專利名稱：一種增強(qiáng)微生物可培養(yǎng)性的微孔濾膜近自然培養(yǎng)法及其裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微生物近自然培養(yǎng)的方法及培養(yǎng)裝置。
背景技術(shù)：
自然界中微生物多樣性越來越受到各國科學(xué)家的關(guān)注，科學(xué)家根據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)證據(jù)推測微生物種類數(shù)目應(yīng)該在105-106。但令人遺憾的是，僅有5,000種以下的原核生物被文獻(xiàn)描述過，流行的Approved List of Bacterial Names記載了3,500種，權(quán)威的Bergey氏手冊中記錄了3,100種。這也就是意味著所知細(xì)菌可能僅占環(huán)境細(xì)菌多樣性的1％或者更少。顯然，99％未曾描述過的原核微生物肯定有著更多的遺傳、代謝和功能多樣性，是一種看不見的國家資源。
微生物的研究長期以來受到培養(yǎng)方法的限制。德國醫(yī)生羅伯特·科赫(Robert Koch，1843-1910)曾用煮沸消毒的土豆來培養(yǎng)細(xì)菌；1887年，Richard Petri發(fā)表了一篇短文，對Koch平板技術(shù)作了又一次的改進(jìn)，設(shè)計了我們今天所使用的培養(yǎng)皿(Petri dish)。從那時到現(xiàn)在，純培養(yǎng)技術(shù)(pure culture technique)就被頻繁和常規(guī)地在微生物實驗室里用于分離、純化、活細(xì)胞計數(shù)和培養(yǎng)微生物，一直成為研究微生物的基石，以至于這一方法看起來也理所當(dāng)然。在這一百多年來，微生物學(xué)取得了長足的進(jìn)步，新的微生物不斷地被分離出來，但這遠(yuǎn)是很少一部分自然資源。Amann RI等(1995)報道，使用標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)培養(yǎng)技術(shù)對不同生境微生物可培養(yǎng)性(culturability)的測定來看，海水中微生物的可培養(yǎng)性約為0.001～0.1％，淡水約為0.25％，土壤約為0.3％，活性污泥為1～15％左右。有些微生物被許多實驗室證實是活動的，但卻不可培養(yǎng)，成為一種活動的但不可培養(yǎng)(viable but nonculturable，VBNC)狀態(tài)，至少有16個屬的30種細(xì)菌被報道有此現(xiàn)象發(fā)生。雖然自然培養(yǎng)、富集培養(yǎng)(enrichment culture)等為培養(yǎng)微生物提供了適宜的營養(yǎng)和生理組合，然而，最后的分離、純化仍然離不開傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)。因此，微生物的純培養(yǎng)技術(shù)的局限性，無疑已經(jīng)成為了微生物學(xué)進(jìn)一步研究發(fā)展的一個瓶頸，仍然需要進(jìn)一步尋找新的培養(yǎng)手段和方法。
近年來，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，利用分子技術(shù)研究自然生境微生物的非培養(yǎng)法(culture-independent method)越來越多地被廣泛使用，有些甚至使用一些能夠在原位進(jìn)行研究的技術(shù)，這些在很大程度上跨越了遏制微生物研究必須純培養(yǎng)這個瓶頸，不斷地揭示出自然界新的16SrRNA序列類型，使得我們能夠認(rèn)識越來越多的微生物?，F(xiàn)在，約有40個細(xì)菌類群成為已知，其中1/3的類群完全由未能培養(yǎng)(nonculturable)細(xì)菌組成，它們僅以16SrRNA序列方式被記錄下來。在許多環(huán)境中，這些新細(xì)菌類群和譜系占優(yōu)勢地位。