專利名稱：一株高產(chǎn)3－羥基丁酮的短小芽孢桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株短小芽孢桿菌，尤其涉及一株高產(chǎn)3-羥基丁酮的短小芽孢桿菌。
背景技術(shù)：
3-羥基丁酮是一種應(yīng)用廣泛、令人喜愛的食用香料，是國際上常用的香料品種，主要用作配置奶油、乳品、酸奶和草莓等香型的香料。3-羥基丁酮具有令人愉快的奶油香味，多用作奶油、干酪、咖啡、堅果等食品的香味增強(qiáng)劑；它還可以改變啤酒的風(fēng)味，確定奶酪發(fā)酵過程中的香味等。現(xiàn)在人們生活水平日益提高，奶制品消費不斷增長，對其口味也有進(jìn)一步的要求，利用奶油香味改善食品的口味已成為時尚?，F(xiàn)在3-羥基丁酮食用香料產(chǎn)品的研究開發(fā)已經(jīng)引起國內(nèi)外生產(chǎn)廠家和科研機(jī)構(gòu)的重視。
目前，國外3-羥基丁酮實驗室制備工藝主要有從含有3-羥基丁酮的植物中萃取的方法、生物法、在催化劑條件下氧化丁酮法、電化學(xué)氧化丁酮法和在硫酸水溶液中用鉈鹽水解直鏈酮類的方法、以丁二酮或2，3-丁二醇為原料合成等方法。
有關(guān)3-羥基丁酮生產(chǎn)的研究，早在20世紀(jì)初就有報道，其方法是通過鋅和酸部分還原丁二酮；另一種3-羥基丁酮合成方法是通過2，3-丁二醇選擇性氧化得到。近年來，有許多關(guān)于用生物法制備3-羥基丁酮的報道，如通過山梨糖菌或生膜菌作用于2，3-丁二醇，或者通過曲霉菌、青霉菌等真菌作用于甘蔗汁，這些工藝方法目前只是處在實驗室研究中。但由于環(huán)保需求以及未來社會綠色化工的需要，這些生物合成法將是未來的主要研究方向。
國內(nèi)外3-羥基丁酮工業(yè)化生產(chǎn)方法主要是采用以丁二酮為原料的化學(xué)合成法。1989年日本Ehime大學(xué)在Zn-ZnCl-EtOH體系中還原丁二酮得到相應(yīng)的3-羥基丁酮。該方法是在常壓下加熱回流進(jìn)行反應(yīng)，再經(jīng)過進(jìn)一步的分離、純化即可得到3-羥基丁酮?；亓鳒囟仍?0～80℃左右，產(chǎn)品收率為71％。1992年我國杭州大學(xué)開發(fā)了用NaHSe還原制備3-羥基丁酮的方法。該方法是在硼氫化鈉溶液中加入硒粉，抽真空后反應(yīng)生成NaHSe，然后再加入乙酸和乙醇的混合液體以及溶解在四氫呋喃中的丁二酮，室溫下攪拌反應(yīng)。產(chǎn)品得率為57％。
1998年英國Witwatersrand大學(xué)的Martin Studer等應(yīng)用經(jīng)過10，11-二氫金雞納(HCD)改性的鉑作為催化劑選擇性地加氫還原丁二酮。他們先將丁二酮、催化劑以及在甲苯溶劑中的HCD加入到高壓反應(yīng)釜中，反應(yīng)壓力為10.7MPa，溫度為0～25℃，反應(yīng)進(jìn)行10min左右停止，產(chǎn)品收率為85％，可以獲得具有一定旋光性的產(chǎn)品。這是一個催化加氫反應(yīng)，反應(yīng)條件的控制十分關(guān)鍵，如果繼續(xù)反應(yīng)，3-羥基丁酮將進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為2，3-丁二醇，產(chǎn)品收率只有50％。英國Hull大學(xué)的J.A.Slipszenko等也開展了以鉑為催化劑選擇性地催化加氫還原丁二酮的研究。但他們所用的溶劑為二氯甲烷，反應(yīng)壓力為1MPa，反應(yīng)溫度為5～25℃，其產(chǎn)率為85％，在反應(yīng)中對反應(yīng)時間以及氫氣分壓進(jìn)行一定的控制，可以使(R)-3-羥基丁酮的對映體過量，產(chǎn)率達(dá)70％。
催化加氫反應(yīng)需要在高壓下進(jìn)行，設(shè)備要求高，而且反應(yīng)所用催化劑是貴金屬，價格昂貴，對于催化劑的制備、改性以及中毒、再生等一系列問題尚未解決，目前尚處于實驗室研究階段，還不能工業(yè)化。
1992年，美國的Hummel等應(yīng)用微生物菌體中的酶作為生物催化劑進(jìn)行還原反應(yīng)。該方法是培養(yǎng)乳酸桿菌或酵母菌以獲得丁二酮還原酶，并在pH值為5、溫度為70℃的條件下，應(yīng)用該還原酶及輔酶NADPH催化丁二酮還原為3-羥基丁酮，其產(chǎn)率最高達(dá)100％。由于許多酶的催化具有立體專一性，催化反應(yīng)僅生成某一構(gòu)型的手性產(chǎn)物，而不產(chǎn)生對映體或?qū)τ丑w量極少。這種利用還原酶進(jìn)行還原反應(yīng)其優(yōu)勢十分明顯，可以獲得高選擇性、高產(chǎn)率的產(chǎn)品，而且產(chǎn)品應(yīng)用于食品添加劑也更加安全無毒，容易實現(xiàn)工業(yè)化。但這一方法的關(guān)鍵步驟就是要能夠培養(yǎng)出反應(yīng)所需的丁二酮還原酶，對于這種生物合成的方法，目前國外報道比較多，在強(qiáng)調(diào)綠色化工的今天，這是一個非常重要的研究方向。
