專(zhuān)利名稱(chēng)：分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子菌種鑒定試劑盒的制備及其應(yīng)用，它屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體是關(guān)于分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒的制備及其在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在全世界結(jié)核病依然是危害人類(lèi)健康的主要傳染病之一，1985年以來(lái)艾滋病的流行、結(jié)核感染的移民和部分人群生活貧困等原因使美國(guó)等歐美發(fā)達(dá)國(guó)家結(jié)核病發(fā)病率呈回升趨勢(shì)，尤其是結(jié)核菌耐藥問(wèn)題和非結(jié)核分枝桿菌病的發(fā)病率逐年上升使結(jié)核病治療更是雪上加霜。
目前全世界有結(jié)核病人約2000萬(wàn)，每年新增結(jié)核病人800～1000萬(wàn)，每年死亡人數(shù)約300萬(wàn)。1993年世界衛(wèi)生組織(WHO)史無(wú)前例地宣布“全球結(jié)核病緊急狀態(tài)”，1998年又重申遏制結(jié)核病的行動(dòng)刻不容緩。
我國(guó)的結(jié)核病疫情和耐藥情況都相當(dāng)嚴(yán)重，是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病人數(shù)位居世界第二，僅次于印度。2000年第四次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查初步結(jié)果表明，我國(guó)有5.5億人感染了結(jié)核菌；現(xiàn)有肺結(jié)核病人451萬(wàn)，其中傳染性肺結(jié)核病人196萬(wàn)；每年死亡人數(shù)約13萬(wàn)，結(jié)核病死亡在我國(guó)各種死亡原因中居第9位，在傳染病中居第一位；分離出的分枝桿菌中，結(jié)核分枝桿菌占86.4％，牛分枝桿菌占2.5％，非結(jié)核分枝桿菌占11.1％，非結(jié)核分枝桿菌的比率較前明顯增加。
究其原因是非結(jié)核分枝桿菌病人對(duì)大多數(shù)一線(xiàn)抗結(jié)核藥物具有天然抗藥性，采用目前標(biāo)準(zhǔn)的化療方案治療無(wú)效。目前，非結(jié)核分枝桿菌病通常依據(jù)傳統(tǒng)的分枝桿菌菌種鑒定來(lái)確診，然而，傳統(tǒng)的分枝桿菌菌種鑒定煩瑣、費(fèi)時(shí)，需1～2月時(shí)間，不能滿(mǎn)足臨床開(kāi)展早期有效化療的需要，使非結(jié)核分枝桿菌病人通常被作為結(jié)核病按常規(guī)治療，病人經(jīng)長(zhǎng)期規(guī)則化療而療效不佳，療程延長(zhǎng)，成為難治、復(fù)治病人，細(xì)菌在局部播散。因此，分枝桿菌菌種的快速鑒定對(duì)結(jié)核病和非結(jié)核分枝桿菌病的早期診斷、鑒別診斷、有效化療和控制傳播都有極其重要的意義。
傳統(tǒng)的分枝桿菌菌種鑒定方法需在改良羅氏培養(yǎng)基、對(duì)硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼鑒別培養(yǎng)基上初步鑒別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌后，再觀察細(xì)菌培養(yǎng)生長(zhǎng)情況(包括菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)溫度和色素產(chǎn)生)，做一系列生化試驗(yàn)(包括耐熱觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、吐溫-80水解試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、芳香硫酸酯酶試驗(yàn)、煙酸試驗(yàn)、鐵離子吸收試驗(yàn)和亞碲酸還原試驗(yàn))進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定，操作煩瑣、費(fèi)時(shí)，需4～8周時(shí)間，影響因素多，重復(fù)性差，現(xiàn)臨床實(shí)驗(yàn)室不常規(guī)開(kāi)展。
BACTAC TB460 1977年問(wèn)世，其特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，可初步鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物和非結(jié)核分枝桿菌，在國(guó)內(nèi)外已成為結(jié)核病診斷的標(biāo)準(zhǔn)參照系統(tǒng)之一。1977年問(wèn)世、90年代初引進(jìn)我國(guó)的BACTAC TB460分枝桿菌快速培養(yǎng)儀，利用放射性14C棕櫚酸為基底物的7H 12B液體培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌時(shí)，由于標(biāo)本中含菌量不同，分枝桿菌生長(zhǎng)產(chǎn)生的放射性CO2量也不同，達(dá)到儀器的檢測(cè)值所需時(shí)間也不同，一般需4-25天。