專利名稱：蛋白質(zhì)功能性的調(diào)控的制作方法
相關(guān)申請的相互參照本申請要求2002年12月31日提交的題為“調(diào)控蛋白質(zhì)功能的方法”(Process ForModulating Protein Function)的臨時申請S/N 60/437,487、2002年13月31日提交的題為“抗癌藥物”(Anti-Cancer Medicaments)的臨時申請S/N 60/437,403、2002年12月31日提交的題為“抗炎藥物”(Anti-Inflammatory Medicaments)的臨時申請S/N 60/437,415、2002年12月31日提交的題為“抗炎藥物”(Anti-InflammatoryMedicaments)的臨時申請S/N 60/437,304，和2003年4月18日提交的題為“治療神經(jīng)變性疾病或糖尿病的藥物”(Medicaments For the Treatment ofNeurodegenerative Disorders or Diabetes)的臨時申請S/N 60/463,804的優(yōu)先權(quán)。這些申請分別納入本文作為參考。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及新的鑒別作為蛋白質(zhì)活性調(diào)制劑的分子的合理方法，以及新的蛋白質(zhì)-調(diào)制劑加合物。更具體地，本發(fā)明涉及所述方法和加合物，在優(yōu)選的方式中，采用涉及開關(guān)控制配體(switch control ligand)和互補的開關(guān)控制口袋(switchcontrol pocket)之間相互作用的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變機制。
現(xiàn)有技術(shù)的描述近來基礎(chǔ)研究為生命科學(xué)研究機構(gòu)提供了大量人類遺傳編碼信息以及由這些編碼所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。在2001年報道了人類基因組的全序列(Lander，E.S.等，InitialSequencing and Analysis of the Human Genome；Nature(2001)409860；Venter，J.C.等，The Sequence of the Human Genome，Science(2001)2911304)。全球的研究機構(gòu)現(xiàn)在正在將這些遺傳序列編碼的50,000多蛋白質(zhì)進行分類，更重要的是試圖鑒別那些成為治療不足的主要人類疾病原因的蛋白質(zhì)。除了人類基因組及其蛋白質(zhì)提供的信息價值，尤其是在蛋白質(zhì)功能構(gòu)象控制區(qū)域，制藥工業(yè)用以開始開發(fā)小分子治療劑的方法和策略在用天然蛋白質(zhì)結(jié)合位點以結(jié)合小分子治療劑方面沒有顯著進展。這些天然位點通常被蛋白質(zhì)用來進行必需的細胞功能，通過結(jié)合并加工天然底物或從天然配體轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。由于這些天然位點被蛋白質(zhì)家族內(nèi)的許多其它蛋白質(zhì)廣泛使用，所以與它們相互作用的藥物通常缺乏選擇性，結(jié)果是不足以使治療窗達到最大功效。這些小分子還有副作用和毒性，無論是在臨床前發(fā)現(xiàn)、臨床試驗或以后在市場上。副作用和毒性仍是藥物開發(fā)過程中高損耗的主要原因。就蛋白質(zhì)的激酶蛋白家族而言，這些天然位點的相互作用最近已被綜述參見J.Dumas，Emerging Pharmacophores1997-2000，Expert Opinion on Therapeutic Patents(2001)11405-429；J.Dumas編，Current Topics如Medicinal Chemistry(2002)2第9期。
已知蛋白質(zhì)是柔性的，這種柔性已被報道并被用來發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)可能的柔性活性位點結(jié)合的小分子。對于此論題的綜述可參見例如Teague，Nature Reviews/DrugDiscovery，卷2，pp.527-541(2003)。也可參見Wu等，Structure，卷11，pp.399-410(2003)。然而，這些報道關(guān)注的是僅在蛋白質(zhì)天然活性位點結(jié)合蛋白質(zhì)的小分子。Peng等，Bio.Organic and Medicinal Chemistry Ltrs.，卷13，pp.3693-3699(2003)，和Schindler等，Science，卷289，p.1938(2000)描述了abl激酶的抑制劑。這些抑制劑在WO出版物No.2002/034727中被鑒別。這類抑制劑結(jié)合ATP活性位點，同時也以誘導(dǎo)激酶催化環(huán)移動的方式結(jié)合。Pargellis等，Nature Structural Biology，卷9，p.268(2002)報道的抑制劑p38α-激酶也揭示在WO出版物No.00/43384和Regan等，J Medicinal Chemistry，卷45，pp.2994-3008(2002)中。這類抑制劑還在與激酶活化環(huán)伴隨移動有關(guān)的ATP活性位點與激酶相互作用。
最近，已揭示激酶利用活化環(huán)和激酶結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)口袋來控制它們的催化活性狀態(tài)。最近已綜述參見M.Huse和J.Kuriyan，Cell(2002)109275。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及鑒別與特定的天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(例如哺乳動物尤其是人類蛋白質(zhì))相互作用以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的分子的方法，并涉及新的蛋白質(zhì)-小分子調(diào)制劑加合物。在其方法方面，本發(fā)明采用天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的特征，即蛋白質(zhì)可根據(jù)蛋白質(zhì)活性的相應(yīng)變化在體內(nèi)改變它們的構(gòu)象。例如，一種構(gòu)象的給定蛋白質(zhì)可被作為一種酶生物上調(diào)，而另一種構(gòu)象的相同蛋白質(zhì)可被生物下調(diào)。此外，本發(fā)明優(yōu)選采用天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)所利用的構(gòu)象變化機制，通過蛋白質(zhì)內(nèi)稱為“開關(guān)控制配體”和“開關(guān)控制口袋”的相互作用。
附圖簡述本專利或申請文件包含至少一張彩色圖。函索并支付必需的費用之后辦公室將提供本專利或?qū)＠暾埞_文本和彩圖的副本。


圖1是本發(fā)明所述天然產(chǎn)生的哺乳動物蛋白質(zhì)的示意圖，包括“開”和“關(guān)”開關(guān)控制口袋、瞬時可修飾的開關(guān)控制配體和活性ATP位點；圖2是圖1所示蛋白質(zhì)的示意圖，其中說明開關(guān)控制配體處于與關(guān)開關(guān)控制口袋的結(jié)合關(guān)系，從而使蛋白質(zhì)呈第一生物下調(diào)構(gòu)象；圖3與圖1類似，但說明開關(guān)控制配體處于其電荷修飾狀態(tài)，其中某些氨基酸殘基的0H基團被磷酸化；圖4與圖2類似，但該蛋白質(zhì)中的開關(guān)控制配體處于與“開”開關(guān)控制口袋的結(jié)合關(guān)系，從而使蛋白質(zhì)處于不同于圖2的第一構(gòu)象的第二生物活性構(gòu)象；圖4a是放大的圖，說明磷酸化的開關(guān)控制配體殘基和“開”開關(guān)控制口袋上的互補殘基之間的結(jié)合；圖5與圖1類似，但說明可能的小分子化合物處于與“開”和“關(guān)”開關(guān)控制口袋結(jié)合的關(guān)系；圖6是蛋白質(zhì)的示意圖，其中開關(guān)控制配體部分與“開”開關(guān)控制口袋形成了復(fù)合開關(guān)控制口袋，并有小分子與復(fù)合口袋結(jié)合關(guān)系；圖7是蛋白質(zhì)的示意圖，其中組合開關(guān)控制口袋是由“開”開關(guān)控制口袋的部分、開關(guān)控制配體序列和活性ATP位點形成的，并有小分子與組合開關(guān)控制口袋結(jié)合關(guān)系；圖8是說明處于生物上調(diào)狀態(tài)的胰島素受體激酶蛋白質(zhì)的“開”構(gòu)象的X射線晶體結(jié)構(gòu)帶狀圖(X-ray crystal structural ribbon diagram)；圖9與圖8類似，但描述處于生物下調(diào)狀態(tài)的“關(guān)”構(gòu)象的蛋白質(zhì)；圖10是abl激酶的SURFNET顯像，其中“開”開關(guān)控制口袋用藍色表示；圖11是abl激酶的GRASP顯像，其中“開”開關(guān)控制口袋用黃色圈出；圖12是abl激酶蛋白質(zhì)的帶狀圖，標出了“開”開關(guān)控制口袋的重要的氨基酸殘基；圖13是激酶蛋白質(zhì)的帶狀圖，說明組合開關(guān)控制口袋(“開”開關(guān)控制口袋/開關(guān)控制配體序列/ATP活性位點)；
圖14是p38激酶的SURFNET顯像，其中“開”開關(guān)控制口袋用藍色表示；圖15是p38激酶的GRASP顯像，其中“開”開關(guān)控制口袋用黃色圈出；圖16是p38激酶蛋白質(zhì)的帶狀圖，標出了“開”開關(guān)控制口袋的重要的氨基酸殘基；圖17是Gsk-3β激酶蛋白質(zhì)的SURFNET顯像，其中雙功能性開-關(guān)開關(guān)控制口袋用藍色表示；圖18是Gsk-3β激酶蛋白質(zhì)的GRASP顯像，其中雙功能性開-關(guān)開關(guān)控制口袋用黃色圈出；圖19是Gsk-3β激酶蛋白質(zhì)的帶狀圖，標出了組合開-關(guān)開關(guān)控制口袋的重要的氨基酸殘基；圖20是鑒定處于其未磷酸化狀態(tài)的半純化的abl激酶結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠；圖21是鑒定處于其未磷酸化狀態(tài)的純化的abl激酶蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠；圖22是半純化的abl激酶結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的色譜洗脫圖；圖23是純化的abl激酶結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的色譜洗脫圖；圖24是TEV標記剪切之前(泳道2-4)和之后(泳道5-8)鑒定abl激酶蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠；圖25是純化的abl蛋白質(zhì)的UV光譜，該蛋白質(zhì)的ATP位點結(jié)合有小分子抑制劑PD 180790；圖26是通過鎳親和層析和Q-瓊脂糖層析純化時abl構(gòu)建物5蛋白質(zhì)(abll-531，Y412F突變體)的色譜洗脫圖；圖27是純化的abl構(gòu)建物5蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠；圖28是處于其未磷酸化狀態(tài)的純化的p38-α激酶蛋白質(zhì)的色譜洗脫圖；圖29是處于其未磷酸化狀態(tài)的純化的p38-α激酶蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠；圖30是處于其磷酸化狀態(tài)的活化的Gsk3-β蛋白質(zhì)的質(zhì)譜；圖31是處于其未磷酸化狀態(tài)的未活化的Gsk3-β蛋白質(zhì)的質(zhì)譜；圖32是用抗磷酸酪氨酸抗體對磷酸化的Gsk3-β蛋白質(zhì)進行Western印跡分析染色；和圖33是用抗磷酸酪氨酸抗體對未磷酸化的Gsk3-β蛋白質(zhì)進行Western印跡分析染色。
優(yōu)選實施方案的詳細描述本發(fā)明提供了合理開發(fā)與天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(例如哺乳動物尤其是人類蛋白質(zhì))相互作用以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的新的小分子調(diào)制劑的方法。也提供了新的蛋白質(zhì)-小分子調(diào)制劑加合物。本發(fā)明優(yōu)選采用天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其具有一種構(gòu)象性質(zhì)，從而該蛋白質(zhì)可根據(jù)蛋白質(zhì)活性的相應(yīng)變化在體內(nèi)改變它們的構(gòu)象。例如，一種構(gòu)象的給定蛋白質(zhì)可作為一種酶被生物上調(diào)，而另一種構(gòu)象的相同蛋白質(zhì)可被生物下調(diào)。此外，本發(fā)明優(yōu)選采用天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)所利用的構(gòu)象變化機制，通過蛋白質(zhì)內(nèi)稱為“開關(guān)控制配體”和“開關(guān)控制口袋”的相互作用。
“開關(guān)控制配體”在這里是指天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)內(nèi)的一個區(qū)域或結(jié)構(gòu)域，其中具有一個或多個氨基酸殘基，通過生化修飾(通常是磷酸化、硫酸化、?；蜓趸?可在各個狀態(tài)之間在體內(nèi)瞬時修飾這些殘基。類似地，“開關(guān)控制口袋”是指天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)內(nèi)的許多毗鄰或不毗鄰的氨基酸殘基，并包含殘基，殘基能夠在體內(nèi)結(jié)合處于其各個狀態(tài)的開關(guān)控制配體的瞬時修飾殘基，以誘導(dǎo)或限制蛋白質(zhì)的構(gòu)象從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物活性，和/或殘基能夠結(jié)合非天然產(chǎn)生的開關(guān)控制調(diào)制劑分子以誘導(dǎo)或限制一種蛋白質(zhì)構(gòu)象從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物活性。
本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)-調(diào)制劑加合物包括具有開關(guān)控制口袋的天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)以及在所述開關(guān)控制口袋區(qū)域與蛋白質(zhì)結(jié)合的非天然產(chǎn)生的分子，所述分子可通過誘導(dǎo)或限制蛋白質(zhì)的構(gòu)象而至少部分用來調(diào)節(jié)所述蛋白質(zhì)的生物活性。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)還含有相應(yīng)的開關(guān)控制配體，所述配體在體內(nèi)與所述口袋相互作用以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)構(gòu)象和生物活性，這樣在配體-口袋的相互作用時所述蛋白質(zhì)呈第一構(gòu)象和第一生物活性，并在所述配體-口袋相互作用不存在時呈第二種不同的構(gòu)象和生物活性。
可參考圖1-4理解開關(guān)控制配體/開關(guān)控制口袋相互作用的特性。具體地，在圖1中，以示意形式說明的蛋白質(zhì)100包括″開″開關(guān)控制口袋102，和″關(guān)’開關(guān)控制口袋104，以及開關(guān)控制配體106。此外，圖示的蛋白質(zhì)還包括ATP活性位點108。在圖1的示范性蛋白質(zhì)中，配體106有三個具有側(cè)鏈OH基團110的氨基酸殘基。關(guān)口袋104含有相應(yīng)的X殘基112，開口袋102有Z殘基114。在示范性例子中，蛋白質(zhì)100將根據(jù)配體106上OH基團110的電荷狀態(tài)改變其構(gòu)象，即當OH基團未被修飾時呈現(xiàn)中性電荷，但當這些基團被磷酸化時呈現(xiàn)負電荷。
可參考圖2-4理解口袋102、104和配體106的功能。在圖2中，配體106與關(guān)口袋104操作性相互作用，從而OH基團110與X殘基112相互作用形成口袋104的一部分。這種相互作用主要是由于OH基團110和殘基112之間的氫鍵。如圖所見，這種配體/口袋相互作用使蛋白質(zhì)100呈不同于圖1所見的構(gòu)象，并與蛋白質(zhì)的關(guān)構(gòu)象或生物下調(diào)構(gòu)象相一致。
圖3說明配體106從圖2所示的關(guān)口袋相互作用構(gòu)象移開和OH基團110已被磷酸化賦予該配體負電荷的狀態(tài)。在這種狀態(tài)下，該配體具有強烈的與開口袋102相互作用的傾向，從而將蛋白質(zhì)構(gòu)象改變成開狀態(tài)或生物上調(diào)狀態(tài)(圖4)。圖4a說明配體106上的磷酸化基團與正電荷殘基114結(jié)合以獲得離子樣穩(wěn)定的鍵。注意，在圖4的開構(gòu)象中，蛋白質(zhì)構(gòu)象不同于圖2的關(guān)構(gòu)象，并存在ATP活性位點，蛋白質(zhì)具有激酶功能。
圖1-4說明蛋白質(zhì)顯示不連續(xù)的口袋102和104以及配體106的簡單狀態(tài)。然而，在許多情況下觀察到更復(fù)雜的開關(guān)控制口袋模式。圖6所示的狀態(tài)中，由配體106和例如口袋102的氨基酸殘基形成了與小分子相互作用的合適的口袋。這被稱為“復(fù)合開關(guān)控制口袋”(composite switch control pocket)，由配體106和口袋的殘基構(gòu)成，并用數(shù)字120表示。出于蛋白質(zhì)調(diào)制的目的，小分子122與口袋120相互作用。
圖7描述了更復(fù)雜的開關(guān)口袋，其中口袋包括開口袋102的殘基和ATP位點108以形成所謂的“組合開關(guān)控制口袋”(combined switch control pocket)。這種組合口袋用數(shù)字124表示，也可包含配體106的殘基。出于蛋白質(zhì)調(diào)制的目的，有合適的小分子126與口袋124結(jié)合。
應(yīng)該理解，在圖1-4所示的簡單口袋狀態(tài)中，小分子將與簡單口袋102或104相互作用，在圖6和7所示的更復(fù)雜的狀態(tài)中，相互作用口袋處于口袋120或124區(qū)域。因此，概言之，小分子“在各個開關(guān)控制口袋區(qū)域”相互作用。
圖8和9是胰島素受體激酶結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)X射線晶體學(xué)分析的帶狀圖，其中圖8說明處于其開構(gòu)象或生物上調(diào)構(gòu)象的蛋白質(zhì)，用藍色表示。在該照片中，黃色的鏈是開關(guān)控制配體序列，品紅色部分代表形成與配體序列相互作用以維持蛋白質(zhì)處于生物上調(diào)構(gòu)象的互補的開-開關(guān)控制口袋的關(guān)鍵殘基。另一方面，圖9用醒目的黃銅色表示了處于其關(guān)構(gòu)象或生物下調(diào)構(gòu)象的蛋白質(zhì)。在該圖中，再次用黃色表示開關(guān)控制序列，并用綠色表示關(guān)-開關(guān)控制口袋的關(guān)鍵殘基。同樣，開關(guān)控制配體和關(guān)-開關(guān)控制口袋之間的相互作用維持蛋白質(zhì)處于所述生物下調(diào)構(gòu)象。
再參考所述的示意圖，圖8的圖與圖4相對應(yīng)，其中配體106與開口袋102相互作用。同樣，圖9與圖2相對應(yīng)，其中配體106與口袋104相互作用。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道，一給定蛋白質(zhì)將隨時間變化在上調(diào)和下調(diào)構(gòu)象之間“轉(zhuǎn)換”，這取決于會使蛋白質(zhì)變?yōu)殚_口袋相互作用的配體106的磷酸化，或從配體會使蛋白質(zhì)變?yōu)殛P(guān)口袋相互作用構(gòu)象的磷酸基團中的剪切。因此，開關(guān)控制配體/開關(guān)控制口袋相互作用導(dǎo)致的構(gòu)象變化是性質(zhì)動態(tài)的并最終受胞內(nèi)條件控制。
還應(yīng)該理解，蛋白質(zhì)構(gòu)象的異?？蓪?dǎo)致或加重疾病。例如，如果一給定蛋白質(zhì)不幸留在關(guān)構(gòu)象或生物下調(diào)構(gòu)象，則將阻止需要活性蛋白質(zhì)的代謝過程，就可能發(fā)生延遲或不希望的副作用。同樣，如果蛋白質(zhì)不幸留在開構(gòu)象或生物上調(diào)構(gòu)象，則代謝過程可被過度促進，這也可導(dǎo)致嚴重的健康問題。