微生物發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丁酮是生物法生產(chǎn)3-羥基丁酮的一個重要分支。以葡萄糖或其它能夠轉(zhuǎn)化生成丙酮酸的化合物為底物發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮的代謝途徑已經(jīng)研究地比較清楚(附圖1)，這為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丁酮提供了理論指導(dǎo)。雖然有很多國外關(guān)于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丁酮的文獻(xiàn)和少量專利報道，但目前基本上都只處在實驗室上游研究階段；國內(nèi)也有很少這方面的研究工作，但結(jié)果不詳。從自然界中篩選分離高產(chǎn)3-羥基丁酮的微生物菌種是發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丁酮工作中重要的一環(huán)?，F(xiàn)在人們已發(fā)現(xiàn)的可以產(chǎn)生3-羥基丁酮的菌種有肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophilia)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、多粘芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、產(chǎn)氣氣桿菌(Aerobacteraerogenes)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、腸膜狀明串珠菌(Leuconoctoc mesenteroides)、乳酸明串珠菌(Leuconoctoc lactis)、酒明串珠菌(Leuconoctoc oenos)、假腸膜狀明串珠菌(Leuconoctoc pseudomesenteroides)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、季氏有胞漢遜酵母(Hanseniaspora guillieromondii)、卡爾斯伯氏釀酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、路氏釀酒酵母(Saccharomycodes ludwigii拜爾結(jié)合酵母(Zygosaccharomyces bailli)、發(fā)酵性結(jié)合酵母(Zygosaccharomycesfermentati)等。但是上述所有涉及的菌種都存在3-羥基丁酮的發(fā)酵濃度較低的問題，或者3-羥基丁酮只是作為發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的副產(chǎn)物。這些原因?qū)е码y以利用上述微生物菌種工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮。
上述從植物中提取3-羥基丁酮的方法的原料來源有限，且原料中3-羥基丁酮的含量太低，提取成本太高，無法實現(xiàn)工業(yè)化；化學(xué)合成法普遍存在較嚴(yán)峻的環(huán)保問題，反應(yīng)條件一般較劇烈，對設(shè)備要求較高，且產(chǎn)品不是綠色天然的；生物合成法，包括微生物發(fā)酵法等大多因菌種、酶活、發(fā)酵條件優(yōu)化及過程控制等等問題使得產(chǎn)物濃度太低，現(xiàn)在只處于實驗室研究階段，還未見工業(yè)化報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有生產(chǎn)3-羥基丁酮方法中的技術(shù)難點及存在的問題，提供一株新分離的以葡萄糖或蔗糖為底物高產(chǎn)3-羥基丁酮的短小芽孢桿菌，可以用此菌株發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮。
本發(fā)明涉及的短小芽孢桿菌為Bacillus pumilus XH195，已于2004年1月27日保藏于德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)，其保藏號為DSM16187。
上述Bacillus pumilus XH195DSM16187菌株形態(tài)為棒桿狀，長1.5μm～3.0μm，直徑0.6μm～0.7μm(附圖2)，菌落顏色為黃色或白色，產(chǎn)芽孢，VP反應(yīng)呈陽性，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖產(chǎn)酸，可水解酪蛋白、明膠、吐溫80，可利用檸檬酸鹽，可在含100g/L NaCl的培養(yǎng)基中生長，可在50℃條件下生長；該菌株的生理生化特征如下表Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株的生理生化特征


上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株的脂肪酸圖譜是典型的芽孢桿菌的脂肪酸圖譜。
上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株的16S rDNA序列與其它不同種的短小芽孢桿菌的16S rDNA序列有98.7％～100％的相似性。
上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株可以在髙糖LB培養(yǎng)基中生長。