此外，由于P-硝基-α-乙酰氨基-β-羥基苯丙酮(P-Nitro-α-Acetylamino-β-hydroxypropi-phenone，簡(jiǎn)稱(chēng)NAP)對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群生長(zhǎng)有抑制作用，而對(duì)非結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，在BACTACTB460內(nèi)加入NAP繼續(xù)培養(yǎng)2-6天后，根據(jù)生長(zhǎng)指數(shù)可初步鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌。但BACTAC TB460只能進(jìn)行初步的菌種鑒別，而且與傳統(tǒng)鑒定法相比，其特異性只有95％左右，區(qū)分出來(lái)的非結(jié)核分枝桿菌尚需進(jìn)一步的菌種鑒定，此外，BACTAC TB460儀器價(jià)格昂貴，需專(zhuān)門(mén)進(jìn)口廠家(美國(guó)BectonDickinson公司)的專(zhuān)利液體培養(yǎng)基，費(fèi)用較高，有放射性，而難以在普通實(shí)驗(yàn)室廣泛開(kāi)展。
PCR菌種鑒定法是用各種分枝桿菌特異性引物對(duì)標(biāo)本DNA進(jìn)行一系列PCR擴(kuò)增或多重PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異性片段進(jìn)行鑒定，或先用分枝桿菌屬特異的外部引物擴(kuò)增，然后再用菌種特異的內(nèi)部引物進(jìn)行巢氏擴(kuò)增鑒定，該法靈敏、快速，但目前PCR所能夠鑒定的分枝桿菌菌種尚不多，主要有結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、鳥(niǎo)分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌，而且鑒定未知的感染菌，需采用一系列種特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增；PCR-直接測(cè)序鑒定法是用分枝桿菌屬特異的引物對(duì)標(biāo)本的16SrRNA或16S-23SrRNA間隔區(qū)序列或65kD或32kD抗原基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后直接測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列，比較其核苷酸的差異來(lái)鑒定菌種，該法雖靈敏、快速，已成為分枝桿菌分子菌種鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但技術(shù)要求高，需專(zhuān)門(mén)的技術(shù)人員，所需的測(cè)序儀器昂貴，成本高，而難以推廣；PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RestrictionFragment Length Polymorphism，簡(jiǎn)稱(chēng)RFLP)菌種鑒定法是以分枝桿菌屬特異性引物對(duì)標(biāo)本中分枝桿菌65KD蛋白編碼基因、16SrDNA或16S-23SrDNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后用不同的限制性?xún)?nèi)切酶消化擴(kuò)增片段，通過(guò)電泳分析酶切圖譜來(lái)鑒定菌種，目前只能鑒定部分菌種，重復(fù)性還不夠理想；PCR-基因芯片鑒定法是指將大量核酸分子以預(yù)先設(shè)計(jì)的方式固定在載體上，檢測(cè)帶標(biāo)記的待測(cè)樣品DNA，是一種大規(guī)模分析遺傳差異的新方法，目前國(guó)內(nèi)外某些實(shí)驗(yàn)室利用分枝桿菌16SrRNA或rpoB基因序列某些位置上的分枝桿菌屬或種特異的核苷酸變化，研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行雜交測(cè)序，鑒定分枝桿菌菌種，但該技術(shù)要求高，所需的點(diǎn)樣系統(tǒng)和熒光分析系統(tǒng)昂貴，而難以推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種快速、敏感、高效、價(jià)廉的分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒；本發(fā)明的另一目的是提供上述試劑盒的制備方法。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案達(dá)到的一種分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒，含有分枝桿菌分子菌種鑒定膜片和分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑，其特征在于所述分枝桿菌分子菌種鑒定膜片是在硝酸纖維膜上固定有一系列針對(duì)分枝桿菌屬和各種分枝桿菌16S核糖體核糖核酸(簡(jiǎn)稱(chēng)rRNA)而設(shè)計(jì)的寡聚核苷酸探針，所述的寡聚核苷酸探針在3’末端加有50-110個(gè)脫氧核糖核酸(簡(jiǎn)稱(chēng)dT)；所述的分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑包括針對(duì)分枝桿菌屬16SrRNA進(jìn)行擴(kuò)增所需的5-10倍PCR緩沖液(包括50mM KCl、pH8.3的10mMTris.HCl、1.5mM MgCl2和0.01％明膠)，濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，濃度各為2.5-12.5μmol/L的5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶；所述分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑各組分的終濃度如下1倍PCR緩沖液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP的終濃度各為0.2mmol/L，5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物的終濃度各為0.2-1.0umol/L，Taq DNA聚合酶2-5U/100μl。