然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可開發(fā)一些小分子化合物來調(diào)制蛋白質(zhì)活性以在體內(nèi)復(fù)制或接近正常的蛋白質(zhì)活性。參考圖5，將見小分子116可與關(guān)口袋104相互作用從而抑制配體106與口袋104相互作用。在這個簡單化的假設(shè)中，蛋白質(zhì)100然后將具有較大的留在開構(gòu)象或生物上調(diào)構(gòu)象的趨勢?；蛘?，如圖所示，小分子118與開口袋102相互作用以抑制配體106與口袋102相互作用。在這種簡單的過程下，將導(dǎo)致配體106與關(guān)口袋104相互作用的較大趨勢，從而使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)為關(guān)構(gòu)象或生物下調(diào)構(gòu)象。
因此，通過分析蛋白質(zhì)以確定相互作用的開關(guān)控制配體和開關(guān)控制口袋的位置和序列，以及理解這些相互作用是如何轉(zhuǎn)換在生物上調(diào)構(gòu)象和下調(diào)構(gòu)象之間的蛋白質(zhì)，將提供可用于為設(shè)計和開發(fā)可調(diào)制蛋白質(zhì)活性的小分子化合物的有力工具。
一般來說，鑒別與特定的天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)相互作用以調(diào)制蛋白質(zhì)活性的分子的方法首先包括鑒別形成該蛋白質(zhì)的一部分的開關(guān)控制配體以及形成該蛋白質(zhì)的一部分并與配體相互作用的開關(guān)控制口袋。所述配體和口袋協(xié)同相互作用以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的構(gòu)象和生物活性，從而可在配體-口袋相互作用時使蛋白質(zhì)呈第一構(gòu)象和相應(yīng)的第一生物活性，并在配體-口袋相互作用不存在的情況下呈第二種不同的構(gòu)象和生物活性。
在下面的步驟中，提供了處于其第一和第二構(gòu)象的蛋白質(zhì)的相應(yīng)樣品，這些蛋白質(zhì)樣品用于篩選測定候選小分子。這種篩選一般包括使候選分子與至少一種樣品接觸，并鑒定哪些小分子在鑒定的開關(guān)控制口袋區(qū)域與蛋白質(zhì)結(jié)合。
本發(fā)明的方法可用于各種天然產(chǎn)生的哺乳動物(例如，人)蛋白質(zhì)，它可以是野生型共有序列蛋白質(zhì)、疾病多形體、疾病融合蛋白和/或人工構(gòu)建的變體蛋白?？墒褂玫牡鞍踪|(zhì)類型包括酶、受體和信號蛋白；更具體有激酶、磷酸酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、硫酸酯酶、轉(zhuǎn)錄因子、核激素受體、g-蛋白偶聯(lián)受體、g-蛋白、gtp酶、激素、聚合酶、以及其它包含核苷酸調(diào)節(jié)位點的蛋白質(zhì)。大多數(shù)情況下，感興趣的蛋白質(zhì)的分子量至少為15kDa，更通常大于約30kDa。
在本發(fā)明的方法中，可用許多技術(shù)來鑒別開關(guān)控制配體序列和開關(guān)控制口袋，以及確定候選小分子調(diào)制劑的上調(diào)或下調(diào)作用。一般來說，這些方法包括生物信息學(xué)分析、X射線晶體學(xué)、核磁共振(NMR)、圓二色性(CD)和親和堿基篩選。此外，所有的常規(guī)技術(shù)如定向誘變和標準生化試驗也可以輔助。
生物信息學(xué)分析無需試驗便可鑒別相關(guān)的配體和口袋。例如在一些情況下可通過使用PUBMED等現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫嚴格確定有關(guān)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)。因此，最初步驟可以是有關(guān)感興趣的蛋白質(zhì)的已知結(jié)構(gòu)查詢PUMBED，其包含序列信息。然后可進行BLAST搜索以確定含有所選最小嚴格性的其它序列(例如，至少60％)。這可揭示感興趣的點突變或多形態(tài)現(xiàn)象，以及異常融合蛋白，所有這些都可成為疾病的原因；這些還可提供深入了解鑒別造成疾病的功能或功能異常的開關(guān)控制配體序列和/或口袋。這種生物信息學(xué)分析的具體例子敘述在下面的實施例1中。
X射線晶體學(xué)技術(shù)首先需要蛋白質(zhì)表達以提供高純化的蛋白質(zhì)?？捎萌蚝铣杉夹g(shù)來化學(xué)合成蛋白質(zhì)基因，最好使用特殊的表達系統(tǒng)。可用常規(guī)技術(shù)從合成的寡核苷酸迅速合成任何基因。用軟件(Gene BuilderTM)和相關(guān)的分子生物學(xué)方法可合成任何基因。全基因分析優(yōu)于常規(guī)克隆方法，因為可迅速合成基因的密碼子最優(yōu)模式以進行最佳表達。此外，可在一個步驟而不是順序地制造復(fù)雜突變(例如許多不同突變的組合)。策略性置換限制性位點有助于根據(jù)需要快速加入其它突變。因此這種技術(shù)能在較短時間內(nèi)創(chuàng)建更多的基因構(gòu)建物。用系統(tǒng)發(fā)育分析、分子建模和結(jié)構(gòu)預(yù)測、已知表達、功能篩選數(shù)據(jù)和報道的文庫數(shù)據(jù)的組合來確定蛋白質(zhì)序列選擇，以開發(fā)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法?？捎檬惺圯d體制造表達構(gòu)建物以在桿狀病毒感染的昆蟲細胞內(nèi)表達蛋白質(zhì)。大腸桿菌(E.coli)表達系統(tǒng)可用來生產(chǎn)其它蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^加入親和標記修飾基因。還可通過產(chǎn)生缺失、點突變和蛋白質(zhì)融合來修飾基因以改進表達、幫助純化和易于結(jié)晶。
蛋白質(zhì)純化可通過氮氣氣蝕、弗氏壓碎或微流體來破裂來自表達試驗的全部細胞漿，微流化被證明是最有效的釋放可溶蛋白的方法。用機械裝置對提取物平行進行蛋白質(zhì)純化，該裝置使多個柱(包括Glu-mAb、金屬螯合物、Q-seph、S-Seph、苯基-Seph和Cibacron Blue)在標準程序下同時平行運行，然后通過SDS-PAGE分析組分。將該信息與公布的純化方法結(jié)合以迅速制定純化方案。一旦純化就可對蛋白質(zhì)進行各種生物物理學(xué)測定(動態(tài)光散射、UV吸收、MALDI-ToF、分析型凝膠過濾等)。
晶體生長和X射線衍射量分析在兩種或多種溫度下建立有或沒有配體的稀疏矩陣聚焦結(jié)晶屏幕。所得沒有配體的晶體(apo晶體)用于配體浸透試驗(ligand soakingexperiment)。基于最初結(jié)果優(yōu)化用于蛋白質(zhì)晶體的晶體生長條件。一旦得到合適的蛋白質(zhì)晶體，并可在R-AXIS IV成像平板系統(tǒng)(imaging plate system)和X-STREAM恒冷箱上對它們進行篩選以確定它們在各種深低溫保藏條件下的衍射性質(zhì)。充足衍射質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體用來收集X射線衍射數(shù)據(jù)，或被儲存在液氮中并保存以便隨后在同步加速器X射線輻射源中進行數(shù)據(jù)收集。蛋白質(zhì)晶體衍射極限是用φ主軸設(shè)定偏離90°的至少兩個衍射圖象確定的。在衍射圖象收集期間φ主軸擺動1°。用HKL-2000序列的X射線數(shù)據(jù)分析和還原軟件處理這兩個圖象。蛋白質(zhì)晶體的衍射分辨率被接受作為分辨殼(resolution shell)的較高分辨率限度，其中50％或更高的加標反射的強度為1δ或更高。
X射線衍射數(shù)據(jù)收集如果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)晶體在R-AXIS IV系統(tǒng)或同步加速器上衍射到3.0_，則是同步加速器中收集的完整數(shù)據(jù)組。完整數(shù)據(jù)組被定義為在已收集的最高分辨殼中具有所有反射的至少90％。用HKL-2000序列的X射線衍射數(shù)據(jù)處理軟件處理X射線衍射數(shù)據(jù)(還原成獨特的反射和強度)。
結(jié)構(gòu)確定使用在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)中獲得的一個或多個蛋白質(zhì)搜索模型通過分子置換(MR)確定蛋白質(zhì)-小分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。如果需要的話，采用多重同晶置換(MIR)和重原子和/或多波長反常衍射(MAD)法可促進結(jié)構(gòu)確定。如果晶體的EXAFS掃描(在沒有重原子的母液或冷凍保護劑中洗滌之后)揭示了合適的重原子信號，則對重原子浸透的晶體收集MAD同步加速器數(shù)據(jù)組。用CCP4計算機程序結(jié)晶套裝完成對重原子衍生數(shù)據(jù)組的分析。用(|FPH|-|FP|)2差異Patterson圖和(F+|-|F-|)2異常差異Patternson圖鑒別重原子位點。
高場核磁共振(NMR)光譜法可用來鑒別開關(guān)控制配體序列和口袋。已報道NMR研究可闡述蛋白質(zhì)尤其是蛋白激酶的結(jié)構(gòu)。(Wuthrich，K；“NMR of Proteins andNucleic Acids”Wiley-Interscience1986；Evans，J.N.S.，Biomolecular NmrSpectroscopy，Oxford University Press1995；Cavanagh，J.等，N.Protein NmrSpectroscopyPrincipals and Practice，Academic Press1996.；Krishna，N.R.；Berliner，L.J.Protein Nmr for the Millenium(Biological Magnetic Resonance，20)，Plenum Pub Corp2003。
在過去20年中，NMR已經(jīng)發(fā)展成探索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)與其它生物分子的相互作用以及顯示小分子-蛋白質(zhì)相互作用細節(jié)的有效技術(shù)。NMR方法是X射線結(jié)晶法的補充，這兩種方法的結(jié)合為揭示蛋白質(zhì)/小分子相互作用的性質(zhì)提供了有力手段。一種特別有利的NMR技術(shù)包括制備15N和/或13C標記的蛋白質(zhì)并分析化學(xué)位移微擾(chemical shift perturbation)，這種微擾在由蛋白質(zhì)開關(guān)控制配體序列與其各自的開關(guān)控制口袋相互作用或小分子調(diào)制劑與開關(guān)控制口袋區(qū)域相互作用而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象變化時發(fā)生。
圓二色性(CD)是一種適合研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的技術(shù)(Johnson，W.C.，Jr.；CircularDichroism Spectroscopy and the vacuum ultraviolet region；Ann.Rev.Phys.Chem.(1978)2993；Johnson，W.C.，Jr.；Protein secondary structure and CircularDichroismA practicalguide″ProteinsSttr.Func.Gen.(1990)7205；Woody，R.W.″Circular Dichroism of peptides″(第2章)The Peptides卷71985Academic Press；Berova，N.，Nakanishi，K.，Woody，R.W.，Circular DichroismPrinciples andApplications，第二版，Wiley-VCH，New York，2000；Schmid，F(xiàn).X.；T.E.Creighton編寫的Spectral methods of characterizing protein conformati on andconformational changes in Protein Structure，a practical approach，IRL Press，Oxford 1989)，據(jù)報道尤其適合研究蛋白激酶的構(gòu)象變化。(Bosca，L；Moran，F(xiàn).；Circular Dichroism analysis of ligand-induced conformational changes inprotein kinase C.Mechanism of translocation of the enzyme from the cytosolto the membranes and its implications.Biochemical J.(1993)290827；Okishio，N.；Tanaka，T.；Fukuda，R.；Nagai，M.；Differential Ligand Recognition bythe Src and Phosphatidylinositol 3-Kinase Src Homology 3DomainsCircularDichroism and Ultraviolet Resonance Raman Studies；Biochemistry(2003)42208；Deng，Z.；Roberts，D.；Wang，X.；Kemp，R.G.；Expression，characterization，and crystallization of the pyrophosphate-dependent phosphofructo-1-kinaseof Borrelia burgdorferi.Arch.Biochem.Biophys.(1999)371.326；Reed，J；Kinzel，V；Kemp，B.E.；Cheng，H.C.；Walsh，D.A.；Circular dichroic evidence for anordered sequence of ligand/binding site interactions in the catalyticreaction of the cAMP-dependent protein kinase.Biochemistry(1985)242967；Okishio，N.；Tanaka，T.；Nagai，M.；Fukuda，R.；Nagatomo，S.；Kitagawa，T.；Identification of Tyrosine Residues Involved in Ligand Recognition bythe Phosphatidylinositol 3-Kinase Src Homology 3DomainCircular Dichroismand UV Resonance Raman Studies.，Biochemistry(2001)4015797；Okishio，N.；Tanaka，T.；Fukuda，R.；Nagai，M.；Role of the Conserved Acidic ResiduesAsp21 in the Structure of Phosphatidylinositol 3-Kinase Src Homology 3 DomainCircular Dichroism and Nuclear Magnetic Resonance Studies，Biochemistry(2001)40119；Mattsson，P.T.；Lappalainen，I.；Backesjo，C.-M.；Brockmann，E.；Lauren，S.；Vihinen，M.；Smith，C.I.E.；“Six X-linked agammaglobulinemia-causing missense mutations in the Src homology 2 domain of Bruton’s tyrosinekinasephosphotyrosine-binding and circular dichroism analysis.”J.Immun.(2000)1644170；Raimbault，C.；Couthon，F(xiàn).；Vial，C.；Buchet，R.；“Effectsof pH and KCl on the conformations of creatine kinase from rabbitmuscle.Infrared，circular dichroic，and fluorescence studies.”Euro.J.Biochem.(1995)234570；Shah，J.；Shipley，G.G.；Circular dichroic studies of proteinkinase C and its interactions with calcium and lipid vesicles.Biochim.Biophys.Acta(1992)111919)。
與通過CD可觀察到的下調(diào)狀態(tài)相比，更明確的螺旋組構(gòu)和構(gòu)象移動發(fā)生在激酶活化(上調(diào))時?；陂_關(guān)控制口袋的小分子調(diào)制可導(dǎo)致優(yōu)勢構(gòu)象狀態(tài)的穩(wěn)定。小分子調(diào)制劑存在時得到的CD譜與不存在調(diào)制劑時得到的CD譜的相互性可用來確定小分子結(jié)合的性質(zhì)，并將這種結(jié)合與常規(guī)的ATP競爭性抑制劑的結(jié)合區(qū)分開。
許多生物分析方法可為小分子提供對蛋白質(zhì)的結(jié)合親和性。采用毛細管區(qū)帶電泳(CZE)的基于親和性的篩選方法可被用于候選小分子調(diào)制劑的早期篩選階段?？色@得直接確定小分子調(diào)制劑-蛋白質(zhì)相互作用的Kd(解離常數(shù))。(Heegaard，N.H.H.；Nilsson，S.；Guzman，N.A.；Affinity capillary electrophoresisimportantapplication areas and some recent developments；J.Chromatography B(1998)71529-54；Yen-Ho Chu，Y.-H.；Lees，W.J.；Stassinopoulos，A.；Walsh，C.T.；Using Affinity Capillary Electrophoresis To Determine BindingStoichiometries of Protein-Ligand Interactions，Biochemistry(1994)3310616-10621；Davis，R.G.；Anderegg R.J.；Blanchard，S.G.，Iterative size-exclusion chromatography coupled with liquid chromatographic massspectrometry to enrich and ident ify tight-binding ligand from complexmixtures，Tetrahedron(1999)5511653-1166；Shen Hu，S.；Dovichi，N.J.；Capillary Electrophoresis for the Analysis of Biopolymers；Anal.Chem.(2002)742833-2850；Honda，S.；Taga，A.；Suzuki，K.；Suzuki，S.；Kakhi，K.，Determinationof the association constant of monovalent mode protein-sugar interaction bycapillary zone eletrophoresis，J.Chromatography B(1992)597377-382；Colton，I.J.；Carbeck，J.D.；Rao，J.；Whitesides，G.M.，Affinity CapillaryElectrophoresisA physical-organic tool for studying interaction inbiomolecular recognition，Electrophoresis(1998)19367-382。
另一種基于親和性的篩選方法使用與候選蛋白質(zhì)結(jié)合的受體熒光探針(fluoroprobe)。在這種熒光探針測定法中篩選候選小分子調(diào)制劑。通過熒光探針受體熒光性的減弱可測量結(jié)合蛋白質(zhì)的化合物。該方法描述在下面的實施例1中。
本發(fā)明還提供了小分子調(diào)制劑-蛋白質(zhì)加合物。這種類型的蛋白質(zhì)以前已被定義。就調(diào)制劑而論，它們應(yīng)該具有與開關(guān)控制口袋區(qū)域內(nèi)的活性殘基互補的官能團，以使調(diào)制劑-蛋白質(zhì)的結(jié)合最大化。例如，在激酶情況下，已發(fā)現(xiàn)具有1-3個二羰基鍵的調(diào)制劑通常是有用的。當發(fā)現(xiàn)具有陽離子性質(zhì)的開關(guān)控制口袋時，小分子調(diào)制劑通常是有酸性官能團或部分，例如磺酸基、磷酸基或羧酸基。就分子量而言，優(yōu)選的調(diào)制劑的分子量通常約為120-650 Da，更優(yōu)選約為300-550 Da。如果要在全細胞環(huán)境中研究這些小分子調(diào)制劑，它們的特性應(yīng)當與很好理解的原則相一致，即優(yōu)化用于細胞穿透性的小分子調(diào)制劑(Lipinski’s Rule of 5，Advanced Drug DeliveryReviews，卷23，1-3期，pp 3-25(1997))。