上述髙糖LB培養(yǎng)基配方如下1L蒸餾水中含200g葡萄糖，10g蛋白胨，5.0g酵母粉，10g NaCl，121℃條件下滅菌15min。固體髙糖LB培養(yǎng)基是在上述配方的基礎(chǔ)上加入20g/L的瓊脂粉。
上述短小芽孢桿菌，即Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株用于發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丁酮。
用上述短小芽孢桿菌，即Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株以葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基或蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮，發(fā)酵溫度為30℃～40℃，在300ml的錐形瓶中裝50ml發(fā)酵液，置于搖床上以160r/min～220r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)40h～70h，可得到成熟的3-羥基丁酮發(fā)酵液。
上述葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下1L蒸餾水中含200g葡萄糖，50g NH4Cl，0.50g KH2PO4，4.0g K2HPO4·3H2O，2.0ml 10g/L的CaCl2水溶液，2.0ml 100g/L的MgCl2·6H2O水溶液，200μl 10g/L的FeCl3水溶液，200μl50g/L的NaCl水溶液，5.0ml10g/L的酵母粉水溶液，5.0ml的金屬離子混合液，200μl的維生素混合液，121℃條件下滅菌15min。其中金屬離子混合液組成為1L蒸餾水中含ZnCl20.50g，F(xiàn)eCl30.50g，MnCl2·4H2O 0.50g，NaMoO4·2H2O 0.10g，CuCl2·2H2O 0.050g，Na2WO4·2H2O 0.050g，HCl 120mmol/L。其中維生素混合液組成為1L蒸餾水中含0.40g泛酸鈣，0.20g肌醇，0.40g尼克酸，0.40g VB6，0.20g對氨基苯甲酸，0.5mg VB12。
上述蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方與上述葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方相同，只是將200g葡萄糖改為180g蔗糖。
上述短小芽孢桿菌，即Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，在裝有滅菌的50ml上述葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml錐形瓶中，于37℃條件下，在搖床上以180r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)60h，可得到濃度為63.0g/L的3-羥基丁酮發(fā)酵液。
上述短小芽孢桿菌，即Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，在裝有滅菌的50ml上述蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml錐形瓶中，于37℃條件下，在搖床上以180r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)60h，可得到濃度為58.1g/L的3-羥基丁酮發(fā)酵液。
得到上述3-羥基丁酮發(fā)酵液后，采用常規(guī)的萃取方法可獲得天然的、具有旋光性的3-羥基丁酮產(chǎn)品。
本發(fā)明提供的高產(chǎn)3-羥基丁酮的短小芽孢桿菌，即Bacillus pumilus XH195 DSM16187菌株，解決了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丁酮中的瓶頸問題。即背景技術(shù)中所涉及的非本發(fā)明的菌種都存在3-羥基丁酮的發(fā)酵濃度較低，或者3-羥基丁酮只是作為發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的副產(chǎn)物等原因所導(dǎo)致的難以工業(yè)化發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丁酮問題。
本發(fā)明所提供的利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮的方法具有原料價廉易得、反應(yīng)條件溫和、3-羥基丁酮產(chǎn)物濃度較高(搖瓶3-羥基丁酮的發(fā)酵濃度可達(dá)63.0克/升)、產(chǎn)品提取方法簡單、產(chǎn)品綠色天然且具有旋光性、成本較低、環(huán)境友好等優(yōu)點。


附圖1為以葡萄糖為底物生產(chǎn)3-羥基丁酮的代謝途徑。
附圖2為本發(fā)明的Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株在德國微生物菌種保藏中心所作的放大2700倍的電鏡照片。