一種優(yōu)選技術(shù)方案，其特征在于所述寡聚核苷酸探針的特異性核苷酸序列為16-18個(gè)堿基。
一種優(yōu)選技術(shù)方案，其特征在于所述寡聚核苷酸探針序列如下表所示。

一種優(yōu)選技術(shù)方案，其特征在于所述5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物序列如下

一種分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒的制備方法，包括以下步驟1.分枝桿菌分子菌種鑒定膜片的制備方法如下(1)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)合成上述寡核苷酸探針；(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA緩沖液稀釋合成的寡核苷酸探針，使其濃度為1.5-6pmol/μl；(3)將硝酸纖維膜浸入2×SSC溶液中預(yù)處理10-30min，晾干或42℃以下烘干；(4)取0.6-1μl寡核苷酸探針點(diǎn)于預(yù)處理后的硝酸纖維膜上，60-80℃烘烤1-2小時(shí)或紫外燈下照射10-20分鐘，用水簡(jiǎn)單漂洗，晾干備用；2.分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑的配制方法如下(1)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)合成上述5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物，用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA緩沖液稀釋合成的5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物，使其濃度為2.5-12.5μmol/L；(2)取5-10倍PCR緩沖液、濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、濃度各為2.5-12.5μmol/L的5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶各裝入一無(wú)菌的塑料管中備用；3.分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒的裝配將分枝桿菌分子菌種鑒定膜片密封后和分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑裝入一容器。
一種優(yōu)選技術(shù)方案，其特征在于所述寡聚核苷酸探針的特異性核苷酸序列為16-18個(gè)堿基。
一種優(yōu)選技術(shù)方案，其特征在于所述寡聚核苷酸探針序列如下表所示。

一種優(yōu)選技術(shù)方案，其特征在于所述5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物序列如下

本發(fā)明的分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒及其制備方法，可以根據(jù)不同種分枝桿菌16S rRNA基因序列，設(shè)計(jì)、合成相應(yīng)的寡核苷酸探針，通過(guò)點(diǎn)樣法將寡核苷酸探針按一定的順序點(diǎn)在經(jīng)預(yù)處理的硝酸纖維膜上，制成檢測(cè)鑒定膜片，與帶生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，根據(jù)探針雜交的藍(lán)紫色信號(hào)強(qiáng)弱用肉眼判讀結(jié)果，可同時(shí)快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)分枝桿菌，鑒別分枝桿菌與非分枝桿菌及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分枝桿菌，鑒定分枝桿菌菌種，24小時(shí)內(nèi)即可報(bào)告結(jié)果，從而輔助臨床診斷、指導(dǎo)臨床開(kāi)展早期有效的化療。
下面通過(guò)附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但并不意味著對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。


圖1為應(yīng)用本發(fā)明膜片鑒定結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的結(jié)果；圖2為應(yīng)用本發(fā)明膜片鑒定鳥(niǎo)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的結(jié)果；圖3為直接測(cè)序法用生物分析軟件BLAST顯示的分枝桿菌臨床分離株No.12027的結(jié)果；圖4為用本發(fā)明膜片鑒定分枝桿菌臨床分離株No.12027的結(jié)果；具體實(shí)施方式
實(shí)施例1一種分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒的制備方法，包括以下步驟1.分枝桿菌分子菌種鑒定膜片的制備方法如下(1)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)合成下述寡核苷酸探針
