼的多肽，以及VEGF基因的非自然發(fā)生的變體編碼的多肽。
VEGF變體具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸不同于天然VEGF的肽序列。這種變體的所述肽序列具有天然VEGF的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、添加或取代的特征。氨基酸的插入優(yōu)選為約1-4個(gè)連續(xù)的氨基酸的插入，而缺失優(yōu)選為約1-10個(gè)連續(xù)氨基酸的缺失。根據(jù)本發(fā)明的變體VEGF基本上保持天然VEGF的功能活性。優(yōu)選的VEGF蛋白變體可由表達(dá)本發(fā)明的具有沉默或保守變化特征的核酸分子來產(chǎn)生。
對應(yīng)一個(gè)或多個(gè)特定基序和/或功能域或人工序列大小的VEGF片段也屬于本發(fā)明的范圍?？赏ㄟ^篩選編碼此肽的核酸的對應(yīng)片段重組產(chǎn)生的肽來獲得VEGF的分離的肽基部分。此外，通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)例如，常規(guī)Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學(xué)來化學(xué)合成片段。
VEGF的變體也可包括VEGF的重組形式。除VEGF外，本發(fā)明優(yōu)選的重組多肽由與編碼哺乳動(dòng)物VEGF基因的核酸序列有至少85％序列同一性的核酸來編碼。
VEGF變體可以包括組成性表達(dá)天然VEGF的功能活性的蛋白的激動(dòng)劑形式。其它VEGF變體可包括由例如改變蛋白酶靶序列的突變而引起的抗蛋白裂解的變體。通過檢測變體的VEGF功能活性可容易地檢測肽的氨基酸序列改變是否能夠產(chǎn)生具有VEGF的一個(gè)或多個(gè)功能活性的變體。
VEGF核酸本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及編碼VEGF的核酸分子及編碼哺乳動(dòng)物VEGF的非天然的核酸。這種核酸分子可以是RNA或DNA(例如，cDNA、基因組DNA及合成DNA)形式。所述DNA可以是雙鏈或單鏈，及如果是單鏈可以是編碼(有義)鏈或非編碼(反義)鏈。
本發(fā)明的其它核酸分子為天然VEGF基因的變體，例如編碼天然VEGF的片段、類似物及衍生物的那些天然VEGF基因的變體。這些變體可以是例如，VEGF基因的自然發(fā)生的等位基因變體、天然VEGF基因同源物、或天然VEGF基因的非自然發(fā)生的變體。這些變體的核苷酸序列與天然VEGF基因的不同之處在于具有一個(gè)或多個(gè)不同的堿基。例如，這種變體的核酸序列具有天然VEGF基因的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、添加或取代的特征。核酸的插入優(yōu)選為約1-10個(gè)連續(xù)的核苷酸的插入，而缺失優(yōu)選為約1-30個(gè)連續(xù)氨基酸的缺失。
在其它的應(yīng)用中，表現(xiàn)結(jié)構(gòu)本質(zhì)變化的變體VEGF可由不引起所編碼多肽的保守改變的核苷酸取代來產(chǎn)生。這種核苷酸取代的例子為引起(a)多肽骨架結(jié)構(gòu)改變；(b)多肽電荷或疏水性改變；或(c)氨基酸側(cè)鏈大小變化的取代。通常希望產(chǎn)生蛋白質(zhì)特性最大變化的核苷酸取代為引起密碼子非保守性改變的取代?？赡芤鸬鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)主要變化的密碼子改變的例子為引起(a)親水性殘基(例如，絲氨酸或蘇氨酸)由(或被)疏水性殘基(例如，亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸氨酸或丙氨酸)所取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸由(或被)其它任意殘基取代；(c)具有正電側(cè)鏈的殘基(例如，賴氨酸、精氨酸或組氨酸)由(或被)負(fù)電殘基(例如，谷氨酸或天冬氨酸)所取代；或(d)具有側(cè)鏈的殘基(例如，苯丙氨酸)由(或被)沒有側(cè)鏈的殘基(例如，丙氨酸)取代的密碼子。
本發(fā)明的VEGF基因的自然發(fā)生的等位基因的變體為分離自哺乳動(dòng)物組織的核酸，其與天然VEGF基因具有至少75％的序列同一性并編碼與天然VEGF具有結(jié)構(gòu)相似性的多肽。本發(fā)明中的天然VEGF同源物為分離自與天然基因具有至少75％的序列同一性的其它物種的核酸，其編碼與天然VEGF具有結(jié)構(gòu)相似性的多肽?？伤褜す埠?或?qū)Ｓ械暮怂釘?shù)據(jù)庫來確定與天然VEGF基因具有較高百分比序列同一性的其它核酸分子。
非自然發(fā)生的VEGF變體為自然界中沒有出現(xiàn)的核酸(例如，由人工制造的)，其與天然VEGF基因具有至少75％的序列同一性，并編碼與天然VEGF具有結(jié)構(gòu)相似性的多肽。非自然發(fā)生的VEGF基因變體的例子為編碼天然VEGF片段的那些變體、或在嚴(yán)格條件下與天然VEGF基因雜交或與天然VEGF基因互補(bǔ)的那些變體、與天然VEGF基因或天然VEGF基因互補(bǔ)序列共有至少65％序列同一性的那些變體、以及編碼VEGF的那些變體。
本發(fā)明中的編碼VEGF片段的核酸為編碼天然VEGF殘基的那些核酸。編碼或與編碼天然VEGF片段的核酸雜交的較短的寡核苷酸能夠用作探針、引物或反義分子。編碼或與編碼天然VEGF片段的核酸雜交的較長的多聚核苷酸也能夠用于本發(fā)明的多個(gè)方面。編碼天然VEGF片段的核酸可通過對全長天然VEGF基因或其變體的酶切(例如，使用限制性內(nèi)切酶)或化學(xué)降解來獲得。
在嚴(yán)格條件下與上述核酸中的一種雜交的核酸也可用于本發(fā)明。例如，此核酸可以是在較低嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件、或較高的嚴(yán)格條件下與上述核酸中的一種雜交的核酸。
編碼VEGF融合蛋白的核酸分子也可用于本發(fā)明。此種核酸可通過制備當(dāng)其被介入到適合的靶細(xì)胞中時(shí)能表達(dá)VEGF融合蛋白的構(gòu)建(例如，表達(dá)載體)來獲得。例如，此種構(gòu)建能夠通過將融合在框架內(nèi)的編碼VEGF蛋白的第一多聚核苷酸與編碼另一種蛋白的第二多聚核苷酸相連接，使得該構(gòu)建在適合的表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)產(chǎn)生一種融合蛋白來制備此構(gòu)建。
本發(fā)明的寡核苷酸可以為單鏈或雙鏈的DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修飾體。可在堿基部分、糖部分或磷酸骨架對此寡核苷酸進(jìn)行修飾，例如改進(jìn)該分子的穩(wěn)定性、雜交等等。本發(fā)明的寡核苷酸可另外含有其它的附加的基團(tuán)，諸如肽(例如，用于在體靶向靶細(xì)胞受體)或促進(jìn)跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的試劑。為此，該寡核苷酸應(yīng)連接到另外的分子上，例如肽、雜交促發(fā)交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)劑、雜交促發(fā)裂解劑等等。
VEGF表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的另一方面，可通過向靶細(xì)胞介入增加VEGF表達(dá)的試劑來增加缺血損傷組織中VEGF的表達(dá)。所述靶細(xì)胞可包括缺血損傷組織中的細(xì)胞或用于再回輸?shù)捏w外處理(ex vivo)的細(xì)胞，其在所述試劑誘導(dǎo)后被移植到所述的缺血損傷組織中。
所述的用于再回輸?shù)捏w外處理細(xì)胞可以是與所述的細(xì)胞欲移植的組織生物匹配的任意細(xì)胞。這些細(xì)胞優(yōu)選從欲治療的個(gè)體中獲得(即自體同源細(xì)胞)并在移植前進(jìn)行培養(yǎng)。為增加用于移植的細(xì)胞的生物匹配性并最小化排斥的可能性，因此優(yōu)選自體同源細(xì)胞。
當(dāng)所述的缺血損傷組織包括梗塞的心肌時(shí)，所述的移植到所述梗塞心肌的細(xì)胞能夠?yàn)槔?，自體同源細(xì)胞、培養(yǎng)的骨骼肌成肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及骨髓來源細(xì)胞。用于移植到梗塞心肌的優(yōu)選細(xì)胞為骨骼肌成肌細(xì)胞。成肌細(xì)胞保持骨骼肌的再生潛能，在應(yīng)激時(shí)能夠增殖和分化為肌管，最終形成具有收縮能力的肌纖維。移植進(jìn)入心肌的成肌細(xì)胞進(jìn)行肌管的形成，從細(xì)胞周期中撤出，并保持活力。功能研究表明移植成肌細(xì)胞到所述的心肌后可改善區(qū)域的收縮性和順應(yīng)性。
在肌纖維的基膜下可容易獲得骨骼肌成肌細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)增該細(xì)胞系，并隨后移植到梗塞的心肌中。例如，在鼠類個(gè)體中，可從該個(gè)體的后肢獲得骨骼肌成肌細(xì)胞，培養(yǎng)并隨后移植到該個(gè)體梗塞的心肌中。
所述的被介入到靶細(xì)胞來增加VEGF表達(dá)的試劑包括天然和合成的VEGF核酸，其被連接到能夠介入并在所述細(xì)胞中復(fù)制的重組核酸構(gòu)建(通常為DNA構(gòu)建)中。此構(gòu)建優(yōu)選包括能夠在給定的靶細(xì)胞中進(jìn)行多肽編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的復(fù)制系統(tǒng)和序列。
也可將其它試劑介入到靶細(xì)胞中來增加靶細(xì)胞中VEGF水平。例如，增加編碼VEGF基因轉(zhuǎn)錄的試劑；增加編碼VEGF的mRNA的翻譯的試劑，和/或那些降低編碼VEGF的mRNA的降解的試劑能夠用于增加VEGF水平。通過在該編碼VEGF基因的上游誘導(dǎo)外源性啟動(dòng)子可提高細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄率。也可使用促進(jìn)異源性基因表達(dá)的增強(qiáng)子元件。
將所述的試劑介入到靶細(xì)胞的優(yōu)選的方法包括基因治療。基因治療指用于體內(nèi)或體外在細(xì)胞中表達(dá)治療產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的基因治療可用于體內(nèi)體外在靶細(xì)胞中表達(dá)VEGF。
基因治療的一種方法使用含有編碼VEGF的核苷酸載體?！拜d體”(有時(shí)指基因傳輸或基因轉(zhuǎn)移“載體”)指包括體內(nèi)或體外欲傳輸?shù)桨屑?xì)胞的多聚核苷酸的大分子或分子復(fù)合物。所述的欲傳輸?shù)亩嗑酆塑账峥梢园ɑ蛑委熤懈信d趣的編碼序列。載體包括，例如，能夠介導(dǎo)多聚核苷酸釋放到靶細(xì)胞的病毒載體(諸如腺病毒(Ad)、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)及逆轉(zhuǎn)錄病毒)、脂質(zhì)體及其它含有脂質(zhì)的絡(luò)合物、以及其它大分子絡(luò)合物。
載體還可包括進(jìn)一步調(diào)節(jié)基因釋放和/或基因表達(dá)的其它成分或功能物，或另外對靶細(xì)胞提供有益特性的物質(zhì)。這些其它的成分包括例如，影響對細(xì)胞結(jié)合或靶定的成分(包括介導(dǎo)細(xì)胞類型或組織特異結(jié)合的成分)；影響細(xì)胞對載體核酸攝取的成分；在攝取后影響細(xì)胞中多聚核苷酸定位的成分(例如介導(dǎo)核定位試劑)；及影響多聚核苷酸表達(dá)的成分。此成分還可包括標(biāo)志，例如可檢測和/或選擇性標(biāo)志，其可用于檢測或選擇已經(jīng)攝取并表達(dá)由載體傳輸?shù)暮怂岬募?xì)胞。此成分以載體的天然特征來提供(例如具有調(diào)節(jié)結(jié)合和攝取的成分和功能物的某種病毒載體的使用)，或能夠修飾載體來提供此功能物。
