專利名稱：酶促制備香子蘭香精的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及制備香子蘭香精的新方法。
香子蘭香精是蘭科扁葉香果蘭(Vanilla planifolia)的豆中所含的有機物質的平衡混合物。
更具體地，主要化合物香草醛是從其糖基化前體(葡糖香草醛)開始在豆的成熟期間經豆中存在的酶的天然酶促水解后而形成。
因此，提取香草醛的常規(guī)方法包括熟成期，其需要長時間(1至5個月，取決于收獲位置)、許多長時間的質量控制并且受到環(huán)境條件的嚴重影響。結果，這牽涉終產物的顯著變異性和香草醛含量部分的損失。因此，該方法從工業(yè)觀點看非常昂貴。
EP0555466公開了替代常規(guī)熟成的方法，其包括用水解酶(纖維素酶、果膠酶、β-glucosydase)處理適宜碾磨的青豆(green bean)，所述水解酶通過分解豆的植物組織起作用，從而促進活性成分的提取，而且將釋放的葡糖香草醛水解成香草醛。
本發(fā)明涉及制備香子蘭提取物的方法，其包括對香子蘭青豆進行提取并隨后用具有高總分解活性的酶系統(tǒng)酶促分解所得提取物的合并處理。
根據本發(fā)明，該方法在時間(數月溫育)和環(huán)境方面都不存在當前已知的工業(yè)方法的限制，同時提供了高產率的富含香草醛的產物。因此，本發(fā)明的方法在容易性、短暫性、可重復性和產率方面與公知方法相比具有顯著優(yōu)點。
本發(fā)明的方法包括以下步驟a)使豆加速褐變；b)對褐變的豆進行提取，然后用含有纖維素酶和半纖維素酶活性的酶系統(tǒng)處理；
c)純化產物以得到富含香草醛的濃縮物。
豆的加速褐變即步驟a)包括將青豆在-10℃至-30℃溫度冷凍，隨后在2至8℃、優(yōu)選4℃的溫度避光解凍達到所需溫度必需的時間，該時間通常為0.5至7天。
備選地，豆的加速褐變即步驟a)可以包括通過將它們在溫度為60至65℃的水中浸泡3分鐘以熱燙青豆，隨后將它們在15至45℃、更優(yōu)選30℃的溫度溫育產生褐色顏色必需的時間，通常為0.5至7天。
提取直接對褐色碾磨的豆進行，使用濃度為20至80％v/v、優(yōu)選40至60％v/v的水-乙醇溶液，溫度為室溫至80℃、優(yōu)選60至70℃，提取時間為70至100分鐘。然后蒸發(fā)所得提取物到總固體約35至約25％w/w。然后將濃縮物用水稀釋到總固體為5至20％w/w，并進行酶處理。
根據本發(fā)明使用的酶系統(tǒng)的特征在于顯著的纖維素酶活性，為2000至6000IU/g、優(yōu)選3000至5000IU/g、最優(yōu)選4000IU/g。該酶系統(tǒng)與現(xiàn)有技術中引用的酶(通常以不同類型的復合系統(tǒng)使用)的不同在于其更高的總分解活性，這使得可以對新鮮豆使用非常低的濃度，甚至0.1-0.3％，或更低。這不僅對于工業(yè)可行性和成本而且對于所得產物的可重復性都無疑是有優(yōu)勢的。
可以在非滅菌環(huán)境中、在裝備攪拌器(例如槳式攪拌器)的恒溫箱中連續(xù)溫和攪拌或者處于靜態(tài)條件下或者用間歇攪拌進行酶促分解，以釋放香草醛。反應在25℃至50℃、優(yōu)選30℃至40℃溫度下進行20至72小時、優(yōu)選24至40小時。加入一定量的纖維素酶活性為2000-6000IU/g的酶，相當于新鮮物質的0.05-0.4％、優(yōu)選0.1-0.3％。混合物的pH可以為3.5至5.5、優(yōu)選4至5。轉化可以通過TLC或者HPLC監(jiān)測并進行至觀察到所需組分的明顯增加。