表5 藥物提取物與混合基質(zhì)的組合實(shí)驗(yàn)(藥物提取物∶混合基質(zhì)＝1∶3)

表6 藥物提取物與混合基質(zhì)的組合實(shí)驗(yàn)(藥物提取物∶混合基質(zhì)＝1∶9)

表7 藥物提取物與混合基質(zhì)的組合實(shí)驗(yàn)(藥物提取物∶混合基質(zhì)＝1∶1)

(3)20×SSC溶液的配制氯化鈉175.3g，檸檬酸鈉88.2g，溶于800ml蒸餾水中，用10M氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，然后定容至1000ml，高壓滅菌。取20×SSC溶液用蒸餾水稀釋10倍成2×SSC溶液，將硝酸纖維膜浸入2×SSC溶液中預(yù)處理10min，置37℃溫箱烘干；(4)取0.8μl寡核苷酸探針點(diǎn)子預(yù)處理后的硝酸纖維膜上，在紫外燈下照射10分鐘，用水簡(jiǎn)單漂洗，晾干備用；2.分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑的配制方法如下(1)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)合成下述5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物

用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA緩沖液稀釋?zhuān)蛊錆舛葹?.75μmol/L；(2)取10倍PCR緩沖液、濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、濃度各為3.75μmol/L的5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物以及1U/μl Taq DNA聚合酶各裝入一無(wú)菌的塑料管中備用；3.分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒的裝配及保存將分枝桿菌分子菌種鑒定膜片密封后和分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑裝入一容器。分枝桿菌分子菌種鑒定膜片室溫干燥保存；分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑保存于-20℃冰箱中，不要保存在無(wú)霜型冰箱的冷凍室，若保存得當(dāng)，可保持活性一年。
分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒的應(yīng)用(1)樣品處理及DNA提取將來(lái)自于中國(guó)藥品生物制品檢定所的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv滅活后，提取DNA；(2)PCR擴(kuò)增①反應(yīng)體系總體積25μl。
②在0.5ml塑料離心管中加入下列試劑
試劑加樣順序 體積(μl)水 1 12.510×PCR緩沖液 2 2.53.75μmol/L 5’端帶生物素標(biāo)3 2.0記的上游引物3.75μmol/L不帶標(biāo)記的下游 4 2.0引物2.5mmol/L的dGTP、dCTP、5 2.0dATP和dTTPDNA樣品6 2.0總計(jì) 23.0若檢測(cè)標(biāo)本較多，可配制主懸液分裝。不同DNA樣品用量可能不同，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)體系中水的體積使總體積一樣。
③混勻后，于95℃變性8min。
④稍冷卻后，加Taq DNA聚合酶2μl(含2U)，混勻，加液體石蠟40μl，以防擴(kuò)增過(guò)程中水份蒸發(fā)，離心5秒使之分層良好。
⑤置珀金埃爾默公司生產(chǎn)的PCR擴(kuò)增儀中，于94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，循環(huán)35次。最后72℃延伸5分鐘。
取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，結(jié)果可見(jiàn)一條280bp的片段。
(3)預(yù)雜交液配制6×SSC溶液，5×Denharts溶液，0.1mg/ml小牛胸腺DNA，0.5十二烷基硫酸鈉(簡(jiǎn)稱(chēng)SDS)溶液。
50×Denharts溶液 10ml20×SSC溶液 30ml10SDS溶液 5ml10mg/ml小牛胸腺DNA1ml加水定容至100ml(4)預(yù)雜交將分枝桿菌分子菌種鑒定膜片和2ml預(yù)雜交液裝入雜交袋中，于37℃水浴孵育30min；(5)雜交將帶生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物20μl置98℃變性10min，置冰浴中冷卻5min后，加入雜交袋中，于37℃水浴孵育30min；(6)洗膜用洗液I2×SSC-0.1％SDS于室溫洗膜10min，再用洗液II0.2×SSC-0.1％SDS于室溫洗膜10min；(7)加酶將分枝桿菌分子菌種鑒定膜片轉(zhuǎn)入新的雜交袋中，與1∶1000的鏈親和素-堿性磷酸酶(SA-AP)于37℃水浴反應(yīng)30min；(8)洗膜用洗液III(100M Tris-HCl-150mM NaCl-2mMMgCl2-0.05％TritonX-100(pH7.5))于室溫洗膜10min，用洗液IV(100MTris-HCl-150mM NaCl-1mM MgCl2(pH9.5))于室溫洗膜10min；(9)顯色將分枝桿菌分子菌種鑒定膜片轉(zhuǎn)入新的雜交袋中，在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(簡(jiǎn)稱(chēng)BCIP)和硝基藍(lán)四氮唑(簡(jiǎn)稱(chēng)NBT)底物中閉光顯色10min。結(jié)果見(jiàn)圖1。
