專利名稱：一種蓮藕組織總rna的快速提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蓮藕的基因克隆、基因功能及轉(zhuǎn)基因蓮藕等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，更具體涉及一種蓮藕組織總RNA的快速提取方法，適用于蓮藕等富含多糖、酚類化合物植物組織總RNA的提取。
背景技術(shù)：
蓮藕是一種重要的水生經(jīng)濟(jì)作物，不僅可以食用，而且也是重要的觀賞花卉和中草藥，對它的研究已經(jīng)引起人們的廣泛重視。就蓮藕遺傳學(xué)研究來看，傳統(tǒng)的研究主要是從形態(tài)方面進(jìn)行的研究，近期的研究主要是運(yùn)用分子生物學(xué)的方法對其進(jìn)行分子方面的研究。
植物總RNA提取技術(shù)是一項(xiàng)植物分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也是進(jìn)行植物分子生物學(xué)方面研究的必要前提。只有分離得到純度高、完整性好的高質(zhì)量總RNA，才能用于Northern雜交、mRNA純化、構(gòu)建cDNA文庫、通過RT-PCR分離基因以及進(jìn)行蛋白質(zhì)體外翻譯等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作。常用的植物組織總RNA提取方法有胍法、苯酚法、Tris-硼酸法、CTAB法、TRIzol試劑盒法等，這些方法已被廣泛用于許多植物組織總RNA的提取，但有一些植物組織中內(nèi)含物極為復(fù)雜，尤其是在富含多糖、酚類物質(zhì)、脂肪及一些尚未能確定的次生代謝物質(zhì)等情況下，不利于RNA的分離和純化，因此能否有效地去除或抑制多糖、酚類等代謝物質(zhì)的干擾是提取高質(zhì)量植物RNA的成敗的關(guān)鍵。
一般認(rèn)為在某些植物組織中，或富含多糖，或富含酚類化合物，或含有某些尚無法確定的次生代謝物質(zhì)，或RNase活性較高等。在完整的細(xì)胞內(nèi)這些物質(zhì)在空間上與RNA是隔離的，但當(dāng)組織被研磨時(shí)，細(xì)胞破碎后，這些物質(zhì)就會與RNA相互作用。多糖形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀下來；而酚類化合物極易被氧化為褐色物質(zhì)，然后與RNA不可逆地結(jié)合，導(dǎo)致RNA活性喪失及在用氯仿抽提時(shí)RNA的丟失，或形成不溶性復(fù)合物；而分離過程中漂浮的脂肪層也不利于RNA溶液的吸取。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蓮藕組織總RNA的快速提取方法，實(shí)驗(yàn)過程簡便，操作方便、安全，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、有效。該方法是進(jìn)行蓮藕基因的克隆及功能研究、CDNA文庫的構(gòu)建、蛋白質(zhì)體外翻譯、轉(zhuǎn)基因蓮藕的研究等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。
本發(fā)明提出的方法有如下步驟1.實(shí)驗(yàn)藥品的配制與實(shí)驗(yàn)用品的處理實(shí)驗(yàn)藥品的配制配制RNA提取緩沖液、10M LiCl、3M NaAc、“氯仿∶異戊醇(24∶1)”等。溶液用0.1％DEPC-H2O或RNase-free-H2O配制。
實(shí)驗(yàn)用品的處理器皿高溫(180-200℃)連續(xù)烘烤8-12小時(shí)或用0.1％DEPC-H2O浸泡過夜后120-130℃滅菌30-60分鐘，電泳槽及加樣梳用雙氧水浸泡過夜。
2.取材蓮藕幼嫩的葉及與葉相連的葉柄。
3.提取總RNA磨樣取新鮮材料于研缽中加入緩沖液后迅速研磨。
抽提用“氯仿∶異戊醇(24∶1)”抽提2-3次。
沉淀加入10M LiCl，使RNA沉淀。
清洗與保存清洗RNA沉淀后，于-80℃～-70℃保存。
4、RNA樣品得率、純度和完整性鑒定用兩種方法檢測紫外吸收光譜檢測、甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果按常規(guī)方法，異硫氰酸胍、TRIzol試劑盒等(用異丙醇沉淀RNA)不能有效地排除多糖干擾，RNA沉淀所獲得的沉淀物體積大，并且難溶于水，這說明異丙醇沉淀RNA時(shí)導(dǎo)致了多糖、酚類物質(zhì)的共沉淀。本實(shí)驗(yàn)通過提高鹽離子濃度，如緩沖液中加入高濃度的NaCl，抽提前又加入3M的NaAc，增加了Na+濃度，減少了多糖的干擾。還有“氯仿∶異戊醇(24∶1)”的反復(fù)抽提去除多糖。
β-ME不僅能打開蛋白酶的二硫鍵使酶失活，從而抑制酚類氧化酶和RNase的活性，也能與酚類競爭性氧化，有抗氧化作用。適當(dāng)提高β-ME在提取緩沖液的終濃度，效果更好。而PVPK30中的CO＝N有很強(qiáng)的結(jié)合酚類化合物的能力，與其形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使之在以后的抽提步驟中被除去，緩沖液中同時(shí)使用還原劑β-ME和螯合劑PVPK30，有效地降低了酚類物質(zhì)的影響。
CTAB是一種較強(qiáng)的去污劑，使蛋白變性的效果明顯強(qiáng)于SDS，緩沖液中加入EDTA，能螯合Mg2+等金屬離子，從而抑制各類酶的活性。Li+可將未被氧化的酚類化合物去除，也能將部分多糖留在上清液中，使RNA更易沉淀。
