專(zhuān)利名稱(chēng)：一種牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞分離純化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞分離純化的方法。
背景技術(shù)：
腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞是具有合成、儲(chǔ)存和分泌兒茶酚胺功能的神經(jīng)元細(xì)胞。當(dāng)被植入中樞神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)，能夠長(zhǎng)期保持活性并根據(jù)需要分泌兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)。雖然大量體內(nèi)試驗(yàn)也顯示出它在減緩疼痛、治療帕金森氏病方面的顯著效果，但目前該技術(shù)仍停留在個(gè)別臨床病例治療階段。對(duì)于將其廣泛應(yīng)用于臨床尚存在一定的問(wèn)題，如細(xì)胞來(lái)源有限，腎上腺嗜鉻細(xì)胞在體外不能分裂增殖，尚無(wú)功能表達(dá)良好的細(xì)胞系，只能依賴(lài)于腎上腺髓質(zhì)的分離來(lái)獲取細(xì)胞；以往報(bào)道的嗜鉻細(xì)胞分離純化工藝復(fù)雜、成本高、獲得細(xì)胞數(shù)量有限，特別是缺少臨床移植的依據(jù)。因此，建立一種穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單的細(xì)胞分離純化方法是將腎上腺嗜鉻細(xì)胞移植治療神經(jīng)性疾病廣泛用于臨床的必要保障。
目前通常采用的牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞分離純化方法是在Livett等方法基礎(chǔ)上的一些改進(jìn)，只能滿(mǎn)足一些基礎(chǔ)研究或?qū)嶒?yàn)室規(guī)模的臨床前試驗(yàn)研究，對(duì)于廣泛臨床應(yīng)用尚存在如下問(wèn)題①以膠原酶消化為主要細(xì)胞離散方法，高濃度膠原酶的大量使用及較長(zhǎng)的消化時(shí)間，不僅導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)率降低，而且大大增加了工藝成本；②由于嗜鉻細(xì)胞具有非均一性，細(xì)胞密度分布在一定范圍內(nèi)，采用連續(xù)密度梯度離心法純化嗜鉻細(xì)胞不僅在細(xì)胞收集時(shí)會(huì)造成損失，而且離心后細(xì)胞層面不夠清晰；③連續(xù)密度梯度離心法需在上萬(wàn)的離心力下才能形成分離介質(zhì)連續(xù)梯度區(qū)帶，只有配備超速離心機(jī)的實(shí)驗(yàn)室才能采用此方法，而且離心介質(zhì)用量較大；④以往采用的差速黏附法純化法持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，雖能獲得純度較高的嗜鉻細(xì)胞，但需以細(xì)胞數(shù)量損失為代價(jià)，細(xì)胞產(chǎn)率極低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞分離純化方法，不僅為臨床移植提供充足健康的細(xì)胞來(lái)源，也為移植時(shí)機(jī)提供相應(yīng)的依據(jù)。
本發(fā)明以機(jī)械分離為主、膠原酶消化為輔的方法離散細(xì)胞，采用Percoll非連續(xù)密度梯度離心法純化細(xì)胞。不僅提高了細(xì)胞產(chǎn)率、純度和活性，為臨床移植提供充足、健康的細(xì)胞來(lái)源，而且工藝成本的降低、操作過(guò)程的簡(jiǎn)化以及設(shè)備要求的降低使得該技術(shù)在多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用成為可能。
本發(fā)明的技術(shù)原理是逆腎上腺靜脈灌注膠原酶溶液，在一定溫度下，充分水解腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞與皮質(zhì)細(xì)胞、髓質(zhì)細(xì)胞之間的膠原蛋白成分。剝離后的髓質(zhì)通過(guò)機(jī)械剪切和梯度過(guò)篩，得到離散的腎上腺嗜鉻細(xì)胞懸液，再利用懸液中細(xì)胞密度的差異將細(xì)胞進(jìn)行純化。細(xì)胞的沉降服從Stokes定律V(x)=d2[ρc-ρm(x)]18η(x)g,]]>其中V(χ)是直徑為d(cm)的細(xì)胞在柱中任一位置x處的瞬時(shí)速度(cm/s)，g是重力加速度或離心速度，ρc表示細(xì)胞的密度(g/ml)，ρm(χ)表示x位點(diǎn)處細(xì)胞周?chē)橘|(zhì)的密度(g/ml)，η(χ)是x位點(diǎn)處介質(zhì)的黏度(N).當(dāng)細(xì)胞密度恰好等于梯度介質(zhì)密度時(shí)，沉降速度為零，即細(xì)胞處于平衡狀態(tài)不再沉降，具有不同密度的細(xì)胞群體在梯度介質(zhì)的不同位置上形成區(qū)帶。非連續(xù)密度梯度離心達(dá)到平衡后，密度介于兩個(gè)梯度之間的細(xì)胞均可停留在梯度界面之間；而連續(xù)密度梯度離心達(dá)到平衡后，細(xì)胞停留在與其密度相同的介質(zhì)位置。因此，使用等量的梯度介質(zhì)，利用非連續(xù)密度梯度離心法不僅增加了純化細(xì)胞的產(chǎn)率，而且加快了到達(dá)平衡的速度、減少擴(kuò)散的混合效應(yīng)。