(10)結(jié)果判定如圖1所示，根據(jù)分枝桿菌探針雜交的藍(lán)紫色信號(hào)強(qiáng)弱，可見(jiàn)M探針和a探針雜交陽(yáng)性，其余探針雜交陰性，從而可判定該細(xì)菌屬于分枝桿菌屬，并可鑒定為結(jié)核分枝桿菌。
實(shí)施例2一種分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒的制備方法，包括以下步驟1.分枝桿菌分子菌種鑒定膜片的制備方法如下(1)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)合成下述寡核苷酸探針


(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA緩沖液稀釋合成的寡核苷酸探針，使其濃度為4pmol/μl；(3)20×SSC溶液的配制氯化鈉175.3g，檸檬酸鈉88.2g，溶于800ml蒸餾水中，用10M氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，然后定容至1000ml，高壓滅菌。取20×SSC溶液用蒸餾水稀釋10倍成2×SSC溶液，將硝酸纖維膜浸入2×SSC溶液中預(yù)處理10min，置室溫晾干；(4)取0.6μl寡核苷酸探針點(diǎn)于預(yù)處理后的硝酸纖維膜上，置烤箱中于60℃烘烤1小時(shí)，用水簡(jiǎn)單漂洗，晾干備用；2.分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑的配制方法如下(1)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)合成下述5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物

用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA緩沖液稀釋?zhuān)蛊錆舛葹?2.5μmol/L；(2)取5倍PCR緩沖液、濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、濃度各為12.5μmol/L的5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物以及5U/μl Taq DNA聚合酶各裝入一無(wú)菌的塑料管中備用；3.分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒的裝配及保存將分枝桿菌分子菌種鑒定膜片和分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑裝入一紙盒。分枝桿菌分子菌種鑒定膜片室溫干燥保存；分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑保存于-20℃冰箱中，不要保存在無(wú)霜型冰箱的冷凍室，若保存得當(dāng)，可保持活性一年。
分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒的應(yīng)用(1)樣品處理及DNA提取將來(lái)自于中國(guó)藥品生物制品檢定所的鳥(niǎo)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株滅活后，提取DNA；(2)PCR擴(kuò)增①反應(yīng)體系總體積50μl。
②在0.5ml塑料離心管中加入下列試劑
試劑加樣順序 體積(μl)水 1 22.05×PCR緩沖液 2 10.012.5μmol/L 5’端帶生物素標(biāo)3 4.0記的上游引物12.5μmol/L不帶標(biāo)記的下游 4 4.0引物2.5mmol/L的dGTP、dCTP、5 4.0dATP和dTTPDNA樣品6 5.0總計(jì) 49.0若檢測(cè)標(biāo)本較多，可配制主懸液分裝。不同DNA樣品用量可能不同，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)體系中水的體積使總體積一樣。
③混勻后，于95℃變性8min。
④稍冷卻后，加Taq DNA聚合酶1μl(含5U)，混勻，加液體石蠟40μl，以防擴(kuò)增過(guò)程中水份蒸發(fā)，離心10秒使之分層良好。
⑤置珀金埃爾默公司生產(chǎn)的PCR擴(kuò)增儀中，于94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，循環(huán)35次。最后72℃延伸5分鐘。
取8μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，結(jié)果可見(jiàn)一條278bp的片段。
(3)預(yù)雜交液配制6×SSC溶液，5×Denharts溶液，0.1mg/ml小牛胸腺DNA，0.5％十二烷基硫酸鈉(簡(jiǎn)稱(chēng)SDS)溶液。
50×Denharts溶液 10ml20×SSC溶液 30ml10％SDS溶液 5ml10mg/ml小牛胸腺DNA 1ml加水定容至 100ml(4)預(yù)雜交將分枝桿菌分子菌種鑒定膜片和3ml預(yù)雜交液裝入雜交袋中，于37℃水浴孵育30min；(5)雜交將帶生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物30μl置98℃變性10min，置冰浴中冷卻5min后，加入雜交袋中，于37℃水浴孵育30min；