本發(fā)明還提供了改變蛋白質(zhì)生物活性的方法，該方法一般包括首先提供具有開關(guān)控制口袋的天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的步驟。然后在一定條件下使這種蛋白質(zhì)與非天然產(chǎn)生的分子調(diào)制劑接觸以使調(diào)制劑在口袋區(qū)域與蛋白質(zhì)結(jié)合，以便通過誘導(dǎo)或限制蛋白質(zhì)的構(gòu)象而至少部分調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物活性。
以下實施例列出了本發(fā)明的代表性方法。然而應(yīng)該理解，這些實施例是通過說明提供的，而不應(yīng)作為對本發(fā)明總范圍的限制。
實施例1在該實施例中，說明了鑒別和/或開發(fā)小分子的技術(shù)，所述小分子將與形成天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)一部分的開關(guān)控制口袋區(qū)域相互作用，以在體內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物活性。具體地，用本發(fā)明的方法分析了已知的激酶蛋白質(zhì)家族，即abl、p38-α、Gsk-3β、胰島素受體-1、蛋白激酶B/Akt和轉(zhuǎn)化生長因子B-1受體激酶。
步驟1激酶蛋白質(zhì)內(nèi)的開關(guān)控制配體的鑒別和分類通常，如果存在足夠詳細的特征信息，便可用各自激酶的序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)鑒別激酶的開關(guān)控制配體。因此，該方法的這一步驟無需試驗便可完成。用已知的激酶數(shù)據(jù)容易鑒別瞬時可修飾的氨基酸殘基，這在這些蛋白質(zhì)被磷酸化或?；揎椀那闆r下。然后可推論出完整的開關(guān)控制配體序列的可能范圍。對激酶而言，另一個有用的因數(shù)是通常從殘基的DFG序列(文中使用單字母氨基酸編碼)開始的配體。abl激酶全長BCR-Abl序列在這里用SEQ ID NO.34表示。abl激酶和bcr-abl融合蛋白激酶的一個開關(guān)控制配體序列由以下序列構(gòu)成D381、F382、G383、L384、S385、R386、L387、M388、T389、G390、D391、T392、Y393、T394、A395、H396(配體1)(SEQ ID NO.1)。Y393在(bcr)abl活化時通過上游調(diào)節(jié)激酶或通過自發(fā)磷酸化而變?yōu)榱姿峄?，從而是瞬時修飾的殘基(Tanis等，Moleulcar and Cellular Biology(2003)233884；Brasher和Van Etten，The Journal of Biological Chemistry(2000)27535631)。開關(guān)控制配體序列開始于DFG并以H396結(jié)束。
另一種開關(guān)控制配體具有序列Myr-G2Q3Q4PSG6K7V8L9G10D11Q12R13R14P15S16L17(配體2)(SEQ ID NO.2)。對abl激酶同種型1B特異的配體2是abl蛋白質(zhì)序列的N-末端帽，尤其是位于G2(甘氨酸2)的N-末端肉豆蔻?；鶊F(Jackson和Baltimore，(1989)EMBOJournal 8449；Resh，Biochem Biophys.Acta(1999)14511)。
p38-α激酶p38-α激酶的開關(guān)控制配體序列(SEQ ID NO.3)由以下序列構(gòu)成D168、F169、G170、L171、A172、R173、H174、T175、D176、D177、E178、M179、T180、G181、Y182、V183、A184、T185、R186、W187、Y188、R189(SEQ ID NO.4)。T180和Y182在p38-α活化時通過上游調(diào)節(jié)激酶變?yōu)榱姿峄?參見Wilson等，Chemistry & Biology(1997)4423以及其中提到的參考資料)，由此是瞬時可修飾的殘基。
Gsk-3β激酶全長Gsk-3β激酶序列在這里用SEQ ID No.32表示。Gsk-3β激酶序列相應(yīng)于1GNG晶體結(jié)構(gòu)(在這里用SEQ ID NO.33表示)。Gsk-3β激酶蛋白質(zhì)的開關(guān)控制配體序列由以下序列構(gòu)成D200、F201、G202、S203、A204、K205、Q206、L207、V208、K209、G210、E211、P212、N213、V214、S215、Y216、I217、C218、S219、K220(Gsk配體1)(SEQ ID NO.5)；Y216在活化時通過上游調(diào)節(jié)激酶變?yōu)榱姿峄?Hughes等，覷EMBOJournal(1993)12803；Lesort等，Journal of Neurochemistry(1999)72576；ter Haar等，Nature Structural Biology(2001)8593以及其中提到的參考資料。
另一種開關(guān)控制配體序列是G3、R4、P5、R6、T7、T8、S9、F10、A11、E12(Gsk配體2)(SEQ ID NO.6)；S9通過上游激酶PKB/Akt的作用變?yōu)榱姿峄?Dajani等，Cell(2001)105721)Cross等，Nature(1995)378785)。S9是瞬時可修飾的殘基。
胰島素受體激酶-1全長IRK-1基因在這里用SEQ ID NO.35表示。其序列相應(yīng)于1GAG晶體結(jié)構(gòu)(在這里用SEQ ID NO.36表示)。需要注意的是，至少SEQ ID NO36中的第一個殘基不同于SEQ ID NO35。胰島素受體激酶-1的開關(guān)配體序列由以下序列構(gòu)成D1150、F1151、G1152、M1153、T1154、R1155、D1156、11157、Y1158、E1159、T1160、D1161、Y1162、Y1163、R1164、K1165、G1166、G1167、K1168、G1169、L1170(SEQIDNO.7)。Y1158、Y1162和Y1163是瞬時可修飾的殘基，并通過胰島素活化胰島素受體時變?yōu)榱姿峄?參見Hubbard等，EMBO Journal(1997)165572以及其中提到的參考資料)。
蛋白激酶B/Atk全長Atkl序列在這里用SEQ ID NO.37表示。唯一的蛋白激酶B/Akt激酶結(jié)構(gòu)域在這里用SEQ ID NO.38表示。需要注意的是，這些序列在N和C末端是不同的。此外，唯一的激酶結(jié)構(gòu)域開始于全長序列的殘基143。蛋白激酶B/Atk的開關(guān)控制配體由以下序列構(gòu)成P468、H469、F470、P471、Q472、F473、S474、Y475、S476、A477、S478(SEQ ID NO.8)。S474是瞬時可修飾的殘基，它在通過上游激酶調(diào)節(jié)蛋白活化時是磷酸化的，從而使PKB/Ptk活性比未磷酸化的PKB/Atk提高1000倍(Yang等，Molecular Cell(2002)91227以及其中提到的參考資料)。
轉(zhuǎn)化生長因子B-1受體激酶TGF-B-I受體激酶的全長序列在這里用SEQ ID NO.39表示。轉(zhuǎn)化生長因子B-1受體激酶的開關(guān)控制配體是T185、T186、S187、G188、S189、G190、S191、G192、L193、P194、L185、L196(SEQ IDNO.9)。T185、T186、S187、S189和S191是瞬時可修飾的殘基，并在通過轉(zhuǎn)化生長因子B-11受體的激酶活性活性時是被部分或全部磷酸化(Wrana等，Nature(1994)370341；Chen和Weinberg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)921565)。
步驟2開關(guān)控制口袋的鑒別和分類當鑒別開關(guān)控制配體時，可從公布的激酶數(shù)據(jù)，尤其是通過X射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)分析推論出互補的開關(guān)控制口袋。該分析中最初的步驟是鑒別可與以前鑒別的相應(yīng)的開關(guān)控制配體內(nèi)的瞬時可修飾的殘基結(jié)合的殘基。
abl激酶abl激酶(SEQ ID NO.30)的X射線晶體結(jié)構(gòu)分析揭示了可能的開關(guān)控制口袋序列，基于結(jié)構(gòu)1FPU(SEQ ID NO.10)(Schlindler等，Science(2000)2891938)和1IEP(SEQIDNO.11)(Nagar等，Cancer Research(2002)624236)。開關(guān)控制口袋序列與這種激酶以前鑒別的開關(guān)控制配體1序列互補，并具有2個堿性氨基酸的簇，它來自α-C螺旋(殘基279-293)和催化環(huán)(殘基359-368)的組合。具體的，α-C螺旋的賴氨酸285和催化環(huán)的精氨酸362形成了開關(guān)控制口袋的一部分，由于這些殘基穩(wěn)定了來自開關(guān)控制配體的瞬時修飾的(磷酸化)殘基Y393的結(jié)合。有助于開關(guān)控制口袋的其它預(yù)計的氨基酸殘基包括來自富含甘氨酸的環(huán)的殘基(殘基253-279)、N-頁(N-lobe)(殘基271)、β-5鏈(殘基313-318)、來自α-C螺旋的其它氨基酸(殘基280-290)和來自催化環(huán)的其它氨基酸(殘基359-368)。另外，預(yù)計C-頁(C-lobe)殘基401或416形成了這種口袋的基礎(chǔ)。
表1說明形成(bcr)abl激酶的配體1的開關(guān)控制口袋的蛋白質(zhì)序列的氨基酸。氨基酸殘基位置的所有參考是相對于全長蛋白質(zhì)而不是相對于從全長蛋白質(zhì)第223位開始的SEQ ID NO30。
表1
abl激酶的X射線晶體結(jié)構(gòu)分析揭示了可能的開關(guān)控制口袋序列，基于結(jié)構(gòu)10PL(SEQ ID NOS.12和13)，它與配體2互補。分析abl激酶同種型1B的X射線晶體結(jié)構(gòu)10PL揭示了這種可能的開關(guān)控制口袋(Nagar等，Cell(2003)112859)。
表2說明形成與(bcr)abl激酶配體2互補的開關(guān)控制口袋的蛋白質(zhì)序列的氨基酸。
表2SH2結(jié)構(gòu)域和C-頁螺旋開關(guān)控制口袋
p38-α激酶p38-α激酶(SEQ ID NO.31)的X射線晶體結(jié)構(gòu)分析揭示了可能的開關(guān)控制口袋，基于結(jié)構(gòu)1KV2(SEQ ID NO.14)(Pargellis，等；Nat.Sctruct，Biol.9 pp.268-272(2002)。以前鑒別的開關(guān)控制配體序列的開關(guān)控制口袋具有2個堿性氨基酸的簇，它來自α-C螺旋(殘基61-78)和催化環(huán)(殘基146-155)的組合。具體地，精氨酸67和/或精氨酸70來自α-C螺旋，精氨酸149來自催化環(huán)。有助于開關(guān)控制口袋的其它預(yù)計的氨基酸包括來自富含甘氨酸的環(huán)的殘基(殘基34-36)、來自α-C螺旋的氨基酸(殘基61-78)和來自催化環(huán)的氨基酸(殘基146-155)。另外，來自C-頁殘基197-200的氨基酸形成了這種口袋的基礎(chǔ)。
表3說明形成開關(guān)控制口袋的蛋白質(zhì)序列的氨基酸。
表3
Gsk-3β激酶gsk-3β激酶的X射線晶體結(jié)構(gòu)分析揭示了開關(guān)控制口袋，基于結(jié)構(gòu)1GNG(SEQ IDNO.15)、1H8F(SEQ ID NOS.16和17)、1109(SEQ ID NO.18)和109U(SEQ ID NOS.28和29)(Frame等，Molecular Cell，卷7，pp.1321-1327(2001)；Dajani等，Cell，卷105，pp.721-732(2001)；Dajani等，EMBO Journal，卷22，pp.494-501(2003)；和ter Haar等，Nature Structural Biology，卷8，pp.593-596(2001)。與上述鑒別的開關(guān)控制配體序列1和2相對應(yīng)的開關(guān)控制口袋具有2個堿性氨基酸的簇，它來自α-C螺旋(殘基96-104)和催化環(huán)(殘基177-186)的組合。具體地，精氨酸96來自α-C螺旋，精氨酸180來自催化環(huán)。有助于開關(guān)控制口袋的其它預(yù)計的氨基酸包括來自富含甘氨酸的環(huán)的殘基(殘基66-68)、來自α-C螺旋的氨基酸(殘基90-104)和來自催化環(huán)的氨基酸(殘基177-186)。另外，來自C-頁殘基233-235的氨基酸形成了這種口袋的基礎(chǔ)。
表4說明形成開關(guān)控制口袋的蛋白質(zhì)序列的氨基酸。
表4
胰島素受體激酶-1胰島素受體激酶-1的X射線晶體結(jié)構(gòu)分析揭示了開關(guān)控制口袋，基于結(jié)構(gòu)1GAG(SEQ ID NO19和20)和1IRK(SEQ ID NO21)(Parang等，Nat.StructuralBiology，8，p.37(2001)；Hubbard等，Nature，372，p.476(1994)。所述開關(guān)控制配體序列的開關(guān)控制口袋具有2個堿性氨基酸的簇，它來自α-C螺旋(殘基1037-1054)和催化環(huán)(殘基1127-1137)的組合。具體地，精氨酸1039來自α-C螺旋，精氨酸1131來自催化環(huán)。有助于開關(guān)控制口袋的其它預(yù)計的氨基酸包括來自富含甘氨酸的環(huán)的殘基(殘基1005-1007)、來自α-C螺旋的氨基酸(殘基1037-1054)和來自催化環(huán)的氨基酸(殘基1127-1137)。另外，來自C-頁殘基1185-1187的氨基酸形成了這種口袋的基礎(chǔ)。
表5說明形成開關(guān)控制口袋的蛋白質(zhì)序列的氨基酸。
表5
蛋白激酶B/Akt蛋白激酶B/Akt的X射線晶體結(jié)構(gòu)分析揭示了開關(guān)控制口袋，基于結(jié)構(gòu)IGZK(SEQID NO.22)、1GZO(SEQ ID NO.23)和IGZN(SEQ ID NO.24)(Yang等，Molecular Cell(2002)91227)。相應(yīng)的開關(guān)控制配體序列的開關(guān)控制口袋由來自B-螺旋(殘基185-190)、C螺旋(殘基194-204)和β-5鏈(殘基225-231)的氨基酸殘基構(gòu)成。具體地，精氨酸202來自C-螺旋。
表6說明形成蛋白激酶B/Akt的開關(guān)控制口袋的蛋白質(zhì)序列的氨基酸。
表6
轉(zhuǎn)化生長因子B-1受體激酶轉(zhuǎn)化生長因子B-I受體激酶的X射線晶體結(jié)構(gòu)分析揭示了開關(guān)控制口袋，基于結(jié)構(gòu)1B6C(SEQ ID NO.25)(Huse等，Cell(1999)96425)。開關(guān)控制口袋由來自GS-1螺旋、GS-2螺旋、N-頁殘基253-266和α-C螺旋殘基242-252的氨基酸殘基構(gòu)成。
表7說明形成TGF B-1受體激酶的開關(guān)控制口袋的蛋白質(zhì)序列的氨基酸。
表7
第二種開關(guān)控制口袋存在于TGF B-1受體激酶中。這種開關(guān)控制口袋類似于上述(bcr)abl(表1)、p38-α激酶(表3)和gsk-3β激酶(表4)口袋。雖然TGFB-1不含有明顯互補的開關(guān)控制配體與這種口袋匹配，但這種口袋在進化上是保守的，并可用于結(jié)合小分子開關(guān)控制調(diào)制劑。這種口袋是由來自富含甘氨酸的環(huán)、α-C螺旋、催化環(huán)、開關(guān)控制配體序列和C-頁的殘基構(gòu)成的。
表8說明形成這種開關(guān)控制口袋的蛋白質(zhì)序列的氨基酸表8
第三種開關(guān)控制口袋在空間上位于ATP結(jié)合口袋和α-C螺旋之間，由來自表9中所鑒別的殘基構(gòu)成。這種口袋是作為結(jié)合抑制蛋白FKBP12(SEQ ID NO.26)的“閉合形式”(closed form)的αC螺旋變形的結(jié)果提供的(參見Huse等，Molecular Cell(2001)8671)。
表9說明第三種開關(guān)控制口袋的序列。
表9
步驟3.確定開關(guān)控制配體-開關(guān)控制口袋相互作用的性質(zhì)，并鑒別小分子設(shè)計的合適基因座。
1.一般的計算方法。開關(guān)控制口袋和開關(guān)控制口袋/配體相互作用的計算機輔助設(shè)示意圖用SurfNet的改進形式(Laskowsi，R.A，J.Mol.Graph.，1995，13，323；PASS；G.Patrick Brady，G.P.Jr.；Stouten，P.F.W.，J.Computer-Aided Mol.Des.2000，14，383，Voidoo，G.J.Kleywegt和T.A.Jones(1994)Acta Cryst D50，178-185；http//www.iucr.ac.uk/journals/acta/tocs/actad/1994/actad5002.html；和Squares；Jiang，F(xiàn).；Kim，S.-H.；“‘Soft-docking’”Matching of Molecular Surface Cubes”，J.Mol.Biol.1991，219，79)和同用于口袋顯像的GRASP并聯(lián)(http//trantor.bioc.columbia.edu/grasp/)。采用SoftDock(http//www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock/；Morris，G.M.；Goodsell，D.S.；Halliday，R.S.；Huey，R.；Hart，W.E.；Belew，R.K.；Olson，A.J，J.Computational Chemistry，1998，19，1639)和Dock[http//www.cmpharm.ucsf.edu/kuntz/dock.html；Ewing，T.D.A.；Kuntz，I.D.，J.Comp.Chem.1997，18，1175]以及基于AMBER[http//www.amber.ucsf.edu/amber/amber.html]在合適時約束分子動態(tài)，以便將小分子化學(xué)型淘選和停靠(Panning and docking)入這些假設(shè)的位點。
口袋分析程序使用的一般方法是確定間隙區(qū)域并用這些區(qū)域來決定蛋白質(zhì)表面上可得到何種溶劑可接近的洞。間隙區(qū)域或基于球形或基于正方形，首先用球形或正方形(完整的和截短的)填充兩個或多個原子之間的區(qū)域來確定，然后用這些來計算3D密度圖譜，當與其輪相符時便可確定間隙區(qū)域的表面。根據(jù)Surfnet用戶手冊，所示一般方法對球形的定義如下a.兩個原子，A和B，具有一個置于其van der Waals表面中間并恰好與每個原子接觸的試驗間隙球(trial gap sphere)。
b.然后依次考慮相鄰的原子。如果有任何原子穿過間隙球，則減小實驗間隙球的半徑直到它恰好接觸擠入的原子。該過程被重復(fù)直到已考慮所有的相鄰原子。如果所述球的半徑小于預(yù)定的最小限度(通常1.0A)它被排斥。否則將保留最終的間隙球。
c.繼續(xù)該過程直到已考慮所有原子，且間隙區(qū)域用球填充。
d.然后采用高斯函數(shù)用球來校正格點的3D陣列上的點。
e.校正的結(jié)果是，當以100.0的等值水平將格畫等值線時，所得3D表面與每個間隙球相對應(yīng)。
f.當所有的球都已校正格，最終的3D輪廓代表了互穿的間隙球的表面，從而確定了含有表面口袋的原子口袋基團的范圍。
影響口袋分析的因素包括格點的間隔、所采用的等值水平以及用來包裝間隙的球半徑的最小和最大限度。通常，開關(guān)控制口袋的大小和性狀被描述為通過覆蓋由各個單獨程序確定的計算開關(guān)控制口袋而發(fā)現(xiàn)的共有口袋。
如上所述，發(fā)現(xiàn)形成了一個開關(guān)控制配體與一個或多個開關(guān)控制口袋的相互作用，被稱為“復(fù)合開關(guān)口袋”。這種復(fù)合開關(guān)口袋具有一個序列，包括取自開關(guān)控制配體和開關(guān)控制口袋的氨基酸殘基。
在其它情況下，開關(guān)控制口袋或復(fù)合開關(guān)控制口袋可與一活性位點口袋(例如，激酶的ATP口袋)重疊產(chǎn)生一個“組合開關(guān)控制口袋”。這些組合開關(guān)控制口袋也可被用作結(jié)合作為開關(guān)控制抑制劑的小分子的基因座。
當然，對復(fù)合開關(guān)口袋和組合開關(guān)口袋的分析是用上文所述的相同技術(shù)連同開關(guān)控制口袋一起進行的。