選擇性標(biāo)志能夠是陽性、陰性或雙功能性的。陽性選擇性標(biāo)志能對攜帶此標(biāo)志的細(xì)胞進(jìn)行選擇，而陰性選擇性標(biāo)志可對攜帶此標(biāo)志的細(xì)胞進(jìn)行選擇性排除。已有多種此類標(biāo)志基因，包括雙功能(即陽性/陰性)標(biāo)志的描述(參見例如，Lupton，S.，WO 92/08796，May 29，1992公布；及Lupton，S.，WO 94/28143，Dec.8，1994公布)。此標(biāo)志基因可提供控制的附加方法，其在治療方案中具有優(yōu)越性。此載體的大多數(shù)是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的且是常規(guī)可獲得的。
本發(fā)明使用的載體包括能夠釋放本發(fā)明的核酸到靶細(xì)胞中的病毒載體、脂質(zhì)為基礎(chǔ)的載體及其它載體。此載體可以是靶向載體，特別是優(yōu)選結(jié)合到所述靶細(xì)胞(例如心肌細(xì)胞)的靶向載體。本發(fā)明使用的優(yōu)選的病毒載體為對靶細(xì)胞低毒性并以組織或細(xì)胞特異性方式誘導(dǎo)治療性作用量的VEGF的產(chǎn)生的載體。
目前優(yōu)選的病毒載體衍生自腺病毒(Ad)或腺病毒相關(guān)病毒(AAV)?？墒褂萌撕头侨瞬《据d體但優(yōu)選的重組病毒載體在人中復(fù)制缺陷(replication-defective)。當(dāng)載體為腺病毒時(shí)，優(yōu)選包括多聚核酸，該多聚核酸具有可操作地連接到編碼VEGF基因的啟動(dòng)子并在人類中復(fù)制缺陷。
本發(fā)明優(yōu)選使用腺病毒載體，其原因是它們(1)在靶細(xì)胞中具有高效基因表達(dá)的能力，及(2)對較大量異源性(非病毒)DNA具有適應(yīng)性。重組腺病毒的優(yōu)選形式為“空殼(gutless)”、“高容量(high-capacity)”、或“輔助依賴性”(helper-dependent)腺病毒載體。此載體的特征為，例如，(1)所有或大部分病毒編碼序列(編碼病毒蛋白的序列)的缺失，(2)病毒DNA復(fù)制所必需的病毒反向(inverted)末端重復(fù)序列(ITRs)，(3)最多達(dá)28-32kb的“外源性”或“異源性”序列(例如，編碼SDF-1蛋白的序列)，及(4)病毒DNA包裝序列，其在病毒基因組進(jìn)入感染性衣殼的包裝中是必需的。對特異的心肌細(xì)胞，此重組腺病毒載體的優(yōu)選變體含有可操作地連接到VEGF基因的組織特異性的(例如，心肌細(xì)胞)增強(qiáng)子和啟動(dòng)子。
AAV為基礎(chǔ)的載體是有優(yōu)勢的，因其表現(xiàn)高度的靶細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并能夠以位點(diǎn)特異性方式整合到靶基因組中。重組AAV載體的使用詳見Tal，J.，J.Biomed.Sci.7279-291，2000；及Monahan and Samulski，GeneTherapy 724-30，2000所述。優(yōu)選的AAV載體包含一對AAV反向末端重復(fù)序列，其側(cè)翼連接至少一個(gè)盒(cassette)，該盒含有可操作地連接到VEGF核酸的組織(例如心肌)或細(xì)胞(例如心肌細(xì)胞)特異啟動(dòng)子。該AAV載體的DNA序列，包括所述ITRs、所述啟動(dòng)子及VEGF基因可整合到靶基因組中。
根據(jù)本發(fā)明可使用的其它病毒載體包括單純皰疹病毒(herpes simplexvirus，HSV)為基礎(chǔ)的載體。缺失了一個(gè)或多個(gè)瞬時(shí)早期基因(IE)的HSV載體是有優(yōu)勢的，因其通常是非毒性的，在靶細(xì)胞中保持類似于潛伏期的狀態(tài)，并提供有效的靶細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。重組HSV載體可連接約30kb的異源核酸。優(yōu)選HSV載體為一種(1)來自HSV I型的工程型(engineered)，(2)具有其IE基因缺失，及(3)含有可操作地連接到VEGF核酸的組織特異性(例如心肌)啟動(dòng)子。HSV擴(kuò)增子載體也可用于本發(fā)明的不同方法中。通常，HSV擴(kuò)增子載體約15kb長，具有病毒來源的復(fù)制和包裝序列。
諸如C-型反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒(lentiviruses)中的反轉(zhuǎn)錄病毒也可在本發(fā)明中使用。例如反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以鼠白血病病毒(MLV)為基礎(chǔ)。參見例如，Hu and Pathak，Pharmacol.Rev.52493-511，2000及Fong et al.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.171-60，2000。MLV-為基礎(chǔ)的載體可含有取代病毒基因的最多達(dá)8kb的異源(治療性)DNA。此異源性DNA可包含組織特異性啟動(dòng)子和SDF-1核酸。在向梗塞心肌傳輸?shù)姆椒ㄖ?，其也可編碼心肌特異受體的配體。
其它的可使用的反轉(zhuǎn)錄病毒載體為復(fù)制缺陷慢病毒為基礎(chǔ)的載體，包括人免疫缺陷病毒(HIV)為基礎(chǔ)的載體。參見例如，Vigna and Naldini，J.Gene Med.5308-316，2000及Miyoshi et al.，J.Virol.728150-8157，1998。慢病毒載體的優(yōu)勢為，其對活動(dòng)分化和非分化細(xì)胞均具有感染的能力。其對轉(zhuǎn)導(dǎo)人上皮細(xì)胞也具有高效性。
用于本發(fā)明的慢病毒載體可以是人源和非人源性(包括SIV)慢病毒。優(yōu)選的慢病毒載體包括載體繁殖所需的核酸序列以及可操作地連接到VEGF基因的組織特異性(例如，心肌)啟動(dòng)子。此前者可包括所述的病毒LTRs，引物結(jié)合位點(diǎn)，多聚鳥苷嘌呤系統(tǒng)(tract)，att位點(diǎn)，及衣殼包裝(encapsidation)位點(diǎn)。
慢病毒載體可包裝到任意適合的慢病毒衣殼中。一種顆粒蛋白被不同病毒的另一種顆粒蛋白的取代指“假型(pseudotyping)”。該載體衣殼可含有來自其它病毒的病毒外膜蛋白，包括小鼠白血病病毒(MLV)或水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)。VSV G-蛋白的使用可產(chǎn)生高載體滴度并導(dǎo)致載體病毒顆粒更高的穩(wěn)定性。
甲病毒(Alphavirus)為基礎(chǔ)的載體，例如產(chǎn)生自塞姆利基(semliki)森林病毒(SFV)和辛德畢斯(sindbis)病毒(SIN)的載體也可用于本發(fā)明中。甲病毒的使用如Lundstrom，K.，Intervirology 43247-257，2000及Perri et al.，Journal of Virology 749802-9807，2000所述。甲病毒載體通常以已知的復(fù)制子(replicon)的形式構(gòu)建。復(fù)制子可包括(1)RNA復(fù)制必需的甲病毒遺傳元件，及(2)諸如一種編碼VEGF核酸的異源核酸。在甲病毒復(fù)制子中，所述的異源核酸可操作地連接到組織特異性(例如，心肌)啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上。
重組、復(fù)制缺陷甲病毒載體是有優(yōu)勢的，因其具有高水平異源(治療)基因表達(dá)能力，并可感染較廣泛范圍的靶細(xì)胞。甲病毒復(fù)制子可通過在其病毒體表面上展現(xiàn)功能異源配體或結(jié)合功能域(其可選擇性地與表達(dá)同類結(jié)合伴侶的靶細(xì)胞結(jié)合)來被靶定在特異細(xì)胞類型(例如，心肌細(xì)胞)上。甲病毒復(fù)制子可具有潛伏期，并因此可在靶細(xì)胞中進(jìn)行長期異源核酸的表達(dá)。該復(fù)制子還可在靶細(xì)胞中表現(xiàn)瞬時(shí)的異源核酸表達(dá)。優(yōu)選的甲病毒載體或復(fù)制子為非細(xì)胞變性的。
在適用于本發(fā)明方法的多種病毒載體中可包括多于一種的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子允許載體表達(dá)多于一種的異源性基因。此外，該載體可含有編碼信號肽的序列或促進(jìn)VEGF基因產(chǎn)物從靶細(xì)胞中分泌的其它部分。
結(jié)合兩種病毒載體系統(tǒng)的優(yōu)越性，可使用雜交的病毒載體來向靶組織(例如，心肌)中傳輸VEGF核酸。構(gòu)建此雜交載體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的。此技術(shù)，例如參見Sambrook，et al.，In MolecularCloningA laboratory manual.Cold Spring Harbor，N.Y.或任何論述重組DNA技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室手冊。腺病毒衣殼中的含有AVV和腺病毒ITRs組合的雙鏈AAV基因組可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。在另一種變體中，可將AAV載體放入“空殼”、“輔助依賴性”或“高容量”腺病毒載體中。腺病毒/AAV雜交載體如Lieber et al.，J.Virol.739314-9324，1999所述。反轉(zhuǎn)錄病毒/腺病毒雜交載體如Zheng et al.，Nature Biotechnol.18176-186，2000所述。其中含有腺病毒的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組可整合到靶細(xì)胞基因組內(nèi)并對VEGF基因的穩(wěn)定表達(dá)發(fā)揮作用。
也可考慮其它促進(jìn)VEGF基因表達(dá)及載體的克隆的核酸序列元件。例如啟動(dòng)子上游增強(qiáng)子或編碼區(qū)下游終止子的存在可例如促進(jìn)表達(dá)。
本發(fā)明還考慮將組織特異的啟動(dòng)子用于細(xì)胞靶向。例如，當(dāng)所述缺血損傷組織為梗塞心肌時(shí)，左心室肌球蛋白輕鏈-2(MLC2V)或肌球蛋白重鏈(MHC)的組織特異性轉(zhuǎn)錄控制序列可融合到轉(zhuǎn)基因上，例如在腺病毒構(gòu)建中的VEGF-165基因上。通過將此組織特異性啟動(dòng)子融合到轉(zhuǎn)基因上，使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)限定在心室心肌細(xì)胞中。通過使用MLC2V或MHC啟動(dòng)子并在體傳輸轉(zhuǎn)基因，相信單獨(dú)心肌細(xì)胞(即不與所述心臟中的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞伴隨表達(dá))能夠提供充足的諸如促進(jìn)血管生成的VEGF-165的促血管形成蛋白的表達(dá)。
對于充血性心肌衰竭的基因轉(zhuǎn)移治療作用，對心肌細(xì)胞的限制性表達(dá)也是有優(yōu)勢的。通過對所述心臟的限制性表達(dá)，可避免非心肌組織中血管形成的潛在有害作用。此外，對于心臟中的細(xì)胞，由于該細(xì)胞不進(jìn)行快速周轉(zhuǎn)，因此該肌細(xì)胞有可能提供最長的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，而不會(huì)如內(nèi)皮細(xì)胞那樣因細(xì)胞分裂和死亡而降低表達(dá)。內(nèi)皮細(xì)胞特異啟動(dòng)子也已用于此目的。
除病毒載體為基礎(chǔ)的方法外，也可使用非病毒方法將VEGF基因介入到靶細(xì)胞中。本發(fā)明使用的優(yōu)選的非病毒基因傳輸方法是利用質(zhì)粒DNA來介導(dǎo)VEGF核酸進(jìn)入細(xì)胞。質(zhì)粒為基礎(chǔ)的基因傳輸方法是本領(lǐng)域所公知的。
合成基因的轉(zhuǎn)移分子可設(shè)計(jì)為質(zhì)粒DNA的多分子集合(multimolecular aggregates)(例如，錨定可操作地連接到心肌-特異啟動(dòng)子的VEGF編碼序列)。這些集合可設(shè)計(jì)用于結(jié)合靶細(xì)胞(例如，心肌細(xì)胞)。