(6)洗膜用洗液I2×SSC-0.1％SDS于室溫洗膜10min，再用洗液II0.2×SSC-0.1％SDS于室溫洗膜10min；(7)加酶將分枝桿菌分子菌種鑒定膜片轉(zhuǎn)入新的雜交袋中，與1∶1000的鏈親和素-堿性磷酸酶(SA-AP)于37℃水浴反應(yīng)30min；(8)洗膜用洗液III(100M Tris-HCl-150mM NaCl-2mMMgCl2-0.05％TritonX-100(pH7.5))于室溫洗膜10min，用洗液IV(100MTris-HCl-150mM NaCl-1mM MgCl2(pH9.5))于室溫洗膜10min；(9)顯色將分枝桿菌分子菌種鑒定膜片轉(zhuǎn)入新的雜交袋中，在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(簡(jiǎn)稱(chēng)BCIP)和硝基藍(lán)四氮唑(簡(jiǎn)稱(chēng)NBT)底物中閉光顯色10min。結(jié)果見(jiàn)圖2。
(10)結(jié)果判定如圖2所示，根據(jù)分枝桿菌探針雜交的藍(lán)紫色信號(hào)強(qiáng)弱，可見(jiàn)M探針和b探針雜交陽(yáng)性，其余探針雜交陰性，從而可判定該細(xì)菌屬于分枝桿菌屬，并可鑒定為鳥(niǎo)分枝桿菌。
對(duì)比例采用PCR-直接測(cè)序鑒定法鑒定來(lái)自于中國(guó)人民解放軍309醫(yī)院的分枝桿菌臨床分離株No.12027。
1.樣品處理及DNA提取將來(lái)自于中國(guó)人民解放軍309醫(yī)院的分枝桿菌臨床分離株No.12027滅活后，提取DNA；2.分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑的配制方法如下(1)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)合成下述上游引物和下游引物

用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA緩沖液稀釋?zhuān)蛊錆舛葹?.75μmol/L；(2)取10倍PCR緩沖液、濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、濃度各為3.75μmol/L的上游引物和下游引物以及5U/μl Taq DNA聚合酶各裝入一無(wú)菌的塑料管中備用；3.分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑的保存將分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑保存于-20℃冰箱中，不要保存在無(wú)霜型冰箱的冷凍室，若保存得當(dāng)，可保持活性一年。
4.PCR擴(kuò)增①反應(yīng)體系總體積100μl。
②在0.5ml塑料離心管中加入下列試劑試劑 加樣順序 體積(μl)水1 57.010×PCR緩沖液 2 10.03.75μmol/L 5’端帶生物素標(biāo) 3 8.0記的上游引物3.75μmol/L不帶標(biāo)記的下游 4 8.0引物2.5mmol/L的dGTP、dCTP、 5 8.0dATP和dTTPDNA樣品 6 8.0總計(jì) 99.0③混勻后，于95℃變性8min。
④稍冷卻后，加Taq DNA聚合酶1μl(含5U)，混勻，加液體石蠟40μl，以防擴(kuò)增過(guò)程中水份蒸發(fā)，離心5秒使之分層良好。
⑤置珀金埃爾默公司生產(chǎn)的PCR擴(kuò)增儀中，于94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，循環(huán)35次。最后72℃延伸5分鐘。
取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，結(jié)果可見(jiàn)一條278bp的片段。
5.直接測(cè)序鑒定法將剩余的95μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和20μl下游引物一起送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。
6.結(jié)果判定測(cè)序結(jié)果如圖3所示，用生物分析軟件BLAST分析顯示與戈登分枝桿菌序列完全相同，說(shuō)明該分離株為戈登分枝桿菌。
實(shí)施例3采用本發(fā)明膜片鑒定來(lái)自于中國(guó)人民解放軍309醫(yī)院的分枝桿菌臨床分離株No.12027。
一種分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒的制備方法，包括以下步驟1.分枝桿菌分子菌種鑒定膜片的制備方法如下(1)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)合成下述寡核苷酸探針

所有的寡聚核苷酸探針在3’末端加有90個(gè)dT。
(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA緩沖液稀釋合成的寡核苷酸探針，使其濃度為1.5pmol/μl；
(3)20×SSC溶液的配制氯化鈉175.3g，檸檬酸鈉88.2g，溶于800ml蒸餾水中，用10M氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，然后定容至1000ml，高壓滅菌。取20×SSC溶液用蒸餾水稀釋10倍成2×SSC溶液，將硝酸纖維膜浸入2×SSC溶液中預(yù)處理10min，置37℃溫箱烘干；(4)取1μl寡核苷酸探針點(diǎn)于預(yù)處理后的硝酸纖維膜上，在紫外燈下照射20分鐘，用水簡(jiǎn)單漂洗，晾干備用；2.分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑的配制方法如下(1)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)合成下述5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物