綜上所述，本發(fā)明的主要內(nèi)容包括1.牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞的離散利用膠原酶灌注消化、髓質(zhì)機(jī)械剪切及梯度過(guò)篩得到離散的牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞懸液。
2.牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞的純化利用Percoll非連續(xù)密度梯度離心的方法將含有的其它種類(lèi)細(xì)胞，如皮質(zhì)細(xì)胞、紅細(xì)胞及細(xì)胞碎屑去除，得到純度較高的牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞。
3.Percoll梯度離心介質(zhì)的密度可根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行調(diào)整，同時(shí)可根據(jù)梯度離心結(jié)果判斷細(xì)胞健康程度。
本發(fā)明提供的穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)易的牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞分離純化的方法，其新穎性和創(chuàng)造性在于結(jié)合膠原酶灌注消化和機(jī)械剪切、過(guò)篩的方法將細(xì)胞離散，不僅有效的水解了組織細(xì)胞之間的膠原成分，而且提高了細(xì)胞收獲量。該發(fā)明使用Percoll非連續(xù)密度梯度離心法純化嗜鉻細(xì)胞，不僅提高了細(xì)胞產(chǎn)率，為臨床移植提供充足、健康的細(xì)胞來(lái)源，而且較低的成本消耗、簡(jiǎn)易的操作過(guò)程以及降低的設(shè)備要求為該技術(shù)廣泛應(yīng)用提供了良好的基礎(chǔ)。


圖1為實(shí)施例1分離純化的牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞。
圖2為實(shí)施例2牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞SPG染色。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞的分離1、從屠宰場(chǎng)選擇熱缺血時(shí)間小于30min的小公牛腎上腺，保存于4℃的D-Hank’s(含有10000units/ml的青霉素和鏈霉素)液中，置于冰上帶回實(shí)驗(yàn)室，利用本發(fā)明方法可同時(shí)完成8-12個(gè)牛腎上腺的嗜鉻細(xì)胞分離與純化。
2、逆靜脈灌注無(wú)鈣、鎂D-Hank’s液后，將腎上腺浸泡在D-Hank’s液中，使殘留在血管中的血細(xì)胞充分滲出。
3、逆腎上腺靜脈灌注質(zhì)量百分濃度為0.1％的I型膠原酶5ml，在37℃恒溫震蕩水浴中消化20min，使皮質(zhì)和髓質(zhì)及髓質(zhì)細(xì)胞之間的膠原成分充分解離。
4、剝除皮質(zhì)，將髓質(zhì)盡量剪碎成1mm3左右的小塊，滴加少量D-Hank’s液以保持髓質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)。
5、將剪切后的髓質(zhì)塊依次研磨過(guò)50、200、350目篩網(wǎng)，并用D-Hank’s液沖洗過(guò)濾。收集的細(xì)胞用D-Hank’s液在80-120×g下離心洗滌數(shù)次，本實(shí)施例是在100×g下離心沖洗兩次，每次8min，最終接種于含有體積比5-20％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，本實(shí)施例是接種于10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。
牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞的純化6、分別配制密度為1.090g/ml、1.064g/ml、1.034g/ml和1.019g/ml的Percoll等滲溶液。