最后，純化(步驟b)包括純化軟的水性提取物，通過用不同醇度(alcoholic degree)的水性乙醇溶液處理或用乙醇稀釋酶處理得到的提取物而得到的50％v/v水性乙醇溶液，所述純化在室溫至50℃溫度下操作。合并所得水性乙醇級分并在真空下于不高于+45℃的溫度下濃縮，得到稠的水性濃縮物。
使用小體積濃縮乙醇可以進一步純化所得產物。
通過進一步純化處理，如用乙酸乙酯萃取或者用醇混合物替換，可以得到更為濃縮和純化的產物。
通過TLC和HPLC可以進行中間步驟和終產物的香草醛含量分析。
TLC分析適當地使用硅膠60F254板(Merck)進行，洗脫劑系統(tǒng)85∶15氯仿-甲醇，254nm紫外檢測；隨后與反應性CAS(硫酸鈰銨二水合物、鉬酸銨四水合物、濃硫酸)反應并在可見光下觀察條帶。
HPLC分析可以使用Zorbax Eclipse XDB-C18柱(250×4.6mm)5μm適當地進行，使用0.3％H3PO4/乙腈95∶5-10∶90線性梯度，流速1ml/min，λ254nm，運行時間55min。
通過將樣品的等分試樣在+105℃烘箱中保溫15小時，可方便地進行中間體和終產物的總固體測定。備選地，可以使用水分分析儀(例如Sartorius Model MA100)，設置分析溫度+105℃；當記錄到失重低于1mg/60秒時，測定樣品的總固體百分數。
提取物的質量從感觀和儀器兩方面評價，所述儀器評價根據USP26/NF20<1061>測量L*、a*、b*、YIE313坐標(CIELAB坐標)?？梢杂帽壬?例如HunterLab model ColorFlex)適當地確定終產物的CIELAB顏色坐標。使用50％v/v乙醇作為稀釋劑，對5.0％w/w總固體的稀釋液測定終產物的顏色。
根據本發(fā)明的方法可以得到的終產物的香草醛含量為4.2-8.5g/kg起始青豆，與用現(xiàn)有技術方法得到的產物具有更優(yōu)的感官特征。
以下實施例更詳細闡明本發(fā)明的方法。
實施例11)提取將青豆在-20℃冷凍，取出并在4℃的溫度保持7天(褐變豆139kg，含1.19％w/w香草醛葡糖苷和0.10％w/w香草醛)，然后通過4.5mm格網(grid)碾磨并載入滲濾器。將植物材料用50％v/v乙醇充分提取。用基于豆水分含量(約80％w/w)計算的一定量的95％v/v乙醇進行第一次提取(即124升)，以得到50％v/v醇度的溶液。隨后的提取(共8次)用與碾磨的植物材料(以Kg表達)的重量相當的一定體積的50％v/v乙醇(以升表達)(即139升)進行。每次提取在+70℃的溫度進行，接觸時間為90分鐘。合并所得水性乙醇滲濾液并在+30℃真空濃縮，得到稠的軟濃縮物(36kg，27％w/w總固體)，其通過加入乙醇穩(wěn)定，得到20％v/v醇度(基于水含量計算的％)并在+4℃保存，直到用于生物轉化。
2)酶促轉化生物轉化前，通過用水替換兩次從中間濃縮物除去存在的乙醇。所得濃縮物用水稀釋，得到10％總固體溶液。向該溶液加入酶Cellulosin AC40(HBI Enzymes Inc.)，其量基于碾磨的植物材料為約0.2％w/w。生物轉化(250升反應器中95升反應混合物)在溫和攪拌下在40℃進行48小時。轉化完成后，在+30℃真空濃縮懸液并通過加入乙醇(20％v/v基于存在的水)穩(wěn)定，以得到29Kg軟殘渣，其含有9.4Kg干殘渣。