該方法與已有的提取方法相比，操作步驟簡單，提取成本低，重復(fù)性好，適用性廣，能快速獲得高質(zhì)量、高純度的RNA，為進(jìn)一步分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，該方法還可用于富含多糖、酚類物質(zhì)和脂肪的其它物種的植物組織總RNA的提取。


圖1為用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測蓮藕的兩種組織中總RNA，電泳后，用AlphalmagerTM2200成像系統(tǒng)拍照所記錄的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式1、實(shí)驗(yàn)藥品的配制與實(shí)驗(yàn)用品的處理(1)、實(shí)驗(yàn)藥品的配制RNA提取緩沖液2％CTAB(w/v)，2-5％PVPK30(w/v)，100mMTris-Cl(PH8.0)，25mM EDTA(PH8.0)，2M NaCl，2-5％β-ME(用時(shí)加入)10M LiCl (用0.1％DEPC-H2O處理)3M NaAc(PH5.2) (用0.1％DEPC-H2O處理)96％乙醇 (用DEPC處理過的RNase-free的H2O配制)75％乙醇 (用DEPC處理過的RNase-free的H2O配制)“氯仿∶異戊醇(24∶1)”(2)、實(shí)驗(yàn)用品的處理
RNA提取中所有的溶液除含Tris外，均用0.1％DEPC-H2O配制，于37℃溫浴12小時(shí)，并經(jīng)125℃滅菌30分鐘；含Tris的溶液則用DEPC處理過的RNase-free的H2O，經(jīng)高壓滅菌后直接配制。玻璃、陶器、金屬等能經(jīng)高溫的器皿則于180℃連續(xù)烘烤8-12小時(shí)，塑料離心管、槍頭等均用0.1％DEPC-H2O浸泡過夜后125℃滅菌30分鐘，電泳槽及加樣梳用雙氧水浸泡過夜。
2、取材取溫室盆栽蓮藕幼嫩的葉及與葉相連的葉柄。
3、抽提，沉淀，離心得到總RNA(1)、RNA提取緩沖液于65℃水浴鍋中溫浴30分鐘以上，然后在緩沖液中加入2-5％β-ME，立即取新鮮材料于研缽中快速研磨(一般0.1g新鮮材料/1mL緩沖液)。
(2)、把研磨好的，成粘稠狀的勻漿液移入離心管中，繼續(xù)在65℃溫浴10分鐘后，加入等體積“氯仿∶異戊醇(24∶1)”，混勻，蓋上蓋子，上下劇烈搖動15秒，然后于4℃，12000g，離心10分鐘。
(3)、小心吸取上清液至一新的離心管，重復(fù)上述抽提步驟2-3次。
(4)、取上清，加入1/4體積的10M LiCl溶液并混勻，4℃條件下過夜，或-20℃條件下放置6小時(shí)以上，使RNA沉淀。
(4)、于4℃，12000g，離心20分鐘，棄上清，獲粗提的總RNA沉淀。
(5)、加入DEPC處理過的RNase-free的H2O重新溶解RNA，再加入1/10體積的3M NaAc，2.5體積的96％乙醇，置于-70℃，30分鐘，使RNA沉淀。
(6)、于4℃，12000g，再次離心20分鐘，棄上清，用70％乙醇清洗沉淀，空氣中干燥后加入DEPC處理過的RNase-free的H2O溶解RNA，保存于-70℃?zhèn)溆?也可直接用無水乙醇保存)。
4、RNA樣品得率、純度和完整性鑒定(1)、紫外吸收光譜檢測用eppendorf Biophotometer紫外分光光度計(jì)測定所抽提RNA樣品的A260、A280值。
(2)、甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測采用1.0％甲醛變性瓊脂糖凝膠，6v/cm電壓，電泳1-2小時(shí)。電泳結(jié)束后，用AlphalmagerTM2200成像系統(tǒng)拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種蓮藕組織總RNA的快速提取方法，它包括下列步驟A、實(shí)驗(yàn)藥品的配制配制RNA提取緩沖液、10M LiCl、3M NaAc、氯仿∶異戊醇24∶1，溶液用0.1％DEPC-H2O；B、實(shí)驗(yàn)用品的處理器皿用180-200℃連續(xù)烘烤8-12小時(shí)或用0.1％DEPC-H2O浸泡過夜后120-130℃滅菌30-60分鐘，電泳槽及加樣梳用雙氧水浸泡過夜；C、取材蓮藕幼嫩的葉及與葉相連的葉柄；D、提取總RNA首先是磨樣取新鮮材料于研缽中加入緩沖液后研磨；其次是抽提用氯仿∶異戊醇24∶1抽提2-3次；第三是沉淀加入10M LiCl，使RNA沉淀；第四是清洗與保存清洗RNA沉淀后，于-80℃～-70℃保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蓮藕組織總RNA的快速提取方法。其步驟是首先是對實(shí)驗(yàn)藥品的配制及實(shí)驗(yàn)用品的處理；其次是取材，取蓮藕幼嫩的葉及與葉相連的葉柄；第三是抽提，沉淀，離心得到總RNA；第四是總RNA的鑒定，分別用紫外分光光度計(jì)和甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據(jù)所得數(shù)據(jù)及電泳結(jié)果，表明所得蓮藕組織總RNA完整性好、純度高并且產(chǎn)率高。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)過程簡便，操作方便、安全，結(jié)果準(zhǔn)確、有效，重復(fù)性好，該方法也適用于富含多糖、多酚的其它物種的植物組織總RNA的提取。
文檔編號C12N15/29GK1587405SQ20041006081
公開日2005年3月2日 申請日期2004年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月9日
發(fā)明者王曼玲, 朱虹玲, 周立, 胡中立, 周明全, 宋運(yùn)淳 申請人:武漢大學(xué)