專利名稱：利用生物轉(zhuǎn)化技術獲得肉蓯蓉苯乙醇苷類化合物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種獲得肉蓯蓉次生代謝產(chǎn)物的方法，特別是涉及一種利用肉蓯蓉細胞生物轉(zhuǎn)化技術獲得肉蓯蓉苯乙醇苷類化合物的方法。
背景技術：
肉蓯蓉(Cistanche)是列當科肉蓯蓉屬多年生寄生草本植物，原生于我國的內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、寧夏和新疆等地區(qū)的鹽堿地、干河溝或戈壁灘上。主要寄生在紅沙柳、鹽爪爪、著葉鹽爪、珍珠和西伯利亞刺等植物的根上。由于其棲息地的環(huán)境惡劣且生長速度緩慢，產(chǎn)量非常有限。肉蓯蓉是一味傳統(tǒng)中藥，具有補腎、益精、強筋健髓之功效，主治下部虛損、老年血液枯槁。久服可以強身壯體，返老還童。近年來常被作為抗衰老和抗癌藥物使用，特別是在保健藥品或食品當中大都添加肉蓯蓉提取物。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉中含有蓯蓉素、苯乙醇甙(松果菊甙、麥角甾苷、海膽苷、順式麥角甾苷、異麥角甾苷、乙?；溄晴捃?、肉蓯蓉苷)、梓醇、丁香苷、紅景天苷、甘露醇、β-谷甾醇、胡蘿卜甙、甜菜堿、升麻甙、鼠李糖苷等多種活性成分，特別是苯乙醇甙類化合物具有增強學習記憶力、抗衰老和健身等重要功能。據(jù)報道我國每年的肉蓯蓉市場需求量在500～1000噸左右，而我國自己的產(chǎn)量不足300噸，除了部分從中東地區(qū)進口以外，還遠遠滿足不了市場的需要。此外，日本也是肉蓯蓉的應用大國，其健康保健飲料當中幾乎都要添加肉蓯蓉提取液。
由于肉蓯蓉棲息于干燥的荒漠或鹽湖周邊，生育環(huán)境極為惡劣，而且其被寄生植物的資源也十分短缺，因此肉蓯蓉野生資源十分匱乏。特別是近些年來的狂采亂挖，現(xiàn)有的野生資源已經(jīng)遭到嚴重破壞，肉蓯蓉的產(chǎn)量日益下降。長此以往，會加速野生肉蓯蓉滅絕的危險。雖然肉蓯蓉的人工栽培已經(jīng)被列為“十五”攻關項目，遺憾的是到目前為止還很難通過人工栽培來滿足市場的需求。更何況肉蓯蓉也是防沙固沙保持生態(tài)系統(tǒng)的重要植物材料之一，通過人工栽培恢復生態(tài)環(huán)境非常重要，采挖肉蓯蓉是破壞固沙生態(tài)的一種行為。
為了減少對野生資源的采摘和破壞，為了將肉蓯蓉的自然生產(chǎn)方式轉(zhuǎn)變?yōu)楣I(yè)化生產(chǎn)方式，利用現(xiàn)代生物技術生產(chǎn)肉蓯蓉的次生代謝產(chǎn)物非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在不破壞自然環(huán)境條件下，利用生物工程技術獲得肉蓯蓉次生代謝產(chǎn)物的方法。
本發(fā)明的技術方案是一種利用生物轉(zhuǎn)化技術獲得肉蓯蓉次生代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于該方法主要包括以下步驟1)在改良的Murashige & Skoog培養(yǎng)基(簡稱，MS培養(yǎng)基)中，按每升培養(yǎng)液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，吲哚乙酸0.1～4mg和細胞分裂素0.1～4mg制成基本培養(yǎng)基；2)在所述基本培養(yǎng)基中添加氨基酸前體(苯丙氨酸和/或酪氨酸)，或黃瓜汁前體，或咖啡酸前體，用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5～7.0制成合成培養(yǎng)基，在125℃，0.1Mpa壓力下消毒后經(jīng)冷卻待用；3)將肉蓯蓉愈傷組織細胞接種到所述合成培養(yǎng)基上，然后在25℃避光條件下振蕩培養(yǎng)1周后，收獲細胞經(jīng)冷凍干燥后用溶劑萃取獲得粗提物，再經(jīng)過純化獲得苯乙醇苷類化合物。
本發(fā)明中所述細胞分裂素為6-芐氨基嘌呤或激動素(kinetin)。
本發(fā)明中所述黃瓜汁的獲取方法是將黃瓜攪拌粉碎后在4000r.p.m，20℃下離心30min，取上清液過濾獲得。
利用本發(fā)明的方法來生產(chǎn)肉蓯蓉的次生代謝產(chǎn)物，生產(chǎn)成本低，培養(yǎng)周期短，不受自然環(huán)境影響，可以實現(xiàn)周年生產(chǎn)，在不進行野外采挖的情況下，獲得大量肉蓯蓉的次生代謝產(chǎn)物。該方法可以滿足人們越來越多的對肉蓯蓉及其次生代謝產(chǎn)物的需求。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