7、細(xì)胞懸液離心沉淀后與密度為1.090g/ml的Percoll溶液混懸后，加入離心管底，在其上依次緩慢加入密度為1.064g/ml、1.034g/ml、1.019g/ml的Percoll溶液，200×g下離心20min。
8、收集介于密度為1.064g/ml與1.034g/ml的Percoll溶液之間的細(xì)胞，加入D-Hank’s液在100×g下離心洗滌兩次，每次8min。最終將細(xì)胞接種于含有體積比10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
9、利用Percoll非連續(xù)密度梯度法純化牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞，平均每個(gè)腎上腺可分離得到0.7×108～3.1×108個(gè)純度在95％以上的嗜鉻細(xì)胞，而且細(xì)胞形態(tài)良好、活性達(dá)到99％(見(jiàn)圖1)。
實(shí)施例2分離純化得到的細(xì)胞經(jīng)乙醛酸誘發(fā)兒茶酚胺特征性熒光染色，可以觀察到嗜鉻細(xì)胞的黃綠色熒光，證實(shí)分離純化得到的細(xì)胞是具有分泌兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)特性的細(xì)胞—即嗜鉻細(xì)胞(見(jiàn)圖2)。
實(shí)施例3逆腎上腺靜脈灌注質(zhì)量百分濃度為0.05％的I型膠原酶7ml，在37℃恒溫震蕩水浴中消化50min，使皮質(zhì)和髓質(zhì)及髓質(zhì)細(xì)胞之間的膠原成分充分解離，其余條件同實(shí)施例1。
實(shí)施例4逆腎上腺靜脈灌注質(zhì)量百分濃度為0.15％的I型膠原酶2ml，在37℃恒溫震蕩水浴中消化30min，其余條件同實(shí)施例1。
與本發(fā)明相關(guān)的比較例文獻(xiàn)1[Kilpatrick，D.L，Ledbetter，F(xiàn).H，Carson，K.A，Kirshner，A.G，Stablility of bovine adrenal medulla cells in culture，1980，35679-692.]、文獻(xiàn)2[Moro M.A.，Lopez M.G.，Gandia L.et al.Separation and Culture ofLiving Adrenaline-and Noradrenaline-Containing Cells from Bovine AdrenalMedullae.Anal.Biochem.，1990，185243-248.]主要采用膠原酶灌注消化及Percoll連續(xù)密度梯度離心的方法分離純化牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞，雖然也得到了形態(tài)和功能活性較好的嗜鉻細(xì)胞，但對(duì)于滿(mǎn)足廣泛的臨床應(yīng)用仍存在一定問(wèn)題①灌注消化后，剪碎的髓質(zhì)又經(jīng)過(guò)2次膠原酶消化，較長(zhǎng)的消化時(shí)間(80min)導(dǎo)致細(xì)胞聚集而產(chǎn)率降低，膠原酶的大量使用也增加了工藝成本；②由于嗜鉻細(xì)胞具有非均一性，細(xì)胞密度分布在一定范圍內(nèi)，采用連續(xù)密度梯度離心法純化嗜鉻細(xì)胞不僅在細(xì)胞收集時(shí)會(huì)造成損失，而且離心后細(xì)胞層面不夠清晰；③連續(xù)密度梯度離心需在上萬(wàn)的離心力下才能形成分離介質(zhì)連續(xù)梯度區(qū)帶，只有配備超速離心機(jī)的實(shí)驗(yàn)室才能采用此方法，而且離心介質(zhì)用量較大。
文獻(xiàn)3[薛毅瓏，王魯寧等，微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞用于制備治療帕金森病藥物的用途，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?9109056.x]、文獻(xiàn)4[薛毅瓏，何立敏等，用于治療疼痛的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞藥物，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?9109057.8]、文獻(xiàn)5[趙欣春，異種嗜鉻細(xì)胞微囊及其制備方法，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?1103136.0]消化腎上腺髓質(zhì)所用膠原酶濃度較高(1％)或用量較大(剪碎的髓質(zhì)仍需膠原酶消化)，消化時(shí)間較長(zhǎng)(60min)。由于采用差速黏附法純化細(xì)胞，大大降低了細(xì)胞的得率(12個(gè)腎上腺只得到5.8×107個(gè)細(xì)胞)，但得到嗜鉻細(xì)胞的純度并不高，僅有80％，細(xì)胞存活率為90％。