陽離子兩性物(包括脂多胺類(lipopolyamines)和陽離子脂質(zhì))可用于提供受體依賴的VEGF核酸轉(zhuǎn)移進(jìn)入靶細(xì)胞中(例如，心肌細(xì)胞)。此外，使用的陽離子脂質(zhì)體或陽離子脂質(zhì)可與質(zhì)粒DNA混合形成細(xì)胞轉(zhuǎn)染復(fù)合物。有陽離子脂質(zhì)制劑參與的方法參見Felgner et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.772126-139，1995和Lasic and Templeton，Adv.Drug Delivery Rev.20221-266，1996的綜述。對于基因的傳輸，也可將DNA結(jié)合到兩性陽離子肽上(Fominaya et al.，J.Gene Med.2455-464，2000)。
本發(fā)明也可使用同時(shí)包括病毒和非病毒為基礎(chǔ)成分的方法。例如，用于治療性基因傳輸?shù)腅pstein Barr病毒(EBV)為基礎(chǔ)的質(zhì)粒，如Cui et al.，Gene Therapy 81508-1513，2001所述。此外，包括將DNA/配體/多聚陽離子附加物耦合到腺病毒的方法如Curiel，D.T.，Nat.Immun.13141-164，1994所述。
編碼VEGF表達(dá)的載體能夠以注射制劑的形式傳輸?shù)桨屑?xì)胞中，如果需要，該制劑可含有諸如鹽的藥物可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明也使用其它藥物載體、制劑和劑型。
當(dāng)靶細(xì)胞包括缺血損傷組織的細(xì)胞時(shí)，在熒光鏡的指引下可使用結(jié)核菌素注射器并以足夠表達(dá)VEGF水平(其能夠有效刺激干細(xì)胞分化)的載體量直接進(jìn)行注射來傳輸所述載體。通過將該載體直接注射到缺血損傷組織中，有可能更有效地靶向該基因并將該重組載體的丟失降低到最小。
這種形式的注射能夠?qū)崿F(xiàn)所希望數(shù)量的細(xì)胞，特別是梗塞心肌的心肌細(xì)胞中的局部轉(zhuǎn)染，因此最大化基因轉(zhuǎn)移的治療效率并最小化病毒蛋白引起炎癥反應(yīng)的可能性。當(dāng)所述缺血損傷組織包括梗塞心肌時(shí)，可使用心肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，例如用來確保限于心肌細(xì)胞的表達(dá)的啟動(dòng)子。因此在這種情況下轉(zhuǎn)基因的傳輸可導(dǎo)致靶定基因在例如左心室(LV)細(xì)胞中的表達(dá)。本領(lǐng)域其它公知的技術(shù)也可用于將所述載體移植到梗塞的心肌的靶細(xì)胞中。
當(dāng)靶細(xì)胞為所培養(yǎng)的隨后將被移植到缺血損傷組織的細(xì)胞時(shí)，所述的載體可通過直接注射到培養(yǎng)液中來傳輸。轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的VEGF核酸能夠可操作地連接到任何適合的調(diào)控序列，包括心肌特異啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。通過本領(lǐng)域公知的移植技術(shù)，例如使用結(jié)核菌素注射器直接進(jìn)行冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射，來隨后將轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞移植到缺血損傷組織中。
當(dāng)所述缺血損傷組織包括梗塞心肌時(shí)，所述的靶細(xì)胞優(yōu)選為收集自欲治療個(gè)體并進(jìn)行用于再回輸?shù)捏w外培養(yǎng)的自體同源細(xì)胞。通過首先體外轉(zhuǎn)染所述靶細(xì)胞并隨后移植所述的轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞到所述梗塞心肌中，與對梗塞的心肌進(jìn)行載體的直接注射比較，可能最小化梗塞的心肌中炎癥反應(yīng)并且改善左心室功能。研究者認(rèn)為，此沒有炎癥反應(yīng)的改善結(jié)果通常與腺病毒注射有關(guān)。
在靶細(xì)胞中，本發(fā)明的VEGF可表達(dá)任意適合長度的時(shí)間，包括瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定、長期表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的VEGF核酸可以有效的劑量在適合并規(guī)定的時(shí)間長度內(nèi)表達(dá)。
有效劑量為能夠在所治療的動(dòng)物或人中產(chǎn)生醫(yī)學(xué)上所希望的治療效果的劑量。如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所公知的，任何動(dòng)物或人的劑量將依靠多種因素來決定，包括個(gè)體的大小、體表面積、年齡、欲給藥的具體組合物、性別、給藥時(shí)間和途徑、一般健康情況及其它同時(shí)給予的藥物。對本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員來講，利用以下所述的實(shí)驗(yàn)方法可容易地確定蛋白、核酸或其它小分子的特定劑量。
無論所述的VEGF表達(dá)是瞬時(shí)的還是長期的，在所述缺血損傷組織中VEGF有限制的表達(dá)的濃度是需要的，來防止血管瘤或內(nèi)皮細(xì)胞衍生血管內(nèi)腫瘤的形成。
干細(xì)胞動(dòng)員根據(jù)本發(fā)明的另一方面，能夠通過給予誘導(dǎo)干細(xì)胞動(dòng)員到外周血的試劑來增加個(gè)體的所述缺血損傷組織的外周血中干細(xì)胞的濃度。利用一些試劑可將個(gè)體干細(xì)胞動(dòng)員到外周血中來增加個(gè)體外周血的干細(xì)胞濃度。例如，為了增加哺乳動(dòng)物外周血中干細(xì)胞的數(shù)量，可對個(gè)體進(jìn)行能夠引起多潛能干細(xì)胞從骨髓動(dòng)員到外周血的試劑的給藥。一些這種試劑是公知的并包括細(xì)胞因子(諸如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨嗜細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-7、IL-3、IL-12、干細(xì)胞因子(SCF)及flt-3配體)，趨化因子(諸如IL-8、Mip-1α及Groβ)以及環(huán)磷酰胺(Cy)和紫杉醇(paclitaxel)的化療試劑。這些試劑在實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞動(dòng)員、干細(xì)胞動(dòng)員類型及效率的時(shí)間結(jié)構(gòu)(time frame)上有所差異。
可將動(dòng)員劑直接注射到所述的個(gè)體來進(jìn)行動(dòng)員劑的給藥。優(yōu)選地，所述的動(dòng)員劑在缺血損傷組織中VEGF表達(dá)上調(diào)后給藥。然而，所述的動(dòng)員劑也可在VEGF表達(dá)上調(diào)之前給藥。
優(yōu)選的動(dòng)員劑為集落刺激因子，例如G-CSF。在鼠類個(gè)體中G-CSF的常規(guī)劑量約為每天125μg/kg，給藥約5-10天?？稍赩EGF表達(dá)上調(diào)后給予G-CSF試劑。
可選擇地，如本領(lǐng)域公知的，可通過將特異化的干細(xì)胞(即MAPC′s)注射到外周血中來增加外周血中干細(xì)胞的濃度。
SDF-1蛋白根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述的在缺血損傷組織中表達(dá)的SDF-1蛋白(或SDF-1多肽)可以是SDF-1基因的表達(dá)產(chǎn)物。許多或不同哺乳動(dòng)物SDF-1蛋白的氨基酸序列是已知的，包括如人、大鼠、小鼠及貓。該SDF-1蛋白可具有與上述天然的哺乳動(dòng)物SDF-1蛋白中的一種相同的氨基酸序列。
本發(fā)明的SDF-1蛋白也可以是哺乳動(dòng)物SDF-1蛋白的變體，例如哺乳動(dòng)物SDF-1蛋白的片段、類似物和衍生物。此種變體包括例如，由天然的SDF-1基因(即編碼自然發(fā)生的哺乳動(dòng)物SDF-1蛋白的自然發(fā)生的核酸)的自然發(fā)生的等位基因變體編碼的多肽，由天然SDF-1基因可選擇的拼接形式編碼的多肽，由天然SDF-1基因同源序列編碼的多肽，及由天然SDF-1基因非自然發(fā)生的變體編碼的多肽。
SDF-1蛋白變體與天然SDF-1蛋白比較其肽序列中有一個(gè)或多個(gè)不同的氨基酸。此變體的肽序列具有SDF-1蛋白的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、添加、或取代的特征。氨基酸插入優(yōu)選為約1-4個(gè)連續(xù)(比鄰)氨基酸，缺失優(yōu)選為約1-10連續(xù)氨基酸。變體SDF-1蛋白基本上保持了天然SDF-1蛋白的功能活性。優(yōu)選的SDF-1蛋白變體通過本發(fā)明中的以沉默或保守的改變?yōu)樘卣鞯暮怂岱肿拥谋磉_(dá)來產(chǎn)生。
對應(yīng)一個(gè)或更多基序的和/或功能域、或?qū)?yīng)任意序列大小的SDF-1蛋白片段屬于本發(fā)明的范圍。可通過篩選編碼此肽的核酸的對應(yīng)片段重組產(chǎn)生的肽來獲得SDF-1蛋白的分離的肽基部分。此外，可利用本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的技術(shù)來化學(xué)合成片段，例如常規(guī)的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學(xué)。例如，本發(fā)明的SDF-1蛋白可任意地分為沒有片段重疊的所希望的長度，或優(yōu)選分為所希望長度的重疊片段?？芍亟M產(chǎn)生所述的片段并檢測鑒定那些具有天然SDF-1蛋白激動(dòng)劑功能的肽基片段。
SDF-1蛋白的變體還能包括SDF-1蛋白的重組形式。除SDF-1蛋白外，本發(fā)明優(yōu)選的重組多肽由核酸編碼，該核酸與編碼哺乳動(dòng)物SDF-1蛋白基因的核酸序列至少有85％序列同一性。
SDF-1蛋白變體可包括組成性表達(dá)天然SDF-1蛋白的功能活性的蛋白的激動(dòng)劑形式。其它SDF-1蛋白變體可包括那些對蛋白降解分裂具有抗性的，例如，由于突變而改變蛋白酶作用的靶序列。肽的氨基酸序列改變是否可產(chǎn)生具有天然SDF-1蛋白的一個(gè)或多個(gè)功能活性的變體可通過檢測變體的天然SDF-1蛋白功能活性來較容易地確定。
SDF-1核酸本發(fā)明的另一方面涉及編碼SDF-1蛋白的核酸分子和編碼SDF-1蛋白的非天然的核酸。這些核酸分子可以是RNA或DNA的形式(例如，cDNA、基因組DNA及合成的DNA)。DNA可以是雙鏈或單鏈的，并且單鏈可以是編碼(有義)鏈或非編碼(反義)鏈。該編碼SDF-1蛋白的編碼序列可以與GenBank登錄號No.AF189724、GenBank登錄號No.AF209976、GenBank登錄號No.L120029及GenBank登錄號No.NM022177的核酸序列相同。作為遺傳密碼的冗余和簡并結(jié)果，其還可以是不同的編碼序列，編碼與該多聚核苷酸編碼的相同的多肽。
本發(fā)明中編碼SDF-1的其它的核酸分子為天然SDF-1的變體，例如，編碼天然SDF-1蛋白的片段、類似物及衍生物的那些核酸。此變體可以是例如自然發(fā)生的天然SDF-1基因的等位基因變體，天然SDF-1基因的同源物、或天然SDF-1基因的非自然發(fā)生的變體。這些變體與天然SDF-1基因比較，其核苷酸序列具有一個(gè)或多個(gè)堿基差異。例如，此變體的核苷酸序列具有天然SDF-1基因的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、添加、或取代的特征。核酸插入優(yōu)選為約1-10個(gè)連續(xù)(比鄰)核苷酸，缺失優(yōu)選為約1-10個(gè)連續(xù)核苷酸的缺失。