3)提純將20％v/v水-乙醇濃縮物用95％v/v乙醇稀釋，得到50％v/v乙醇的水-醇溶液(％基于存在的水)。將稀釋的混合物在+45℃、攪拌下保持約1小時，然后在室溫靜置，最后過濾。將過濾殘渣用水吸收并在+45℃勻漿，用乙醇稀釋到60％v/v醇度并在室溫過夜靜置。隨后過濾該水-醇溶液。合并水-醇溶液并在+45℃溫度的真空下濃縮，直至得到稠的水性濃縮物。保持+45℃并在攪拌下，加入95％v/v乙醇，直到均勻并且無論如何直至達到最終醇度不低于20％v/v。
該方法對每Kg處理的植物材料產生6.29g香草醛，相當于植物材料的總計算香草醛的93.7％(6.72g/Kg植物材料，為游離香草醛和葡糖苷結合的香草醛的總和)。
實施例2
1)提取將青豆(198.6g，含1.12％w/w葡糖苷香草醛和0.05％w/w香草醛)在預熱至+60℃的水中浸泡3分鐘。熱燙后，將豆在+30℃溫育5天，期間植物材料變成暗褐色。完成溫育后，觀察到的失重為16％。將褐變的豆(166.7g)碾磨，調節(jié)至50％v/v醇度(加入147ml 95％v/v乙醇得到)并置于加熱夾套式滲濾器中。將植物材料用50％v/v乙醇充分提取。每次提取(共9次)用550ml 50％v/v乙醇。每次提取在+70℃溫度下進行，接觸時間為100分鐘。合并所得水性醇滲濾液并在+45℃真空下濃縮，得到稠的軟濃縮物(33.1g，36.4％w/w總固體)。
2)酶轉化將所得濃縮物用水稀釋，直至得到20％w/w總固體溶液。向該溶液加入酶Cellulosin AC40(HBI Enzymes Inc.)，其量基于碾磨的植物材料為約0.2％w/w。生物轉化在溫和攪拌、40℃下進行72小時。
3)提純轉化完成后，通過加入一定量的調節(jié)醇度到50％v/v的95％v/v乙醇淬滅反應。將提取液在+45℃真空濃縮約1小時，得到稠的軟殘渣。得到26.9g提取物，其含有33.9％w/w總固體。
該方法對每Kg處理的植物材料產生5.06g香草醛，相當于植物材料的總計算香草醛的85.5％(5.92g/Kg植物材料，為游離香草醛和葡糖苷結合的香草醛的總和)。
實施例31)提取將冷凍的青豆(2117g，含1.19％w/w香草醛葡糖苷和0.10％w/w香草醛)在+4℃的溫度保持0.5天。溫育期間植物材料解凍并變成暗褐色，溫育完成后，觀察到的失重為7.6％。將褐變的豆(2006g)通過4.5mm格網碾磨，加入1800ml 95％v/v乙醇并室溫下置于滲濾器中。提取植物材料80分鐘，然后收集首次提取物。將植物材料用50％v/v乙醇充分提取。隨后的提取(共5次)用與碾磨的植物材料的重量(以Kg表示)相當的一定體積的50％v/v乙醇(以升表示)(即2升)進行。每次提取在室溫進行，接觸時間為80分鐘。合并所得水性醇滲濾液并在+45℃真空濃縮，得到稠的軟濃縮物(265g，53.8％w/w總固體)。
2)酶轉化將所得濃縮物用水稀釋得到20％總固體溶液。向該溶液加入酶Cellulosin AC40(HBI Enzymes Inc.)，其量基于碾磨的植物材料為約0.2％w/w。生物轉化在溫和攪拌、50℃進行47小時。轉化完成后，通過加入一定量的調節(jié)醇度至50％v/v的95％v/v乙醇淬滅反應(所加的體積以ml表示，相當于以g表示的反應混合物重量的0.89倍)。
3)提純將稀釋的混合物在+45℃、攪拌下保持約1小時，然后在室溫靜置，最后過濾。將過濾殘渣用水吸收并在+45℃勻漿，用乙醇稀釋到60％v/v醇度并在室溫過夜靜置。最后，通過濾紙過濾該水性醇溶液。合并水性醇溶液并在真空、+45℃溫度濃縮，直至得到稠的水性濃縮物。保持溫度為+45℃并在攪拌下，加入95％v/v乙醇，直至均勻并且無論如何直至達到最終醇度不低于20％v/v。