附圖3為本發(fā)明的Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株在葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮的結(jié)果。
附圖4為本發(fā)明的Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株在蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮的結(jié)果。
具體實施例方式
實施例1耐高糖并且產(chǎn)3-羥基丁酮菌株的篩選從蘋果園、葡萄園等地取得土樣，用髙糖LB培養(yǎng)基浸泡24h，在300ml錐形瓶中裝浸泡液50ml，在37℃條件下，置于搖床上以180r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)48小時。將培養(yǎng)液以10-2、10-3兩個稀釋度涂布在固體髙糖LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24h，挑出單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，檢測3-羥基丁酮產(chǎn)量，得到耐高糖并且產(chǎn)3-羥基丁酮的菌株。上述髙糖LB培養(yǎng)基配方為1L蒸餾水中含200g葡萄糖，10g蛋白胨，5.0g酵母粉，10g NaCl，121℃條件下滅菌15min。固體髙糖LB培養(yǎng)基是在上述配方的基礎(chǔ)上加入20g/L的瓊脂粉。
實施例2通過誘變育種得到本發(fā)明菌株挑取固體髙糖LB培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)的由實施例1得到的耐高糖并且產(chǎn)3-羥基丁酮的菌株一環(huán)，接種在裝有滅菌的50ml髙糖LB培養(yǎng)基的300ml錐形瓶中，在37℃條件下，置于搖床上以180r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24小時，即制得耐高糖并且產(chǎn)3-羥基丁酮菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。
將制得的上述細(xì)胞液體培養(yǎng)物以3000r/min離心5min，傾去上清，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。將菌懸液放入一已滅菌的、裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入設(shè)有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi)，作為待處理菌懸液。
用分析天平稱取1mg亞硝基胍，加入2ml 0.1mol/L pH6.0的磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。吸取亞硝基胍溶液1ml，加入到1ml上述待處理菌懸液中，37℃振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2、10-3、10-4、10-5四個稀釋度涂布在固體髙糖LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)36小時，挑出單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，檢測3-羥基丁酮產(chǎn)量，挑選其中最高產(chǎn)量的菌株，即得到本發(fā)明菌株。
上述本發(fā)明菌株形態(tài)為棒桿狀，長1.5μm～3.0μm，直徑0.6μm～0.7μm(附圖2)，菌落顏色為黃色或白色，產(chǎn)芽孢，VP反應(yīng)呈陽性，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖產(chǎn)酸，可水解酪蛋白、明膠、吐溫80，可利用檸檬酸鹽，可在含100g/L NaCl的培養(yǎng)基中生長，可在50℃條件下生長，其脂肪酸圖譜是典型的芽孢桿菌的脂肪酸圖譜，其16SrDNA序列與其它不同種的短小芽孢桿菌的16SrDNA序列有98.7％～100％的相似性。
本發(fā)明菌株定名為Bacillus pumilus XH195，已于2004年1月27日保藏于德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)，其保藏號為DSM 16187。
實施例3制備上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取固體髙糖LB培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)的Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株一環(huán)，接種在裝有滅菌的50ml髙糖LB培養(yǎng)基的300ml錐形瓶中，在37℃條件下，置于搖床上以180r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24h，即制得Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。
