專利名稱：miRNA檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種miRNA及其前體RNA的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒，本方法可用于miRNA及其前體的表達(dá)分析、克隆研究以及臨床標(biāo)本檢驗(yàn)。
背景技術(shù)：
miRNA(microRNA)是一類具有19～25nt的RNA分子，是由其前體分子在酶的作用下加工生成，其前體序列一般為70～120nt，廣泛存在于生物體中。由于miRNA序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍認(rèn)為miRNA的功能是參與生命的一些基本過(guò)程，如發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、應(yīng)激反應(yīng)和脂肪代謝等，越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNA在細(xì)胞中起著調(diào)控基因表達(dá)的重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)miRNA與細(xì)胞的癌變有著極為密切的關(guān)系，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA與肺癌、結(jié)直腸腫瘤、伯基特淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病等腫瘤疾病有關(guān)，分析結(jié)果顯示約一半已發(fā)現(xiàn)的miRNA定位于染色體腫瘤基因相關(guān)區(qū)域及染色體的脆性位點(diǎn)。這些研究結(jié)果都表明miRNA在細(xì)胞癌變中可能發(fā)揮著重要的作用。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、費(fèi)用低的檢測(cè)方法對(duì)miRNA的功能研究和臨床檢測(cè)具有重要意義。
由于miRNA分子只有20nt左右大小，檢測(cè)比較困難。目前采用的方法主要是Northern blot等雜交的方法進(jìn)行檢測(cè)，方法繁瑣，不易成功。Allawi等建立了Invader Assay的方法(Allawi HT，Deahlberg JE，OlsonS，et al.Quantitation of microRNAs using a modified Invader assay.RNA，2004，101153-1161)，Liu等建立了寡核苷酸芯片方法(Liu C，Calin GA，et al.An oligonucleotide microchip for genome-widemicroRNA profiling in human and mouse tissues.PNAS，2004，101(26)9740-9744)，需要熒光標(biāo)記和熒光儀或芯片檢測(cè)儀，而且由于miRNA分子太小，應(yīng)用也受到一定的限制。對(duì)miRNA前體的檢測(cè)主要是采用RT-PCR的方法(Schmittgen TD，Jiang J，Liu Q，et al.A high-throughput method to monitor theexpression of microRNA precursors.Nucleic Acids Research，2004，32(4)e43)，采用隨機(jī)引物或與miRNA前體互補(bǔ)的引物直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，但是該方法不適用于miRNA分子的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種檢測(cè)miRNA分子的簡(jiǎn)便、實(shí)用的方法及其配套試劑盒，用于miRNA及其前體的檢測(cè)。
本發(fā)明的miRNA及其前體檢測(cè)方法，其特征在于其檢測(cè)方法是基于細(xì)胞和組織總RNA或小分子RNA的純化，經(jīng)多聚核苷酸聚合酶在RNA分子3′端加上Poly(A)，再由oligo(dT)12-30-接頭引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以miRNA或其前體相關(guān)序列和接頭引物的互補(bǔ)序列為多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)引物，擴(kuò)增獲得相應(yīng)的miRNA或其前體的DNA片段。反轉(zhuǎn)錄oligo(dT)12-30-接頭引物一般長(zhǎng)度為40～60nt，5′端為20～30nt的接頭序列，3′端為12～30nt的oligo(dT)，還可以在3′末端加上兩個(gè)堿基的A，G或C/A，G，C或T，最后兩個(gè)堿基可以起錨定作用。接頭引物互補(bǔ)序列引物為反轉(zhuǎn)錄oligo(dT)12-30-接頭引物不包括dT部分的5′端序列。作為檢測(cè)miRNA的PCR擴(kuò)增引物的miRNA相關(guān)DNA序列可以是miRNA分子序列的全長(zhǎng)，也可以是miRNA的部分序列，但是長(zhǎng)度最好大于18nt。作為檢測(cè)miRNA前體的PCR擴(kuò)增引物的DNA序列可以是miRNA前體上的部分序列，但是長(zhǎng)度最好大于18nt。PCR擴(kuò)增miRNA或其前體所使用的相應(yīng)的miRNA或其前體引物DNA序列的5′端可以加上一段接頭引物。
由于本方法采用了在RNA分子的3′端加上poly(A)的方式，使小分子的RNA片段得以延長(zhǎng)，因此適用于小分子RNA的檢測(cè)。
miRNA及其前體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒由RNA加Poly(A)尾反應(yīng)系統(tǒng)、反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和PCR擴(kuò)增系統(tǒng)和對(duì)應(yīng)的引物組成，該試劑盒包括1)多聚核苷酸聚合酶，及其反應(yīng)緩沖液；2)反轉(zhuǎn)錄酶，及其反應(yīng)緩沖液；3)Taq酶，及其反應(yīng)緩沖液；4)反轉(zhuǎn)錄oligo(dT)12-30-接頭引物、接頭引物互補(bǔ)序列引物和miRNA或其前體PCR擴(kuò)增用引物。