該方法對每Kg處理的植物材料產生6.45g香草醛，相當于植物材料的總計算香草醛的72.0％(8.96g/Kg植物材料，為游離香草醛和葡糖苷結合的香草醛的總和)。
實施例41)提取將青豆在-20℃冷凍(350kg，含1.32％w/w香草醛葡糖苷和0.10％w/w香草醛)，通過4.5mm格網碾磨并置于滲濾器中。將碾磨的植物材料用50％v/v乙醇充分提取。用基于豆的水含量(約80％w/w)計算的一定量的95％v/v乙醇進行首次提取(即311升)，以得到50％v/v醇度的溶液。隨后的提取(共8次)用與碾磨的植物材料的重量(以Kg表示)相當的一定體積的50％v/v乙醇(以升表示)(即350升)進行。每次提取在+70℃的溫度進行，接觸時間為90分鐘。合并所得水-醇滲濾液并在+30℃真空濃縮，得到稠的軟殘渣(92.5kg，26.3％w/w總固體)，通過加入乙醇將其穩(wěn)定，得到20％v/v醇度(％基于存在的水計算)并在+4℃保存，直到用于生物轉化。
2)酶轉化生物轉化前，通過用水替換兩次從中間濃縮物除去存在的乙醇。所得濃縮物用水稀釋，得到10％總固體溶液。向該溶液加入酶Cellulosin AC40(HBI Enzymes Inc.)，其量基于碾磨的植物材料為約0.2％w/w。生物轉化(1000升反應器中240升反應混合物)在+40℃溫和攪拌下進行44小時。轉化完成后，在+30℃真空濃縮懸液并通過加入乙醇(20％v/v基于存在的水)穩(wěn)定，以得到63Kg軟濃縮物，其含有24Kg干殘渣。
3)提純將20％v/v水性醇濃縮物用95％v/v乙醇稀釋，得到50％v/v水性醇溶液(％基于水含量)。將稀釋的混合物在+45℃、攪拌下保持約1小時，然后在室溫靜置，最后過濾。將過濾殘渣用水吸收并在+45℃勻漿，用乙醇稀釋到60％v/v醇度并在室溫過夜靜置。隨后過濾水-醇溶液。合并水性醇溶液并在+45℃溫度的真空濃縮，得到稠的水性濃縮物。保持溫度+45℃并在攪拌下，加入95％v/v乙醇，直至均勻并且無論如何直至達到最終醇度不低于20％v/v。
該方法對每Kg處理的植物材料產生6.96g香草醛，相當于植物材料的總計算香草醛的94％(7.40g/Kg植物材料，為游離香草醛和葡糖苷結合的香草醛的總和)。
實施例5(比較實施例，EP0555466的方法)將青豆(220kg，含1.24％w/w香草醛葡糖苷和0.10％w/w香草醛)通過4.5mm網格碾磨。
將1000升滲濾器加載相當于碾磨的植物材料重量(以Kg表示)兩倍的水體積(以升表示)(即440升)，所述水含有基于植物材料為0.2％w/w的一定量的酶Cellulosin AC40(HBI Enzymes Inc.)。將碾磨的植物材料置于裝備再循環(huán)系統(tǒng)的滲濾器中。生物轉化在+40℃進行24小時。
將反應混合物滲濾并將滲濾液(506kg)加入500升95％v/v乙醇，得到50％v/v乙醇溶液。將植物材料在+70℃用50％v/v乙醇連續(xù)、充分提取，得到5份每份200升的水性乙醇級分(共1000升)。
將兩份(水性和水性醇)滲濾液保持分離并在約30℃真空中濃縮。之后，向每份濃縮物中加入乙醇，基于所存在的水達到20％v/v醇度。
得到以下濃縮物1.來自水性提取物的水-乙醇濃縮物(37.4kg，含10kg干殘渣)2.來自水-乙醇提取物的水-乙醇濃縮物(30.6kg，含3.5kg干殘渣)。
混合所得產物并通過蒸發(fā)溶劑濃縮。