但是，得到的這些微生物序列，我們對其形態(tài)、生理代謝、遺傳和生態(tài)功能等方面的知識僅僅是靠推測獲得；另外，那些只有在微生物被培養(yǎng)出來才能夠產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)，如今也不可能被研究和獲得。因此，雖然非培養(yǎng)法已經(jīng)有了長足的進(jìn)步，但為了完全了解微生物在自然環(huán)境中的功能角色，現(xiàn)有的富集和分離策略就需要提高，仍然需要發(fā)展新的培養(yǎng)方法。但迄今為止，增強(qiáng)微生物的可培養(yǎng)性、把更多的未能培養(yǎng)微生物(nonculturable microorganism)轉(zhuǎn)變成為可培養(yǎng)仍然只是微生物學(xué)家的一個夢想。
為什么眾多的微生物難以用純培養(yǎng)法被培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上呢？這是因為純培養(yǎng)法本身是指從自然界中只將特定微生物分離出來，在人工培養(yǎng)基上增殖，這意味著被培養(yǎng)微生物是處于一種同自然界其它微生物和大多數(shù)有關(guān)物質(zhì)隔絕的單純條件下。然而，自然細(xì)菌群落具有高度多樣性，微生物原來生存的自然生境要復(fù)雜、豐富得多，因此很難用一套培養(yǎng)裝置和方法讓大多數(shù)細(xì)菌生長。另外，還有一系列的因素阻礙了微生物在人工培養(yǎng)基上的復(fù)原和培養(yǎng)(1)許多微生物的復(fù)原需要提供天然樣本中的原始生態(tài)環(huán)境，這些小生境(niche，或稱為生態(tài)位)難以在人工條件下復(fù)原，極微小的變化都有可能使其喪失生活力(viability)。
(2)純培養(yǎng)中極度變化的營養(yǎng)水平甚至可能成為主要生長障礙，特別對貧營養(yǎng)水體中的微生物和那些生存策略(K-選擇)適宜于低營養(yǎng)含量和很低生長率的種類，提供營養(yǎng)成分豐富的培養(yǎng)基反而成為阻礙微生物復(fù)原的重要因素，甚至底物加速死亡(substrate-accelerated death)。
(3)對細(xì)菌培養(yǎng)的潛在重要的ATP(它在海水淡水中的濃度可達(dá)1nM，很可能源自浮游植物和其它浮游生物)和其它活性物質(zhì)，純培養(yǎng)階段很難被提供，而且很難以活性狀態(tài)提供。
(4)微生物的自然生態(tài)環(huán)境中許多種類相互依存，同一生境的微生物之間聯(lián)系千絲萬縷，細(xì)胞與細(xì)胞之間有著廣泛的通訊和聯(lián)系，在大多數(shù)饑餓狀態(tài)下微生物基因表達(dá)所涉及的cAMP、大多數(shù)革蘭氏陰性菌間的N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯(N-acyl homoserine lactones)都有可能是細(xì)胞之間溝通的信號分子，這些正逐漸被微生物學(xué)的不斷發(fā)展所揭示和證明。
(5)共代謝(cometabolism)方式是很可能是微生物在自然界中生存的重要模式之一，共棲、互生、共生便是微生物自然生態(tài)關(guān)系中共同協(xié)作生存方式的不同層次。
顯然，傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)方式完全隔絕了被培養(yǎng)微生物同外界的交流和通訊，使其難以獲得特定生境和特定生物的活性物質(zhì)，因此，自然界中的大部分微生物從其原生環(huán)境中被帶走時就會萎縮、凋謝，難以被現(xiàn)有純培養(yǎng)方法培養(yǎng)或可培養(yǎng)性很低(lowculturability)。