abl激酶口袋分析的SURFNET圖在圖10中說明。開關(guān)控制口袋用淡藍色突出顯示。該開關(guān)控制口袋的GRASP圖在圖11中說明，其中圈出了蛋白質(zhì)的復(fù)合口袋區(qū)域。圖12說明構(gòu)成(bcr)abl激酶復(fù)合開關(guān)控制口袋的關(guān)鍵氨基酸氨基酸殘基。構(gòu)成復(fù)合口袋的氨基酸殘基由先前鑒別的開關(guān)控制是由配體和開關(guān)控制口袋提供的。復(fù)合開關(guān)控制口袋的示意圖列于圖6中。
構(gòu)成復(fù)合口袋的特定氨基酸殘基列在表10中。
表10
為該復(fù)合開關(guān)控制口袋設(shè)計的最初的小分子集中于化學(xué)探針，它可結(jié)合取自N-頁β鏈殘基(M278)、α-C螺旋(E282、K285)、α-E螺旋(F359)、催化環(huán)(I360、H361、R362、D363、N368)、開關(guān)控制配體序列(R386、L387、Y393)、C-環(huán)殘基(F401)和α-F螺旋(F416)的氨基酸。利用這種復(fù)合開關(guān)控制口袋可設(shè)計錨入(bcr)abl激酶復(fù)合開關(guān)控制口袋的抑制劑。
為篩選而選擇的代表性的化合物是N-(4-甲基-3-(4-苯基嘧啶-2-基氨基)苯基)-L-4-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯甲酰胺。
圖13說明構(gòu)成(bcr)abl激酶組合開關(guān)控制口袋的關(guān)鍵氨基酸殘基。構(gòu)成該組合口袋的氨基酸殘基由先前鑒別的開關(guān)控制配體、開關(guān)控制口袋和ATP活性位點提供。組合開關(guān)控制口袋的示意圖列于圖7中。
構(gòu)成所述組合口袋的特定氨基酸殘基列在表11中。
表11
利用這種組合開關(guān)控制口袋可設(shè)計錨入(bcr)abl激酶組合開關(guān)控制口袋的抑制劑。
為篩選而選擇的代表性的化合物包括N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-4-(l，1，3-三氧代-[1，2，5]噻二唑烷-2基甲基)-苯甲酰胺；-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-D-4-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯甲酰胺；-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-L-4-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯甲酰胺；-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-基氨基)-苯基]-4-(4，4-二氧代-4-硫代嗎啉代甲基)苯甲酰胺；和N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-((l-甲基-3，5-二氧代-1，2，4-三唑烷-4-基)甲基)苯甲酰胺。
p38-α激酶口袋分析的SURFNET圖在圖14中說明。復(fù)合開關(guān)控制口袋用淡藍色突出顯示。該復(fù)合開關(guān)控制口袋的GRASP圖在圖15中說明。
圖16說明構(gòu)成p38-α激酶復(fù)合開關(guān)控制口袋的關(guān)鍵氨基酸氨基酸殘基。這些氨基酸取自富含甘氨酸的環(huán)(Y35)、α-C螺旋(I62、I63、R67、R70、L74、L75、M78)、α-D螺旋(I141、I146)、催化環(huán)(I147、H148、R149、D150、N155)、N-頁鏈(L167)、開關(guān)控制配體序列(D168、F169)和α-F螺旋(Y200)。構(gòu)成所述復(fù)合口袋的特定氨基酸殘基列在下表中表12說明形成復(fù)合開關(guān)控制口袋的蛋白質(zhì)序列的氨基酸。
表12
利用這種復(fù)合開關(guān)控制口袋可設(shè)計錨入p38-α激酶的這種開關(guān)控制口袋的抑制劑。
代表性的化合物包括3-14-[3-叔-丁基-5-(3-(4-氯苯基)脲基-1H-吡唑-1-基)苯基]丙酸；3-{4-[3-叔-丁基-5-(3-(萘-1-基)脲基)-1H-吡唑-1-基]苯基}丙酸；3-(3-{3-叔-丁基-5-[3-(4-氯苯基)脲基]-1H-吡唑-1-基)苯基)丙酸；3-(3-{3-叔-丁基-5-[3-(萘-1-基)脲基]-1H-吡唑-1-基)苯基丙酸；1-{3-叔-丁基-1-[3-(氨基甲?；谆?苯基)-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲；和1-{3-叔-丁基-1-[3-(2-嗎啉代-2-氧代乙基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲。
Gsk-3β激酶口袋分析的SURFNET圖在圖17中說明。復(fù)合開關(guān)控制口袋用淡藍色突出顯示。該復(fù)合開關(guān)控制口袋的GRASP圖在圖18中說明。
圖19說明構(gòu)成gsk-3β激酶復(fù)合開關(guān)控制口袋的關(guān)鍵氨基酸氨基酸殘基。這些堿基來自富含甘氨酸的環(huán)(F67)、α-C螺旋(R96、I100、M101、L104)、α-D螺旋(I141、I146)、催化環(huán)(I177、C178、H179、R180、D181、N186)、開關(guān)控制配體序列(D200、F201、S203、K205、L207、V208、P212、N213、V214、Y216)和α-F螺旋(Y200)。利用這種口袋可設(shè)計錨入gsk-3β激酶的這種復(fù)合開關(guān)控制口袋的小分子調(diào)制劑化合物。
表13中說明的復(fù)合口袋是一種雙功能開關(guān)控制口袋。當其與互補配體序列1(Gsk配體1)結(jié)合時，所述口袋作為上調(diào)蛋白質(zhì)活性的開-口袋?；蛘撸斊渑c互補配體序列2(Gsk配體2)結(jié)合時，所述口袋作為下調(diào)蛋白質(zhì)活性的關(guān)-口袋。
表13說明形成復(fù)合開關(guān)控制口袋的蛋白質(zhì)序列的氨基酸。
表13
步驟4表達和純化靜態(tài)地限制于不同開關(guān)控制狀態(tài)的蛋白質(zhì)基因合成?；蛉渴遣捎肊merald/deCODE genetics，Inc提供的軟件(GeneBuilderTM)從具有最佳密碼子使用的合成寡核苷酸制備的。整個基因合成能使基因的最佳密碼子式樣迅速合成。限制性位點的戰(zhàn)略置換有助于迅速涵蓋所需的其它突變。
蛋白質(zhì)是在桿狀病毒感染的昆蟲細胞或在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達的?；蛉芜x被通過摻入親和標記進行修飾，這樣通?？蓪擞浀牡鞍踪|(zhì)進行一步抗體親和純化。構(gòu)建物最佳供可結(jié)晶性、配體相互作用、純化和密碼子使用。使用了兩個每月產(chǎn)量超過100L的11L的Wave生物反應(yīng)器來培養(yǎng)昆蟲細胞。
蛋白質(zhì)純化。對于蛋白質(zhì)純化，可使用AKTA提純器、AKTA FPLC、Parr氮氣氣蝕彈(Parr Nitrogen Cavitation Bomb)、EmulsiFlex-C5勻漿器和Protein MakerTM蛋白質(zhì)制造器(Emerald的自動平行純化系統(tǒng))。鑒定純化的蛋白質(zhì)的裝置包括熒光光譜、MALDI-ToF質(zhì)譜和動態(tài)光散射。
通過氮氣氣蝕、弗氏壓碎或微流體來破碎全細胞漿。用Protein MakerTM裝置對提取物進行平行蛋白質(zhì)純化。Protein Maker是由Emerald開發(fā)的一種機器裝置，它可平行運轉(zhuǎn)多個柱(包括Glu-mAb、金屬螯合物、Q-seph、S-Seph、苯基-Seph和Cibacron Blue)同時進行純化。組分通過SDS-PAGE分析。對純化的蛋白質(zhì)進行許多生物物理測定(動態(tài)光散射、UV吸收、MALDI-ToF、分析型凝膠過濾等)以定量純度的水平。
abl激酶對Abl構(gòu)建物1(激酶結(jié)構(gòu)域、6xHis-TEV標記、殘基248-534)、Abl構(gòu)建物2(激酶結(jié)構(gòu)域、Glu-6xHis-TEV標記、殘基248-518)、abl構(gòu)建物3(激酶結(jié)構(gòu)域、Glu-6xHis-TEV標記、殘基248-518、Y412F突變體)、abl構(gòu)建物4(具有K29R/E30D突變的同種型1B 1-531、TEV-6xHis-Glu)和abl構(gòu)建物5(具有K29R/E30D/Y412F的同種型1B 1-531)完成全基因分析和亞克隆并在昆蟲細胞中進行轉(zhuǎn)染。用類似的方法制備Bcr-abl構(gòu)建物1(Glu-6xHis-TEV標記、殘基1-2029)和bcr-abl構(gòu)建物2(Glu-6xHis-TEV標記、殘基1-2029；Y412F突變體)并轉(zhuǎn)染入昆蟲細胞。任選在ATP競爭性抑制劑PD 180790或Gleevec存在時進行Fernbach轉(zhuǎn)染培養(yǎng)以確保產(chǎn)生的(bcr)Abl蛋白在Y245或Y412上未被磷酸化(參見Tanis等，Molecular Cell Biology，卷23，p3884，(2003)；Van Etten等，Journal of Biological Chemistry，卷275，p35631，(2000))。通過免疫沉淀和SDS-Page確定蛋白質(zhì)表達水平。abl構(gòu)建物1和2的蛋白質(zhì)表達水平超過10mg/L。對這些抑制劑存在時表達的純化的蛋白質(zhì)進行Py20(抗磷酸酪氨酸抗體)Western印跡以確保Y245或Y412未被磷酸化。
圖20和21說明在鎳親和層析(圖20)和隨后的POROS HQ陰離子交換層析(圖21)之后PD180970存在時表達的abl-構(gòu)建物2的純度。圖22顯示了來自鎳親和層析的abl構(gòu)建物2的洗脫圖形，圖23描述了來自POROS HQ陰離子交換層析的Abl構(gòu)建物2的洗脫圖形。這種形式的abl處于其未磷酸化的生理狀態(tài)。
圖24說明用tev蛋白酶處理以除去Glu-6xHis-TEV親和標記之后Abl構(gòu)建物2的洗脫圖形。組分17-19包含具有完整Glu-6xHis-TEV標記的abl蛋白質(zhì)，而組分20-23包含已除去Glu-6xHis-TEV標記的abl蛋白質(zhì)。對合并的組分20-23進行UV分析(圖25)顯示最大吸收在360nm，這說明ATP競爭性抑制劑PD 180970仍與abl ATP口袋結(jié)合，從而確保abl蛋白質(zhì)在表達和純化過程中保持其未磷酸化的狀態(tài)。
圖26說明通過鎳親和層析和Q-瓊脂糖層析純化時abl構(gòu)建物5(蛋白質(zhì)abl1-531、Y412F突變體)的洗脫圖形。圖27說明對純化的合并組分進行SDS-Page分析的結(jié)果。
p38-α激酶對p38-α激酶構(gòu)建物1(6xHis-TEV標記，全長)或構(gòu)建物2(Glu-6xHis-TEV標記，殘基5-354)完成全基因分析，并采用阿拉伯糖可誘導(dǎo)的啟動子和T7啟動子載體在大腸桿菌中表達蛋白質(zhì)。用0.5M IPTG(pET15b)或0.2％阿拉伯糖(pBAD)誘導(dǎo)后檢測p38-α激酶在兩個表達載體(pETl 5b和pBAD)中的表達。通過免疫沉淀和SDS-Page檢測蛋白質(zhì)表達。通過與抗-GLU單克隆抗體免疫沉淀可清楚證明誘導(dǎo)后p38-α在pBAD構(gòu)建物中的表達。
圖28說明Q-瓊脂糖層析時p38-α蛋白質(zhì)的洗脫圖形。對合并的純化的組分進行SDS-Page的結(jié)果在圖29中說明。
Gsk-3β激酶對構(gòu)建物1(6xHis-TEV標記，全長，與1H8F蛋白質(zhì)序列相同)、構(gòu)建物2(10xHis，殘基27-393，與1GNG蛋白質(zhì)序列相同)和構(gòu)建物3(Glu-6xHis-TEV標記，殘基35-385)完成全基因分析。在昆蟲細胞中進行轉(zhuǎn)染。通過免疫沉淀和SDS-Page確定蛋白質(zhì)表達。構(gòu)建物3的表達水平超過5mg/L。對gsk-3β蛋白質(zhì)的純化包括能夠從相同的表達運轉(zhuǎn)中分離開關(guān)控制配體未磷酸化的激酶(GSK-P)和開關(guān)控制配體磷酸化的激酶(GSK+P)兩種形式。在20mM HEPES緩沖液(pH7.5)中進行鎳親和層析。這一步驟之后進行POROS HS(陽離子交換)層析。圖30說明GSK+P蛋白質(zhì)的MALDI-TOF譜，表明預(yù)期的分子離子為42862Da。圖31說明GSK-P蛋白質(zhì)的MADLI-TOF譜，表明預(yù)期的分子離子為42781。
圖32和33說明通過SDS-Page分析結(jié)合抗磷酸酪氨酸抗體PY-20染色分析POROSHS層析組分的結(jié)果。組分10-15用PY-20抗體顯像，表明開關(guān)控制配體酪氨酸殘基上存在磷酸。組分17-29通過PY-20抗體不顯像，表明不存在酪氨酸的開關(guān)控制配體的磷酸化。
步驟5.用候選小分子開關(guān)控制調(diào)制劑篩選純化的蛋白質(zhì)P38-α激酶篩選/P38 MAP激酶結(jié)合測定以SKF 86002作為熒光探針，基于已公布的方法進行修改(C.Pargellis等，NatureStructural Biology(2002)9，268-272；J.Regan等，J.Med Chem.(2002)45，2994-3008)，采用競爭測定確定了p38 MAP激酶小分子調(diào)制劑的結(jié)合親和性。簡言之，SKF 86002，p38激酶的有效抑制劑(Kd＝180nM)，當其與激酶結(jié)合在340nm處激發(fā)時顯示約420nm的發(fā)射熒光。因此，p38激酶抑制劑的結(jié)合親和性可通過其減弱SKF 86002熒光的能力來測定。SKF 86002是一種熒光探針試劑，作為p38-α激酶ATP活性位點口袋完整性的報告分子。結(jié)合入p38-α激酶開關(guān)控制口袋的小分子調(diào)制劑將改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而阻斷熒光探針SKF 86002的結(jié)合能力。因此，小分子阻斷熒光探針結(jié)合的能力提供了一個與開關(guān)控制口袋結(jié)合的試驗讀出。進行對照試驗來確定小分子調(diào)制劑不與熒光探針結(jié)合直接競爭而在ATP口袋上競爭。該試驗在Polarstar Optima平板閱讀器(BMG)上的384平板(Greiner核384平板)上進行。通常，反應(yīng)混合物含有1μM SKF 86002、80nM p38激酶和各種濃度的抑制劑，在含有0.15％(w/v)正-辛基葡糖苷和2mM EDTA的20mM二-三丙烷緩沖液(pH 7)中，最終體積為65μl。通過加入酶引發(fā)反應(yīng)。將平板在室溫(約25℃)下培育2小時，然后在420nm的發(fā)射處閱讀并在340nm處激發(fā)。通過將rfu(相對熒光單位)值與對照(無小分子調(diào)制劑)比較，計算出各個濃度的小分子的抑制百分比。采用Prism，從一定濃度范圍的小分子調(diào)制劑獲得的百分抑制值計算出IC50值。當評定時間依賴型抑制時，在多個反應(yīng)時間如0.5、1、2、3、4和6小時時閱讀平板。在各個時間點計算IC50值。如果IC50值隨反應(yīng)時間而降低(在4小時內(nèi)超過2倍)則抑制被認為是時間依賴的。
表14
反應(yīng)時間為2小時時獲得的IC50值步驟6.確定蛋白質(zhì)調(diào)制的開關(guān)控制機制通過生化研究來測定發(fā)現(xiàn)對蛋白質(zhì)具有親和性或?qū)Φ鞍踪|(zhì)活性具有功能性調(diào)制的小分子，以確定結(jié)合或功能性調(diào)制與天然配體位點(例如激酶蛋白質(zhì)的ATP位點)是非競爭性或反競爭性的。這是采用標準Lineweaver-Burk型分析完成的。
開關(guān)控制調(diào)制劑與各種蛋白質(zhì)的結(jié)合模式是通過X射線晶體學(xué)或NMR技術(shù)確定的。以下部分列出了用來確定結(jié)合的分子模式的X射線晶體學(xué)技術(shù)。
用X射線晶體學(xué)技術(shù)確定蛋白質(zhì)調(diào)制的開關(guān)控制機制。
1.結(jié)晶實驗室使用用戶定制的數(shù)據(jù)庫軟件捕獲所有結(jié)晶試驗數(shù)據(jù)，該軟件被用來驅(qū)動建立結(jié)晶試驗的各種機器裝置并監(jiān)控結(jié)果。B.計算機硬件Multiple Linux工作站、Windows 2000服務(wù)器和Silicon Graphics 02工作站。C.X射線晶體學(xué)軟件HKL2000，包括DENZO和SCALEPACK(X射線衍射數(shù)據(jù)處理)；MOSFILM；CCP4套裝，包括AMORE、MOLREP和REFMAC(各種結(jié)晶計算操作，包括通過分子置換取相、MIR和MAD)；用于重原子定位的SnB；SHARP(重原子取相程序)；CNX(各種結(jié)晶計算操作，包括模型細分)；EPMR(分子置換)；XtalView(模型顯示和建造)。
2.晶體生長和X射線衍射量分析在兩個或多個溫度下在有和沒有配體時建立稀疏矩陣和聚焦結(jié)晶屏幕。一旦獲得合適的蛋白質(zhì)-晶體，便可進行篩選以在R-AXIS IV成像平板系統(tǒng)和X-STREAM恒冷箱的各種深低溫保藏條件下確定蛋白質(zhì)晶體的衍射質(zhì)量。具有足夠衍射質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體被用于機構(gòu)內(nèi)部X射線衍射數(shù)據(jù)收集，或儲存在液氮中并保存，供隨后在Argonne國家實驗室的先進光子源(Advanced PhotonSource)的COM-CAT射線束(beamline)或另一同步加速器射線束的同步加速器X射線輻射源上進行數(shù)據(jù)收集。用φ主軸設(shè)定偏離90°的至少兩個衍射圖象來確定蛋白質(zhì)-晶體的衍射極限。在衍射圖象收集期間φ主軸擺動1度。用HKL-2000序列的X-射線數(shù)據(jù)分析和還原軟件處理這兩個圖象。蛋白質(zhì)晶體的衍射分辨率被接受作為分辨殼(resolution shell)的較高分辨率限度，其中50％或更高的加標反射強度為1δ或更高。
3.X射線衍射數(shù)據(jù)收集已收集完整數(shù)據(jù)組，完整數(shù)據(jù)組被定義為在所收集的最高分辨殼中具有至少90％的所有反射。用HKL-2000序列的X射線衍射數(shù)據(jù)處理軟件處理X射線衍射數(shù)據(jù)(還原成獨特的反射和強度)。
4.結(jié)構(gòu)確定使用在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)中獲得的一個或多個蛋白質(zhì)搜索模型通過分子分子置換(MR)確定蛋白質(zhì)一小分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。如果需要的話，采用多重同晶置換(MIR)和重原子和/或多波長反常衍射(MAD)法可簡化結(jié)構(gòu)確定。如果對晶體的EXAFS掃描(在沒有重原子的母液或冷凍保護劑中洗滌之后)揭示了合適的重原子信號，則對浸透重原子的晶體收集MAD同步加速器數(shù)據(jù)組。用CCP4計算程序結(jié)晶套裝完成對重原子衍生數(shù)據(jù)組的分析。用(|FPH|-FP|)2差異Patterson圖和(|F+|-|F-|)2異常差異Patternson圖鑒別重原子位點。
步驟7.重復(fù)上述步驟以改進小分子開關(guān)控制調(diào)制劑評價發(fā)現(xiàn)用來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的各個小分子的親和性并在蛋白質(zhì)超家族內(nèi)(例如，其它激酶，如果候選蛋白質(zhì)是激酶)或蛋白質(zhì)家族之間(例如，其它蛋白質(zhì)家族，如磷酸酶和轉(zhuǎn)錄因子，如果候選蛋白質(zhì)是激酶)對其它蛋白質(zhì)的功能性調(diào)制。在這個篩選范例中還評價了小分子篩選文庫。評估結(jié)構(gòu)活性關(guān)系(SARs)，并隨后將小分子設(shè)計成對候選蛋白質(zhì)更有效和/或?qū)τ诤蜻x蛋白質(zhì)的調(diào)制更有選擇性，以便使與反靶countertarget)蛋白的相互作用最小化。
對激酶蛋白質(zhì)的分析揭示了4種類型的開關(guān)控制口袋，可根據(jù)它們與互補的開關(guān)控制配體的結(jié)合模式進行分類，即(1)穩(wěn)定并結(jié)合帶電荷的配體的口袋，通常由互補的開關(guān)控制配體(帶電荷的配體)中的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的磷酸化形成，或由甲硫氨酸或半胱氨酸的硫原子氧化形成；(2)通過氫鍵或疏水相互作用(氫鍵/疏水配體)機制與配體結(jié)合的口袋；(3)結(jié)合具有?；瘹埢??；潴w)的配體的口袋；和(4)不與配體內(nèi)源性結(jié)合的口袋，但可結(jié)合非天然產(chǎn)生的開關(guān)控制調(diào)制劑化合物(未鑒別的配體)。此外，這四種類型的口袋可以是圖1-4示意性描述的簡單類型、圖6的復(fù)合類型、或圖7的組合類型。最后，可根據(jù)它們的開關(guān)控制功能來定義這些口袋，即所述口袋可以是開類型，它在開關(guān)控制配體相互作用時誘導(dǎo)生物上調(diào)的蛋白質(zhì)構(gòu)象，可以是關(guān)類型，它在開關(guān)控制配體相互作用時誘導(dǎo)生物下調(diào)的蛋白質(zhì)構(gòu)象，或者稱為“雙功能”口袋，這意味著同一個口袋在與不同的互補的開關(guān)控制配體相互作用時可作為開-口袋和關(guān)-口袋。在所有感興趣的蛋白質(zhì)(即那些通過開關(guān)控制配體序列和互補的開關(guān)控制口袋的相互作用經(jīng)歷構(gòu)象變化的蛋白質(zhì))中都可發(fā)現(xiàn)這種同樣的口袋光譜。