該方法對每kg處理的植物材料產生4.29g香草醛，相當于植物材料的總計算香草醛的61.3％(7.00g/Kg植物材料，為游離香草醛和葡糖苷結合的香草醛的總和)。
實施例61)測定終產物總固體對于來自實施例1至5的每種軟提取物遵循以下步驟將每種提取物的約1g等分試樣均勻分布在板(裝備玻璃纖維濾器)上并在水分分析儀上準確稱重；加熱程序設置在+105℃并將樣品的失重記錄為時間的函數；當失重速率低于1mg/60秒時，認為樣品重量恒定；總固體百分數(TS％)計算為最終重量與最初重量的比。
實施例1至5的產物的記錄值在下表1中報告
2)測定CIELAB顏色坐標將來自實施例1至5的每種提取物的等分試樣用50％v/v乙醇稀釋，得到含5.0％w/w總固體的溶液。根據USP26/NF20<1061>，用比色計(HunterLab，model ColorFlex)分析溶液，以確定L*、a*、b*、YIE313坐標。
3)終產物的感官分析將來自實施例1至5的每種提取物的等分試樣用50％v/v乙醇稀釋，得到香草醛含量為1.0％w/w(HPLC測定)的溶液；評估每種水性乙醇溶液的嗅覺感官特性。將每種稀釋液的1.0g和更少(直到感知閾值)的等分試樣用加糖的全脂乳(5％w/w蔗糖)進一步稀釋到50g。評估乳稀釋液的味道感官特征。
以下表2概括了分析結果表2
所報導的數據證明YIE313值小于200對應于在感官上較YIE313值大于200的那些提取物更好的提取物。具體地，實施例1-3和實施例4-5的比較表明褐變步驟提供了感官質量的改善，同時降低了YIE313值。
權利要求
1.制備香子蘭提取物的方法，其包括以下步驟a)使豆褐變；b)提取豆，然后用具有纖維素酶和半纖維素酶活性的酶系統(tǒng)處理；c)純化產物以得到富含香蘭素的濃縮物。
2.權利要求1所述的方法，其中通過在-10至-30℃的溫度冷凍并在2至8℃的溫度解凍的循環(huán)進行豆的褐變。
3.權利要求1所述的方法，其中通過在60至65℃的溫度的水中熱燙并隨后在15至45℃的溫度溫育的循環(huán)進行豆的褐變。
4.權利要求1所述的方法，其中用20至80％v/v醇度的水性乙醇溶液在室溫至80℃的溫度下進行提取。
5.權利要求4所述的方法，其中用40至60％v/v醇度的水性乙醇溶液在60至70℃的溫度下進行提取。
6.權利要求1至5任一項所述的方法，其中通過使提取物與纖維素酶活性為2000至6000IU/g的酶接觸而進行酶處理。
7.權利要求6所述的方法，其中使用活性為3000至5000IU/g的酶。
8.權利要求7所述的方法，其中使用纖維素酶活性為4000IU/g的酶。
9.權利要求6至8任一項所述的方法，其中使用基于新鮮的豆?jié)舛葹?.05至0.4％的酶。
10.權利要求6至8任一項所述的方法，其中反應在25℃至50℃的溫度下進行20至72小時。
11.前述權利要求任一項所述的方法，其中純化(步驟b)包括用不同醇度的水-乙醇溶液的一系列處理，以提純水性軟提取物或者用乙醇稀釋酶處理的提取物而得到的50％v/v水性醇溶液，該處理在室溫至50℃的溫度操作。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備香子蘭提取物的方法，該方法包括使香子蘭青豆進行加速褐變，然后進行提取/酶處理。
文檔編號C12N9/42GK1764389SQ200380110250
公開日2006年4月26日 申請日期2003年12月22日 優(yōu)先權日2003年4月15日
發(fā)明者C·蓬佐內, V·達達戈, M·貝爾塔尼 申請人:因德納有限公司