通過(guò)比較例可以看出本發(fā)明具有如下效果1)采用膠原酶灌注消化、機(jī)械分離及Percoll非連續(xù)密度梯度離心分離純化牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞，經(jīng)濟(jì)可靠、可重復(fù)性強(qiáng)，具有可操作性。
2)分離純化得到的嗜鉻細(xì)胞呈圓形或多角形，表面光滑，胞漿明亮，具有良好折光性。
3)分離純化的嗜鉻細(xì)胞直徑一般在15～25μm。
4)平均每個(gè)牛腎上腺可分離得到0.7×108～3.1×108個(gè)嗜鉻細(xì)胞。
5)分離純化的嗜鉻細(xì)胞的活細(xì)胞率在99％以上。
6)分離純化的嗜鉻細(xì)胞的純度在95％以上。
權(quán)利要求
1.一種牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞分離純化的方法，其主要步驟是分離a)選擇牛腎上腺，保存于0-6℃的D-Hank’s液中；b)逆靜脈灌注無(wú)鈣、鎂D-Hank’s液后，將腎上腺浸泡在D-Hank’s液中，使殘留在血管中的血細(xì)胞充分滲出；c)逆腎上腺靜脈灌注質(zhì)量百分比濃度為0.05-0.15％的I型膠原酶2-7ml，在37℃恒溫震蕩水浴中消化20-50min，使皮質(zhì)和髓質(zhì)及髓質(zhì)細(xì)胞之間的膠原成分充分解離；d)剝除皮質(zhì)，將髓質(zhì)剪碎成0.5-1.5mm3左右的小塊，滴加D-Hank’s液以保持髓質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)；e)將剪切后的髓質(zhì)塊依次研磨過(guò)50、200、350目篩網(wǎng)，并用D-Hank’s液沖洗過(guò)濾；收集的細(xì)胞用D-Hank’s液離心洗滌，最終接種于含有體積比5-20％牛血清的DMEM培養(yǎng)液中；純化f)分別配制密度為1.090g/ml、1.064g/ml、1.034g/ml和1.019g/ml的Percoll溶液；g)將分離步驟中e制得的細(xì)胞懸液沉淀，與密度為1.090g/ml的Percoll溶液混懸后，加入離心管底，在其上依次加入密度為1.064g/ml、1.034g/ml、1.019g/ml的Percoll溶液離心；h)收集介于密度為1.064g/ml與1.034g/ml的Percoll溶液之間的細(xì)胞，加入D-Hank’s液離心洗滌；最終將細(xì)胞接種于含有體積比5-20％牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中選擇的牛腎上腺熱缺血時(shí)間小于30分鐘。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中的D-Hank’s液含有8000-14000單位/ml的青霉素和鏈霉素。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c中的消化時(shí)間為30-40min。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟e和步驟h中的離心洗滌是在80-120×g下沖洗。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟g中的離心是在200×g下離心。
全文摘要
一種牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞分離純化的方法，逆腎上腺靜脈灌注膠原酶溶液，在一定溫度下，充分水解腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞與皮質(zhì)細(xì)胞、髓質(zhì)細(xì)胞之間的膠原蛋白成分。剝離后的髓質(zhì)通過(guò)機(jī)械剪切和梯度過(guò)篩，得到離散的腎上腺嗜鉻細(xì)胞懸液，再利用懸液中細(xì)胞密度的差異將細(xì)胞進(jìn)行純化。利用Percoll非連續(xù)密度梯度法純化牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞，平均每個(gè)腎上腺可分離得到0.7×10
文檔編號(hào)C12N5/071GK1648241SQ20041000506
公開(kāi)日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2004年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月19日
發(fā)明者馬小軍, 張曉慧, 王為 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所