在其它應(yīng)用中，可通過核苷酸的取代(該取代不引起編碼的多肽的保守改變)來產(chǎn)生表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)的實(shí)質(zhì)性變化的變體SDF-1蛋白。此核苷酸取代的例子為引起(a)多肽骨架結(jié)構(gòu)改變；(b)多肽電荷或疏水性改變；或(c)氨基酸側(cè)鏈大小的改變的那些取代。通常希望能夠產(chǎn)生蛋白特性的最大變化的核苷酸的取代是那些引起密碼子非保守性改變的取代?？赡芤鸬鞍捉Y(jié)構(gòu)較大變化的密碼子改變的例子為引起(a)親水殘基(例如絲氨酸或蘇氨酸)由(或被)疏水殘基(例如亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸)所取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸由(或被)任何其它殘基所取代；(c)具有正電側(cè)鏈的殘基(例如賴氨酸、精氨酸或組氨酸)由(或被)負(fù)電性殘基(例如谷氨酸或天冬氨酸)所取代；或(d)具有側(cè)鏈的殘基(例如苯丙氨酸)由(或被)沒有側(cè)鏈的殘基(例如甘氨酸)所取代的那些密碼子。
本發(fā)明的天然SDF-1基因的自然發(fā)生的等位基因變體為分離自哺乳動(dòng)物組織中的核酸，其與天然SDF-1基因具有至少75％序列同一性，并編碼與天然SDF-1蛋白具有結(jié)構(gòu)相似性的多肽。本發(fā)明的天然SDF-1基因的同源序列為分離自其它種群的核酸，其與所述的天然基因具有至少75％的序列同一性，并編碼與天然SDF-1蛋白具有結(jié)構(gòu)相似性的多肽?？伤褜す埠?或?qū)Ｓ械暮怂釘?shù)據(jù)庫來確定與天然SDF-1基因具有較高百分比(例如，70％或更多)序列同一性的其它核酸分子。
非自然發(fā)生的SDF-1基因變體為自然界中沒有出現(xiàn)的核酸(例如，由人工制造)，與天然SDF-1基因具有至少75％的序列同一性，并編碼與天然SDF-1蛋白具有結(jié)構(gòu)相似性的多肽。非自然發(fā)生的SDF-1基因變體的例子為編碼天然SDF-1蛋白片段的那些變體、或在嚴(yán)格條件下與天然SDF-1基因雜交或與天然SDF-1基因互補(bǔ)的那些變體、與天然SDF-1基因或天然SDF-1基因互補(bǔ)序列具有至少65％序列同一性的那些變體、以及編碼SDF-1融合蛋白的那些變體。
本發(fā)明中的編碼天然SDF-1蛋白片段的核酸為編碼天然SDF-1蛋白殘基的那些核酸。編碼核酸(編碼天然SDF-1蛋白片段)或與之雜交的較短的寡核苷酸能夠用作探針、引物或反義分子。編碼核酸(該核酸編碼天然SDF-1蛋白片段)或與之雜交的較長的多聚核苷酸也能夠用于本發(fā)明的多個(gè)方面。編碼天然SDF-1片段的核酸可通過對全長天然SDF-1基因或其變體的酶切(例如，使用限制性內(nèi)切酶)或化學(xué)降解來獲得。
在嚴(yán)格條件下與上述核酸中的一種雜交的核酸也可用于本發(fā)明。例如，此核酸能夠是在較低的嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件、或較高的嚴(yán)格條件下與上述核酸中的一種雜交的核酸，其也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
編碼SDF-1融合蛋白的核酸分子也可用于本發(fā)明。此種核酸可通過制備當(dāng)其介入適合的靶細(xì)胞中時(shí)表達(dá)SDF-1融合蛋白的構(gòu)建(例如，表達(dá)載體)來獲得。例如，此種構(gòu)建能夠通過將融合在框架內(nèi)的編碼的SDF-1蛋白的第一多聚核苷酸與編碼另一種蛋白的第二多聚核苷酸連接來制備，使得該構(gòu)建在適合的表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)產(chǎn)生融合蛋白。
本發(fā)明的寡核苷酸可以為DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修飾體，其可為單鏈或雙鏈的。能夠?qū)Υ斯押塑账岬膲A基部分、糖部分或磷酸骨架進(jìn)行修飾，例如改進(jìn)該分子的穩(wěn)定性、雜交等等。本發(fā)明的寡核苷酸可另外含有其它的附加的基團(tuán)，諸如肽(例如，用于在體靶定靶細(xì)胞受體)，或促進(jìn)跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、雜交-促發(fā)裂解(hybridization-triggeredcleavage)的試劑。為此，該寡核苷酸應(yīng)連接到另外的分子上，例如肽、雜交促發(fā)交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)試劑、雜交促發(fā)裂解劑等等。
SDF-1表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的另一方面，通過將所述細(xì)胞介入所述缺血損傷組織中來上調(diào)所述缺血損傷組織中SDF-1的表達(dá)。將細(xì)胞介入缺血損傷組織中來上調(diào)缺血損傷組織中SDF-1蛋白的表達(dá)。例如，將骨骼肌成肌細(xì)胞移植到鼠類個(gè)體的梗塞心肌中，從骨骼肌成肌細(xì)胞移植到該心肌后約1小時(shí)到移植后不多于約7天內(nèi)，上調(diào)所述的梗塞心肌中SDF-1蛋白的表達(dá)。
能夠移植到所述缺血損傷組織中的細(xì)胞類型包括與所述欲移植細(xì)胞的組織生物匹配的任何細(xì)胞。這些細(xì)胞優(yōu)選從欲治療的個(gè)體中獲得(即自體同源細(xì)胞)并在移植前進(jìn)行培養(yǎng)。為增加用于移植的細(xì)胞的生物匹配性并最小化排斥的可能性，因此優(yōu)選自體同源細(xì)胞。
當(dāng)所述的缺血損傷組織包括梗塞心肌時(shí)，用于移植到梗塞的心肌的細(xì)胞為例如，自體同源細(xì)胞、培養(yǎng)的骨骼肌成肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及骨髓來源細(xì)胞。用于移植到所述梗塞心肌的優(yōu)選細(xì)胞為骨骼肌成肌細(xì)胞。
介入到所述缺血損傷組織來上調(diào)所述SDF-1蛋白表達(dá)的細(xì)胞能夠與介入到所述缺血損傷組織來上調(diào)所述VEGF表達(dá)的細(xì)胞相同或不同。當(dāng)通過介入所述缺血損傷組織表達(dá)所述VEGF的細(xì)胞使所述VEGF的濃度增加時(shí)，表達(dá)VEGF的細(xì)胞優(yōu)選與用于上調(diào)所述缺血損傷組織中SDF-1蛋白表達(dá)的細(xì)胞相同。例如，當(dāng)表達(dá)VEGF的轉(zhuǎn)染骨骼肌成肌細(xì)胞被移植到鼠類梗塞心肌時(shí)，其將引起所述梗塞心肌中SDF-1蛋白從所述骨骼肌成肌細(xì)胞移植入所述梗塞心肌后1小時(shí)至移植后少于約7天的瞬時(shí)表達(dá)。
在本發(fā)明的另一方面，通過向靶細(xì)胞中介入增加靶細(xì)胞中SDF-1蛋白表達(dá)的試劑可上調(diào)SDF-1蛋白的表達(dá)。所述的靶細(xì)胞包括缺血損傷組織中的細(xì)胞或用于再回輸?shù)捏w外培養(yǎng)的細(xì)胞，例如從該個(gè)體獲得的并培養(yǎng)的自體同源細(xì)胞。例如，所述用于再回輸?shù)捏w外培養(yǎng)的細(xì)胞能夠是介入所述缺血損傷組織來表達(dá)VEGF的細(xì)胞和/或介入所述缺血損傷組織來提供SDF-1的瞬時(shí)表達(dá)的細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明和以上所述，所述的試劑包括被連接到重組核酸構(gòu)建(典型的為DNA構(gòu)建)中的天然和合成的核酸，其能夠被介入并在細(xì)胞中復(fù)制。此構(gòu)建優(yōu)選包括能夠在給定的靶細(xì)胞中進(jìn)行多肽編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的復(fù)制系統(tǒng)和序列。
也能夠?qū)⑵渌噭┙槿氲桨屑?xì)胞中來增加靶組織中SDF-1蛋白水平。例如，增加編碼SDF-1蛋白基因轉(zhuǎn)錄的試劑，增加編碼SDF-1蛋白的mRNA的翻譯的試劑，和/或降低SDF-1蛋白的mRNA的降解的試劑能夠用于增加SDF-1蛋白水平。通過在該編碼SDF-1蛋白基因的上游誘導(dǎo)外源性啟動(dòng)子可實(shí)現(xiàn)增加細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄率。也可使用促進(jìn)異源性基因表達(dá)的增強(qiáng)子元件。
將所述的試劑介入到靶細(xì)胞的優(yōu)選的方法包括使用基因治療。本發(fā)明的基因治療可用于體內(nèi)體外在靶細(xì)胞中表達(dá)SDF-1蛋白。優(yōu)選的基因治療方法包括使用含有編碼SDF-1蛋白的核苷酸載體?？墒褂玫妮d體的例子包括，能夠介導(dǎo)多聚核苷酸釋放到靶細(xì)胞的病毒載體(諸如腺病毒(Ad)、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)及逆轉(zhuǎn)錄病毒)、脂質(zhì)體和其它含有脂質(zhì)的絡(luò)合物、以及其它大分子絡(luò)合物。
載體還包括進(jìn)一步調(diào)節(jié)基因釋放和/或基因表達(dá)的其它成分或功能物，或另外對靶細(xì)胞提供有益特性的物質(zhì)。這些其它的成分如上所述。
用于表達(dá)SDF-1蛋白的載體包括能夠釋放本發(fā)明的核酸到靶細(xì)胞中的病毒載體、脂質(zhì)為基礎(chǔ)的載體及其它載體。此載體可以是靶向載體，特別是優(yōu)選結(jié)合到特定細(xì)胞類型的靶向載體。本發(fā)明使用的優(yōu)選的病毒載體為對靶細(xì)胞低毒性并以組織特異性方式誘導(dǎo)治療性作用量的SDF-1蛋白的產(chǎn)生。
目前優(yōu)選的病毒載體衍生自腺病毒(Ad)或腺病毒相關(guān)病毒(AAV)?？墒褂萌撕头侨瞬《据d體但優(yōu)選的重組病毒載體在人中復(fù)制缺陷。當(dāng)載體為腺病毒時(shí)，優(yōu)選包括多聚核酸，該多聚核酸具有可操作地連接到編碼SDF-1蛋白基因的啟動(dòng)子并在人類中復(fù)制缺陷。能夠使用的包括病毒和非病毒載體的其它載體是本領(lǐng)域所述技術(shù)人員公知的并如上所述。
在適用于本發(fā)明方法的多種病毒載體中可包括多于一種的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子允許載體表達(dá)多于一種的異源性基因。此外，該載體可含有編碼信號肽的序列或促進(jìn)SDF-1基因產(chǎn)物從靶細(xì)胞中分泌的其它部分。
結(jié)合兩種病毒載體系統(tǒng)的優(yōu)越性，可使用雜交的病毒載體來向靶組織(例如，心肌)中傳輸SDF-1核酸。構(gòu)建此雜交載體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的。例如，啟動(dòng)子上游增強(qiáng)子或編碼區(qū)下游終止子的存在可例如促進(jìn)表達(dá)。
本發(fā)明的另一方面，組織特異性或藥物調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子可融合到SDF-1基因上。通過將此組織特異性啟動(dòng)子融合到腺病毒構(gòu)建中，使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)限定在特異的細(xì)胞類型(例如心室心肌細(xì)胞)中或?qū)μ囟ǖ乃幬锇l(fā)生反應(yīng)(例如四環(huán)素)。組織特異性啟動(dòng)子提供的基因表達(dá)的效率和特異性程度可使用本發(fā)明的重組腺病毒系統(tǒng)來測定。
在所述缺血損傷組織為梗塞心肌的情況下，當(dāng)在體傳輸SDF-1基因時(shí)，單獨(dú)針對心肌細(xì)胞(即不在所述心臟中的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中伴隨表達(dá))的組織特異性啟動(dòng)子的使用可提供治療性處理的SDF-1蛋白的充分表達(dá)。對心肌的限定性表達(dá)也具有關(guān)于CHF治療的基因轉(zhuǎn)移應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)。此外，由于心肌細(xì)胞不進(jìn)行快速的周轉(zhuǎn)，因此心肌細(xì)胞似乎可提供最長的轉(zhuǎn)基因表達(dá)；表達(dá)因而不會(huì)如內(nèi)皮細(xì)胞那樣因細(xì)胞分化和死亡而減少。