在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中如果只加入miRNA擴(kuò)增引物，就可以只檢測(cè)相應(yīng)的miRNA分子；如果在PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入miRNA和miRNA前體擴(kuò)增引物，就可以在同一個(gè)PCR反應(yīng)中檢測(cè)miRNA和其前體分子。對(duì)于成熟miRNA分子位于其前體分子5′端的miRNA在合適的反應(yīng)條件下只用miRNA引物也可以在同一PCR反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)miRNA和其前體分子。
由于miRNA分子較小，因此，PCR反應(yīng)產(chǎn)物最好用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。電泳結(jié)束后，可以用EB染色和銀染的方法染色觀察。
在PCR反應(yīng)體系中還可以加入內(nèi)對(duì)照引物進(jìn)行半定量PCR反應(yīng)，或?qū)CR引物進(jìn)行熒光分子標(biāo)記進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。
本方法和相應(yīng)的試劑盒可用于miRNA及其前體的表達(dá)分析、克隆研究以及臨床標(biāo)本檢驗(yàn)。
本發(fā)明用下列實(shí)施例進(jìn)行解釋，這些實(shí)施例的目的只是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。


結(jié)合

本發(fā)明的具體實(shí)施方法圖1檢測(cè)組織及細(xì)胞中成熟miRNA的表達(dá)電泳2檢測(cè)組織及細(xì)胞中miRNA前體的表達(dá)電泳圖實(shí)施例實(shí)施例一檢測(cè)組織及細(xì)胞中成熟miRNA的表達(dá)以檢測(cè)HepG2、Hela及人胎肝的miR-26a、miR-27a、miR-30b及miR-30c為例。
1.相關(guān)引物設(shè)計(jì)(1)反轉(zhuǎn)錄oligo(dT)12-30-接頭引物為5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG(T)30(A，G或C)(A，G，C或T)；(2)接頭引物互補(bǔ)序列引物為5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG，為3′PCR引物；(3)miR-26a、miR-27a、miR-30b及miR-30c的5′PCR引物分別為miR-26a5′TTCAAGTAATCCAGGATAGGCTmiR-27a5′TTCACAGTGGCTAAGTTCCGCCmiR-30b5′TGTAAACATCCTACACTCAGCmiR-30c5′TGTAAACATCCTACACTCTCAGC2.cDNA的制備以HepG2、Hela及人胎肝為材料，用Ambion公司mirVanaTMmiRNA Isolation Kit提取其小分子RNA(≤200nt)(操作方法見(jiàn)其說(shuō)明書(shū))。各取1μg RNA用多聚核苷酸聚合酶(Poly(A)聚合酶)在3′端加上Poly(A)，反應(yīng)條件如下RNA1μg10×緩沖液 5μlMnCl25μlDTT5μ10.1％BSA 10μlATP1mmol/LPoly(A)聚合酶 3UDEPC處理的H2O 加到50μl于37℃反應(yīng)30分鐘。之后加入50μl DEPC處理水，再加入100μl(等量)的苯酚/氯仿(1∶1)，充分混勻。12000rpm離心5分鐘，取上清移至另一微量離心管中，再加入100μl(等量)氯仿，充分混勻后以12000rpm離心5分鐘。取上清移至另一微量離心管中，加入2μl糖原(10mg/ml)、10μl(1/10量)的3mol/LNaAc(pH5.2)混勻。再加入250μl的冷無(wú)水乙醇，-20℃放置1小時(shí)。于4℃，以12000rpm離心20分鐘，用75％的乙醇漂洗沉淀，室溫晾干后溶于適量DEP℃處理的水中。
以上述處理的RNA為模板，以反轉(zhuǎn)錄oligo(dT)12-30-接頭引物5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG(T)30(A，G或C)(A，G，C或T)為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(反應(yīng)條件參考逆轉(zhuǎn)錄酶的說(shuō)明書(shū))，合成的cDNA即為PCR反應(yīng)的模板。
3.PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳分析于20μl PCR反應(yīng)體系中分別加入5′端的miRNA擴(kuò)增引物及3′端擴(kuò)增引物各0.5μg，0.25μl cDNA，再加入dNTP、PCR緩沖液及Taq酶。按下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增94℃ 30秒、61℃ 30秒、72℃ 30秒，25個(gè)循環(huán)。取10μl PCR產(chǎn)物行12％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，EB染色后進(jìn)行結(jié)果分析。
圖1中a為miR-26a，b為miR-27a，c為miR-30b，d為miR-30c；1為HepG2細(xì)胞，2為Hela細(xì)胞，3為人胎肝組織。M為DL2000 Marker，C為無(wú)模板對(duì)照。結(jié)果表明此方法可擴(kuò)增miRNA，特異性較好。
回收擴(kuò)增獲得的miRNA的DNA片段，克隆至測(cè)序載體，測(cè)序結(jié)果證明所擴(kuò)增序列正確。
實(shí)施例二檢測(cè)組織及細(xì)胞中miRNA前體的表達(dá)以實(shí)施例一的cDNA為模板，以逆轉(zhuǎn)錄引物的接頭序列5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG為3′端PCR引物，以miR-16-1、miR-30b及miR-30c-2前體的3′端部分序列為5′PCR引物，分別為miR-16-15′TGTGCTGCTGAAGTAAGGTTGAmiR-30b5′GGTGGATGTTTACTTCAGCTGAmiR-30c-25′GCTGGGAGAAGGCTGTTTACTC于20μl PCR反應(yīng)體系中分別加入5′端及3′端PCR引物各0.5μg，0.25μl cDNA，再加入dNTP、PCR緩沖液及Taq酶。按下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增94℃ 30秒、61℃ 30秒、72℃ 30秒，25個(gè)循環(huán)。取10μl PCR產(chǎn)物行12％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，EB染色后進(jìn)行結(jié)果分析。
