專利名稱：離子液體溶膠－凝膠復(fù)合膜包埋酶制備生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于離子液體溶膠-凝膠復(fù)合膜包埋酶制備生物傳感器的方法。
背景技術(shù)：
溶膠-凝膠包埋法是迄今應(yīng)用最普遍的固定化酶的方法，利用這種方法可在低溫下對(duì)有機(jī)硅烷化物水解、聚合形成網(wǎng)絡(luò)狀的膜，制得的含酶凝膠膜具有物理剛性，化學(xué)惰性和可忽略的溶漲性等優(yōu)點(diǎn)。目前已報(bào)道的溶膠-凝膠膜固定酶的生物傳感器主要集中在凝膠/聚合物的體系。B.A.Gregg，A.Heller，在J.Phys.Chem.，1991，95，5976中公開(kāi)了一種電極表面用長(zhǎng)鏈雙環(huán)交聯(lián)聚4-乙烯基吡啶并同時(shí)固定化酶的方法，所得酶凝膠能牢固固定于電極表面并有較快的響應(yīng)，但是在聚合物的交聯(lián)過(guò)程中會(huì)造成酶的失活。在Analysis 1992，20，543中，Lev公開(kāi)了一種以表面活性劑攙雜到溶膠中制備了一種無(wú)開(kāi)裂的溶膠-凝膠膜。但是表面活性劑會(huì)破壞膜中酶的活性進(jìn)而影響生物傳感器的性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種離子液體溶膠-凝膠復(fù)合膜包埋酶制備生物傳感器的方法。
本發(fā)明選用了一種新型固定化酶載體-離子液體溶膠-凝膠。由于1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼是一種粘稠的導(dǎo)電性離子液體，具有超分子結(jié)構(gòu)，它成功的避免了傳統(tǒng)溶膠-凝膠載體容易干裂、溶漲的缺點(diǎn)；同時(shí)由于離子液體良好的生物相容性及模板作用，固定化酶具有良好的生物活性而且使得其與被檢測(cè)物的接觸更容易。
本發(fā)明離子液體溶膠-凝膠復(fù)合膜包埋酶制備生物傳感器的制備方法，其主要步驟為a)將1-2毫升1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼，2-4毫升四乙氧基硅，1-2毫升水和0.05-0.1毫升0.1mol L-1的鹽酸在室溫下混合，磁力攪拌3小時(shí)，室溫下放置1-2小時(shí)，得到溶膠A；b)將1-3毫克的酶，加入50微升0.05mol L-1的pH＝6-7的磷酸緩沖溶液中混合均勻得溶液B；c)將溶膠A和溶液B按照體積比1∶1-2.5混合均勻，涂覆到電極表面，于0-4℃下放置24-48小時(shí)，得生物傳感器。
上述步驟c中涂覆電極之前也可以先在電極表面滴涂10微升濃度為7.5-15毫克/毫升的二茂鐵乙醇溶液，放置至干后再滴涂混合液。
所述酶是辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶和/或多酚氧化酶。
本發(fā)明采用的電極為本領(lǐng)域公知的基底電極。
本發(fā)明制備的生物傳感器響應(yīng)快，使用壽命長(zhǎng)，適合于檢測(cè)各種酶底物。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 制備辣根過(guò)氧化物酶?jìng)鞲衅飨仍诨纂姌O表面先滴加10微升7.5毫克/毫升的二茂鐵的乙醇溶液，放置10分鐘；再將1毫升1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼，2毫升四乙氧基硅，1毫升水和0.05毫升0.1mol L-1的鹽酸于室溫下混合，磁力攪拌3小時(shí)，即得到均相溶膠A，然后室溫下放置1小時(shí)；另將1毫克的辣根過(guò)氧化物酶加入50微升0.05mol L-1的pH6.86的磷酸緩沖溶液中混合均勻得溶液B；然后將溶膠A和溶液B按照1∶1的比例混合均勻，用微量注射器移取該混合液10微升滴涂到上述基底電極表面，然后再在4℃下放置24小時(shí)，即制得辣根過(guò)氧化物酶?jìng)鞲衅?，可用于水相中檢測(cè)過(guò)氧化氫。該生物傳感器平衡時(shí)間在5分鐘以內(nèi)；相應(yīng)時(shí)間為15秒；線形范圍為2×10-5-2×10-4mol L-1；檢測(cè)限為1×10-6mol L-1；穩(wěn)定性，2個(gè)月以上。
實(shí)施例2 制備葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅?毫升1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼，4毫升四乙氧基硅，2毫升水和0.1毫升0.1mol L-1的鹽酸于室溫下混合，磁力攪拌3小時(shí)，即得到均相溶膠A，然后室溫下放置2小時(shí)；另將3毫克的葡萄糖氧化酶，加入50微升0.05mol L-1的pH6的磷酸緩沖溶液中混合均勻得溶液B；然后將溶膠A和溶液B按照1∶2.5的比例混合均勻，用微量注射器移取該混合液5微升滴涂到基底電極表面，然后再在0℃下放置36小時(shí)，即制得葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅?，可用于水相中檢測(cè)葡萄糖。該生物傳感器平衡時(shí)間在6分鐘以內(nèi)；響應(yīng)時(shí)間為15秒；穩(wěn)定性，2個(gè)月以上。
實(shí)施例3 制備多酚氧化酶?jìng)鞲衅鲗?.5毫升1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼，3毫升四乙氧基硅，1.5毫升水和0.075毫升0.1mol L-1的鹽酸于室溫下混合，磁力攪拌3小時(shí)，即得到均相溶膠A，然后室溫下放置1.5小時(shí)；另將1毫克的酶，即葡萄糖氧化酶、辣根過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶中的一種，加入50微升0.05mol L-1的pH7的磷酸緩沖溶液中混合均勻得溶液B；然后將溶膠A和溶液B按照1∶2的比例混合均勻，用微量注射器移取該混合液10微升滴涂到基底電極表面，然后再在4℃下放置24小時(shí)，即制得多酚氧化酶生物傳感器，可用于水相中測(cè)定苯酚，兒茶酚等物質(zhì)。該生物傳感器平衡時(shí)間在6分鐘以內(nèi)；響應(yīng)時(shí)間為15秒；穩(wěn)定性，1個(gè)月以上。