除病毒載體為基礎(chǔ)的方法外，非病毒方法也可用于將SDF-1基因介入到靶細(xì)胞中。本發(fā)明的優(yōu)選的非病毒基因傳輸方法是利用質(zhì)粒DNA來介導(dǎo)SDF-1核酸進(jìn)入細(xì)胞。質(zhì)粒為基礎(chǔ)的基因傳輸方法是本領(lǐng)域所公知的。
本發(fā)明也可使用同時(shí)包括病毒和非病毒為基礎(chǔ)的成分的方法。例如，用于治療性基因傳輸?shù)腅pstein Barr病毒(EBV)為基礎(chǔ)的質(zhì)粒，如Cui et al.，Gene Therapy 81508-1513，2001所述。此外，包括將DNA/配體/多陽離子附屬物結(jié)合到腺病毒的方法，如Curiel，D.T.，Nat.Immun.13141-164，1994所述。
編碼SDF-1表達(dá)的載體能夠以注射制劑的形式傳輸?shù)桨屑?xì)胞中，如果需要該制劑可含有諸如鹽的藥物可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明也可使用其它藥物載體、制劑和劑型。
在熒光鏡的指引下可使用結(jié)核菌素注射器并以使SDF-1蛋白的表達(dá)程度至能夠產(chǎn)生較高療效的載體量直接進(jìn)行注射來傳輸所述載體。通過將該載體直接注射到缺血損傷組織，有可能更有效地靶向該基因并將該重組載體的丟失降低到最小。這種形式的注射還能夠?qū)崿F(xiàn)所希望數(shù)量的細(xì)胞的局部轉(zhuǎn)染，因此最大化基因轉(zhuǎn)移的治療效率并最小化病毒蛋白引起炎癥反應(yīng)的可能性。
當(dāng)缺血損傷組織包括梗塞的心肌細(xì)胞時(shí)，可使用心肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，例如用來確保限于心肌細(xì)胞的表達(dá)的啟動(dòng)子。因此在這種情況下轉(zhuǎn)基因的傳輸可導(dǎo)致靶定基因在例如左心室細(xì)胞中的表達(dá)。本領(lǐng)域其它公知的技術(shù)也可用于將所述載體移植到梗塞的心肌的靶細(xì)胞中。
當(dāng)靶細(xì)胞為所培養(yǎng)的隨后將被移植到缺血損傷組織的細(xì)胞時(shí)，所述的載體可通過直接注射到培養(yǎng)液中來傳輸。轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的SDF-1核酸能夠可操作地被連接到任何適合的調(diào)控序列，包括心肌特異啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。
通過本領(lǐng)域公知的移植技術(shù)，例如使用結(jié)核菌素注射器直接進(jìn)行注射，來隨后將轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞移植到缺血損傷組織中。與對缺血損傷組織進(jìn)行載體的直接注射比較，通過首先進(jìn)行離體的靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染，然后將轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞移植到梗塞的心肌中，將最小化梗塞的心肌中炎癥反應(yīng)的可能性。
在靶細(xì)胞中，本發(fā)明的SDF-1核酸可表達(dá)任意長度的時(shí)間，包括瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定、長期表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的SDF-1核酸可以有效的劑量在適合并規(guī)定的時(shí)間長度內(nèi)表達(dá)。對本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員來講，利用以下所述的實(shí)驗(yàn)方法可容易地確定蛋白、核酸或其它小分子的特定劑量。
當(dāng)沒有用SDF-1蛋白編碼載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被移植到所述梗塞的心肌中時(shí)，所述的SDF-1表達(dá)可以是瞬時(shí)的?？蛇x擇地，當(dāng)利用SDF-1蛋白編碼載體對梗塞的心肌進(jìn)行轉(zhuǎn)染或?qū)嵤┝薙DF-1蛋白編碼載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被移植到該梗塞的心肌時(shí)，SDF-1蛋白表達(dá)可以是長期的。
長期SDF-1表達(dá)是有優(yōu)勢的，因其能通過諸如G-CSF或一些其它因子的動(dòng)員劑在手術(shù)或移植細(xì)胞步驟一段時(shí)間后來增加干細(xì)胞的濃度。當(dāng)G-CSF為動(dòng)員劑時(shí)，嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)會(huì)顯著增加，其可引起圍手術(shù)期的副作用，而不在多天或多周后。另外，長期或慢性的SDF-1蛋白表達(dá)上調(diào)可使產(chǎn)生多企圖的干細(xì)胞動(dòng)員。此外，慢性SDF-1蛋白表達(dá)上調(diào)不需要干細(xì)胞的動(dòng)員即可引起干細(xì)胞從外周血中長期歸巢到缺血損傷組織中。
實(shí)施例通過以下的特定實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。所給出的實(shí)施例僅是為了說明的目的而不是任何方式的對本發(fā)明范圍或內(nèi)容的限定。第一系列實(shí)施例MI8周后G-CSF對干細(xì)胞動(dòng)員的作用為了利用建立的缺血性心肌病模型，確定由G-CSF誘導(dǎo)的干細(xì)胞動(dòng)員是否能夠引起大鼠心肌再生，將MI后8周的大鼠隨機(jī)分為接受重組人G-CSF(125μg/kg/天，5天，腹腔注射)組或鹽水組。開始G-CSF治療5天后，獲得血液樣本來證明骨髓刺激，與鹽水組(11.8±4.0細(xì)胞/μl)比較，G-CSF組表現(xiàn)三倍的白血病計(jì)數(shù)(37.3±5.3細(xì)胞/μl)。在G-CSF給藥的最后一天開始給予5-溴-2′-脫氧尿苷BrdU，共14天，來標(biāo)記心肌20中的增殖細(xì)胞。
如圖1(a和b)所示，分別為梗塞區(qū)域的BrdU-陽性細(xì)胞數(shù)量(a)和縮短分?jǐn)?shù)(b)給予鹽水或G-CSF 4周后(LAD結(jié)扎后12周)。細(xì)胞以每mm2計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組n＝6-8。
LAD結(jié)扎后2個(gè)月，給予G-CSF 2不導(dǎo)致梗塞區(qū)域中(圖1a)BrdU陽性細(xì)胞的增加或有意義的心肌再生(由梗塞區(qū)域中血管形成或心肌肌球蛋白陽性細(xì)胞的缺乏來測定(數(shù)據(jù)未顯示))。LAD結(jié)扎后12周，這些動(dòng)物顯示顯著的心肌病，對照動(dòng)物的縮短分?jǐn)?shù)顯著小于10％(正常＞60％)。與結(jié)扎8周后對G-CSF的反應(yīng)缺少顯著的心肌再生的組織學(xué)證據(jù)一致，對于G-CSF沒有觀察到有意義的收縮功能的恢復(fù)(圖1b)。
干細(xì)胞動(dòng)員前SKMB移植對缺血性心肌病的作用為了驗(yàn)證在心肌梗塞的一段較長時(shí)間后對干細(xì)胞動(dòng)員反應(yīng)的心肌再生是較理想的假說，在LAD結(jié)扎8周后進(jìn)行骨骼肌成肌細(xì)胞的移植。在梗塞邊界區(qū)域內(nèi)，動(dòng)物接受了5個(gè)200,000SKMB/注射的注射。由于最初的假說是移植的SKMB可用于表達(dá)負(fù)責(zé)干細(xì)胞歸巢的基因產(chǎn)物，作為對照，用編碼熒光素酶的腺病毒來轉(zhuǎn)染SKMB。
如圖2(a和b)所示為骨骼肌成肌細(xì)胞(SKMB)移植(LAD結(jié)扎后12周)在細(xì)胞移植4周后梗塞區(qū)域內(nèi)對BrdU+細(xì)胞計(jì)數(shù)的作用。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組n＝6-8。
在沒有G-CSF存在下，將SKMB介入到梗塞心臟不能顯著增加BrdU陽性細(xì)胞在梗塞區(qū)域中的摻入。然而，SKMB移植與G-CSF聯(lián)合使用確實(shí)在4周后可顯著增加梗塞區(qū)域中BrdU陽性細(xì)胞的數(shù)量(圖2a)。此外，與單獨(dú)接受G-CSF或SKMB移植的動(dòng)物比較，接受聯(lián)合治療的動(dòng)物相對于鹽水對照組表現(xiàn)出顯著的縮短分?jǐn)?shù)的增加(圖2b)。
為了確定梗塞區(qū)域中的BrdU陽性細(xì)胞是來源于骨髓還是來自分裂的心肌的內(nèi)源性細(xì)胞，LAD結(jié)扎后8周，給予BrdU，共5天，在SKMB移植和G-CSF起始前6天開始。
如圖3a所示，BrdU標(biāo)記的骨髓(BM)顯示培養(yǎng)自多種動(dòng)物的幾乎100％的骨髓細(xì)胞標(biāo)記。圖3b顯示在未處理的心肌中，BrdU給藥5天后，沒有觀察到顯著的Brdu+細(xì)胞。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，由獨(dú)立的兩個(gè)觀察者，對每組動(dòng)物進(jìn)行一致的雙盲陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。每組n＝6-8。比例條表示25μM。這導(dǎo)致在骨髓的細(xì)胞中有標(biāo)記而心肌的細(xì)胞沒有任何Brdu的顯著標(biāo)記(17.5±2.9陽性細(xì)胞/mm2)。
如圖3c所示為本發(fā)明治療產(chǎn)生的梗塞區(qū)域中增加的BrdU+細(xì)胞。
在這些實(shí)驗(yàn)中，只有接受SKMB和G-CSF的動(dòng)物在梗塞區(qū)域內(nèi)具有顯著增加的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量。這些數(shù)據(jù)與BrdU-陽性細(xì)胞來自于骨髓并在聯(lián)合治療后歸巢于梗塞區(qū)域的觀點(diǎn)一致。該數(shù)據(jù)也支持了SKMB的移植重建了干細(xì)胞歸巢到心肌所必需的信號。
負(fù)責(zé)干細(xì)胞歸巢到梗塞組織的信號分子在SKMB移植產(chǎn)生的組織“刺激”下，循環(huán)細(xì)胞將會(huì)在MI后8周移入梗塞組織，此觀察推動(dòng)了干細(xì)胞歸巢潛在介導(dǎo)劑的評價(jià)?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)為已知的介導(dǎo)造血干細(xì)胞行走和骨髓中干細(xì)胞歸巢的因子；因此其作為干細(xì)胞移植到MI中以及響應(yīng)SKMB移植的潛在的信號分子的作用可以實(shí)現(xiàn)。
如圖4所示為以心肌梗塞后的時(shí)間為函數(shù)，顯示基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)表達(dá)的RT-PCR照片。SDF-1表達(dá)在基線沒有出現(xiàn)，在MI后1和24小時(shí)增加。在MI后24小時(shí)與7天之間SDF-1表達(dá)返回到未表達(dá)的狀態(tài)并在MI后保持30天未表達(dá)。在MI后30天(30+)進(jìn)行SKMB移植，SDF-1表達(dá)可在移植后72小時(shí)重新出現(xiàn)。