下表15還按照口袋分類和類型鑒別了步驟2和3中描述的口袋表15
本發(fā)明的原則性目的是堿化設(shè)計和開發(fā)非天然產(chǎn)生的小分子調(diào)制劑化合物，它將在所選蛋白質(zhì)一個或多個開關(guān)控制口袋區(qū)域與其結(jié)合以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性。根據(jù)開關(guān)控制口袋(-開、-關(guān)或-雙功能)的類型、所選調(diào)制劑化合物的性質(zhì)以及調(diào)制劑化合物和蛋白質(zhì)之間相互結(jié)合的類型，可用幾種不同方法實現(xiàn)這種功能目的。
例如，所選調(diào)制劑化合物可在所選開關(guān)控制口袋區(qū)域作為開關(guān)控制配體激動劑，即所述調(diào)制劑化合物引起由天然產(chǎn)生的、互補開關(guān)控制配體誘導(dǎo)的相同類型的構(gòu)象變化。因此，如果開關(guān)控制配體激動劑與開-口袋結(jié)合，結(jié)果將上調(diào)蛋白質(zhì)活性，如果與關(guān)-口袋結(jié)合則發(fā)生下調(diào)。
相反，一種給定的調(diào)制劑可結(jié)合作為開關(guān)控制配體拮抗劑，即所述調(diào)制劑化合物引起由天然產(chǎn)生的、互補開關(guān)控制配體誘導(dǎo)的相反類型的構(gòu)象變化。因此，如果開關(guān)控制配體拮抗劑與開-口袋結(jié)合，結(jié)果將下調(diào)蛋白質(zhì)活性，如果與關(guān)-口袋結(jié)合則發(fā)生上調(diào)。
在雙功能和未鑒別的配體口袋的情況下，調(diào)制劑化合物作為功能激動劑或功能拮抗劑，這取決于所得到的反應(yīng)類型。
實施例2潛在開關(guān)控制小分子的合成以下實施例列舉了尤其可用作被設(shè)計與激酶蛋白質(zhì)相互作用的開關(guān)控制分子候選物的化合物的合成。在這些實施例中，用字母表示的實施例指中間體的合成，而用數(shù)字表示的實施例指最終化合物的合成。氨基酯(試劑AA)、1，5，7，-三甲基-2，4-二氧代-3-氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷-7-羧酸(試劑BB)和Kemp酸酐(試劑CC)按照文獻中所述的方法制備。為了解更多細節(jié)可參見Askew等；J.Am.Chem.Soc.1989，111，1082。
實施例A 0℃下，在溶于濃鹽酸(200mL)的間-氨基苯甲酸(200g，1.46mol)溶液中加入NaNO2(102g，1.46mol)水(250mL)溶液。將反應(yīng)混合物攪拌1小時，然后在0℃加入溶于濃鹽酸(2L)的SnCl2·2H2O(662g，2.92mol)溶液，并將反應(yīng)物在室溫下再攪拌2小時。將沉淀濾出并用乙醇和乙醚洗滌，得到白色固體狀的3-肼基-苯甲酸鹽酸鹽。
將溶于乙醇(2L)的上述反應(yīng)的粗物質(zhì)(200g，1.06mol)和4，4-二甲基-3-氧代-戊腈(146g，1.167mol)加熱回流過夜。反應(yīng)溶液在真空下蒸發(fā)并通過柱層析純化殘余物，得到白色固體3-(3-叔-丁基-5-氨基-1H-吡唑-1-基)苯甲酸乙酯(實施例A，116g，40％)和3-(5-氨基-3-叔-丁基-1H-吡唑-1-基)苯甲酸(93g，36％)。1HNMR(DMSO-d6)δ8.09(s，1H)，8.05(brd，J＝8.0Hz，1H)，7.87(brd，J＝8.0Hz，1H)，7.71(t，J＝8.0Hz，1H)，5.64(s，1H)，4.35(q，J＝7.2Hz，2H)，1.34(t，J＝7.2Hz，3H)，1.28(s，9H)。
實施例B
0℃下，在溶于THF(100mL)的1-萘基異氰酸酯(9.42g，55.7mmol)和吡啶(44mL)溶液中加入溶于THF(200mL)的實施例A(8.0g，27.9mmol)的溶液?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?小時，加熱至所有固體溶解，再在室溫下攪拌3小時，并用水(200mL)淬滅。將沉淀濾出，用稀鹽水和水洗滌，并在真空下干燥，得到白色粉末3-[3-叔-丁基-5-(3-萘-1-基)脲基]-1H-吡唑-1-基]苯甲酸乙酯(12.0g，95％)。1H NMR(DMSO-d6)δ9.00(s，1H)，8.83(s，1H)，8.257.42(m，11H)，6.42(s，1H)，4.30(q，J＝7.2Hz，2H)，1.26(s，9H)，1.06(t，J＝7.2 Hz，3H)；MS(ESI)m/z457.10(M+H+)。
實施例C 0℃下，在吡啶(56mL)和THF(30mL)混合物中的實施例A(10.7g，70.0mmol)的溶液中加入4-硝基苯基4-氯苯基氨基甲酸酯(10g，34.8mmol)的THF(150mL)溶液。混合物在室溫下攪拌1小時并加熱直到所有固體溶解，再在室溫下攪拌3小時。加入H2O(200mL)和CH2Cl2(200mL)，將水相分離并用CH2Cl2(2×100mL)提取。合并的有機層用1N NaOH、0.1N HCl和飽和鹽水洗滌，并用無水硫酸鈉干燥。在真空下除去溶劑得到3-{3-叔-丁基-5-[3-(4-氯苯基)脲基]-1H-吡唑-1-基}苯甲酸乙酯(8.0g，52％)。1H NMR(DMSO-d6δ9.11(s，1H)，8.47(s，1H)，8.06(m，1H)，7.93(d，J＝7.6Hz，1H)，7.81(d，J＝8.0Hz，1H)，7.65(dd，J＝8.0，7.6Hz，1H)，7.43(d，J＝8.8Hz，2H)，7.30(d，J＝8.8Hz，2H)，6.34(s，1H)，4.30(q，J＝6.8Hz，2H)，1.27(s，9H)，1.25(t，J＝6.8Hz，3H)；MS(ESI)m/z441(M++H)。
實施例D
在-10℃氮氣下，在實施例B(8.20g，18.0mmol)的THF(500mL)溶液中邊攪拌邊加入LiAlH4粉末(2.66g，70.0mmol)?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?小時，然后通過緩慢加入冰來破壞過量的LiAlH4。用稀鹽酸將反應(yīng)混合物酸化至pH＝7，在真空下濃縮并用EtOAc提取殘余物。合并的有機層在真空下濃縮，得到白色粉末1-{3-叔-丁基-1-[3-(羥基甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲(7.40g，99％)。1HNMR(DMSO-d6)9.19(s，1H)，9.04(s，1H)，8.80(s，1H)，8.26-7.35(m，11H)，6.41(s，1H)，4.60(s，2H)，1.28(s，9H)；MS(ESI)m/z415(M+H+)。
實施例E 將實施例C(1.66g，4.0mmol)和SOCl2(0.60mL，8.0mmol)的CH3Cl(100mL)溶液回流3小時并在真空下濃縮，得到白色粉末1-{3-叔-丁基-1-[3-氯甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲(1.68g，97％)。1H NMR(DMSO-d6)δ9.26(s，1H)，9.15(s，1H)，8.42-7.41(m，11H)，6.40(s，1H)，4.85(s，2H)，1.28(s，9H)。MS(ESI)m/z433(M+H+)。
實施例F
在-10℃氮氣下，在實施例C(1.60g，3.63mmol)的THF(200mL)溶液中邊攪拌邊加入LiAlH4粉末(413mg，10.9mmol)。將混合物攪拌2小時，過量的LiAlH4通過加冰淬滅。溶液用稀鹽酸酸化至pH＝7。緩慢除去溶劑，將固體濾出并用EtOAc(200+100mL)洗滌。將濾液濃縮得到1-{3-叔-丁基-1-[3-羥基甲基]苯基}-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(1.40g，97％)。1H NMR(DMSO-d6)δ9.11(s，1H)，8.47(s，1H)，7.47-7.27(m，8H)，6.35(s，1H)，5.30(t，J＝5.6Hz，1H)，4.55(d，J＝5.6Hz，2H)，1.26(s，9H)；MS(ESI)m/z399(M+H+)。
實施例G 將實施例F(800mg，2.0mmol)和SOCl2(0.30mL，4mmol)的CHCl3(30mL)溶液溫和回流3小時。溶劑在真空下蒸發(fā)并將殘余物取出置于CH2Cl2(2×20mL)中。除去溶劑后，得到白色粉末狀的1-{3-叔-丁基-1-[3-(氯甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(812mg，97％)。1H NMR(DMSO-d6)δ9.57(s，1H)，8.75(s，1H)，7.63(s，1H)，7.50-7.26(m，7H)，6.35(s，1H)，4.83(s，2H)，1.27(s，9H)；MS(ESI)m/z417(M+H+)。
實施例H
在0℃氮氣下，在LiAlH4(5.28g，139.2mmol)的THF(1000mL)懸液中分批加入實施例A(20.0g，69.6mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌5小時，在0℃用1N HCl淬滅并將沉淀濾出，用EtOAc洗滌并將濾液蒸發(fā)得到[3-(5-氨基-3-叔-丁基-1H-吡唑-1-基)苯基]甲醇(15.2g，89％)。1H NMR(DMSO-d6)7.49(s，1H)，7.37(m，2H)，7.19(d，J＝7.2Hz，1H)，5.35(s，1H)，5.25(t，J＝5.6Hz，1H)，5.14(s，2H)，4.53(d，J＝5.6Hz，2H)，1.19(s，9H)；MS(ESI)m/z246.19(M+H+)。
以上反應(yīng)的粗物質(zhì)(5.0g，20.4mmol)被溶于無水THF(50mL)和SOCl2(4.85g，40.8mmol)，在室溫下攪拌2小時，在真空下濃縮得到3-叔-丁基-1-(3-氯甲基苯基)-1H-吡唑-5-胺(5.4g)，將其加入DMF(50mL)中的N3(3.93g，60.5mmol)。將反應(yīng)混合物在30℃加熱2小時，倒入H2O(50mL)，并用CH2Cl2提取。將有機層合并，用硫酸鎂干燥，并在真空下濃縮得到粗制的3-叔-丁基-1-[3-(疊氮基甲基)苯基]-1H-吡唑-5-胺(1.50g，5.55mmol)。
實施例I 室溫下，將實施例H溶于無水THF(10mL)并加入1-異氰基萘(1.13g，6.66mmol)和吡啶(5.27g，66.6mmol)的THF(10mL)溶液。將反應(yīng)混合物攪拌3小時，用水(30mL)淬滅，濾出所得沉淀，并用1N HCl和乙醚洗滌，得到白色固體1-[2-(3-疊氮基甲基-苯基)-5-叔-丁基-2H-吡唑-3-基]-3-萘-1-基-脲(2.4g，98％)。
將THF(30mL)中的以上反應(yīng)的粗物質(zhì)和Pd/C(0.4g)在室溫1atm下氫化2小時。過濾除去催化劑并將濾液在真空下濃縮，得到黃色固體1-{3-叔-丁基-1-[3-(氨基甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲(2.2g，96％)。1H NMR(DMSO-d6)9.02(s，1H)，7.91(d，J＝7.2Hz，1H)，7.89(d，J＝7.6Hz，2H)，7.67-7.33(m，9H)，6.40(s，1H)，3.81(s，2H)，1.27(s，9H)；MS(ESI)m/z414(M+H+)。
實施例J 室溫下，在實施例H(1.50g，5.55mmol)的無水THF(10mL)溶液中加入4-氯苯基異氰酸酯(1.02g，6.66mmol)和吡啶(5.27g，66.6mmol)的THF(10mL)溶液。將反應(yīng)混合物攪拌3小時然后加入H2O(30mL)。將沉淀濾出并用1N HCl和乙醚洗滌，得到白色固體1-{3-叔-丁基-1-[3-(氨基甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(2.28g，97％)，其無需進一步純化即可用于下面的步驟。MS(ESI)m/z424(M+H+)。
實施例K 在芐胺(16.5g，154mmol)和溴乙酸乙酯(51.5g，308mmol)的乙醇(500mL)溶液中加入K2CO3(127.5g，924mmol)。將混合物在室溫下攪拌3小時，過濾，用EtOH洗滌，在真空下濃縮并層析得到N-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-N-(苯基甲基)-甘氨酸乙酯(29g，67％)。1H NMR(CDCl3)δ7.39-7.23(m，5H)，4.16(q，J＝7.2Hz，4H)，3.91(s，2H)，3.54(s，4H)，1.26(t，J＝7.2Hz，6H)；MS(ESI)m/e280(M++H)。
將N-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-N-(苯基甲基)-甘氨酸乙酯(7.70g，27.6mmol)的甲胺醇溶液(25-30％，50mL)在封管中在加熱至50℃3小時，冷卻至室溫并在真空下濃縮，得到一定產(chǎn)量的N-(2-甲基氨基-2-氧代乙基)-N-(苯基甲基)-甘氨酸甲基酰胺(7.63g)。1H NMR(CDCl3)δ7.35-7.28(m，5H)，6.75(br s，2H)，3.71(s，2H)，3.20(s，4H)，2.81(d，J＝5.6Hz，6H)；MS(ESI)m/e 250(M+H+)。
在N-(2-甲基氨基-2-氧代乙基)-N-(苯基甲基)-甘氨酸甲基酰胺(3.09g，11.2mmol)的MeOH(30mL)混合物中加入10％Pd/C(0.15g)。攪拌混合物并在40psi氫氣下加熱至40℃10小時，過濾并在真空下濃縮以得到一定產(chǎn)量的N-(2-甲基氨基-2-氧代乙基)-甘氨酸甲基酰胺(1.76g)。1H NMR(CDCl3)δ6.95(br s，2H)，3.23(s，4H)，2.79(d，J＝6.0，4.8Hz)，2.25(br s 1H)；MS(ESI)m/e 160(M+H+)實施例1 將1-甲基-[1，2，4]三唑烷-3，5-二酮(188mg，16.4mmol)和氫化鈉(20mg，0.52mmol)的DMSO(1mL)溶液加入實施例E(86mg，0.2mmol)。使反應(yīng)物在室溫下攪拌過夜，用H2O(10mL)淬滅，用CH2Cl2提取，并分離有機層，用鹽水洗滌，Na2SO4干燥并在真空下濃縮。殘余物通過制備型HPLC純化以得到1-(3-叔-丁基-1-{3-[(1-甲基-3，5-二氧代-1，2，4-三唑烷-4-基)甲基]苯基}-1H-吡唑-5-基)-3-(萘-1-基)脲(實施例1，14mg)。1H NMR(CD3OD)δ7.88-7.86(m，2H)，7.71-7.68(m，2H)，7.58(m，2H)，7.60-7.42(m，5H)，6.49(s，1H)，4.85(s，1H)，1.34(s，9H)，1.27(s，6H)；MS(ESI)m/z525(M+H+)。
實施例2 標題化合物是用與實施例1類似的方法用實施例G合成的，得到1-(3-叔-丁基-1-{3-[(1-甲基-3，5-二氧代-1，2，4-三唑烷-4-基)甲基]苯基}-1H-吡唑-5-基)-3-(4-氯苯基)脲。1H NMR(CD3OD)δ7.2-7.5(m，7H)，6.40(s 1H)，4.70(s，2H)，2.60(d，J＝14Hz，2H)，1.90(m，1H)，1.50(m，1H)，1.45(s，9H)，1.30(m，2H)，1.21(s，3H)，1.18(s，6H)；MS(ESI)m/z620(M+H+)。
實施例3 在-10℃氮氣下，將THF(2mL)中化合物1，1-二氧代-[1，2，5]噻二唑烷-3-酮(94mg，0.69mmol)和NaH(5.5mg，0.23mmol)的混合物攪拌1小時直到所有的NaH溶解。加入實施例E(100mg，0.23mmol)并將反應(yīng)物在室溫下攪拌過夜，用H2O淬滅，并用CH2Cl2提取。合并的有機層在真空下濃縮，殘余物通過制備型HPLC純化以得到白色粉末狀的1-(3-叔-丁基-1-{[3-(1，1，3-三氧代-[1，2，5]噻二唑烷-2-基)甲基]苯基}-1H-吡唑-5-基)-3-(萘-1-基)脲(18mg)。1H NMR(CD3OD)δ7.71-7.44(m，11H)，6.45(s，1H)，4.83(s，2H)，4.00(s，2H)，1.30(s，9H)。MS(ESI)m/z533.40(M+H+)。
實施例4 標題化合物是用類似于實施例3的方法用實施例G獲得的，得到1-(3-叔-丁基-1-{[3-(1，1，3-三氧代-[1，2，5]噻二唑烷-2-基)甲基]苯基}-1H吡唑-5-基)-3-(4-氯苯基)脲。1H NMR(CD3OD)δ7.38-7.24(m，8H)，6.42(s，1H)，4.83(s，2H)，4.02(s，2H)，1.34(s，9H)；MS(ESI)m/z517(M+H+)。
實施例5
0℃下，在氯磺酰異氰酸酯(19.8μL，0.227mmol)的CH2Cl2(0.5mL)溶液中邊攪拌邊加入吡咯烷(18.8μL，0.227mmol)，加入速度為反應(yīng)溶液的溫度不超過5℃。攪拌1.5小時后，加入實施例J(97.3mg，0.25mmol)和Et3N(95μL，0.678mmol)的CH2Cl2(1.5mL)溶液，加入速度為反應(yīng)溫度不超過5℃。當加入完成時使反應(yīng)溶液加熱到室溫并將其攪拌過夜。將反應(yīng)混合物倒入10％HCl，用CH2Cl2提取，有機層用飽和NaCl洗滌，硫酸鎂干燥，并過濾。除去溶劑后，粗制產(chǎn)物通過制備型HPLC純化以得到1-(3-叔-丁基-1-[[3-N-[[(1-吡咯烷基羰基)氨基]磺酰]氨基甲基]苯基]-1H-吡唑-5-基)-3-(4-氯苯基)脲。1H NMR(CD3OD)δ7.61(s，1H)，7.43-7.47(m，3H)，7.23-7.25(dd，J＝6.8Hz，2H)，7.44(dd，J＝6.8Hz，2H)，6.52(s，1H)，4.05(s，2H)，3.02(m，4H)，1.75(m，4H)，1.34(s，9H)；MS(ESI)m/z574.00 M+H+)。
實施例6 標題化合物是用與實施例5類似的方法用實施例I制成的，得到1-(3-叔-丁基-1-[[3-N-[[1-吡咯烷基羰基]氨基]磺酰]氨基甲基]-苯基)-1H-吡唑-5-基)-3-(萘-1-基)脲。1H NMR(CDCl3)δ7.88(m，2H)，7.02-7.39(m，2H)，7.43-7.50(m，7H)，6.48(s，1H)，4.45(s，1H)，3.32-3.36(m，4H)，1.77-1.81(m，4H)，1.34(s，9H)；MS(ESI)m/z590.03(M+H+)。
實施例7
在0℃下，在氯磺酰異氰酸酯(19.8μΛ，0.227μμoλ)的vXH1Xλ1(0.5μΛ)溶液中邊攪拌邊加入實施例J(97.3mg，0.25mmol)，加入速度為反應(yīng)溶液的溫度不超過5℃。攪拌1.5小時后，加入吡咯烷(18.8μL，0.227mmol)和Et3N(95μL，0.678mmol)的CH2Cl2(1.5mL)溶液，加入速度為反應(yīng)溫度不超過5℃。當加入完成后使反應(yīng)溶液回復(fù)室溫并將其攪拌過夜。將反應(yīng)混合物倒入10％HCl，用CH2Cl2提取，有機層用飽和NaCl洗滌，通過硫酸鎂干燥，并過濾。除去溶劑后，粗制產(chǎn)物通過制備型HPLC純化以得到1-(3-叔-丁基-1-[[3-N-[[(1-吡咯烷基磺酰)氨基]羰基]氨基甲基]苯基]-1H-吡唑-5-基)-3-(4-氯苯基)脲。1H NMR(CDCl3)δ7.38(m，1H)，7.36-7.42(m，3H)，7.23(d，J＝8.8Hz，2H)，7.40(d，J＝8.8Hz，2H)，6.43(s，1H)，4.59(s，1H)，4.43(s，2H)，1.81(s，2H)，1.33(s，9H)；MS(ESI)m/z574.10(M+H+)。
實施例8 標題化合物是用與實施例7類似的方法用實施例I制成的，得到1-(3-叔-丁基-1-[[3-N-[[(1-吡咯烷基磺酰)氨基]羰基]氨基甲基]-苯基]-1H-吡唑-5-基)-3-(萘-1-基)脲。1HNMR(CDCl3)δ7.88(m，2H)，7.02-7.39(m，2H)，7.43-7.50(m，7H)，6.48(s，1H)，4.45(s，1H)，3.32-3.36(m，4H)，1.77-1.81(m，4H)，1.34(s，9H)；MS(ESI)m/z590.03(M+H+)。
實施例9