實(shí)施例4 制備葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅飨仍诨纂姌O表面先滴涂15微升15毫克/毫升的二茂鐵的乙醇溶液，放置10分鐘；再將2毫升1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼，4毫升四乙氧基硅，2毫升水和0.1毫升0.1mol L-1的鹽酸于室溫下混合，磁力攪拌3小時(shí)，即得到均相溶膠A，然后室溫下放置1小時(shí)；另將2毫克的葡萄糖氧化酶，加入50微升0.05mol L-1的pH6的磷酸緩沖溶液中混合均勻得溶液B；然后將溶膠A和溶液B按照1∶2.5的比例混合均勻，用微量注射器移取溶膠A和溶液B的混合液5微升滴涂到基底電極表面，然后于4℃下放置48小時(shí)，即制得葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅?，可用于水相中檢測(cè)葡萄糖。該生物傳感器平衡時(shí)間在6分鐘以內(nèi)；響應(yīng)時(shí)間為14秒；穩(wěn)定性，1個(gè)月以上。
實(shí)施例5 制備辣根過(guò)氧化物酶?jìng)鞲衅飨仍诨纂姌O表面先滴涂15微升10毫克/毫升的二茂鐵的乙醇溶液，放置至干燥；再將1.5毫升1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼，2毫升四乙氧基硅，1毫升水和0.05毫升0.1mol L-1的鹽酸于室溫下混合，磁力攪拌3小時(shí)，即得到均相溶膠A，然后室溫下放置1小時(shí)；另將1.2毫克的辣根過(guò)氧化物酶加入50微升0.05mol L-1的pH6.86的磷酸緩沖溶液中混合均勻得溶液B；然后將溶膠A和溶液B按照1∶1.5的比例混合均勻，用微量注射器移取該混合液10微升滴涂到上述基底電極表面，然后再在4℃下放置48小時(shí)，即制得辣根過(guò)氧化物酶?jìng)鞲衅?，可用于水相中檢測(cè)過(guò)氧化氫。該生物傳感器平衡時(shí)間在6分鐘以內(nèi)；相應(yīng)時(shí)間為15秒；穩(wěn)定性，2個(gè)月以上。
實(shí)施例6 制備多酚氧化酶?jìng)鞲衅飨仍诨纂姌O表面先滴涂7.5微升12毫克/毫升的二茂鐵的乙醇溶液，放置至干燥；將1.5毫升1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼，3毫升四乙氧基硅，1.5毫升水和0.075毫升0.1mol L-1的鹽酸于室溫下混合，磁力攪拌3小時(shí)，即得到均相溶膠A，然后室溫下放置1.5小時(shí)；另將1毫克的酶，即葡萄糖氧化酶、辣根過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶中的一種，加入50微升0.05mol L-1的pH6.86的磷酸緩沖溶液中混合均勻得溶液B；然后將溶膠A和溶液B按照1∶1.5的比例混合均勻，用微量注射器移取該混合液10微升滴涂到基底電極表面，然后再在4℃下放置30小時(shí)，即制得多酚氧化酶生物傳感器，可用于水相中測(cè)定苯酚，兒茶酚等物質(zhì)。該生物傳感器平衡時(shí)間在6分鐘以內(nèi)；響應(yīng)時(shí)間為16秒；穩(wěn)定性，1個(gè)月以上。
權(quán)利要求
1.一種離子液體溶膠-凝膠復(fù)合膜包埋酶制備生物傳感器的方法，其主要步驟為a)將1-2毫升1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼，2-4毫升四乙氧基硅，1-2毫升水和0.05-0.1毫升0.1mol L-1的鹽酸在室溫下混合，磁力攪拌3小時(shí)，室溫下放置1-2小時(shí)，得到溶膠A；b)將1-3毫克的酶，加入50微升0.05mol L-1的pH＝6-7的磷酸緩沖溶液中混合均勻得溶液B；c)將溶膠A和溶液B按照體積比1∶1-2.5混合均勻，涂覆到電極表面，于0-4℃下放置24-48小時(shí)，得生物傳感器。
2.如權(quán)利要求1所述的離子液體溶膠-凝膠復(fù)合膜包埋酶制備生物傳感器的方法，其特征在于，步驟c中涂覆電極之前先在電極表面涂覆10微升二茂鐵乙醇溶液，放置至干后再滴涂混合液。
3.如權(quán)利要求1所述的離子液體溶膠-凝膠復(fù)合膜包埋酶制備生物傳感器的方法，其特征在于，所述二茂鐵乙醇溶液濃度為7.5-15毫克/毫升。
4.如權(quán)利要求1所述的離子液體溶膠-凝膠復(fù)合膜包埋酶制備生物傳感器的方法，其特征在于，所述酶是辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶或多酚氧化酶。
全文摘要
一種離子液體溶膠－凝膠復(fù)合膜包埋酶制備生物傳感器的方法，其主要步驟為將1－2毫升1－丁基，3－甲基咪唑四氟化硼，2－4毫升四乙氧基硅，1－2毫升水和0.05－0.1毫升0.1mol L
文檔編號(hào)C12Q1/26GK1661043SQ200410011340
公開(kāi)日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2004年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日
發(fā)明者劉洋, 王美佳, 李迪, 李景虹 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所