用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA緩沖液稀釋?zhuān)蛊錆舛葹?.5μmol/L；(2)取10倍PCR緩沖液、濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、濃度各為2.5μmol/L的5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物以及10U/μl Taq DNA聚合酶各裝入一無(wú)菌的塑料管中備用；3.分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒的裝配及保存將分枝桿菌分子菌種鑒定膜片和分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑裝入一紙盒。分枝桿菌分子菌種鑒定膜片室溫干燥保存；分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑保存于-20℃冰箱中，不要保存在無(wú)霜型冰箱的冷凍室，若保存得當(dāng)，可保持活性一年。
分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒的應(yīng)用(1)樣品處理及DNA提取將來(lái)自于解放軍309醫(yī)院的分枝桿菌臨床分離株No.12027滅活后，提取DNA；(2)PCR擴(kuò)增①反應(yīng)體系總體積100μl。
②在0.5ml塑料離心管中加入下列試劑
試劑 加樣順序 體積(μl)水 1 57.010×PCR緩沖液 2 10.03.75μmol/L 5’端帶生物素標(biāo)3 8.0記的上游引物3.75μmol/L不帶標(biāo)記的下游 4 8.0引物2.5mmol/L的dGTP、dCTP、5 8.0dATP和dTTPDNA樣品6 8.0總計(jì) 99.0③混勻后，于95℃變性8min。
④稍冷卻后，加Taq DNA聚合酶1μl(含5U)，混勻，加液體石蠟40μl，以防擴(kuò)增過(guò)程中水份蒸發(fā)，離心5秒使之分層良好。
⑤置珀金埃爾默公司生產(chǎn)的PCR擴(kuò)增儀中，于94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，循環(huán)35次，最后72℃延伸5分鐘。
⑥取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，結(jié)果可見(jiàn)一條278bp的片段。
(3)預(yù)雜交液配制6×SSC溶液，5×Denharts溶液，0.1mg/ml小牛胸腺DNA，0.5十二烷基硫酸鈉(簡(jiǎn)稱(chēng)SDS)溶液。
50×Denharts溶液 10ml20×SSC溶液 30ml10％SDS溶液 5ml10mg/ml小牛胸腺DNA1ml加水定容至100ml(4)預(yù)雜交將分枝桿菌分子菌種鑒定膜片和4ml預(yù)雜交液裝入雜交袋中，于37℃水浴孵育30min；(5)雜交將帶生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物40μl置98℃變性10min，置冰浴中冷卻5min后，加入雜交袋中，于37℃水浴孵育30min；(6)洗膜用洗液I2×SSC-0.1％SDS于室溫洗膜10min，再用洗液II0.2×SSC-0.1％SDS于室溫洗膜10min；(7)加酶將分枝桿菌分子菌種鑒定膜片轉(zhuǎn)入新的雜交袋中，與1∶1000的鏈親和素-堿性磷酸酶(SA-AP)于37℃水浴反應(yīng)30min；(8)洗膜用洗液III(100M Tris-HCl-150mM NaCl-2mMMgCl2-0.05％TritonX-100(pH7.5))于室溫洗膜10min，用洗液IV(100MTris-HCl-150mM NaCl-1mM MgCl2(pH9.5))于室溫洗膜10min；(9)顯色將分枝桿菌分子菌種鑒定膜片轉(zhuǎn)入新的雜交袋中，在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(簡(jiǎn)稱(chēng)BCIP)和硝基藍(lán)四氮唑(簡(jiǎn)稱(chēng)NBT)底物中閉光顯色10min。結(jié)果見(jiàn)圖4。
(10)結(jié)果判定如圖4所示，根據(jù)分枝桿菌探針雜交的藍(lán)紫色信號(hào)強(qiáng)弱，可見(jiàn)M探針和k探針雜交陽(yáng)性，其余探針雜交陰性，從而可判定該細(xì)菌屬于分枝桿菌屬，并可鑒定為戈登分枝桿菌。
權(quán)利要求
1.一種分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒，含有分枝桿菌分子菌種鑒定膜片和分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑，其特征在于所述分枝桿菌分子菌種鑒定膜片是在硝酸纖維膜上固定一系列針對(duì)分枝桿菌屬和各種分枝桿菌16S核糖體核糖核酸而設(shè)計(jì)的寡聚核苷酸探針，所述的寡聚核苷酸探針在3’末端加有50-110個(gè)脫氧核糖核酸；所述的分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑包括針對(duì)分枝桿菌屬16S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增所需的5-10倍PCR緩沖液，濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，濃度各為2.5-12.5μmol/L的5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶；所述分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑各組分的終濃度如下1倍PCR緩沖液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP的終濃度各為0.2mmol/L，5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物的終濃度各為0.2-1.0umol/L，Taq DNA聚合酶2-5U/100μl。