因此，通過RT-PCR，在1與24小時(shí)觀測到SDF-1表達(dá)，但在0、7或30天、LAD結(jié)扎后沒有觀測到。SKMB誘導(dǎo)SDF-1表達(dá)，并在移植后72h可觀察到，但在假手術(shù)動(dòng)物中沒有觀察到(數(shù)據(jù)未顯示)。相同樣品中的GAPDH的PCR顯示所有樣品中的cDNA是完整的(數(shù)據(jù)未顯示)。由SKMB移植引起的SDF-1表達(dá)增加可被實(shí)時(shí)PCR證實(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)時(shí)PCR顯示在組間GAPDH水平是相似的。
為評估SDF-1是否調(diào)節(jié)BrdU陽性細(xì)胞移植進(jìn)入梗塞區(qū)域，將對照心肌成纖維細(xì)胞或用SDF-1表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞移植進(jìn)入LAD結(jié)扎后4周的心肌中。10天后，為下調(diào)內(nèi)源性SDF-1表達(dá)，給予G-CSF共5天，相同的地，在G-CSF給藥最后一天開始給予BrdU共5天。
如圖5(a和b)所示為心肌成纖維細(xì)胞移植后4周梗塞區(qū)域中(a)BrdU+細(xì)胞數(shù)和(b)CD117+細(xì)胞數(shù)，該移植細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染了SDF-1表達(dá)載體，在心肌成纖維細(xì)胞移植后給予或不給予G-CSF共5天。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，由兩個(gè)獨(dú)立的觀察者，對每組動(dòng)物進(jìn)行一致的雙盲陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。每組n＝3-5。
如圖5c所示為SDF-1/G-CSF處理的動(dòng)物CD117+標(biāo)記細(xì)胞?？潭葪l表示25μM。
與足夠誘導(dǎo)干細(xì)胞歸巢到損傷心肌的SDF-1一致，在對G-CSF的反應(yīng)中，接受SDF-1表達(dá)的心肌成纖維細(xì)胞移植的心臟在整個(gè)梗塞區(qū)域表現(xiàn)出大于3倍的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量的增加。接受對照心肌成纖維細(xì)胞移植的動(dòng)物的BrdU信號與對照組沒有差異。
BrdU陽性細(xì)胞的鑒定我們通過免疫熒光來測定梗塞區(qū)域中BrdU細(xì)胞特性?？贵w標(biāo)記CD45表明，在分別對細(xì)胞移植和G-CSF給藥的反應(yīng)中＜5％的BrdU-陽性細(xì)胞為白細(xì)胞。在進(jìn)行G-CSF處理、同時(shí)未進(jìn)行或進(jìn)行SKMB或心肌成纖維細(xì)胞移植的動(dòng)物梗塞區(qū)域中沒有觀察到心肌肌球蛋白-BrdU陽性細(xì)胞。
在MI后期VEGF表達(dá)SKMB與G-CSF對新血管形成和LV功能的作用雖然在接受SKMB移植和用G-CSF刺激骨髓的聯(lián)合處理動(dòng)物中有BrdU陽性細(xì)胞數(shù)的增加，但沒有觀測到梗塞區(qū)域中有血管密度或心肌細(xì)胞數(shù)量的增加。因此，我們另外對VEGF過表達(dá)對SKMB移植和G-CSF給藥的影響進(jìn)行了研究。
如圖6(a和b)所示，梗塞區(qū)域中的免疫組織化學(xué)顯示LAD結(jié)扎12周后，用(a)SKMB細(xì)胞移植或(b)VEGF表達(dá)SKMB移植后用G-CSF進(jìn)行干細(xì)胞動(dòng)員時(shí)，BrdU+陽性細(xì)胞(開放箭頭)和心肌肌球蛋白表達(dá)細(xì)胞(閉合箭頭)。
如圖6c所示為相對于沒有處理對照組的LV功能的改善，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組n＝6-8?？潭葪l表示10μM。
MI后8周進(jìn)行VEGF-165表達(dá)SKMB細(xì)胞移植，與鹽水對照比較可產(chǎn)生梗塞區(qū)域中血管密度的增加(44.1±5.2vs.17.7±2.8血管數(shù)/mm2；分別為VEGF-165vs.生理鹽水)。此外，VEGF-165表達(dá)與利用G-CSF的干細(xì)胞動(dòng)員聯(lián)合處理可導(dǎo)致梗塞區(qū)域中心肌肌球蛋白表達(dá)細(xì)胞再生，這與心肌細(xì)胞再生一致(圖6a)。如縮短分?jǐn)?shù)檢測所示，對SKMB加入VEGF-165表達(dá)也可顯著增加LV功能(圖6b)。在VEGF-165表達(dá)SKMB移植和SKMB移植聯(lián)合G-CSF給藥的治療策略之間沒有觀察到縮短分?jǐn)?shù)的顯著差別(數(shù)據(jù)未顯示)。
方法LAD結(jié)扎所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到了動(dòng)物研究委員會(huì)(Animal Research Committee)的批準(zhǔn)，并將所有動(dòng)物飼養(yǎng)在Cleveland臨床基地的AAALAC動(dòng)物設(shè)施中。用50mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物，插管，使用壓力循環(huán)嚙齒動(dòng)物呼吸機(jī)(Kent Scientific Corp，RSP1002)以室內(nèi)空氣每分鐘80次進(jìn)行通氣。在外科顯微鏡(Leica M500)下通過左前降支(LAD)的結(jié)扎在150-175g雄性Lewis大鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生前壁MI。
2D-超生心動(dòng)圖使用與Sequoia C256(Acuson)連接的15-MHz線性陣列傳感器(lineararray transducer)，在LAD結(jié)扎后5-7天和8周，以及SKMB移植后4周，進(jìn)行2D-超生心動(dòng)圖的檢測。在每次超生心動(dòng)圖中用開他命(ketamine)(50mg/kg)對大鼠進(jìn)行輕微的鎮(zhèn)靜。對于LV容積和壁厚度的定量，我們數(shù)字記錄了從正位于乳頭肌下方的mid-LV的短軸切面(short axisview)上觀測的2D鉗(clip)和m-模式圖像，這能使在不同大鼠中得到相同解剖位置的一致的檢測。檢測由兩個(gè)雙盲的觀察者使用ProSolve脫線(offline)進(jìn)行。每只動(dòng)物的每種檢測進(jìn)行6次，從對處理手段不知情的觀察者記錄的5個(gè)中隨機(jī)選擇3個(gè)m-模式鉗。當(dāng)分析LV功能時(shí)，從M-模式記錄中計(jì)算縮短分?jǐn)?shù)?？s短分?jǐn)?shù)(％)＝(LVEDD-LVESD)/LVEDD*100，其中LVEDD左心室舒張末期容積，LVESD左心室收縮末期容積。從恰好位于乳頭肌水平下方的短軸切面測量前壁和后壁之間的距離來檢測容積。此外，在舒張末期檢測前壁厚度。
細(xì)胞的制備和傳輸從一些Lewis大鼠(Harlan Labs)的前肢中收集骨骼肌成肌細(xì)胞，放入175ml培養(yǎng)瓶(Falcon)中，并在含有10％胎牛血清、300mg/l ECGS以及抗生素青霉素、鏈霉素和吡啶羧酶(ofloxacin)的DMEM中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞到達(dá)75％融合時(shí)進(jìn)行傳代以避免分化。在細(xì)胞移植前一天，在CMV啟動(dòng)子控制下，用108pfu/ml的表達(dá)VEGF-165的復(fù)制缺陷腺病毒或熒光素酶(對照)轉(zhuǎn)染純化的成肌細(xì)胞。在移植的當(dāng)天，用胰蛋白酶收集成肌細(xì)胞，在PBS中進(jìn)行充分的清洗來去除游離的病毒顆粒，并在移植前立即進(jìn)行再生。隨后麻醉動(dòng)物，通氣并進(jìn)行外側(cè)開胸術(shù)(lateral thoracotomy)來直接觀察梗塞區(qū)域。在每只動(dòng)物的5個(gè)區(qū)域中注射約1×106個(gè)細(xì)胞。
從一些成年大鼠心臟中收集心肌成纖維細(xì)胞并以與SKMB相同的方式培養(yǎng)。將來自總RNA的SDF-1克隆至PCDNA3.1表達(dá)載體(正向-NOT-1)-AATAAGAAATGCGGCCGCATGGACGCCAAGGTCGTCGCTGTGCTGGCC；反向-(Xba-1)-TCTAGACTTGTTTAAGGCTTTGTCCAGGTACTCTTGGA)，該總RNA回收自梗塞后24小時(shí)的心臟。利用新霉素選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了SDF-1PCDNA3.1表達(dá)載體的心肌成纖維細(xì)胞。
干細(xì)胞動(dòng)員在骨骼肌成纖維細(xì)胞移植當(dāng)天，開始通過腹腔內(nèi)注射(i.p.)給予重組人G-CSF(125μg/kg)，共5天。在移植后0、5、14、及21天獲得全血細(xì)胞計(jì)數(shù)以及不同數(shù)據(jù)(Bayer，ADVIA)。為檢測細(xì)胞增殖的累計(jì)程度，在第5天進(jìn)行50mg/kg BrdU的i.p.注射，共14天，使BrdU標(biāo)記由G-CSF誘導(dǎo)的任何增殖的干細(xì)胞。
組織學(xué)分析大鼠安樂死后，在移植4周后，進(jìn)行HistoChoice(Amresco Inc.，Solon，OH)灌注固定后，收集其心臟，并垂直于LV長軸將其分割成3個(gè)等份。中間心室和頂端小片用石蠟包埋并分割成6μm厚的切片用于免疫組織化學(xué)分析。使用心肌肌球蛋白(Chemicon)、CD45(Chemicon)、因子VIII(Chemicon)、CD117(Santa Cruz Biotehnology)及BrdU(Vector labs)的單克隆抗體，并使用FITC-或生物素標(biāo)記的第二抗體。對于定量分析，對梗塞區(qū)域中的5個(gè)切片進(jìn)行陽性細(xì)胞和血管密度的分析。我們不能進(jìn)行CD117和BrdU的雙標(biāo)記，由于我們的步驟中用于檢測BrdU抗原的HCl處理可導(dǎo)致核抗原決定簇的表達(dá)，其可由三種不同的CD117抗體識(shí)別。
PCR分析作為SKMB移植后和LAD結(jié)扎后的時(shí)間函數(shù)，對分離自大鼠心臟中的總RNA進(jìn)行RT-PCR分析。用異硫氰酸胍-氯化銫方法從組織中提取總RNA。使用大鼠SDF-1特異引物(正向TTGCCAGCACAAAGACACTCC；反向CTCCAAAGCAAACCGAA TACAG，設(shè)計(jì)表達(dá)產(chǎn)物243bp，40個(gè)循環(huán))，GAPDH引物(正向CCCCTGGCCAAGGTCATCCA；反向CGGAAGGCCATGCCAGTGAG，設(shè)計(jì)表達(dá)產(chǎn)物238bp，20個(gè)循環(huán))。隨后通過實(shí)時(shí)PCR(Perkin-Elmer，ABI Prism 7700)，用SYBR-綠結(jié)合到上述PCR產(chǎn)物SDF-1(正向ATGCCCCTGCCGATTCTTTG；反向TGTTGTTGCTTTTCAGCCTTGC，設(shè)計(jì)產(chǎn)物116bp)和如上所述的GAPDH中，來驗(yàn)證梗塞和移植心臟中表達(dá)的增加。
腺病毒構(gòu)建由Gen Vec，Inc(Gaithersburg，MD)慷慨惠贈(zèng)編碼VEGF-165的腺病毒構(gòu)建。簡而言之，從美國典型培養(yǎng)收集中心(American Type CultureCollection)獲得293細(xì)胞(ATCC CRL.1573)并保持在含10％牛血清的Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)液(DMEM)中。通過在反向末端重復(fù)序列(ITR)的左側(cè)末端相鄰的唯一限制性位點(diǎn)將穿梭質(zhì)粒載體線性化來產(chǎn)生E1-、E3-腺病毒載體AdVEGF-165，并與ClaI消化的H5d1324DNA共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。兩次連續(xù)斑點(diǎn)純化后，將載體原料(stocks)在293細(xì)胞中繁殖，并通過氯化銫梯度上三個(gè)連續(xù)帶(three sequential banding)來純化。純化的病毒用含10mM Tris，pH7.8，150mM NaCl，10mM MgCl2及3％蔗糖的緩沖液來透析，并儲(chǔ)存在-80℃直到使用。由細(xì)胞肥大病毒即刻早期啟動(dòng)子來控制轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過Student t-檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。