在試劑BB(36mg，0.15mmol)、實施例I(62mg，0.15mmol)、HOBt(40mg，0.4mmol)和NMM(0.1mL，0.9mmol)的DMF(10mL)溶液中加入EDCI(58mg，0.3mmol)。攪拌過夜后，將混合物倒入水(15mL)中并用EtOAc(35mL)提取。將有機層合并，用鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，并在真空下濃縮。殘余物通過制備型TLC純化以得到1，5，7-三甲基-2，4-二氧代-3-氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷-7-羧酸3-[3-叔-丁基-5-(3-萘-1-基-脲基)-吡唑-1-基]苯甲酰胺(22mg)。1HNMR(CDCl3)δ8.40(s，1H)，8.14(d，J＝8.0Hz，2H)，7.91(s，1H)，7.87(s，1H)，7.86(d，J＝7.2Hz，1H)，7.78(d，J＝7.6Hz，1H)，7.73(d，J＝8.4Hz，1H)，7.69(d，J＝8.4Hz，1H)，7.57-7.40(m，4H)，7.34(d，J＝7.6Hz，1H)，6.69(s，1H)，6.32(t，J＝5.6Hz，1H)，5.92(brs，1H)，4.31(d，J＝5.6Hz，2H)，2.37(d，J＝14.8Hz，2H)，1.80(d，J＝13.2Hz，1H)，1.35(s，9H)，1.21(d，J＝13.2Hz，1H)，1.15(s，3H)，1.12(d，J＝12.8Hz，2H)，1.04(s，6H)；MS(ESI)m/z635(M+H+)。
實施例10 標題化合物是用與實施例9類似的方法用實施例J合成的，得到1，5，7-三甲基-2，4-二氧代-3-氮雜-二環(huán)[3.3.1]壬烷-7-羧酸3-{3-叔-丁基-5-[3-(4-氯-苯基)-脲基]-吡唑-1-基}苯甲酰胺。1HNMR(CDCl3)δ8.48(s，1H)，7.78(s，1H)，7.75(d，J＝8.0Hz，1H)，7.69(s，1H)，7.53(t，J＝8.0Hz，1H)，7.48(d，J＝8.8Hz，2H)，7.26(m，3H)，6.62(s，1H)，6.35(t，J＝6.0Hz，1H)，5.69(brs，1H)，4.26(d，J＝6.0Hz，2H)，2.48(d，J＝14.0Hz，2H)，1.87(d，J＝13.6Hz，1H)，1.35(s，9H)，1.25(m，6H)，1.15(s，6H)；MS(ESI)m/z619(M+H+)。
實施例11 將無水CH2Cl2(2mL)中實施例I(41mg，0.1mmol)、Kemp酸酐(24mg，0.1mmol)和Et3N(100mg，1mmol)的混合物在室溫下攪拌過夜并在真空下濃縮。在殘余物中加入無水苯(20mL)，將混合物回流3小時，在真空下濃縮并通過制備型HPLC純化以得到3-{3-[3-叔-丁基-5-(3-萘-1-基-脲基)-吡唑-1-基]-芐基}-1，5-二甲基-2，4-二氧代-3-氮雜二環(huán)[3.3.1]壬烷-7-羧酸(8.8mg，14％)。1H NMR(CD3OD)δ7.3-7.4(m，2H)，7.20(m，2H)，7.4-7.6(m，7H)，6.50(m，1H)，4.80(s，2H)，2.60(d，J＝14Hz，2H)，1.90(m，1H)，1.40(m，1H)，1.30(m，2H)，1.20(s，3H)，1.15(s，6H)；MS(ESI)m/z636(M+H+)。
實施例12 標題化合物是用與實施例11類似的方法用實施例J合成的，得到3-{3-[3-叔-丁基-5-(3-萘-1-基-脲基)-吡唑-1-基]-芐基}-1，5-二甲基-2，4-二氧代-3-氮雜-二環(huán)[3.3.1]壬烷-7-羧酸。1H NMR(CD3OD)δ7.2-7.5(m，7H)，6.40(s 1H)，4.70(s，2H)，2.60(d，J＝14Hz，2H)，1.90(m，1H)，1.50(m，1H)，1.45(s，9H)，1.30(m，2H)，1.21(s，3H)，1.18(s，6H)；MS(ES1)m/z620(M+H+)。
實施例13 標題化合物是用與實施例1類似的方法用實施例E和4，4-二甲基-3，5-二氧代-吡唑烷合成的，得到1-(3-叔-丁基-1-{3-[(4，4-二甲基-3，5-二氧代吡唑烷-1-基)甲基]苯基}-1H-吡唑-5-基)-3-(萘-1-基)脲。1HNMR(CD3OD)δ7.88-7.86(m，2H)，7.71-7.68(m，2H)，7.58(m，2H)，7.60-7.42(m，5H)，6.49(s，1H)，4.85(s，1H)，1.34(s，9H)，1.27(s，6H)；MS(ESI)m/z525(M+H+)。
實施例14 標題化合物是用與實施例1類似的方法用實施例G和4，4-二甲基-3，5-二氧代-吡唑烷合成的，得到1-(3-叔-丁基-1-{3-[(4，4二甲基-3，5-二氧代吡唑烷-1基)甲基]苯基}-1H-吡唑-5-基)-3-(4-氯苯基)脲。1H NMR(CD3OD)δ7.60-7.20(m，8H)，6.43(s，1H)，4.70(s，1H)，1.34(s，9H)，1.26(s，6H)；MS(ESI)m/z509，511(M+H+)。
實施例15 在MeOH中用2N LiOH皂化實施例B，并在所得酸(64.2mg，0.15mmol)中加入HOBt(30mg，0.225mmol)、實施例K(24mg，0.15mmol)和4-甲基嗎啉(60mg，0.60mmol 4.0當量)、DMF(3mL)以及EDCI(43mg，0.225mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜并倒入H2O(3mL)中，收集白色沉淀并通過制備型HPLC進一步純化得到1-[1-(3-{二[(甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲?；鶀苯基)-3-叔-丁基-1H-吡唑-5-基]-3-(萘-1-基)脲(40mg)。1H NMR(CDCl3)δ8.45(brs，1H)，8.10(d，J＝7.6Hz，1H)，7.86-7.80(m，2H)，7.63-7.56(m，2H)，7.52(s，1H)，7.47-7.38(m，3H)，7.36-7.34(m，1H)，7.26(s，1H)，7.19-7.17(m，2H)，6.60(s，1H)，3.98(s，2H)，3.81(s，3H)，2.87(s，3H)，2.63(s，3H)，1.34(s，9H)；MS(ESI)m/z570(M+H+)。
實施例16 標題化合物是用與實施例15類似的方法用實施例C(37mg)和實施例K合成的，得到1-[1-(3-{二[(甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲?；鶀苯基)-3-叔-丁基-1H-吡唑-5-基]-3-(4-氯苯基)脲。1H NMR(CD3OD)δ8.58(brs，1H)，8.39(brs，1H)，7.64-7.62(m，3H)，7.53-7.51(m，1H)，7.38(d，J＝9.2Hz，2H)，7.25(d，J＝8.8Hz，2H)，6.44(s，1H)，4.17(s，2H)，4.11(s，2H)，2.79(s，3H)，2.69(s，3H)，1.34-1.28(m，12H)；MS(ESI)m/z554(M+H+)。
實施例17 在MeOH中用2N LiOH皂化實施例B，在無水THF(25mL)中的所得酸(0.642g，1.5mmol)中邊劇烈攪拌邊加入新鮮蒸餾的三乙胺(0.202g，2.0mmol)和新戊酰氯(0.216g，1.80mmol)。在-78℃攪拌15分鐘并在0℃攪拌45分鐘后再將混合物冷卻至-78℃，然后轉(zhuǎn)移到D-4-苯基-噁唑烷-2-酮的鋰鹽的THF溶液中[*噁唑烷酮試劑的鋰鹽預(yù)先制得，方法是在-78℃下將n-BuLi(2.50M溶于己烷，1.20mL，3.0mmol)緩慢加入D-4-苯基-噁唑烷-2-酮的THF溶液]。反應(yīng)溶液在-78C下攪拌2小時并在室溫下過夜，然后用氯化銨水溶液淬滅并用二氯甲烷(100mL)提取。將合并的有機層干燥(Na2SO4)并在真空下濃縮。殘余物通過制備型HPLC純化以得到D-1-{5-叔-丁基-2-[3-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯基]-2H-吡唑-3-基}-3-(萘-1-基)脲(207mg，24％)。1H NMR(CDCl3)δ8.14-8.09(m，2H)，8.06(s，1H)，7.86-7.81(m，4H)，7.79(s，1H)，7.68-7.61(m，2H)，7.51-7.40(m，9H)，6.75(s，1H)，5.80(t，J＝9.2，7.6Hz，1H)，4.89(t，J＝9.2Hz，1H)，4.42(dd，J＝9.2，7.6Hz，1H)，1.37(s，9H)；MS(ESI)m/z574(M+H+)。
實施例18 標題化合物是用與實施例17類似的方法用實施例B和L-4-苯基-噁唑烷-2-酮合成的，得到L-1-{5-叔-丁基-2-[3-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯基]-2H-吡唑-3-基}-3-(萘-1-基)脲。1H NMR(CD3)δ8.14-8.09(m，2H)，8.06(s，1H)，7.86-7.81(m，4H)，7.79(s，1H)，7.68-7.61(m，2H)，7.51-7.40(m，9H)，6.75(s，1H)，5.80(t，J＝9.2，7.6Hz，1H)，4.89(t，J＝9.2Hz，1H)，4.42(dd，J＝9.2，7.6Hz，1H)，1.37(s，9H)；MS(ESI)m/z574(M+H+)實施例19 標題化合物是用與實施例17類似的方法用實施例C和D-4-苯基-噁唑烷-2-酮合成的，得到D-1-{5-叔-丁基-2-[3-(2-氧代-4-苯基噁唑烷基-3-羰基)苯基]-2H-吡唑-3-基}-3-(4-氯苯基)脲。1H NMR(CDCl3)δ7.91(s，1H)，7.85(d，J＝8.0Hz，1H)，7.79(d，J＝7.6Hz，1H)，7.71(m，1H)，7.65(m，1H)，7.49-7.40(m，8H)，7.26-7.24(m，2H)，6.68(s，1H)，5.77(dd，J＝8.8，8.0Hz，1H)，4.96(t，8.8Hz，1H)，4.44(dd，J＝8.8，8.0Hz，1H)，1.36(s，9H)；MS(ESI)m/z558(M+H+)實施例20 標題化合物是用與實施例17類似的方法用實施例C和L-4-苯基-噁唑烷-2-酮合成的，得到L-1-{5-叔-丁基-2-[3-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯基]-2H-吡唑-3-基}-3-(4-氯苯基)脲。1H NMR(CDCl3)δ7.91(s，1H)，7.85(d，J＝8.0Hz，1H)，7.79(d，J＝7.6Hz，1H)，7.71(m，1H)，7.65(m，1H)，7.49-7.40(m，8H)，7.26-7.24(m，2H)，6.68(s，1H)，5.77(dd，J＝8.8，8.0Hz，1H)，4.96(t，8.8Hz，1H)，4.44(dd，J＝8.8，8.0Hz，1H)，1.36(s，9H)；MS(ESI)m/z558(M+H+)
實施例L 在0℃氮氣下，在(3-硝基-苯基)-乙酸(2g)的CH2Cl2(40ml，含有催化量的DMF)懸液中邊攪拌邊逐滴加入草酰氯(1.1ml)。將反應(yīng)混合物攪拌40分鐘，加入嗎啉(2.5g)。攪拌20分鐘后過濾反應(yīng)混合物。濾液在真空下濃縮以得到固體狀的1-嗎啉-4-基-2-(3-硝基-苯基)-乙酮(2g)。將在乙醇(30ml)中的1-嗎啉-4-基-2-(3-硝基-苯基)-乙酮(2g)和10％碳載鈀(0.2g)在30psi下氫化3小時并通過硅藻土過濾。在真空下除去揮發(fā)性物質(zhì)得到2-(3-氨基-苯基)-1-嗎啉-4-基-乙酮(1.7g)。將2-(3-氨基-苯基)-1-嗎啉-4-基-乙酮(1.7g，7.7mmol)溶于6N HCl(15ml)，冷卻至0℃，并劇烈攪拌。加入硝酸鈉(0.54g)的水(8ml)溶液。30分鐘后，加入氯化錫(II)二水合物(10g)的6N HCl(30ml)溶液。將反應(yīng)混合物在0℃攪拌3小時。用固體氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至pH 14并用EtOAc提取。合并的有機提取物在真空下濃縮得到2-(3-肼-苯基)-1-嗎啉-4-基-乙酮(1.5g)。將2-(3-肼基苯基)-1-嗎啉-4-基-乙酮(3g)和4，4-二甲基-3-氧代戊腈(1.9g，15mmol)的乙醇(60ml)溶液和6N HCl(1ml)回流1小時，并冷卻至室溫。加入固體碳酸氫鈉總和反應(yīng)混合物。漿液過濾并在真空下除去揮發(fā)性物質(zhì)，得到的殘余物用乙酸乙酯提取。在真空下除去揮發(fā)性物質(zhì)以得到2-[3-(3-叔-丁基-5-氨基-1H-吡唑-1-基)苯基]-1-嗎啉代乙酮(4g)，其無需進一步純化即可使用。
實施例21 將無水CH2Cl2(4ml)中實施例L(0.2g，0.58mmol)和1-萘基異氰酸酯(0.10g，0.6mmol)的混合物在室溫下攪拌18小時。在真空下除去溶劑，粗制產(chǎn)物通過柱層析純化，用乙酸乙酯/己烷/CH2Cl2(3/1/0.7)作為洗脫液(0.11g，灰白色固體)，得到1-{3-叔-丁基-1-[3-(2-嗎啉代-2-氧代乙基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲。mp194-196；1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ9.07(1H，s)，8.45(s，1H)，8.06-7.93(m，3H)，7.69-7.44(m，7H)，7.33-7.29(d，6.9Hz，1H)，6.44(s，1H)，3.85(m，2H)，3.54-3.45(m，8H)，1.31(s，9H)；MS實施例22 標題化合物是用與實施例21類似的方法用實施例L(0.2g，0.58mmol)和4-氯苯基異氰酸酯(0.09g，0.6mmol)合成的，得到1-{3-叔-丁基-1-[3-(2-嗎啉代-2-氧代乙基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲。mp100-104；1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ9.16(s，1H)，8.45(s，1H)，7.52-7.30(m，8H)，6.38(s，1H)，3.83(m，1H)，3.53-3.46(m，8H)，1.30(s，9H)；MS實施例23 標題化合物是用與實施例21類似的方法用實施例L(0.2g，0.58mmol)和苯基異氰酸酯(0.09g，0.6mmol)合成的，得到1-{3-叔-丁基-1-[3-(2-嗎啉代-2-氧代乙基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-苯基脲。
實施例24
標題化合物是用與實施例21類似的方法用實施例L(0.2g，0.58mmol)和1-異氰酸根-4-甲氧基-萘合成的，得到1-{3-叔-丁基-1-[3-(2-嗎啉代-2-氧代乙基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(1-甲氧基萘-4-基)脲。
實施例M 標題化合物是用與實施例C類似的方法用實施例A和苯基異氰酸酯合成的，得到3-(3-叔-丁基-5-(3-苯基脲基)-1H-吡唑-1-基)苯甲酸乙酯。
實施例N 將(3-硝基苯基)乙酸(23g，127mmol)的甲醇(250ml)溶液和催化量的濃硫酸加熱回流18小時。反應(yīng)混合物在真空下濃縮得到黃色油狀物。將其溶于甲醇(250ml)并在冰浴中攪拌18小時，在溶液上面充入緩慢流動的氨。在真空下除去揮發(fā)性物質(zhì)。殘余物用二乙醚洗滌并干燥以得到2-(3-硝基苯基)乙酰胺(14g，灰白色固體)。1HNMR(CDCl3)δ 8.1(s，1H)，8.0(d，1H)，7.7(d，1H)，7.5(m，1H)，7.1(bd s，1H)，6.2(brs，1H)，3.6(s，2H)。
將上述反應(yīng)的粗物質(zhì)(8g)和10％碳載鈀(1g)在乙醇(100ml)中于30psi下氫化18小時并通過硅藻土過濾。在真空下除去揮發(fā)性物質(zhì)得到2-(3-氨基苯基)乙酰胺(5.7g)。將該物質(zhì)(7g，46.7mmol)的溶液溶于6N HCl(100ml)，冷卻至0℃，并劇烈攪拌。加入硝酸鈉(3.22g，46.7mmol)水(50ml)溶液。30分鐘后加入溶于6NHCl(100ml)的氯化錫(II)二水合物(26g)。反應(yīng)混合物在0℃攪拌3小時。用50％NaOH水溶液將pH調(diào)至pH14并用乙酸乙酯提取。合并的有機提取物在真空下濃縮得到2-(3-肼基苯基)乙酰胺。
將乙醇(60ml)和6N HCl(1.5ml)中的上述反應(yīng)的粗物質(zhì)(約15mmol)和4，4-二甲基-3-氧代戊腈(1.85g，15mmol)回流1小時并冷卻至室溫。加入固體碳酸氫鈉中和反應(yīng)混合物。漿液過濾并在真空下除去揮發(fā)性物質(zhì)得到殘余物，該殘余物用乙酸乙酯提取。在真空下除去溶劑以得到白色固體狀的2-[3-(3-叔-丁基-5-氨基-1H-吡唑-1-基)苯基]乙酰胺(3.2g)，其無需進一步純化即可使用。
實施例25 將無水CH2Cl2(4ml)中的實施例N(2g，0.73mmol)和1-萘基異氰酸酯(0.124g，0.73mmol)的混合物在室溫氮氣下攪拌18小時。在真空下除去溶劑，粗制產(chǎn)物用乙酸乙酯(8ml)洗滌并在真空下干燥得到白色固體狀的1-{3-叔-丁基-1-[3-(氨基甲?；谆?苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲(0.22g)。mp230(dec.)；1HNMR(200MHz，DMSO-d6)δ9.12(s，1H)，8.92(s，1H)，8.32-8.08(m，3H)，7.94-7.44(m，8H)，6.44(s，1H)，3.51(s，2H)，1.31(s，9H)；MS實施例26
標題化合物是用與實施例23類似的方法用實施例N(0.2g，0.73mmol)和4-氯苯基異氰酸酯(0.112g，0.73mmol)合成的，得到白色固體狀的1-{3-叔-丁基-1-[3-(氨基甲?；谆?苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(0.28g)。mp222224.(dec.)；1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ9.15(s，1H)，8.46(s，1H)，7.55-7.31(m，8H)，6.39(s，1H)，3.48(s，2H)，1.30(s，9H)；MS實施例O 標題化合物是用與實施例C類似的方法用實施例A和1-異氰酸根-4-甲氧基-萘合成的，得到3-(3-叔-丁基-5-(3-(1-甲氧基萘-4-基)脲基)-1H-吡唑-1-基)苯甲酸乙酯。
實施例27
標題化合物是用與實施例17類似的方法用實施例M和D-4-苯基-噁唑烷-2-酮合成的，得到D-1-{5-叔-丁基-2-[3-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯基]-2H-吡唑-3-基}-3-苯基脲。
實施例28 標題化合物是用與實施例17類似的方法用實施例M和L-4-苯基-噁唑烷-2-酮合成的，得到L-1-{5-叔-丁基-2-[3-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯基]-2H-吡唑-3-基}-3-苯基脲。
實施例P 將3-(3-氨基-苯基)-丙烯酸甲酯(6g)和10％碳載鈀(1g)的混合物在乙醇(50ml)中于30psi下氫化18小時并通過硅藻土過濾。在真空下除去揮發(fā)性物質(zhì)得到3-(3-氨基-苯基)丙酸甲酯(6g)。
邊劇烈攪拌邊將上述反應(yīng)的粗物質(zhì)(5.7g，31.8mmol)溶液溶于6N HCl(35ml)，并冷卻至0℃，加入硝酸鈉(2.2g)水(20ml)溶液。1小時后加入溶于6N HCl(35ml)的氯化錫(II)二水合物(18g)?；旌衔镌?℃攪拌3小時。用KOH固體將pH調(diào)至pH14并用EtOAc提取。合并的有機提取物在真空下濃縮得到3-(3-肼基-苯基)丙酸甲酯(1.7g)。
將乙醇(30ml)和6N HCl(2ml)中的上述反應(yīng)的粗物質(zhì)(1.7g，8.8mmol)和4，4-二甲基-3-氧代戊腈(1.2g，9.7mmol)的溶液邊攪拌邊回流18小時，并冷卻至室溫。在真空下除去揮發(fā)性物質(zhì)，將殘余物溶于EtOAc并用1N NaOH水溶液洗滌。將有機層干燥(Na2SO4)，在真空下濃縮并通過柱層析純化殘余物，用30％乙酸乙酯的己烷溶液作為洗脫液，得到3-[3-(3-叔-丁基-5-氨基-1H-吡唑-1-基)苯基]丙酸甲酯(3.2g)，其無需進一步純化即可使用實施例29 在氮氣下將無水CH2Cl2(5ml)中的實施例P(0.35g，1.1mmol)和1-萘基異氰酸酯(0.19g，1.05mmol)的混合物在室溫下攪拌20小時。在真空下除去溶劑并將殘余物在含有氫氧化鋰(0.1g)的THF(3ml)/MeOH(2ml)/水(1.5ml)溶液中在室溫下攪拌3小時，隨后用EtOAc和稀檸檬酸溶液稀釋。將有機層干燥(Na2SO4)，并在真空下除去揮發(fā)性物質(zhì)。殘余物通過柱層析純化，用3％的甲醇的CH2Cl2溶液作為洗脫液，得到3-(3-{3-叔-丁基-5-[3-(萘-1-基)脲基]-1H-吡唑-1-基}苯基丙酸(0.22g，褐色固體)。mp105-107；1H NMR(200MHz，CDCl3)δ7.87-7.36(m，10H)，7.18-7.16(m，1H)，6.52(s，1H)，2.93(t，J＝6.9Hz，2H)，2.65(t，J＝7.1Hz，2H)，1.37(s，9H)；MS實施例30
標題化合物是用與實施例29類似的方法用實施例P(0.30g，0.95mmol)和4-氯苯基異氰酸酯(0.146g，0.95mmol)合成的，得到3-(3-{3-叔-丁基-5-[3-(4-氯苯基)脲基]-1H-吡唑-1-基)苯基)丙酸(0.05g，白色固體)。mp8587；1H NMR(200MHz，CDCl3)δ8.21(s，1H)，7.44-7.14(m，7H)，6.98(s，1H)，6.55(s，1H)，2.98(t，J＝5.2Hz，2H)，2.66(t，J＝5.6Hz，2H)，1.40(s，9H)；MS實施例Q 將3-(4-氨基苯基)丙烯酸乙酯(1.5g)和10％碳載鈀(0.3g)的混合物在乙醇(20ml)中于30psi下氫化18小時，并通過硅藻土過濾。在真空下除去揮發(fā)性物質(zhì)得到3-(4-氨基苯基)丙酸乙酯(1.5g)。
