專利名稱：用于檢測(cè)SARS疫苗中殘留DNA含量的非洲綠猴的Alu序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)SARS疫苗殘留DNA含量的非洲綠猴的Alu序列，以及利用所述序列的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
Alu序列是人類、靈長(zhǎng)類和嚙齒動(dòng)物染色體上的中等重復(fù)序列，因?yàn)楹邢拗菩詢?nèi)切酶Alu位點(diǎn)而得名，大約有300,000個(gè)拷貝。Alu序列長(zhǎng)約280bp，序列的左半部120bp和右半部150bp是兩個(gè)相似的單位，中間被富含A的區(qū)域隔開，在不同Alu家族中5’端比較保守，3’端則由比較有變化的多聚A組成。Alu序列的側(cè)翼還有7-20bp的直接重復(fù)，在不同Alu家族中并不保守，而是獨(dú)特的(Schmid CW，JelinekWR.The Alu family of dispersed repetitive sequences.Science，1982，2161065-1070)。Grimaldi等對(duì)非洲綠猴的Alu序列進(jìn)行了研究，其Alu序列的分布間隔是8kb，非洲綠猴基因文庫(kù)中75％的克隆能與人的Alu序列雜交，其Alu序列在DNA順序、散在性分布方式以及拷貝數(shù)等方面與人類是非常相似的(Grimaldi G，Queen C，Singer MF，Intrspersed repeated sequences in the African green monkey genomethat homologous to the human Alu family.Nucleic Acids Research，1981，9(21)5553-5567)。
過(guò)去認(rèn)為在人類基因組中Alu序列占到3-6％，并且是均一分布的。最近根據(jù)人類基因組圖譜研究，Alu序列占到10％，其分布不是均勻的，但仍然可以肯定它是散在分布的(Batzer MA，Deininger PL，Alu repeats and human genomic diversity.Nature reviews genetics，2002，3370-379)。Alu序列的這種散在性及高拷貝性使之可以作為基因組DNA的代表，因此世界衛(wèi)生組織推薦使用多拷貝基因Alu序列作為探針對(duì)疫苗制品痕量DNA進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。
目前尚未開發(fā)出一種簡(jiǎn)單而且重復(fù)性穩(wěn)定的探針，用于以Vero細(xì)胞作為基質(zhì)制備的疫苗中殘留DNA的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于檢測(cè)SARS疫苗中殘留DNA的非洲綠猴Alu序列。具體的，所述SARS疫苗為以Vero細(xì)胞作為基質(zhì)的疫苗。
本發(fā)明所述非洲綠猴Alu序列選自具有SEQ ID NO1所示的核酸序列和具有SEQ ID NO2所示的核酸序列。
在本發(fā)明的再一方面涉及利用所述非洲綠猴Alu序列檢測(cè)SARS疫苗中殘留DNA的方法。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，利用所述非洲綠猴Alu序列檢測(cè)SARS疫苗中殘留DNA的方法包括如下步驟1)將所述的Alu序列進(jìn)行標(biāo)記；2)分別將不同濃度的Vero DNA參比標(biāo)準(zhǔn)以及待測(cè)樣品預(yù)雜交；3)加入步驟1)中經(jīng)標(biāo)記的探針；4)樣品DNA殘留量通過(guò)與參比Vero細(xì)胞DNA雜交信號(hào)強(qiáng)度相比較以及樣品的體積而確定。
本發(fā)明所述方法中采用地高辛序列標(biāo)記的Alu序列探針進(jìn)行點(diǎn)雜交，可以特異識(shí)別Vero細(xì)胞DNA，其識(shí)別靈敏度為10pg。因此可以用于SARS滅活疫苗的質(zhì)量控制，還可以檢測(cè)其它以Vero細(xì)胞作為基質(zhì)制備的疫苗殘留DNA?？梢杂行ПO(jiān)控殘留DNA含量，為生產(chǎn)工藝提供指導(dǎo)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及本發(fā)明所述非洲綠猴Alu序列用于檢測(cè)SARS疫苗殘留DNA的用途。


圖1是PCR擴(kuò)增Alu片段的瓊脂糖電泳結(jié)果，其中，MDGL 2000DNA Marker，從上至下分別為2kb，1.6kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp.1PCR擴(kuò)增的290bp Alu片段。
圖2是T-Alu質(zhì)粒的酶切鑒定的瓊脂糖電泳結(jié)果。
MDGL 2000DNA Marker，從上至下分別為2kb，1.6kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp.1-66個(gè)質(zhì)粒的NcoI和SalI雙酶切鑒定；圖3是pT-Alu結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4顯示Alu序列探針的特異性和靈敏性。其中泳道1為陰性對(duì)照TE buffer，2-6Vero細(xì)胞DNA濃度分別為1pg，10pg，100pg，1ng，10ng；圖5是SARS滅活疫苗制備過(guò)程中的點(diǎn)雜交結(jié)果。其中第一行是參比Vero細(xì)胞DNA標(biāo)準(zhǔn)，第二行是超濾液，第三行是純化液。
實(shí)施例1非洲綠猴Alu序列的制備PCR方法擴(kuò)增Alu序列以GeneBank中的非洲綠猴Alu序列X01476做為參考設(shè)計(jì)PCR引物。上游引物P15’-gct，ttg，agg，ccg，ggc，ggg，atg-3’(21bp，SEQ IDNO3)，下游引物P25’-ctc，tct，ctt，aga，gtc，ttg，ctc，tg-3’(23bp，SEQID NO4)。PCR反應(yīng)參數(shù)為98℃變性5min，94℃ 25sec，68℃30sec，72℃30sec，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增后經(jīng)電泳檢查可見到290bp條帶(圖1)。