長期以來，微生物學(xué)家為了進(jìn)一步加強(qiáng)微生物可培養(yǎng)性、改善微生物從環(huán)境樣本中復(fù)原的狀況，主要從兩個不同的角度來進(jìn)行研究一是試驗如何盡量在自然條件下使微生物增殖，稱為自然培養(yǎng)法；二是探索在普通的純培養(yǎng)中，加入什么樣的新條件便可大大地接近自然條件，既近自然培養(yǎng)法。土壤微生物學(xué)家維諾格拉德斯基(Winogradsky)很重視微生物的自然培養(yǎng)，建立Winogradsky Column用于富集硫化菌和硝化菌，并成為微生物富集培養(yǎng)的先鋒；Rossi-Cholodny埋片法(Rossi-Cholodny buried slide technique)仍然是自然培養(yǎng)的最好的例子，Henrichi(1932)的報告認(rèn)為，載玻片在淡水中保持一定時間后，在顯微鏡下可觀察到多種多樣的未知微生物；Aristovskaya和Parinkina(1962)等前蘇聯(lián)土壤微生物學(xué)者提出的毛細(xì)管測數(shù)法也是一種在自然條件下的增殖培養(yǎng)。對近自然純培養(yǎng)的研究，則多是在增殖培養(yǎng)基的組成方面盡量接近在自然界活動的微生物的營養(yǎng)條件，如用土壤抽提液作為培養(yǎng)土壤微生物的基本成分，河水或海水作為必要的添加來培養(yǎng)各自水體中的微生物，植物汁液加入培養(yǎng)基用于培養(yǎng)植物病原菌等，但在該方面仍然沒有取得革命性的進(jìn)步。該思想最成功的范例應(yīng)該是Kaeberlein T等(2002)在Science雜志上的報道，他們使用了微孔濾膜、中間加隔片的裝置對沙灘微生物進(jìn)行過培養(yǎng)，模擬沙灘生境，結(jié)果他們獲得了成功，證明該方法能夠有效地增強(qiáng)部分微生物的可培養(yǎng)性，而且已經(jīng)有兩個菌株被證明是以前的未能培養(yǎng)微生物(nonculturable microorganism)，但遺憾地是他們并未形成一套完整的、可通用的微生物近自然純培養(yǎng)方法和裝置。
微生物學(xué)中長期以來使用微孔濾膜來過濾液體或者收集微生物，產(chǎn)品有各種各式的微孔濾器；濾膜培養(yǎng)法(filter method)中還將收集微生物后的膜直接放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，一些公司甚至將其進(jìn)一步商品化，設(shè)計為培養(yǎng)基同微孔濾膜構(gòu)成一體，如檢驗用的便攜式微孔濾膜菌落計數(shù)板，還有德國賽多利斯(Sartorius)公司的實驗室微孔過濾產(chǎn)品NPS(Nutrient Pad Set)套件(濾膜+培養(yǎng)基+培養(yǎng)皿)等，都只是微生物檢測用的培養(yǎng)基套件；微生物學(xué)中的透析培養(yǎng)系統(tǒng)，只是為了將微生物細(xì)胞與營養(yǎng)物及產(chǎn)物分開的連續(xù)培養(yǎng)裝置，或者將微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)的一種裝置；中國和其它國家許多動物細(xì)胞和組織培養(yǎng)的專利和產(chǎn)品中，很多都使用微孔濾膜作為培養(yǎng)動物細(xì)胞和組織的支撐，如細(xì)胞化學(xué)趨化功能分析中的Boyden chamber系統(tǒng)，Opticell的透明細(xì)胞培養(yǎng)卡等；在中國專利中，申請?zhí)枮?7106707的“微生物培養(yǎng)和檢測的設(shè)備和方法”敘述了選擇性地培養(yǎng)活動細(xì)菌，適合于部分細(xì)菌的復(fù)蘇；申請?zhí)枮?2120114.5的“微生物及細(xì)胞的液體培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)裝置”中使用了微孔薄膜作為進(jìn)行氣體交換的隔膜的方法和裝置。所有上述這些方法，都不具備本發(fā)明的微生物近自然培養(yǎng)方法的思想；其次，這些裝置要么是不能使被培養(yǎng)微生物同外界相交流，要么不適宜微生物在其上純培養(yǎng)和形成菌落，要么沒有形成完整可進(jìn)行微生物純培養(yǎng)的通用實驗方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有培養(yǎng)方法和裝置存在的不足，在充分研究阻礙自然界微生物復(fù)原和純培養(yǎng)的不利因素基礎(chǔ)上，提出了一種繼承和發(fā)揚近自然培養(yǎng)法思想的、為微生物提供不割斷活性物質(zhì)和通訊來源的培養(yǎng)方法，該方法將微生物培養(yǎng)在內(nèi)襯有微孔濾膜的有孔培養(yǎng)裝置中，將其放入被培養(yǎng)微生物的真實或模擬自然生境中進(jìn)行培養(yǎng)；本發(fā)明還涉及一種適用該方法的裝置，該裝置可保證被培養(yǎng)的微生物能夠同外界環(huán)境交流和通訊，但微生物本身不可逃逸和被污染，達(dá)到增強(qiáng)部分微生物的可培養(yǎng)性、甚至將部分未能培養(yǎng)微生物轉(zhuǎn)變?yōu)榭膳囵B(yǎng)(culturable)的目的。