第二系列實(shí)施例骨骼肌成肌細(xì)胞移植對左心室功能的影響檢測自體同源SKMB移植對血管密度和LV功能的影響來確定SKMB表達(dá)VEGF-165是否能夠?qū)е嘛@著的所述梗塞區(qū)域的新血管再生并改善左心室的功能。
通過LAD結(jié)扎誘導(dǎo)心肌梗塞后8周，在所述梗塞區(qū)周圍，用1百萬SKMB(n＝6)或生理鹽水(n＝7)以5次等量分開的注射進(jìn)行注射。4周后，通過超聲心動(dòng)圖對LV功能以縮短分?jǐn)?shù)進(jìn)行定量分析，并收集所述心臟。通過因子VIII的免疫組化來鑒定血管系統(tǒng)，并對全部梗塞區(qū)域的血管密度進(jìn)行定量分析。
圖7(a和b)所示為本研究的數(shù)據(jù)結(jié)果，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*P＜0.01。
該數(shù)據(jù)表明，由LAD結(jié)扎誘導(dǎo)的心肌梗塞8周后將SKMB移植到該梗塞區(qū)域周圍沒有引起所述梗塞區(qū)域的新血管再生(7a)。然而，通過在乳頭肌水平上的縮短分?jǐn)?shù)檢測表明，SKMB移植確實(shí)能夠產(chǎn)生少量(～20％)然而具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義地顯著改善LV功能(6.8±1.0％ vs.8.1±1.1％，P＜0.01)(7b)。
對細(xì)胞為基礎(chǔ)和直接腺病毒VEGF傳輸?shù)男卵茉偕磻?yīng)比較了直接病毒注射與病毒轉(zhuǎn)染SKMB移植的血管再生反應(yīng)。在每種情況下，LAD結(jié)扎誘導(dǎo)的心肌梗塞后8周，通過1×107pfu的AdVEGF-165(n＝4)，或1百萬用AdLuc(n＝3)或AdVEGF-165(n＝6)轉(zhuǎn)染的SKMB對所述梗塞區(qū)周圍進(jìn)行5次等量分開注射。利用因子VIII免疫組化鑒定血管，并通過計(jì)數(shù)正位于乳頭肌水平下方的組織切片中因子VIII標(biāo)記的血管來進(jìn)行血管密度的定量分析。
圖8顯示了所述梗塞區(qū)域中，通過直接腺病毒注射與通過表達(dá)VEGF-165的細(xì)胞移植血管密度的比較。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*P＜0.05。
無論是在接受VEGF-165的腺病毒注射還是接受VEGF-165表達(dá)SKMB移植的動(dòng)物中均觀察到顯著的血管密度增加。這兩種治療策略均沒有血管瘤形成的數(shù)量和組織學(xué)證據(jù)。與直接病毒注射比較，還觀察到采用細(xì)胞移植處理的動(dòng)物血管密度明顯增加。
圖9(a-f)所示為分別為通過1百萬用AdLUC(A，D)、1×107pfuAdVEGF-165(B，E)轉(zhuǎn)染的SKMB或1百萬用AdVEGF-165轉(zhuǎn)染的SKMB(C，F(xiàn))對所述梗塞區(qū)域周圍進(jìn)行5次等量分開注射4周后所述梗塞區(qū)域切片照片。(A-C)為H&E染色，(D-F)為因子VIII的免疫組化分析。
圖9(a-f)的照片表明，SKMB移植后的所述梗塞區(qū)域相對無血管(圖9(a和d))。通過任何形式的VEGF-165治療后的新血管再生引起的血管密度的增加是以增加的毛細(xì)血管和小動(dòng)脈數(shù)量為特征的(圖9(b，c，e和f))。
圖10(a和b)顯示通過1×107pfu AdVEGF-165(a)或1百萬用1×107pfuAdVEGF-165轉(zhuǎn)染的SKMB(b)進(jìn)行5次等量分開注射4周后所述梗塞區(qū)域周圍的代表性H&E染色切片。
治療后4周，所述動(dòng)物的用腺病毒注射的梗塞區(qū)域周圍一致性顯示炎癥浸潤(圖10a)，其未出現(xiàn)在用VEGF-165表達(dá)SKMB移植的任何動(dòng)物中(圖10b)。
細(xì)胞為基礎(chǔ)的VEGF傳輸導(dǎo)致左心室功能的改善為測定直接病毒注射或細(xì)胞為基礎(chǔ)的VEGF-165表達(dá)是否會(huì)改善LV功能，在心肌梗塞后8周，用生理鹽水、1×107pfu AdVEGF-165(n＝4)、用AdLuc(n＝3)或AdVEGF-165(n＝6)轉(zhuǎn)染的1百萬SKMB對所述梗塞區(qū)域周圍進(jìn)行5次等量分開注射。4周后通過超聲心動(dòng)圖定量分析LV功能。
圖11(a和b)顯示由縮短分?jǐn)?shù)(％)(A)或相對與生理鹽水對照(B)表示的LV功能。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*P＜0.01。
用于這些研究的所述LAD結(jié)扎模型可導(dǎo)致顯著的縮短分?jǐn)?shù)的降低。與接受編碼VEGF-165的腺病毒的直接注射的心臟比較，采用表達(dá)VEGF-165的細(xì)胞移植的心臟的LV功能明顯改善(圖11a)。此外，采用表達(dá)VEGF-165的SKMB進(jìn)行移植比單獨(dú)用SKMB移植所觀察到的LV功能改善明顯提高(圖11b)。雖然用VEGF-165編碼腺病毒直接注射可產(chǎn)生血管密度的顯著增加，但與單獨(dú)的生理鹽水注射比較，這種治療策略不能改善LV功能(圖11b)。
來自這些第二系列試驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明，腺病毒和細(xì)胞為基礎(chǔ)的VEGF-165傳輸均能誘導(dǎo)所述梗塞區(qū)域周新血管再生(與單獨(dú)的SKMB比較，血管密度分別增加50±7％和145±29％)。以細(xì)胞為基礎(chǔ)的而不是腺病毒的VEGF-165傳輸能導(dǎo)致心肌功能的顯著增強(qiáng)(與生理鹽水對照比較，縮短分?jǐn)?shù)增加69.1±8.2％和1.5±5.8％)，甚至與單獨(dú)的SKMB傳輸比較也增強(qiáng)(增加19.1±10.7％)。來自第二系列試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，細(xì)胞為基礎(chǔ)的VEGF傳輸能夠產(chǎn)生高于直接腺病毒注射的治療效果，并提示當(dāng)考慮SKMB移植時(shí)，已經(jīng)發(fā)展的腺病毒載體可作為輔助治療的潛在應(yīng)用。
這些途徑均可導(dǎo)致局部的VEGF的瞬時(shí)表達(dá)，并且本研究的所有動(dòng)物最終以1×107pfu的編碼腺病毒的VEGF處理。
兩種VEGF傳輸策略均在整個(gè)的梗塞區(qū)域中觀察到顯著的新血管再生，并且采用單獨(dú)的SKMB處理，在這些動(dòng)物中觀察到左心室功能的較少的增加。表達(dá)VEGF-165的SKMB的移植導(dǎo)致顯著的血管密度的增加，并且以縮短分?jǐn)?shù)定量，LV功能增強(qiáng)達(dá)70％。另一方面，雖然采用編碼VEGF-165的腺病毒注射產(chǎn)生所述梗塞區(qū)域中血管密度的增加，但這種治療不能改善LV功能。
利用SKMB與VEGF的共同作用得到的LV功能的協(xié)同改善的潛在機(jī)制可能與VEGF誘導(dǎo)造血干細(xì)胞(HSC)從骨髓中釋放有關(guān)。已表明，在小鼠中，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)給藥動(dòng)員CD34+造血干細(xì)胞，導(dǎo)致新細(xì)胞再生的增加。雖然兩種傳輸策略有相似的HSC釋放是可能的，但當(dāng)不出現(xiàn)通常與腺病毒注射相關(guān)的炎癥反應(yīng)(且與VEGF-165表達(dá)SKMB的移植無關(guān))時(shí)，所述進(jìn)入心肌的HSC更容易分化為心肌細(xì)胞。
方法LAD結(jié)扎所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到了動(dòng)物研究委員會(huì)(Animal Research Committee)的批準(zhǔn)，并將所有動(dòng)物飼養(yǎng)在Cleveland臨床基地的AAALAC動(dòng)物設(shè)施中。用50mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物，插管，使用壓力循環(huán)嚙齒動(dòng)物呼吸機(jī)(Kent Scientific Corp，RSP1002)以室內(nèi)空氣每分鐘80次進(jìn)行通氣。在外科顯微鏡(Leica M500)下通過左前降支(LAD)的結(jié)扎在150-175g雄性Lewis大鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生前壁MI。
2D-超生心動(dòng)圖使用與Sequoia C256(Acuson)連接的15-MHz線性陣列傳感器(lineararray transducer)，在LAD結(jié)扎后5-7天和8周，以及SKMB移植后4周，進(jìn)行2D-超生心動(dòng)圖的檢測。在每次超生心動(dòng)圖中用開他命(ketamine)(50mg/kg)對大鼠進(jìn)行輕微的鎮(zhèn)靜。對于LV容積和壁厚度的定量，我們數(shù)字記錄了從正位于乳頭肌下方的mid-LV的短軸切面(short axisview)上觀測的2D鉗(clip)和m-模式圖像，這能使在不同大鼠中得到相同解剖位置的一致的檢測。檢測由兩個(gè)雙盲的觀察者使用ProSolve脫線(offline)進(jìn)行。每只動(dòng)物的每種檢測進(jìn)行6次，從對處理手段不知情的觀察者記錄的5個(gè)中隨機(jī)選擇3個(gè)m-模式鉗。當(dāng)分析LV功能時(shí)，從M-模式記錄中計(jì)算縮短分?jǐn)?shù)?？s短分?jǐn)?shù)(％)＝(LVEDD-LVESD)/LVEDD*100，其中LVEDD左心室舒張末期容積，LVESD左心室收縮末期容積。從恰好位于乳頭肌水平下方的短軸切面測量前壁和后壁之間的距離來檢測容積。此外，在舒張末期檢測前壁厚度。
細(xì)胞的制備及細(xì)胞與病毒的傳輸從一些Lewis大鼠(Harlan Labs)的前肢中收集骨骼肌成肌細(xì)胞，放入175ml培養(yǎng)瓶(Falcon)中，并在含有10％胎牛血清、300mg/l ECGS以及抗生素青霉素、鏈霉素和吡啶羧酶(ofloxacin)的DMEM中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞到達(dá)75％融合時(shí)進(jìn)行傳代以避免分化。
在細(xì)胞移植前一天，在CMV啟動(dòng)子控制下，用1×107pfu/ml的表達(dá)VEGF-165的E1、E3缺少的復(fù)制缺陷腺病毒或熒光素酶(對照)轉(zhuǎn)染純化的成肌細(xì)胞。在移植的當(dāng)天，用胰蛋白酶收集成肌細(xì)胞，在PBS中進(jìn)行充分的清洗來去除游離的病毒顆粒，并在移植前立即進(jìn)行再生。隨后麻醉動(dòng)物，通氣并進(jìn)行外側(cè)開胸術(shù)(lateral thoracotomy)來直接觀察梗塞區(qū)域。在每只動(dòng)物的5個(gè)區(qū)域中注射約1×106個(gè)細(xì)胞。類似地，通過每次0.2×107pfu共5次的注射來實(shí)現(xiàn)對梗塞周圍的直接病毒注射。每次注射的體積為100μL。在所有的試驗(yàn)中，沿梗塞區(qū)域的周圍邊界的左側(cè)和右側(cè)分別進(jìn)行兩次注射，第五次注射位于所述梗塞區(qū)域周圍的LV尖部。