(2)Alu序列的克隆將PCR產(chǎn)物克隆于Promega公司的pGEM-T上，轉(zhuǎn)化E.coliJM109菌株，通過(guò)小量提取質(zhì)粒，NcoI和SalI雙酶切鑒定，得到若干個(gè)含有290bp插入片段的陽(yáng)性克隆(圖2)，挑選一個(gè)克隆命名為T-Alu，其結(jié)構(gòu)如圖3所示。
實(shí)施例2利用非洲綠猴Alu序列檢測(cè)疫苗中殘留DNA的方法將300ng純化回收的Alu序列NcoI和SalI酶切片段按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行標(biāo)記。SARS疫苗中殘留DNA的檢測(cè)采用點(diǎn)雜交法。
首先，裁取一塊所需大小的尼龍膜，分別將10gn，1ng，100pg，10pg的Vero DNA參比標(biāo)準(zhǔn)分別點(diǎn)于膜上，再將待測(cè)樣品按不同稀釋度點(diǎn)于膜上。膜分別經(jīng)過(guò)變性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)，中和液(0.5M Tris pH7.0，1M NaCl)，2XSSC各5分鐘，然后在紫外交聯(lián)儀中45J交聯(lián)5分鐘。將膜于雜交袋中預(yù)雜交1小時(shí)后加入探針雜交過(guò)夜，洗膜之后加入抗地高辛的二抗孵育，經(jīng)過(guò)洗膜后進(jìn)行生色反應(yīng)。樣品DNA殘留量通過(guò)與參比Vero細(xì)胞DNA雜交信號(hào)強(qiáng)度相比較以及樣品的體積而確定。地高辛標(biāo)記的Alu序列探針與點(diǎn)于尼龍膜上的Vero細(xì)胞DNA進(jìn)行點(diǎn)雜交。
陰性對(duì)照無(wú)雜交信號(hào)，對(duì)于不同濃度的Vero DNA該探針能夠特異性識(shí)別，雜交信號(hào)強(qiáng)度與DNA濃度成正比，對(duì)1pgVero細(xì)胞DNA檢測(cè)不到雜交信號(hào)，可見此地高辛標(biāo)記探針靈敏度是10pg(圖4)。
本方法可以有效監(jiān)控殘留DNA含量，為生產(chǎn)工藝提供指導(dǎo)。圖5顯示某批疫苗制備的超濾液階段，殘留Vero DNA含量是50ng/ml，在純化液階段殘留Vero DNA含量是5ng/ml，達(dá)到國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理指標(biāo)。
序列表<110>北京科興生物制品有限公司<120>用于檢測(cè)SARS疫苗中殘留DNA的非洲綠猴Alu<130>IDC030117<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>293<212>DNA<213>非洲綠猴<400>1gctttgaggc cgggcgggat ggctccagcc tgtaatccca gcactttggg aggccgagac60gggcggatca caaggtcagg agatcgagac catcctggct aacacggtga aaccccgtct120ctagtaaaaa atacaaaaaa ctagccgggc gaggtggcag gcgcctgtag tcccagctac180tcgggaggct gaggcaggag aatggcataa acccgggagg cggagcttgc agtgagctga240gatccggcca ccgcactcca gcctgggcca cagagcaaga ctctaagaga gag 293<210>2<211>289<212>DNA<213>非洲綠猴<400>2gctttgaggc cgggcgggat ggctcagcct gtaatcccag cacgttggga ggctgaggcg60ggaggatcac gaggtcagga gttcaaaact agcccaacca aaatggtgaa accctgtctc120tactaaaaat acaaaaatta tctgggtgtg atggcgcgtg cctgtaatcc cagctactca180ggaggctgag gcaggagaat cgcttgtacc cgggaggcag aggttgcagt gagccgagat240cacgccactg cactccagcc tggggacaga gcaagactct aagagagag289
<210>3<211>21<212>DNA<213>引物<400>3gctttgaggc cgggcgggat g 21<210>4<211>23<212>DNA<213>引物<400>4ctctctctta gagtcttgct ctg2權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)SARS疫苗殘留DNA含量的非洲綠猴的Alu序列。
2.按照權(quán)利要求1所述的序列，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.按照權(quán)利要求1所述的核酸分子，它具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
4.一種檢測(cè)SARS疫苗中殘留DNA含量的方法，包括如下步驟1)將權(quán)利要求1所述的Alu序列進(jìn)行標(biāo)記；2)分別將不同濃度的Vero DNA參比標(biāo)準(zhǔn)以及待測(cè)樣品預(yù)雜交；3)加入步驟1)中經(jīng)標(biāo)記的探針；4)樣品DNA殘留量通過(guò)與參比Vero細(xì)胞DNA雜交信號(hào)強(qiáng)度相比較以及樣品的體積而確定。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述標(biāo)記采用地高辛標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)SARS疫苗殘留DNA含量的非洲綠猴的Alu序列，以及利用所述序列的檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1690224SQ20041003849
公開日2005年11月2日 申請(qǐng)日期2004年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月29日
發(fā)明者高虹, 張振山, 高強(qiáng), 韓中山, 寧葉, 劉長(zhǎng)民, 張建三, 尹衛(wèi)東 申請(qǐng)人:北京科興生物制品有限公司