申請人經(jīng)過多年的研究實驗中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)微生物時，如果在移植它們時創(chuàng)造一個被純培養(yǎng)微生物所需要的外部環(huán)境，提供其原生環(huán)境中的化合物組成及其共同生活的微生物，讓其感受到它們所有的環(huán)境和鄰居沒有變化或者變化足以忍受，那么這些微生物就不會知道它們被移動了，就會又有許多微生物會被培養(yǎng)出來。經(jīng)研究總結(jié)，申請人發(fā)明了本培養(yǎng)方法采用下部有孔、內(nèi)襯有微孔濾膜的培養(yǎng)裝置，滅菌加入無菌培養(yǎng)基后，先將培養(yǎng)裝置放入被培養(yǎng)微生物所需的自然環(huán)境中，讓培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)基同外環(huán)境中活性物質(zhì)相互滲透保持一致；平衡一定時間后，在無菌條件下接種微生物，繼續(xù)放回原生環(huán)境中培養(yǎng)直至獲得所需微生物，通過培養(yǎng)裝置既允許微生物同外界通訊和交流活性物質(zhì)、但又不允許微生物細(xì)胞逃逸和通過。
培養(yǎng)方法中應(yīng)該注意的是(a)在進(jìn)行微生物固體培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中固化劑成分含量應(yīng)該比通常培養(yǎng)基制備中量稍高一些，防止由于外界環(huán)境中滲透液過度進(jìn)入而破壞固體培養(yǎng)基形態(tài)；(b)培養(yǎng)前外環(huán)境液面可高于內(nèi)部培養(yǎng)基平面，壓差促進(jìn)內(nèi)外平衡；(c)固體培養(yǎng)時，外環(huán)境中的液面通常不應(yīng)高于里面培養(yǎng)基高度，培養(yǎng)基表面無明顯水漬形成，以有利于固體培養(yǎng)時菌落的形成；液體培養(yǎng)時則需調(diào)節(jié)內(nèi)外液面和滲透壓；(d)培養(yǎng)過程中，外環(huán)境物質(zhì)不能以除透過微孔濾膜的其它方式進(jìn)入；(e)其外部環(huán)境是指被培養(yǎng)微生物所需的任何環(huán)境，可以是自然環(huán)境，也可是人為創(chuàng)造的環(huán)境，包括各種水體和含液體的環(huán)境，如土壤、沙灘或沼澤、甚至可以是活體植物或動物組織和個體。
同時，申請人發(fā)明了適應(yīng)該方法實現(xiàn)的培養(yǎng)裝置，該裝置是在傳統(tǒng)培養(yǎng)微生物的容器下部穿孔，讓其同外界相通，這些有孔容器的內(nèi)部襯有一層到數(shù)層微孔濾膜，微孔濾膜的功能是使被培養(yǎng)微生物與外部環(huán)境相隔開，允許被培養(yǎng)微生物同外界細(xì)胞進(jìn)行交流、通訊，吸收外界環(huán)境中的生物活性物質(zhì)，但卻不允許膜內(nèi)微生物逃逸和被污染；而有孔容器是為微孔濾膜提供了支撐和保護(hù)，同時可以在不改變現(xiàn)有微生物實驗室其它條件下完成近自然培養(yǎng)，大大地增強(qiáng)部分微生物的生活力和可培養(yǎng)性。
微孔濾膜的孔徑大小是根據(jù)不允許微生物細(xì)胞本身通過、但允許膜兩邊細(xì)胞通訊和交流活性物質(zhì)的要求來確定，選擇對微生物無毒或低毒的微孔濾膜。微孔濾膜可以松散地內(nèi)襯在有孔容器內(nèi)，也可以進(jìn)一步工業(yè)化將二者合為一體，可以覆蓋有孔容器全部內(nèi)表面，也可是一個有孔容器內(nèi)表面的一部分，微孔濾膜可以是開放或全閉合。