將上述反應(yīng)的粗物質(zhì)(1.5g，8.4mmol)的溶液溶于6N HCl(9ml)，冷卻至0℃，并劇烈攪拌。加入硝酸鈉(0.58g)的水(7ml)溶液。1小時后加入溶于6N HCl(10ml)的氯化錫(II)二水合物(5g)。將反應(yīng)混合物在0℃攪拌3小時。用KOH固體將pH調(diào)至pH14并用EtOAc提取。合并的有機提取物在真空下濃縮得到3-(4-肼基-苯基)-丙酸乙酯(1g)。
將溶于乙醇(8ml)和6N HCl(1ml)的上述反應(yīng)的粗物質(zhì)(1g，8.8mmol)和4，4-二甲基-3-氧代戊腈(0.7g)回流18小時，并冷卻至室溫。在真空下除去揮發(fā)性物質(zhì)。殘余物溶于乙酸乙酯并用1N氫氧化鈉水溶液洗滌。將有機層干燥(Na2SO4)并在真空下濃縮。殘余物通過柱層析純化，用0.7％的甲醇的CH2Cl2溶液作為洗脫液，得到3-{4-[3-叔-丁基-5-(3-(萘-1-基)脲基)-1H-吡唑-1-基]苯基}丙酸乙酯(0.57g)。
實施例31
將無水CH2Cl2(5ml)中的實施例Q(0.25g，0.8mmol)和1-萘基異氰酸酯(0.13g，0.8mmol)的混合物在氮氣下室溫攪拌20小時。在真空下除去溶劑，將殘余物在含有氫氧化鋰(0.1g)的THF(3ml)/MeOH(2ml)/水(1.5ml)溶液中室溫下攪拌3小時，并用EtOAc和稀檸檬酸溶液稀釋。將有機層干燥(Na2SO4)，并在真空下除去揮發(fā)性物質(zhì)。殘余物通過柱層析純化，用4％的甲醇的CH2Cl2溶液作為洗脫液，得到3-{4-[3-叔-丁基-5-(3-(萘-1-基)脲基]-1H-吡唑-1-基3苯基)丙酸(0.18g，灰白色固體)。mp120122；1H NMR(200MHz，CDCl3)δ7.89-7.06(m，11H)，6.5(s，1H)，2.89(m，2H)，2.61(m，2H)，1.37(s，9H)；MS實施例32 標題化合物是用與實施例31類似的方法用實施例Q(0.16g，0.5mmol)和4-氯苯基異氰酸酯(0.077g，0.5mmol)合成的，得到3-{4-[3-叔-丁基-5-(3-(4-氯苯基)脲基]-1H-吡唑-1-基}苯基)丙酸(0.16g，灰白色固體)。mp112-114；1H NMR(200MHz，CDCl3)δ8.16(s，1H)，7.56(s，1H)，7.21(s，2H)，7.09(s，2H)，6.42(s，1H)，2.80(m，2H)，2.56(m，2H)，1.32(s，9H)；MS實施例R
在250mL壓力容器(ACE Glass Teflon螺帽)中裝入溶于THF(約100mL)的3-硝基二苯基(20g，0.10mol)和10％Pd/C(3g)。在反應(yīng)容器中充入氫氣(g)并吹掃3次。在反應(yīng)容器中充入40psi H2(g)并將其置于Parr振動式氫化裝置上在室溫下振蕩過夜。HPLC顯示反應(yīng)完成，通過硅藻土床過濾反應(yīng)混合物并蒸發(fā)以得到胺16.7g(產(chǎn)率98％)在放入磁性攪拌棒的250mL錐形燒瓶中，將上述反應(yīng)的粗物質(zhì)(4.40g，0.026mol)加入6N HCl(40mL)，并用冰浴冷卻至約0℃。逐滴加入NaNO2(2.11g，0.0306mol，1.18eq.)的水(5mL)溶液。30分鐘后加入SnCl2·2H2O(52.0g，0.23mol，8.86eq.)的6N HCl(100mL)溶液并將反應(yīng)混合物攪拌3小時，然后將其轉(zhuǎn)移到500mL圓底燒瓶中。在其中加入4，4-二甲基-3-氧代戊腈(3.25g，0.026mol)和EtOH(100ml)并將混合物回流4h，在真空下濃縮，殘余物用EtOAc(2×100mL)提取。殘余物用己烷/EtOAc/Et3N(8∶2∶0.2)通過柱層析純化，得到0.53g實施例R。1H NMR(CD3)δ7.5(m，18H)，5.8(s，1H)，1.3(s，9H)。
實施例33 在放入磁性攪拌棒的干燥小瓶中將實施例R(0.145g；0.50mmol)溶于2mLCH2Cl2(無水)，然后加入苯基異氰酸酯(0.0544mL；0.50mmol；1eq.)。將反應(yīng)物在氬氣下攪拌17小時。蒸發(fā)溶劑后得到一種晶體物質(zhì)，將其與己烷/EtOAc(4∶1)一起研磨并過濾以得到1-(3-叔-丁基-1-(3-苯基苯基)-1H-吡唑-5-基)-3-苯基脲(0.185g，90％)。HPLC純度96％；mp8084；1H NMR(CDCl3)δ7.3(m，16H)，6.3(s，1H)，1.4(s，9H)。
實施例34 標題化合物是用與實施例33類似的方法用實施例R(0.145g；0.50mmol)和對-氯苯基異氰酸酯(0.0768g，0.50mmol，leq.)合成的，得到1-(3-叔-丁基-1-(3-苯基苯基)-1H-吡唑-5-基)-3-(4-氯苯基)脲(0.205g，92％)。HPLC純度96.5％；mp134136；1H NMR(CDCl3)δ7.5(m，14H)，7.0(s，1H)，6.6(s，1H)，6.4(s，1H)，1.4(s，9H)。
實施例S 標題化合物是用與實施例C類似的方法用實施例A和4-氟苯基異氰酸酯合成的，得到3-(3-叔-丁基-5-(3-(4-氟苯基)脲基)-1H-吡唑-1-基)苯甲酸乙酯。
實施例35 標題化合物是用與實施例17類似的方法用實施例M和D-4-苯基-噁唑烷-2-酮合成的，得到D-1-{5-叔-丁基-2-[3-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯基]-2H-吡唑-3-基}-3--(萘-1-基)脲。
實施例36 標題化合物是用與實施例29類似的方法用實施例P(0.30g，0.95mmol)和4-氟苯基異氰酸酯(0.146g，0.95mmol)合成的，得到3-(3-(3-叔-丁基-5-(3-(4-氟苯基)脲基)-1H-吡唑-1-基)苯基)丙酸。
實施例T 在實施例N(2g，7.35mmol)的THF(6ml)溶液中邊攪拌邊加入硼烷-甲基硫化物(18mmol)。將混合物加熱回流90分鐘并冷卻至室溫，之后加入6N HCl并加熱回流10分鐘。用NaOH將混合物堿化并用EtOAc提取。將有機層干燥(Na2SO4)，過濾，并在真空下濃縮以得到3-叔-丁基-1-[3-(2-氨基乙基)苯基]-1H-吡唑-5胺(0.9g)。
將無水CH2Cl2(5ml)中的上述反應(yīng)的粗物質(zhì)(0.8g，3.1mmol)和二-叔-丁基碳酸酯(0.7g，3.5mmol)以及催化量的DMAP在氮氣下室溫攪拌18小時。反應(yīng)混合物在真空下濃縮，殘余物通過柱層析純化，用1％的甲醇的CH2Cl2溶液作為洗脫液，得到3-(3-叔-丁基-5-氨基-1H-吡唑-1-基)苯基氨基甲酸叔丁酯(0.5g)。
實施例37
將無水CH2Cl2(5ml)中的實施例T(0.26g，0.73mmol)和1-萘基異氰酸酯(0.123g，0.73mmol)的混合物在氮氣下室溫攪拌48小時。在真空下除去溶劑，殘余物通過柱層析純化，用1％的甲醇的CH2Cl2溶液作為洗脫液(0.15g，灰白色固體)。該固體用TFA(0.2ml)處理5分鐘并用EtOAc稀釋。有機層用飽和NaHCO3溶液和鹽水洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾，并在真空下濃縮以得到固體狀的1-{3-叔-丁基-1-[3-(2-氨基乙基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲(80mg)。mp110-112；1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ9.09(s，1H)，8.90(s，1H)，8.01-7.34(m，11H)，6.43(s，1H)，3.11(m，2H)，2.96(m，2H)，1.29(s，9H)；MS實施例38 標題化合物是用與實施37例類似的方法用實施例T(0.15g，0.42mmol)和4-氯苯基異氰酸酯(0.065g，0.42mmol)合成的，得到灰白色固體的1-{3-叔-丁基-1-[3-(2-氨基乙基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(20mg)。mp125-127；1H NMR(200MHz，CDCl3)δ8.81(s，1H)，8.66(s，1H)，7.36-7.13(m，8H)，6.54(s，1H)，3.15(brs，2H)，2.97(brs，2H)，1.32(s，9H)；MS實施例U
在放入磁性攪拌棒的250mL錐形瓶中將間-甲氧基苯胺(9.84g，0.052mol)加入6N HCl(80mL)并用冰浴冷卻至0℃。逐滴加入NaNO2(4.22g，0.0612mol，1.18eq.)的水(10mL)溶液。30分鐘后加入SnCl2·2H2O(104.0g，0.46mol，8.86eq.)的6N HCl(200mL)溶液并將反應(yīng)混合物攪拌3小時，隨后轉(zhuǎn)移到1000mL圓底燒瓶。在其中加入4，4-二甲基-3-氧代戊腈(8.00g，0.064mol)和EtOH(200mL)，并將混合物回流4小時，在真空下濃縮，殘余物從CH2Cl2中重結(jié)晶以得到3-叔-丁基-1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-胺，其為鹽酸鹽(13.9g)。
將上述反應(yīng)的粗物質(zhì)(4.65g，0.165mol)溶于30mL CH2Cl2，其中含有Et3N(2.30mL，0.0165mol，1eq.)，并攪拌30分鐘。用水提取，然后用硫酸鈉干燥有機相并在真空下濃縮以得到棕色漿液，其為游離堿3-叔-丁基-1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-胺(3.82g，94.5％)，其無需進一步純化即可使用。
實施例39 在放入磁性攪拌棒的干燥小瓶中將實施例U(2.62g，0.0107mol)溶于CH2Cl2(5mL，無水)，隨后加入1-萘基異氰酸酯(1.53mL，0.0107mol，1eq.)。將反應(yīng)物置于氬氣下并攪拌18小時。蒸發(fā)溶劑，然后進行柱層析，用EtOAc/己烷/Et3N(7∶2∶0.5)作為洗脫液，得到1-[3-叔-丁基-1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-(萘-1-基)脲(3.4g，77％)。HPLC97％；mp78-80；1HNMR(CDCl3)δ7.9-6.8(m，15H)，6.4(s，1H)，3.7(s，3H)，1.4(s，9H)。
實施例40
標題化合物是用與實施例39類似的方法用實施例U(3.82g；0.0156mol)和對-氯苯基異氰酸酯(2.39g，0.0156mol，1eq.)合成的，通過與己烷/EtOAc(4∶1)一起研磨來純化，并過濾以得到1-[3-叔-丁基-1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-(4-氯苯基)脲(6.1g，98％)。HPLC純度95％；mp158-160；1H NMR(CDCl3)δ7.7(s，1H)；87.26.8(m，8H)，6.4(s，1H)，3.7(s，3H)，1.3(s，9H)。
實施例41 在放入磁性攪拌棒的100ml圓底燒瓶中將實施例39(2.07g)溶于CH2Cl2(20mL)并用冰浴冷卻至0℃。慢慢加入BBr3(1M，溶于CH2Cl2；7.5mL)。使反應(yīng)混合物回復(fù)室溫并過夜。再加入BBr3(1M，溶于CH2Cl2，2×1mL，總共加入9.5mmol)，并通過加入MeOH淬滅反應(yīng)。將溶劑蒸發(fā)得到一種晶體物質(zhì)，在硅膠(30g)上層析，用CH2Cl2/MeOH(9.6∶0.4)作為洗脫液，得到1-[3-叔-丁基-1-(3-羥基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-(萘-1-基)脲(0.40g，20％)。1H NMR(DMSO-d6)δ9.0(s，1H)，8.8(s，1H)，8.1-6.8(m，11H)，6.4(s，1H)，1.3(s，9H)。MS(ESI)m/z401(M+H+)。
實施例42
標題化合物是用與實施例41類似的方法用實施例40(2.00g，5mmol)合成的，得到一種晶體物質(zhì)，將該物質(zhì)過濾并用MeOH洗滌以得到1-[3-叔-丁基-1-(3-羥基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-(4-氯苯基)脲(1.14g，60％)。HPLC純度96％；mp214-216；IH NMR(CDCl3)δ8.4(s，1H)，7.7(s，1H)，7.4-6.6(m，9H)，1.3(s，9H)。
實施例V 起始物質(zhì)1-[4-(氨基甲基)苯基]-3-叔-丁基-N-亞硝基-1H-吡唑-5-胺是用與實施例A類似的方法用4-氨基苯甲酰胺和4，4-二甲基-3-氧代戊腈合成的。
一個1L的四頸圓底燒瓶上裝有攪拌棒、干燥氬氣源、加熱套和回流冷凝器。在該燒瓶中充入氬氣并裝入上述反應(yīng)的粗物質(zhì)(12g，46.5mmol；258.1g/mol)和無水THF(500ml)。用LiAlH4(2.65g，69.8mmol)小心處理該溶液并將反應(yīng)物攪拌過夜。將反應(yīng)物加熱回流并加入其余的LiAlH4(總共加入8.35g)。將反應(yīng)物冷卻至0℃并依次加入水(8.4ml)、15％NaOH(8.4ml)和水(24ml)。將混合物攪拌2小時，通過硅藻土過濾固體物質(zhì)，用THF充分洗滌，溶液在真空下濃縮以得到油狀的1-(4-(氨基甲基-3-甲氧基)苯基)-3-叔-丁基-1H-吡唑-5-胺(6.8g)。
在一個40mL小瓶上裝置攪拌棒、隔片和氬氣源。在該小瓶中裝入上述反應(yīng)的粗物質(zhì)(2g，8.2mmol，244.17g/mol)和CHCl3(15mL)，在氬氣下冷卻至0℃，并用2分鐘時間逐滴加入溶于CHCl3(5mL)的二-叔-丁基碳酸酯(1.9g，9.0mmol)?；旌衔镉?N KOH(2mL)處理，在2小時內(nèi)加入。加入飽和的NaCl溶液破碎所得乳液，將各層分離，水相用CH2Cl2(2×1.5ml)提取。合并的有機相用硫酸鈉干燥，過濾，在真空下濃縮以得到淡黃色固體狀的[4-(3-叔-丁基-5-氨基-1H-吡唑-1-基)-2-甲氧基芐基氨基甲酸叔丁酯(2.23g，79％)。1H NMR(CDCl3)δ7.4(m，5H)，5.6(s，1H)，4.4(d，2H)，1.5(s，9H)，1.3(s，9H)。
實施例43 在一個40mL小瓶上裝置隔片、攪拌棒和氬氣源，并裝入實施例V(2g，5.81mmol)，用氬氣吹掃，并溶于CHCl3(20mL)。溶液用溶于CHCl3(5mL)的2-萘基異氰酸酯(984mg，5.81mmol)處理，在1分鐘內(nèi)加入。將反應(yīng)物攪拌8h，再加入1-萘基異氰酸酯(81mg)并將反應(yīng)物攪拌過夜。將固體過濾并用CH2Cl2洗滌以得到4-[3-叔-丁基-5-(3-萘-1-基)脲基]-1H-吡唑-1-基]芐基氨基甲酸叔丁酯(1.2g)。HPLC純度94.4％；1H NMR(DMSO-d6)δ9.1(s，1H)，8.8(s，1H)，8.0(m，3H)，7.6(m，9H)，6.4(s，1H)，4.2(d，2H)，1.4(s，9H)，1.3(s，9H)。
實施例44 標題化合物是用與實施例43類似的方法用實施例V(2.0g，5.81mmol)和對-氯苯基異氰酸酯(892mg)合成的，得到叔-丁基4-[3-叔-丁基-5-(3-(4-氯苯基)脲基)-1H-吡唑-1-基]芐基氨基甲酸酯(1.5g)。HPLC純度97％；1H NMR(DMSO-d6)δ9.2(s，1H)，8.4(s，1H)，7.4(m，8H)，6.4(s，1H)，4.2(d，2H)，1.4(s，9H)，1.3(s，9H)。
實施例45
用氬氣吹掃一個放入攪拌棒的10mL燒瓶，并在其中裝入實施例43(770mg，1.5mmol)和CH2Cl2(1ml)和1∶1的CH2Cl2∶TFA(2.5mL)。1.5小時后，在真空下濃縮反應(yīng)混合物，將殘余物溶于EtOAc(15mL)，用飽和的NaHCO3(10mL)和飽和的NaCl(10mL)洗滌。將有機層干燥，過濾，并在真空下濃縮，得到1-{3-叔-丁基-1-[4-(氨基甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲(710mg)。1H NMR(DMSO-d6)δ7.4(m，11H)，6.4(s，1H)，3.7(s，2H)，1.3(s，9H)。
實施例46 標題化合物是用與實施例45類似的方法用實施例44(1.5g，1.5mmol)合成的，得到1-{3-叔-丁基-1-[4-(氨基甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(1.0g)。HPLC純度93.6％；mp100-102；1H NMR(CDCl3)δ8.6(s，1H)，7.3(m，8H)，6.3(s，1H)，3.7(brs，2H)，1.3(s，9H)。
實施例47
在氬氣下，在10ml的小瓶中裝入實施例45(260mg，63mmol)和無水EtOH(3mL)。用3分鐘逐滴加入二乙烯砜(63uL，74mg，.63mmol)并將反應(yīng)物在室溫下攪拌1.5小時。在真空下濃縮以得到黃色固體，通過制備型TLC進行純化，用5％MeOH∶CH2Cl2展開。切下主要的條帶，并用1∶1 EtOAc∶MeOH洗脫去硅，過濾，并在真空下濃縮以得到1-{3-叔-丁基-1-[4-(1，1-二氧代硫代嗎啉-4-基)甲基苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲(150mg)。HPLC純度96％；1H NMR(DMSO-d6)δ9.1(s，1H)，9.0(s，1H)，7.9(m，3H)，7.5(m，8H)，6.4(s，1H)，3.1(brs，4H)，2.9(brs，4H)，1.3(s，9H)。
實施例48 標題化合物是用與實施例47類似的方法用實施例46(260mg，0.66mmol)合成的，得到1-{3-叔-丁基-1-[4-(1，1-二氧代硫代嗎啉-4-基)甲基苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(180mg)。HPLC純度93％；mp136-138；1H NMR(DMSO-d6)δ9.2(s，1H)，8.5(s，1H)，7.4(m，9H)，6.4(s，1H)，3.1(brs，4H)，3.0(brs，4H)，1.3(s，9H)。
實施例49
0℃下，在氯磺酰異氰酸酯(0.35g，5mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液中邊攪拌邊加入吡咯烷(0.18g，5mmol)，加入速度為不使反應(yīng)物的溫度超過5℃。攪拌2小時后加入實施例41(1.10g，6.5mmol)和三乙胺(0.46g，9mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液。當加入結(jié)束時，使混合物回復(fù)室溫并攪拌過夜。將反應(yīng)混合物倒入用NaCl飽和的10％HCl(10mL)，將有機層分離并用乙醚(20mL)提取水層。將合并的有機層干燥(Na2SO4)并在真空下濃縮，通過制備型HPLC純化以得到(吡咯烷-1-羰基)氨基磺酸3-[3-叔-丁基-5-(3-萘-1-基-脲基)-吡唑-1-基]苯酯(40mg)。1H NMR(CD3)δ9.12(brs，1H)，8.61(brs，1H)，7.85-7.80(m，3H)，7.65(d，J＝8.0Hz，2H)，7.53-7.51(m，1H)，7.45-7.25(m，5H)，6.89(s，4H)，3.36-3.34(brs，1H)，3.14-3.13(brs，2H)，1.69(brs，2H)，1.62(brs，2H)，1.39(s，9H)；MS(ESI)m/z577(M+H+)。
實施例50 標題化合物是用與實施例49類似的方法用實施例42合成的，得到(吡咯烷-1-羰基)氨基磺酸3-[3-叔-丁基-5-(4-氯苯基-1基-脲基)吡唑-1基]苯酯。MS(ESI)m/z561(M+H+)。
實施例W
將固體4-甲氧基苯基肼鹽酸(25.3g)懸浮于甲苯(100mL)并用三乙胺(20.2g)處理。混合物在室溫下攪拌30分鐘并用新戊酰乙腈(18g)處理。將反應(yīng)物加熱回流并攪拌過夜。過濾熱的混合物，固體用己烷洗滌并在真空下干燥以得到3-叔-丁基-1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-胺(25g，70％)。1H NMR(DMSO-d6)δ7.5(d，2H)，7.0(d，1H)，6.4(s，1H)，6.1(s，2H)，3.9(s，3H)，1.3(s，9H)。
實施例51 在1-異氰酸根-4-甲氧基-萘(996mg)的無水CH2Cl2(20mL)溶液中加入實施例W(1.23g)。將反應(yīng)溶液攪拌3小時，將所得白色沉淀過濾，用10％HCl處理并從MeOH中重結(jié)晶，在真空下干燥以得到白色晶體狀的1[3-叔-丁基-1(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-(1-甲氧基萘-4-基-脲(900mg，40％)。HPLC純度96％；mp143-144；1H NMR(DMSO-d6)δ8.8(s，1H)，8.5(s，1H)，8.2(d，1H)，8.0(d，1H)，7.6(m，5H)，7.1(d，2H)，7.0(d，1H)，6.3(s，1H)，4.0(s，3H)，3.9(s，3H)；1.3(s，9H)。