實施例4利用上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，以葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基獲得成熟的3-羥基丁酮發(fā)酵液將通過實施例3的方法獲得的Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以50ml/L的接種量接種在裝有滅菌的50ml葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml錐形瓶中，在37℃條件下，置于搖床上以180r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，間隔4h取樣并檢測3-羥基丁酮含量，在第60h 3-羥基丁酮的濃度達(dá)到63.0g/L。在第60h將錐形瓶從搖床上取下停止發(fā)酵，即得成熟的3-羥基丁酮發(fā)酵液。
上述葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下1L蒸餾水中含200g葡萄糖，50g NH4Cl，0.50g KH2PO4，4.0g K2HPO4·3H2O，2.0ml 10g/L的CaCl2水溶液，2.0ml 100g/L的MgCl2·6H2O水溶液，200μl 10g/L的FeCl3水溶液，200μl 50g/L的NaCl水溶液，5.0ml10g/L的酵母粉水溶液，5.0ml的金屬離子混合液，200μl的維生素混合液，121℃條件下滅菌15min。其中金屬離子混合液組成為1L蒸餾水中含ZnCl20.50g，F(xiàn)eCl30.50g，MnCl2·4H2O 0.50g，NaMoO4·2H2O 0.10g，CuCl2·2H2O 0.050g，Na2WO4·2H2O 0.050g，HCl 120mmol/L。其中維生素混合液組成為1L蒸餾水中含0.40g泛酸鈣，0.20g肌醇，0.40g尼克酸，0.40g VB6，0.20g對氨基苯甲酸，0.5mg VB12。
實施例5利用上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，改變發(fā)酵條件，以葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基獲得成熟的3-羥基丁酮發(fā)酵液重復(fù)實施例4的操作，只是將發(fā)酵溫度改為30℃，搖床轉(zhuǎn)速改為220r/min。在第70h 3-羥基丁酮的濃度達(dá)到53.2g/L。
實施例6利用上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，改變發(fā)酵條件，以葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基獲得成熟的3-羥基丁酮發(fā)酵液重復(fù)實施例4的操作，只是將發(fā)酵溫度改為40℃，搖床轉(zhuǎn)速改為160r/min。在第40h 3-羥基丁酮的濃度達(dá)到55.7g/L。
實施例7利用上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，以蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基獲得成熟的3-羥基丁酮發(fā)酵液重復(fù)實施例4的操作，只是將葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基改為蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基。在第60h 3-羥基丁酮的濃度達(dá)到58.1g/L。
上述蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方與實施例4中葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方相同，只是將200g葡萄糖改為180g蔗糖。
實施例8利用上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，改變發(fā)酵條件，以蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基獲得成熟的3-羥基丁酮發(fā)酵液重復(fù)實施例7的操作，只是將發(fā)酵溫度改為33℃，搖床轉(zhuǎn)速改為200r/min。在第68h 3-羥基丁酮的濃度達(dá)到54.1g/L。
實施例9利用上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，改變發(fā)酵條件，以蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基獲得成熟的3-羥基丁酮發(fā)酵液重復(fù)實施例7的操作，只是將發(fā)酵溫度改為40℃，搖床轉(zhuǎn)速改為170r/min。在第45h 3-羥基丁酮的濃度達(dá)到55.1g/L。
權(quán)利要求