微孔濾膜內(nèi)的培養(yǎng)基可以是固體、液體或半固體培養(yǎng)基。
利用本發(fā)明的方法和裝置，在不改變現(xiàn)有微生物實驗室的其它條件的基礎(chǔ)上，為許多微生物的復(fù)蘇和生長提供所需環(huán)境，不僅可以大大增強(qiáng)活動細(xì)菌的可培養(yǎng)性，特別那些是貧營養(yǎng)狀態(tài)下的微生物，甚至有可能將現(xiàn)階段微生物學(xué)領(lǐng)域認(rèn)為的未能培養(yǎng)微生物(nonculturable microorganism)中的一部分培養(yǎng)出來，使我們尋找更多的微生物資源成為可能。同時，通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法、微孔濾膜近自然培養(yǎng)法、非培養(yǎng)技術(shù)的結(jié)合，使我們能夠更多地解讀自然界微生物的真正面貌。


圖1A是本發(fā)明的一種培養(yǎng)裝置——有孔培養(yǎng)皿立體圖；圖1B是有孔培養(yǎng)皿的剖視圖；圖2A是本發(fā)明的一種培養(yǎng)裝置——有孔三角瓶立體圖；圖2B是有孔三角瓶的剖視圖；圖3A是本發(fā)明的一種培養(yǎng)裝置——有孔試管立體圖；圖3B是有孔試管的剖視圖。
具體實施例方式
接下來將參照附圖描述本發(fā)明微生物培養(yǎng)和分離時，將襯有微孔濾膜的有孔培養(yǎng)皿(如圖1A)包裝滅菌，加入無菌培養(yǎng)基，冷凝后待用。培養(yǎng)前，首先該有孔培養(yǎng)皿放入被培養(yǎng)微生物所需的環(huán)境中，讓外環(huán)境液面高于培養(yǎng)基的表面，壓差促進(jìn)內(nèi)外平衡，讓培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基同外環(huán)境中活性物質(zhì)相互滲透、平衡，保持一致。平衡一定時間后，在無菌條件下劃線或其它方式接種微生物，繼續(xù)放回原生環(huán)境中培養(yǎng)，此時的外環(huán)境液面應(yīng)控制為不高于培養(yǎng)基的表面，以保證培養(yǎng)基表面無明顯水漬，有利于微生物菌落形成；但如果使用傾倒平板技術(shù)(pourplate technique)時，則在瓊脂和被培養(yǎng)微生物倒入該裝置后，等待瓊脂冷凝，直接放入被培養(yǎng)微生物所需的環(huán)境中培養(yǎng)。微生物菌株保藏則使用有孔試管和微孔濾膜的裝置，滅菌后加入無菌培養(yǎng)基，冷凝，制成斜面待用；使用時，將該裝置放入外部環(huán)境中平衡，外環(huán)境液面可高于培養(yǎng)基內(nèi)表面，但應(yīng)保證接種時培養(yǎng)基表面無明顯水漬，有利于菌苔的形成；培養(yǎng)時，外環(huán)境液面通常不高于斜面下端。使用該方法微生物液體培養(yǎng)時，采用內(nèi)襯微孔濾膜的有孔三角瓶，加入液體培養(yǎng)基，放入微生物需要的外環(huán)境中平衡；平衡一定時間后，接種，繼續(xù)放入外環(huán)境中培養(yǎng)；用此法培養(yǎng)時，應(yīng)該注意調(diào)節(jié)內(nèi)外液面和滲透壓的平衡。
本方法所用的裝置有多種形式，以下例舉幾種參見圖1A和圖1B，此為內(nèi)襯有微孔濾膜的有孔培養(yǎng)皿。1為皿體，其底部有數(shù)個孔洞；2為皿蓋；3為微孔濾膜，覆蓋于培養(yǎng)皿內(nèi)表面；4為固體培養(yǎng)基。微生物培養(yǎng)和分離時，將1，2，3包裝好滅菌，加入無菌4，冷凝后待用。培養(yǎng)前，首先該裝置放入被培養(yǎng)微生物所需的環(huán)境中，讓外環(huán)境液面高于固體培養(yǎng)基4的表面，壓差促進(jìn)內(nèi)外平衡；接種微生物，繼續(xù)放回原生環(huán)境中培養(yǎng)，此時的外環(huán)境液面應(yīng)控制為不高于4的表面，以保證4表面無明顯水漬，有利于微生物菌落形成。