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定試劑盒，其特征在于所述的PCR緩沖液含有50mM KCl、pH8.3的10mM Tris.HCl、1.5mM MgCl2和0.01％明膠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定試劑盒，其特征在于所述的寡聚核苷酸探針的特異性核苷酸序列為16-18個(gè)堿基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定試劑盒，其特征在于所述的寡聚核苷酸探針序列如下表所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定試劑盒，其特征在于所述的5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物序列如下表所示。
6.一種分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒的制備方法，包括以下步驟[1].分枝桿菌分子菌種鑒定膜片的制備方法如下(1)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)合成所述寡核苷酸探針；(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA緩沖液稀釋合成的寡核苷酸探針，使其濃度為1.5-6pmol/μl；(3)將硝酸纖維膜浸入2×SSC溶液中預(yù)處理10-30min，晾干或42℃以下烘干；(4)取0.6-1μl寡核苷酸探針點(diǎn)于預(yù)處理后的硝酸纖維膜上，60-80℃烘烤1-2小時(shí)或紫外燈下照射10-20分鐘，用水簡(jiǎn)單漂洗，晾干備用；[2].分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑的配制方法如下(1)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)合成所述5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物，用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA緩沖液稀釋合成的5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物，使其濃度為2.5-12.5μmol/L；(2)取5-10倍PCR緩沖液、濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、濃度各為2.5-12.5μmol/L的5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶各裝入一無(wú)菌的塑料管中備用；[3].分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒的裝配將分枝桿菌分子菌種鑒定膜片密封后和分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑裝入一容器。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的鑒定試劑盒的制備方法，其特征在于所述的寡聚核苷酸探針的特異性核苷酸序列為16-18個(gè)堿基。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的鑒定試劑盒的制備方法，其特征在于所述的寡聚核苷酸探針序列如下表所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的鑒定試劑盒的制備方法，其特征在于所述的5’端帶生物素標(biāo)記的上游引物和不帶標(biāo)記的下游引物序列如下表所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒及其制備方法，可以根據(jù)不同種分枝桿菌16S rRNA基因序列，設(shè)計(jì)、合成相應(yīng)的寡核苷酸探針，通過(guò)點(diǎn)樣法將寡核苷酸探針按一定的順序點(diǎn)在經(jīng)預(yù)處理的硝酸纖維膜上，制成檢測(cè)鑒定膜片，與帶生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。利用本發(fā)明的鑒定試劑盒，根據(jù)探針雜交的藍(lán)紫色信號(hào)強(qiáng)弱用肉眼判讀結(jié)果，可同時(shí)快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)分枝桿菌，鑒別分枝桿菌與非分枝桿菌及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分枝桿菌，鑒定分枝桿菌菌種，24小時(shí)內(nèi)即可報(bào)告結(jié)果，從而輔助臨床診斷、指導(dǎo)臨床開(kāi)展早期有效的化療。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1635158SQ20041008382
公開(kāi)日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月19日
發(fā)明者吳雪瓊, 梁建琴, 張俊仙, 李洪敏 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三0九醫(yī)院