實施例中所用的肉蓯蓉愈傷組織(優(yōu)選CS2002荒漠肉蓯蓉細胞系或CS2001鹽生肉蓯蓉細胞系)可以通過如下方法獲得在改良的MS培養(yǎng)基中，按每升培養(yǎng)液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，吲哚乙酸(IAA)0.1～4mg和6-芐氨基嘌呤(BA)0.1～4mg制成基本培養(yǎng)基。在基本培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)液添加2g高效凝固劑(Gellan gum)，經(jīng)高溫消毒并冷卻后做成固體平板培養(yǎng)基，將肉蓯蓉細胞系接種在該培養(yǎng)基上，在25℃黑暗條件下靜止培養(yǎng)28天，肉蓯蓉愈傷組織將增長5～10倍，待用。
實施例1添加兩種氨基酸前體進行生物轉(zhuǎn)化(1)在改良的MS培養(yǎng)基中，按每升培養(yǎng)液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，吲哚乙酸(IAA)0.1～4mg和6-芐氨基嘌呤(BA)0.1～4mg制成基本培養(yǎng)基。
(2)向所述基本培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)液添加苯丙氨酸50～500mg和酪氨酸50～400mg，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5～7.0制成合成培養(yǎng)基，在125℃，0.1Mpa壓力下消毒后經(jīng)冷卻后待用。
(3)將所述肉蓯蓉愈傷組織細胞接種到步驟(2)中所述合成培養(yǎng)基上，接種量為20％左右。然后在25℃避光條件下培養(yǎng)1周后，收獲細胞經(jīng)冷凍干燥后用溶劑萃取獲得粗提物，再經(jīng)過純化處理就可以獲得苯乙醇苷類化合物。
實施例2添加黃瓜汁前體進行生物轉(zhuǎn)化本實施例中的黃瓜汁可用如下方法獲取選取新鮮的黃瓜，攪拌粉碎后在4000r.p.m，20℃下離心30min，取上清液過濾即得，4℃保存?zhèn)溆谩?br> (1)在改良的MS培養(yǎng)基中，按每升培養(yǎng)液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，吲哚乙酸(IAA)0.1～4mg和激動素(kinetin)0.1～4mg制成基本培養(yǎng)基。
(2)向所述基本培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)液添加黃瓜汁40～200ml，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5～7.0制成合成培養(yǎng)基，在125℃，0.1Mpa壓力下消毒后經(jīng)冷卻后待用。
(3)將所述肉蓯蓉愈傷組織細胞接種到步驟(2)中所述合成培養(yǎng)基上，接種量為30％左右。然后在25℃避光條件下培養(yǎng)1周后，收獲細胞經(jīng)冷凍干燥后用溶劑萃取獲得粗提物，再經(jīng)過純化處理就可以獲得苯乙醇苷類化合物。
實施例3添加咖啡酸前體進行生物轉(zhuǎn)化(1)在改良的MS培養(yǎng)基中，按每升培養(yǎng)液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，吲哚乙酸(IAA)0.1～4mg和6-芐氨基嘌呤(BA)0.1～4mg制成基本培養(yǎng)基。
(2)向所述基本培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)液添加咖啡酸5～100ml，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5～7.0制成合成培養(yǎng)基，在125℃，0.1Mpa壓力下消毒后經(jīng)冷卻后待用。
(3)將所述肉蓯蓉愈傷組織細胞接種到步驟(2)中所述合成培養(yǎng)基上，接種量為50％左右。然后在25℃避光條件下培養(yǎng)1周后，收獲細胞經(jīng)冷凍干燥后用溶劑萃取獲得粗提物，再經(jīng)過純化處理就可以獲得苯乙醇苷類化合物。