腺病毒構(gòu)建由Gen Vec，Inc(Gaithersburg，MD)慷慨惠贈(zèng)編碼VEGF-165的腺病毒構(gòu)建。簡而言之，從美國典型培養(yǎng)收集中心(American Type CultureCollection)獲得293細(xì)胞(ATCC CRL.1573)并保持在含10％牛血清的Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)液(DMEM)中。通過在反向末端重復(fù)序列(ITR)的左側(cè)末端相鄰的唯一限制性位點(diǎn)將穿梭質(zhì)粒載體線性化來產(chǎn)生引-、E3-缺失的腺病毒載體AdVEGF-165，并與ClaI消化的H5d1324DNA共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。兩次連續(xù)斑點(diǎn)純化后，將載體原料(stocks)在293細(xì)胞中繁殖，并通過氯化銫梯度上三個(gè)連續(xù)帶(three sequential banding)來純化。純化的病毒用含10mM Tris，pH7.8，150mM NaCl，10mM MgCl2及3％蔗糖的緩沖液來透析，并儲(chǔ)存在-80℃直到使用。由細(xì)胞肥大病毒即刻早期啟動(dòng)子來控制轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
組織學(xué)分析大鼠安樂死后，在移植4周后，進(jìn)行HistoChoice(Amresco Inc.，Solon，OH)灌注固定后，收集其心臟，并垂直于LV長軸將其分割成3個(gè)等份。中間心室部分用石蠟包埋并在正位于乳頭肌下方分割成6μm厚的切片用于免疫組織化學(xué)分析。使用蘇木精和伊紅染色切片用于組織學(xué)分析。為輔助血管鑒定，用因子VIII(Santa Cruz Biotehnology)的抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠第二抗體來標(biāo)記切片。這些切片用蘇木精對應(yīng)標(biāo)記。由不知曉每只動(dòng)物特性的訓(xùn)練有素的觀察者來計(jì)數(shù)每只動(dòng)物整個(gè)梗塞區(qū)域的血管。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過Student t-檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。
序列表<110>Penn，Marc<120>細(xì)胞為基礎(chǔ)的VEGF傳輸<130>CCF-6374<140>US 10/426,769<141>2003-04-30<160>8<170>Patentln version 3.1<210>1<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>載體<400>1aataagaaat gcggccgcat ggacgccaag gtcgtcgctg tgctggcc 48<210>2<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCDNA3.1載體<400>2tctagacttg tttaaggctt tgtccaggta ctcttgga 38<210>3<211>21<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>3ttgccagcac aaagacactc c 21<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>4ctccaaagca aaccgaatac ag22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>5cccctggcca aggtcatcca20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>6cggaaggcca tgccagtgag20<210>7
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>7atgcccctgc cgattctttg20<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>8tgttgttgct tttcagcctt gc 2權(quán)利要求
1.在缺血損傷組織中刺激干細(xì)胞分化的方法，所述的缺血損傷組織含有第一濃度的干細(xì)胞和第一濃度的VEGF，所述的方法包括如下步驟將所述的缺血損傷組織中的VEGF從第一濃度增加到第二濃度；及，將所述的缺血損傷組織的干細(xì)胞濃度從所述第一濃度增加到第二濃度，當(dāng)所述的缺血損傷組織中的所述VEGF濃度增加時(shí)，所述的干細(xì)胞濃度同時(shí)增加。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的增加干細(xì)胞濃度的步驟包括給予能夠引起干細(xì)胞從骨髓動(dòng)員到缺血損傷組織的外周血的試劑。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的能夠引起干細(xì)胞從骨髓動(dòng)員到外周血的試劑選自細(xì)胞因子、趨化因子和化療試劑。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的試劑包括G-CSF。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的增加干細(xì)胞數(shù)量的步驟包括注射干細(xì)胞到外周血中。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的增加缺血損傷組織中的VEGF濃度的步驟包括作用細(xì)胞使其在所述的缺血損傷組織中表達(dá)VEGF。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中使用基因治療來作用所述的細(xì)胞使其表達(dá)VEGF。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的被作用使其表達(dá)VEGF的細(xì)胞包括用于再回輸?shù)捏w外培養(yǎng)后并被介入到所述的缺血損傷組織中的細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的被作用使其表達(dá)VEGF的細(xì)胞包括自體同源細(xì)胞，其在培養(yǎng)前收集自欲進(jìn)行治療的個(gè)體。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的被作用使其表達(dá)VEGF的細(xì)胞包括所述缺血損傷組織中的細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的缺血損傷組織含有第一濃度的SDF-1，并進(jìn)一步包括在增加所述缺血損傷組織中VEGF濃度的同時(shí)將所述缺血損傷組織中的SDF-1濃度從所述的第一濃度增加到第二濃度的步驟。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中通過作用所述缺血損傷組織中的細(xì)胞使其表達(dá)SDF-1來增加所述缺血損傷組織的SDF-1濃度。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中通過向所述細(xì)胞中介入表達(dá)載體來作用所述細(xì)胞使其表達(dá)SDF-1，所述的表達(dá)載體包括編碼SDF-1的核酸。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的被作用使其表達(dá)SDF-1的細(xì)胞包括用于再回輸?shù)捏w外培養(yǎng)后并介入到所述缺血損傷組織中的細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的被作用使其表達(dá)SDF-1的細(xì)胞包括自體同源細(xì)胞，其在培養(yǎng)前收集自欲進(jìn)行治療的個(gè)體。
16.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的被作用使其表達(dá)SDF-1的細(xì)胞包括所述缺血損傷組織中的天然細(xì)胞。
17.在梗塞的心肌中刺激干細(xì)胞分化的方法，所述的方法包括如下步驟介導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入所述的梗塞心肌中，所述的細(xì)胞被作用在所述的梗塞心肌中表達(dá)VEGF；及，給予引起所述干細(xì)胞從骨髓動(dòng)員到所述梗塞心肌的外周血的試劑，當(dāng)所述的VEGF在所述的梗塞心肌中表達(dá)時(shí)，所述的干細(xì)胞同時(shí)從所述骨髓被動(dòng)員到所述外周血中。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的引起干細(xì)胞從所述骨髓動(dòng)員到所述外周血的試劑選自細(xì)胞因子、趨化因子和化療試劑。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的試劑包括G-CSF。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其中使用基因治療來作用所述的細(xì)胞使其表達(dá)VEGF。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的被作用使其表達(dá)VEGF的細(xì)胞被表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，所述的表達(dá)載體包括編碼VEGF的核酸。
22.如權(quán)利要求17所述的方法，進(jìn)一步包括在作用所述細(xì)胞使其表達(dá)VEGF之前對細(xì)胞進(jìn)行用于再回輸?shù)捏w外培養(yǎng)的步驟。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的被作用使其表達(dá)VEGF的細(xì)胞包括在培養(yǎng)前收集自欲進(jìn)行治療的個(gè)體的自體同源細(xì)胞。
24.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的梗塞心肌含有第一濃度的VEGF，所述的被作用使其表達(dá)VEGF的細(xì)胞在所述缺血損傷組織中將所述VEGF的濃度從第一濃度增加到第二濃度。
25.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的被作用在所述梗塞心肌中表達(dá)VEGF的細(xì)胞還被作用在所述缺血組織中表達(dá)SDF-1。
26.如權(quán)利要求17所述的方法，其中通過介入表達(dá)載體到所述的用于再回輸?shù)捏w外培養(yǎng)細(xì)胞來作用所述細(xì)胞使其表達(dá)SDF-1，所述表達(dá)載體包括編碼SDF-1的核酸。
27.在梗塞的心肌中刺激干細(xì)胞分化的方法，所述的方法包括如下步驟將骨骼肌成肌細(xì)胞介入到所述梗塞心肌中，所述的骨骼肌成肌細(xì)胞被在所述梗塞心肌中表達(dá)VEGF的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染；及給予使干細(xì)胞從骨髓動(dòng)員到所述梗塞心肌外周血的集落刺激因子，在所述的梗塞心肌中所述VEGF被表達(dá)的同時(shí)，所述的干細(xì)胞從所述骨髓中動(dòng)員到所述外周血中。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的從所述骨髓動(dòng)員的干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的干細(xì)胞分化促進(jìn)所述梗塞心肌中組織再生。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在缺血損傷組織中刺激干細(xì)胞分化的方法，包括增加所述缺血損傷組織中的VEGF濃度、及當(dāng)所述缺血損傷組織中的VEGF濃度增加時(shí)增加所述缺血損傷組織的干細(xì)胞濃度的步驟。
文檔編號C12N5/06GK1725954SQ200380106167
公開日2006年1月25日 申請日期2003年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月6日
發(fā)明者馬克·S·佩恩, 阿爾曼·T·阿斯卡里, 馬修·凱德羅夫斯基 申請人:克里夫蘭診所基金會(huì)