實施例52
標題化合物是用與實施例51類似的方法用實施例W和對-溴苯基異氰酸酯(990mg)合成的，得到灰白色晶體狀的1-{3-叔-丁基-1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-基}-3-(4-溴苯基)脲(1.5g，68％)。HPLC純度98％；mp200-201；1HNMR(DMSO-d6)δ9.3(s，1H)，8.3(s，1H)，7.4(m，6H)，7.0(d，2H)，6.3(s，1H)，3.8(s，3H)，1.3(s，9H)。
實施例53 標題化合物是用與實施例51類似的方法用實施例W和對-氯苯基異氰酸酯(768mg)合成的，得到白色晶體狀的1-{3-叔-丁基-1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(1.3g，65％)。HPLC純度98％；mp209-210；1H NMR(DMSO-d6)δ9.1(s，1H)，8.3(s，1H)，7.4(m，4H)，7.3(d，2H)，7.1(d，2H)，6.3(s，1H)，3.8(s，3H)，1.3(s，9H)。
實施例54
標題化合物是用與實施例41類似的方法用實施例53(500mg)合成的，得到白色晶體狀的1-{3-叔-丁基-1-(4-羥基苯基)-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(300mg，62％)。HPLC純度94％；mp144-145；1H NMR(DMSO-d6)δ9.7(s，1H)，9.1(s，1H)，8.3(s，1H)，7.4(d，2H)，7.3(m，4H)；6.9(d，2H)，6.3(s，1H)，1.3(s，9H)實施例55 標題化合物是用與實施例41類似的方法用實施例52(550mg)合成的，得到白色結(jié)晶固體狀的1-{3-叔-丁基-1-(4-羥基苯基)-1H-吡唑-5-基}-3-(4-溴苯基)脲(400mg，70％)。HPLC純度93％；mp198-200；1H NMR(DMSO-d6)δ9.7(s，1H)，9.2(s，1H)，8.3(s，1H)，7.4(d，4H)，7.2(m，2H)，6.9(d，2H)，6.3(s，1H)，1.3(s，9H)。
實施例X 甲基4-(3-叔-丁基-5-氨基-1H-吡唑-1-基)苯甲酸酯(3.67mmol)是按照Regan等的方法(J.Med.Chem.，45，2994(2002))從甲基4-肼基苯甲酸酯和新戊酰乙腈制備的。
實施例56
在一個500mL的圓底燒瓶中放入磁力攪拌棒并置于冰浴中。在該燒瓶中裝入實施例X(1g)并將其溶于CH2Cl2(100mL)。加入飽和碳酸氫鈉(100mL)并迅速攪拌混合物，用冰浴冷卻并用雙光氣(1.45g)處理，并將不均一的混合物攪拌1小時。將各層分離，CH2Cl2層用叔丁醇(1.07g)處理，溶液在室溫下攪拌過夜。該溶液用水(2×150mL)洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾，在真空下濃縮，并通過急驟層析純化，用1∶2乙酸乙酯∶己烷作為洗脫液，得到灰白色固體狀的1-(4-(甲氧基羰基)苯基)-3-叔-丁基-1H-吡唑-5-基氨基甲酸叔丁酯(100mg)。1HNMR(DMSO-D6)δ9.2(s，1H)，8.1(d，2H)，7.7(d，2H)，6.3(s，1H)，3.3(s，3H)，1.3(s，18H)。
實施例57 標題化合物是用與實施例41類似的方法用實施例X(1.37g)和對-氯苯基異氰酸酯(768mg)合成的，得到白色晶體狀的4-{3-叔-丁基-5-[3-(4-氯苯基)脲基]-1H-吡唑-1-基}苯甲酸甲酯(1.4g 66％)。HPLC純度98％；mp160-161；1H NMR(DMSO-d6)δ9.2(s，1H)，8.6(s，1H)，8.1(d，2H)，7.8(d，2H)，7.5(d，2H)，7.3(d，2H)，6.4(s，1H)，3.9(s，3H)，1.3(s，9H)。
實施例58
標題化合物是用與實施例41類似的方法用實施例X(1.27g)和1-異氰酸根-4-甲氧基-萘(996mg)合成的，得到白色晶體狀的4-{3-叔-丁基-5-[3-(1-甲氧基萘-4-基)脲基]-1H-吡唑-1-基}苯甲酸甲酯(845mg，36％)。HPLC純度98％；mp278-280；1H NMR(DMSO-d6)δ8.76(s，1H)，8.73(s，1H)，8.1(m，3H)，7.9(d，1H)，7.7(d，2H)，7.6(m，3H)，7.0(d，1H)，7.0(d，1H)，6.3(s，1H)，4.0(s，3H)，3.9(s，3H)，1.3(s，9H)。
實施例59 標題化合物是用與實施例41類似的方法用實施例X(1.37g)和對-溴苯基異氰酸酯(990mg)合成的，得到白色晶體狀的4-3-叔-丁基-5-[3-(4-溴苯基)脲基]-1H-吡唑-1-基}苯甲酸甲酯(1.4g，59％)。HPLC純度94％；mp270272；1H NMR(DMSO-d6)δ9.2(s，1H)，8.6(s，1H)，8.1(d，2H)，7.7(d，2H)，7.4(d，4H)，6.4(s，1H)，3.9(s，3H)，1.3(s，9H)。
實施例60
-78℃下，在溶于30mL甲苯的實施例59(700mg)的溶液中用10分鐘逐滴加入二異丁基氫化鋁的甲苯溶液(1M，溶于甲苯，7.5mL)。反應(yīng)混合物在-78℃攪拌30分鐘，然后在0℃攪拌30分鐘。反應(yīng)混合物在真空下濃縮至干并用水處理。將固體過濾并用乙腈處理。將溶液蒸發(fā)至干，并將殘余物溶于乙酸乙酯，用己烷沉淀以得到黃色固體，將其在真空下干燥以得到1-[3-叔-丁基-1-(4-羥基甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基)脲(400mg，61％)。HPLC純度95％；1H NMR(DMSO-d6)δ9.2(s，1H)，8.4(s，1H)，7.5(m，8H)，6.4(s，1H)，5.3(t，1H)，4.6(d，2H)，1.3(s，9H)。
上面提到的所有參考資料納入本文作為參考。此外，還將兩個同時提交的申請，即抗炎藥物(Anti-Inflammatory Medicaments)，S/N＿＿，＿＿提交和抗癌藥物(Anti-Cancer Medicaments)，S/N＿＿，＿＿提交，并入本文作為參考。
序列表<110>迪賽孚爾藥品研制有限公司(Deciphera Pharmaceuticals，Inc.)D.L.費林(Flynn，Daniel L)P.A.彼得里洛(Petillo，Peter A)<120>蛋白質(zhì)功能性的調(diào)控<130>34475<150>US 60/437,487<151>2002-12-31<160>38<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>16<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Asp Phe Gly Leu Ser Arg Leu Met Thr Gly Asp Thr Tyr Thr Ala His1 5 10 15<210>2<211>17<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>
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<221>misc feature<222>(182)..(182)<223>Xaa可以是任何天然產(chǎn)生的氨基酸<400>27Ser Lys Val Thr Thr Val Val Ala Thr Pro Gly Gln Gly Pro Asp Arg1 5 10 15Pro Gln Glu Val Ser Tyr Thr Asp Thr Lys Val Ile Gly Asn Gly Ser20 25 30
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<400>38Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr20 25 30Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala35 40 45Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser50 55 60Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu85 90 95Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu100 105 110Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr115 120 125His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val130 135 140Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu145 150 155 160Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn165 170 175Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser180 185 190Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu195 200 205Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser210 215 220Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr
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權(quán)利要求
1.一種鑒別與天然產(chǎn)生的特定蛋白質(zhì)相互作用以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的分子的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟鑒別形成所述蛋白質(zhì)一部分的開關(guān)控制配體；鑒別形成所述蛋白質(zhì)一部分并與所述開關(guān)控制配體相互作用的開關(guān)控制口袋，所述配體在體內(nèi)與所述口袋相互作用以調(diào)節(jié)所述蛋白質(zhì)的構(gòu)象和生物活性，從而在所述配體-口袋相互作用時該蛋白質(zhì)呈第一構(gòu)象和第一生物活性，并在所述配體-口袋相互作用缺乏時呈第二種不同的構(gòu)象和生物活性；提供處于所述第一和第二構(gòu)象的所述蛋白質(zhì)的相應(yīng)樣品；以及通過使分子與一種所述樣品接觸，并鑒別在所述口袋區(qū)域與這種蛋白質(zhì)結(jié)合以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的小分子，用一個或多個候選分子來篩選至少一種所述樣品。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自酶、受體和信號蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自激酶、磷酸酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、硫酸酯酶、轉(zhuǎn)錄因子、核激素受體、g蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體、g-蛋白、gtp酶、激素、聚合酶和包含核苷酸調(diào)節(jié)位點的其它蛋白質(zhì)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的分子量至少約15kDa。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述分子量大于約30kDa。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述鑒別所述開關(guān)控制配體序列和所述開關(guān)控制口袋的步驟選自生物信息學(xué)分析、X射線晶體學(xué)、核磁共振(NMR)、圓二色性(CD)和親和堿基篩選。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述提供蛋白質(zhì)的步驟包括獲得靜態(tài)地限于與所述第一和第二構(gòu)象相對應(yīng)的各個狀態(tài)的基本純化的所述蛋白質(zhì)樣品的步驟。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述接觸步驟包括選自下組的技術(shù)基于親和性的篩選、毛細管區(qū)帶電泳、熒光探針置換測定、核磁共振譜、圓二色性和X射線晶體學(xué)。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是一種激酶蛋白質(zhì)。
10.一種蛋白質(zhì)-調(diào)制劑加合物，其包括具有開關(guān)控制口袋的天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)以及在所述開關(guān)控制口袋區(qū)域與蛋白質(zhì)結(jié)合的非天然產(chǎn)生的分子，所述分子通過誘導(dǎo)或限制所述蛋白質(zhì)的構(gòu)象至少用來部分調(diào)節(jié)所述蛋白質(zhì)的生物活性。
11.如權(quán)利要求10所述的加合物，其特征在于，所述分子用來誘導(dǎo)所述蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。
12.如權(quán)利要求10所述的加合物，其特征在于，所述分子用來限制所述蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。
13.如權(quán)利要求10所述的加合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)還具有一開關(guān)控制配體，所述配體在體內(nèi)與所述口袋相互作用以調(diào)節(jié)所述蛋白質(zhì)的構(gòu)象和生物活性，從而在所述配體-口袋相互作用時該蛋白質(zhì)呈第一構(gòu)象和第一生物活性，并在所述配體-口袋相互作用缺乏時呈第二種不同的構(gòu)象和生物活性。
14.如權(quán)利要求10所述的加合物，其特征在于，所述口袋是開-口袋，所述分子在所述開-口袋區(qū)域作為激動劑與所述蛋白質(zhì)結(jié)合。
15.如權(quán)利要求10所述的加合物，其特征在于，所述口袋是開-口袋，所述分子在所述開-口袋區(qū)域作為拮抗劑與所述蛋白質(zhì)結(jié)合。
16.如權(quán)利要求10所述的加合物，其特征在于，所述口袋是關(guān)-口袋，所述分子在所述關(guān)-口袋區(qū)域作為激動劑與所述蛋白質(zhì)結(jié)合。
17.如權(quán)利要求10所述的加合物，其特征在于，所述口袋是關(guān)-口袋，所述分子在所述關(guān)-口袋區(qū)域作為拮抗劑與所述蛋白質(zhì)結(jié)合。
18.如權(quán)利要求10所述的加合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自酶、受體和信號蛋白。
19.如權(quán)利要求18所述的加合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自激酶、磷酸酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、硫酸酯酶、轉(zhuǎn)錄因子、核激素受體、g蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體、g-蛋白、gtp酶、激素、聚合酶和包含核苷酸調(diào)節(jié)位點的其它蛋白質(zhì)。
20.如權(quán)利要求10所述的加合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的分子量至少約15kDa。
21.如權(quán)利要求20所述的加合物，其特征在于，所述分子量大于約30kDa。
22.如權(quán)利要求10所述的加合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是一種激酶蛋白質(zhì)。
23.一種改變蛋白質(zhì)生物活性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟提供具有開關(guān)控制口袋的天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)；使所述蛋白質(zhì)與非-天然產(chǎn)生的分子調(diào)制劑接觸；和使所述調(diào)制劑在所述口袋區(qū)域與所述蛋白質(zhì)結(jié)合，以通過誘導(dǎo)或限制所述蛋白質(zhì)的構(gòu)象至少部分調(diào)節(jié)所述蛋白質(zhì)的生物活性。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述分子用來誘導(dǎo)所述蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述分子用來限制所述蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)還具有一開關(guān)控制配體，所述配體在體內(nèi)與所述口袋相互作用以調(diào)節(jié)所述蛋白質(zhì)的構(gòu)象和生物活性，從而在所述配體-口袋相互作用時該蛋白質(zhì)呈第一構(gòu)象和第一生物活性，并在所述配體-口袋相互作用缺乏時呈第二種不同的構(gòu)象和生物活性。
27.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述口袋是開-口袋，所述分子在所述開-口袋區(qū)域作為激動劑與所述蛋白質(zhì)結(jié)合。
28.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述口袋是開-口袋，所述分子在所述開-口袋區(qū)域作為拮抗劑與所述蛋白質(zhì)結(jié)合。
29.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述口袋是關(guān)-口袋，所述分子在所述關(guān)-口袋區(qū)域作為激動劑與所述蛋白質(zhì)結(jié)合。
30.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述口袋是關(guān)-口袋，所述分子在所述關(guān)-口袋區(qū)域作為拮抗劑與所述蛋白質(zhì)結(jié)合。
31.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自酶、受體和信號蛋白。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自激酶、磷酸酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、硫酸酯酶、轉(zhuǎn)錄因子、核激素受體、g蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體、g-蛋白、gtp酶、激素、聚合酶和包含核苷酸調(diào)節(jié)位點的其它蛋白質(zhì)。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的分子量至少約15kDa。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述分子量大于約30kDa。
35.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是一種激酶蛋白質(zhì)。
全文摘要
提供了合理鑒別能夠與天然產(chǎn)生的特定蛋白質(zhì)相互作用的分子的新方法，以便產(chǎn)生新的藥理學(xué)上重要的化合物和治療模態(tài)。概括地說，所述方法包括鑒別形成感興趣的特定蛋白質(zhì)的一部分的開關(guān)控制配體，以及還鑒別形成蛋白質(zhì)的一部分并與所述開關(guān)控制配體相互作用的互補的開關(guān)控制口袋的步驟。所述配體在體內(nèi)與口袋相互作用以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的構(gòu)象和生物活性，這樣在配 體－口袋相互作用時所述蛋白質(zhì)呈第一構(gòu)象和第一生物活性，在所述配體－口袋相互作用不存在時呈第二種不同的構(gòu)象。然后提供呈第一和第二構(gòu)象的所述蛋白質(zhì)的相應(yīng)樣品，并通過使樣品與分子接觸來篩選一種或多種候選分子。從而可鑒別在口袋區(qū)域結(jié)合蛋白質(zhì)的小分子。還提供了新的蛋白質(zhì)－調(diào)制劑加合物和改變蛋白質(zhì)活性的方法。
文檔編號C12Q1/48GK1756849SQ200380110049
公開日2006年4月5日 申請日期2003年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月31日
發(fā)明者D·L·費林, P·A·彼得里洛 申請人:迪賽孚爾藥品研制有限公司