實施例4添加一種氨基酸前體進行生物轉(zhuǎn)化(1)在改良的MS培養(yǎng)基中，按每升培養(yǎng)液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，吲哚乙酸(IAA)0.1～4mg和6-芐氨基嘌呤(BA)0.1～4mg制成基本培養(yǎng)基。
(2)向所述基本培養(yǎng)基中按每升培養(yǎng)液添加苯丙氨酸50～500mg(或酪氨酸50～400mg)，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5～7.0制成合成培養(yǎng)基，在125℃，0.1Mpa壓力下消毒后經(jīng)冷卻后待用。
(3)將所述肉蓯蓉愈傷組織細胞接種到步驟(2)中所述合成培養(yǎng)基上，接種量為20％左右。然后在25℃避光條件下培養(yǎng)1周后，收獲細胞經(jīng)冷凍干燥后用溶劑萃取獲得粗提物，再經(jīng)過純化處理就可以獲得苯乙醇苷類化合物。
通過高效液相色譜分析(HPLC)按照以上方法將肉蓯蓉愈傷組織細胞作為微反應器進行生物轉(zhuǎn)化，其松果菊苷，洋丁香酚苷(類葉升麻苷)，2′-乙?；蠖∠惴榆?2′-乙?；惾~升麻苷)的總產(chǎn)量可以達到15％以上。
本發(fā)明中所述的改良的Murashige&Skoog培養(yǎng)基、也可以由Miller培養(yǎng)基替代，產(chǎn)生的技術效果相似。
權利要求
1.利用生物轉(zhuǎn)化技術獲得肉蓯蓉次生代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于該方法主要包括以下步驟1)在改良的Murashige & Skoog培養(yǎng)基中，按每升培養(yǎng)液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，吲哚乙酸0.1～4mg和細胞分裂素0.1～4mg制成基本培養(yǎng)基；2)在所述基本培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸前體，或酪氨酸前體，或黃瓜汁前體，或咖啡酸前體，用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5～7.0制成合成培養(yǎng)基，在125℃，0.1Mpa壓力下消毒后經(jīng)冷卻待用；3)將肉蓯蓉愈傷組織細胞接種到所述合成培養(yǎng)基上，然后在25℃避光條件下振蕩培養(yǎng)1周后，收獲細胞經(jīng)冷凍干燥后用溶劑萃取獲得粗提物，再經(jīng)過純化獲得苯乙醇苷類化合物。
2.根據(jù)權利要求1所述的獲得肉蓯蓉次生代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于所述細胞分裂素為6-芐氨基嘌呤或激動素。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的獲得肉蓯蓉次生代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于所述黃瓜汁的獲取方法是將黃瓜攪拌粉碎后在4000r.p.m，20℃下離心30min，取上清液過濾獲得。
全文摘要
利用生物轉(zhuǎn)化技術獲得肉蓯蓉次生代謝產(chǎn)物的方法，屬于生物轉(zhuǎn)化技術領域，包括以下步驟1)在改良的MS培養(yǎng)基中，按每升培養(yǎng)液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，吲哚乙酸0.1～4mg和細胞分裂素0.1～4mg制成基本培養(yǎng)基；在基本培養(yǎng)基中添加前體物質(zhì)，將pH值調(diào)整到5.5～7.0制成合成培養(yǎng)基，在125℃，0.1Mpa壓力下消毒后經(jīng)冷卻待用；將肉蓯蓉愈傷組織細胞接種到合成培養(yǎng)基上，然后在25℃避光條件下振蕩培養(yǎng)1周后，收獲細胞經(jīng)冷凍干燥后用溶劑萃取獲得粗提物，再經(jīng)過純化獲得苯乙醇苷類化合物。利用本發(fā)明所述方法生產(chǎn)肉蓯蓉的次生代謝產(chǎn)物，生產(chǎn)成本低，培養(yǎng)周期短，不受自然環(huán)境影響，可以實現(xiàn)周年生產(chǎn)。
文檔編號C12P19/44GK1556200SQ20041000034
公開日2004年12月22日 申請日期2004年1月9日 優(yōu)先權日2004年1月9日
發(fā)明者郭志剛 申請人:清華大學