參見圖2A和圖2B，此為內(nèi)襯有微孔濾膜的有孔三角瓶。5為三角瓶，其特征為底部和瓶壁的下部有孔；內(nèi)襯微孔濾膜3；加上棉塞7，滅菌后加入無菌液體培養(yǎng)基6，可進(jìn)行微生物的液體培養(yǎng)。培養(yǎng)前將該裝置放入外環(huán)境中平衡，接種后繼續(xù)放入外環(huán)境中培養(yǎng)，此時應(yīng)注意調(diào)節(jié)內(nèi)外液面以維持滲透壓的平衡。該裝置可用于微生物細(xì)胞的液體培養(yǎng)。
參見圖3A或圖3B，此為內(nèi)襯有微孔濾膜的有孔試管。8為有孔試管，其特征為試管底部、下部有孔；內(nèi)襯有微孔濾膜3；加上棉塞7，滅菌后加入無菌固體培養(yǎng)基4，制作斜面，冷凝后可用于微生物菌株純化、轉(zhuǎn)接和菌株保藏等。培養(yǎng)前應(yīng)將有孔試管放入外環(huán)境中，讓外環(huán)境液面高于固體培養(yǎng)基4平面，壓差促進(jìn)內(nèi)外平衡；培養(yǎng)時外環(huán)境的液面不高于斜面最下部，以保證固體培養(yǎng)基4表面無明顯水漬，有利于微生物形成菌苔。
以上裝置中微孔濾膜的選擇要求①孔徑大小應(yīng)允許膜兩邊微生物活性物質(zhì)交流和通訊，但微生物細(xì)胞不能通過，一般常用為0.2μm，0.25μm，0.45μm等，特殊時可選用更小、更大孔徑濾膜；②膜對微生物無毒或低毒；③膜為親水性，如聚碳酸酯膜、醋酸纖維膜等等；④能夠承受121℃高溫滅菌后仍保持其原有特性。
微孔濾膜的使用先用少量清水或無菌水將其潤濕，使其更加柔軟，從而能更緊密同有孔容器內(nèi)表面相貼近(特別是有孔試管，管壁較深，不易熨帖)。
以上方法和裝置為實驗室規(guī)模下采用。有孔容器和微孔濾膜可以被進(jìn)一步合為一體，可以擴(kuò)大進(jìn)行工業(yè)化和批量化生產(chǎn)，可以有其它稱謂，但方法特征不變。
本發(fā)明是在深入研究傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法的弊端后提出和產(chǎn)生的，因此，在傳統(tǒng)純培養(yǎng)中方法和裝置中能進(jìn)行的工作，利用本方法和裝置都能進(jìn)行，如有孔培養(yǎng)皿同樣可用于微生物純培養(yǎng)、菌株分離、活細(xì)胞計數(shù)等，有孔三角瓶可用于菌株液體培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)等，有孔試管可以用于純種分離和菌株保藏等。但是，該裝置為被培養(yǎng)微生物提供了一個同外環(huán)境溝通的可能，只要有需要就可以將其放入原生環(huán)境中獲得外界環(huán)境中的信息和產(chǎn)物，這是傳統(tǒng)純培養(yǎng)法所不能提供的。在使用微孔濾膜近自然培養(yǎng)法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較的初步測定中，對泉水、溫泉水、江水、貧營養(yǎng)湖、富營養(yǎng)湖、活性污泥中的微生物可培養(yǎng)性進(jìn)行了測定，在相同培養(yǎng)情況下(如培養(yǎng)基成分、pH值、溫度)，近自然微孔濾膜培養(yǎng)法平皿中出現(xiàn)的菌落數(shù)明顯比傳統(tǒng)培養(yǎng)法平皿中的要多，統(tǒng)計表明呈顯著或極顯著差異。盡管如此，這仍只是該方法功能的一個小的部分，該方法的潛力可能是巨大的，未來很可能會證明利用本方法會獲得某些未能培養(yǎng)微生物菌株。
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)微生物可培養(yǎng)性的微孔濾膜近自然培養(yǎng)法，其特征在于采用下部有孔、內(nèi)襯濾膜并加有培養(yǎng)基的培養(yǎng)裝置，先將培養(yǎng)裝置放入被培養(yǎng)微生物所需的自然環(huán)境中，讓培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)基同外環(huán)境中活性物質(zhì)相互滲透保持一致，平衡一定時間后，然后在無菌條件接種微生物，繼續(xù)放回原生環(huán)境中培養(yǎng)直至獲得所需微生物，通過培養(yǎng)裝置既允許微生物同外界通訊和交流活性物質(zhì)、但又不允許微生物細(xì)胞逃逸和通過。