圖2中a為miR-16-1，b為miR-30b，c為miR-30c-2；1為HepG2細(xì)胞，2為Hela細(xì)胞，3為人胎肝組織。M為DL2000 Marker，C為無(wú)模板對(duì)照。結(jié)果表明此方法可擴(kuò)增miRNA的前體，特異性較好。
回收擴(kuò)增獲得的miRNA前體DNA片段，克隆至測(cè)序載體，測(cè)序結(jié)果證明所擴(kuò)增序列正確。
權(quán)利要求
1.一種miRNA及其前體檢測(cè)方法，其特征在于其檢測(cè)方法是基于細(xì)胞和組織總RNA或小分子RNA的純化，經(jīng)多聚核苷酸聚合酶在RNA分子3′端加上Poly(A)，再由oligo(dT)12-30—接頭引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以miRNA或其前體相關(guān)序列和接頭引物的可補(bǔ)序列為多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)引物，擴(kuò)增獲得相應(yīng)的miRNA或其前體的DNA片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，反轉(zhuǎn)錄oligo(dT)12-30—接頭引物長(zhǎng)度為40～60nt，5′端為20～30nt的接頭序列，3′端為12～30nt的dT，在3′末端加上兩個(gè)堿基的A，G或C/A，G，C或T，最后兩個(gè)堿基起錨定作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，接頭引物互補(bǔ)序列引物為反轉(zhuǎn)錄oligo(dT)12-30—接頭引物不包括dT部分的5′端序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，作為檢測(cè)miRNA的PCR擴(kuò)增引物的miRNA相關(guān)DNA序列可以是miRNA分子序列的全長(zhǎng)，也可以是miRNA的部分序列，長(zhǎng)度大于18nt。作為檢測(cè)miRNA前體的PCR擴(kuò)增引物的DNA序列可以是miRNA前體上的部分序列，長(zhǎng)度大于18nt。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，PCR擴(kuò)增miRNA或其前體所使用的相應(yīng)的miRNA或其前體引物DNA序列的5′端可以加上一段接頭引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，在PCR反應(yīng)體系中可以加入內(nèi)對(duì)照引物進(jìn)行半定量PCR反應(yīng)，或?qū)CR引物進(jìn)行熒光分子標(biāo)記進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。
7.同一種miRNA和其前體的檢測(cè)可以在同一反應(yīng)中進(jìn)行，也可以分別進(jìn)行。
8.一種miRNA及其前體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒由RNA加Poly(A)尾反應(yīng)系統(tǒng)、反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和PCR擴(kuò)增系統(tǒng)和對(duì)應(yīng)的引物組成，該試劑盒包括1)多聚核苷酸聚合酶，及其反應(yīng)緩沖液；2)反轉(zhuǎn)錄酶，及其反應(yīng)緩沖液；3)Taq酶，及其反應(yīng)緩沖液；4)反轉(zhuǎn)錄oligo(dT)12-30—接頭引物、接頭引物互補(bǔ)序列引物和miRNA或其前體PCR擴(kuò)增用引物。
9.上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，用于miRNA和其前體檢測(cè)試劑盒。
10.本方法和試劑盒可用于miRNA及其前體的表達(dá)分析、克隆研究以及臨床標(biāo)本檢驗(yàn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種miRNA及其前體RNA的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒。其檢測(cè)方法是提取細(xì)胞總RNA或小分子RNA，經(jīng)多聚核苷酸聚合酶在RNA分子3’端加上Poly(A)，再由oligodT－接頭引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以miRNA或其前體的相關(guān)序列和接頭引物的互補(bǔ)序列為多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)引物，擴(kuò)增獲得相應(yīng)的miRNA和其前體RNA。檢測(cè)試劑盒由RNA加Poly(A)尾反應(yīng)系統(tǒng)、反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和PCR擴(kuò)增系統(tǒng)和對(duì)應(yīng)的引物組成。本方法具有簡(jiǎn)便、快速和適于大量樣本檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。本方法可用于miRNA及其前體的表達(dá)分析、克隆研究以及臨床標(biāo)本檢驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1763223SQ20041008381
公開(kāi)日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2004年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月19日
發(fā)明者鄭曉飛, 付漢江, 朱捷, 孫志賢 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所