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微孔濾膜近自然培養(yǎng)法，其特征在于在進(jìn)行微生物固體培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中固化劑成分含量應(yīng)該比常規(guī)固體培養(yǎng)基制備中稍高，防止由于外界環(huán)境中滲透液進(jìn)入而破壞固體培養(yǎng)基形態(tài)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微孔濾膜近自然培養(yǎng)法，其特征在于培養(yǎng)裝置在接種微生物前，外環(huán)境液面可高于內(nèi)部培養(yǎng)基平面，壓差促進(jìn)內(nèi)外平衡。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微孔濾膜近自然培養(yǎng)法，其特征在于固體培養(yǎng)時外環(huán)境中的液面通常應(yīng)低于里面固體培養(yǎng)基高度，以保證固體培養(yǎng)時菌落的形成；液體培養(yǎng)時內(nèi)外液面應(yīng)根據(jù)維持滲透壓平衡原理進(jìn)行調(diào)節(jié)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微孔濾膜近自然培養(yǎng)法，其特征在于培養(yǎng)的外部環(huán)境是指被培養(yǎng)微生物所需的任何環(huán)境，可以是自然環(huán)境，也可是人為創(chuàng)造的環(huán)境，包括各種水體和含液體的環(huán)境，甚至動植物活體組織或個體。
6.一種增強(qiáng)微生物可培養(yǎng)性的微孔濾膜近自然培養(yǎng)裝置，其特征是裝置是一種下部有孔的容器結(jié)構(gòu)，容器內(nèi)襯有一層或者數(shù)層微孔濾膜，濾膜內(nèi)加有培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微孔濾膜近自然培養(yǎng)裝置，其特征是微孔濾膜的孔徑大小是根據(jù)不允許微生物細(xì)胞本身通過、但允許膜兩邊細(xì)胞通訊和交流活性物質(zhì)的要求來確定。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微孔濾膜近自然培養(yǎng)裝置，其特征是微孔濾膜可以松散地內(nèi)襯在有孔容器內(nèi)，也可以進(jìn)一步工業(yè)化將二者合為一體。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微孔濾膜近自然培養(yǎng)裝置，其特征是微孔濾膜可以覆蓋有孔容器全部內(nèi)表面，也可是一個有孔容器內(nèi)表面的一部分；微孔濾膜可以是開放或全閉合。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微孔濾膜近自然培養(yǎng)裝置，其特征是微孔濾膜內(nèi)的培養(yǎng)基可以是固體、液體或半固體培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公布一種以近自然培養(yǎng)法為原理的微生物純培養(yǎng)方法和裝置，使用有孔的培養(yǎng)容器，容器內(nèi)襯有一層至數(shù)層微孔濾膜，滅菌后加入無菌培養(yǎng)基可用于微生物純培養(yǎng)。培養(yǎng)時將該有孔容器放入被培養(yǎng)微生物所需的環(huán)境中，使膜內(nèi)微生物可同外界微生物交流和通訊、但膜內(nèi)微生物又難以逃逸或被污染，從而使被培養(yǎng)微生物獲得一種接近自然的培養(yǎng)條件。該發(fā)明可增強(qiáng)許多自然環(huán)境中微生物的可培養(yǎng)性，甚至使部分未能培養(yǎng)微生物的分離純化成為可能。
文檔編號C12M3/00GK1556192SQ20041003703
公開日2004年12月22日 申請日期2004年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月31日
發(fā)明者葉姜瑜 申請人:重慶大學(xué)