1.一株高產(chǎn)3-羥基丁酮的短小芽孢桿菌，其特征在于該短小芽孢桿菌名為Bacillus pumilus XH195，2004年1月27日保藏于“德國微生物菌種保藏中心”，其保藏號為DSM 16187，該短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株)細(xì)菌學(xué)特征是形態(tài)為棒桿狀，長1.5～3.0μm，直徑0.6～0.7μm，菌落顏色為黃色或白色，產(chǎn)芽孢，VP反應(yīng)呈陽性，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖產(chǎn)酸，可水解酪蛋白、明膠、吐溫80，可利用檸檬酸鹽，可在質(zhì)量百分比為10％的NaCl中生長，可在50℃下生長，所述Bacillus pumilusXH195 DSM 16187菌株的脂肪酸圖譜是典型的芽孢桿菌的脂肪酸圖譜，所述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株的16S rDNA序列與其它不同種的短小芽孢桿菌的16S rDNA序列有98.7～100％的相似性。
2.如權(quán)利要求1所述的短小芽孢桿菌，其特征在于所述Bacillus pumilus XH195DSM 16187菌株可以在高滲LB培養(yǎng)基上生長。
3，如權(quán)利要求1、2所述的短小芽孢桿菌，其特征在于所述高滲LB培養(yǎng)基配方為1升蒸餾水中含200克葡萄糖，10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，固體高滲LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量百分比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌15分鐘。
4.如權(quán)利要求1、2所述的短小芽孢桿菌，其特征在于所述短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus XH195 DSM 16187菌株)用于發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丁酮。
5.如權(quán)利要求4所述的短小芽孢桿菌，其特征在于所述用Bacillus pumilus XH195DSM 16187菌株發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丁酮，采用葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基或蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮。
6.如權(quán)利要求5所述的短小芽孢桿菌，其特征在于所述Bacillus pumilus XH195DSM 16187菌株在葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵生成3-羥基丁酮，所述葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方為1升蒸餾水中含140克葡萄糖，50克NH4Cl，0.5克KH2PO4，4克K2HPO4，2毫升質(zhì)量百分比為1％的CaCl2，2毫升質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O，200微升質(zhì)量百分比為1％的FeCl3，200微升質(zhì)量百分比為5％的NaCl，5毫升質(zhì)量百分比為1％的酵母粉，200微升的維生素混合液，5毫升的金屬離子混合液，115條件下滅菌20分鐘。
7.如權(quán)利要求6所述的短小芽孢桿菌，其特征在于所述葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方中金屬離子混合液組成為1升蒸餾水中含ZnCl20.5克，F(xiàn)eCl20.5克，MnCl2·4H2O 0.5克，Na2MoO4·2H2O 0.1克，CuCl2·2H2O 0.05克，Na2WO4·2H2O0.05克，HCl 120毫摩爾/升；維生素混合液組成為1升蒸餾水中含400毫克泛酸鈣，200毫克肌醇，400毫克尼克酸，400毫克VB6，200毫克對氨基苯甲酸，0.5毫克VB12。
8.如權(quán)利要求5所述的短小芽孢桿菌，其特征在于所述Bacillus pumilus XH195DSM 16187菌株在蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵生成3-羥基丁酮，所述蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方為1升蒸餾水中含120克蔗糖，50克NH4Cl，0.5克KH2PO4，4克K2HPO4，2毫升質(zhì)量百分比為1％的CaCl2，2毫升質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O，200微升質(zhì)量百分比為1％的FeCl3，200微升質(zhì)量百分比為5％的NaCl，5毫升質(zhì)量百分比為1％的酵母粉，200微升的維生素混合液，5毫升的金屬離子混合液，115條件下滅菌20分鐘。
9.如權(quán)利要求8所述的短小芽孢桿菌，其特征在于所述蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方中金屬離子混合液組成為1升蒸餾水中含ZnCl20.5克，F(xiàn)eCl20.5克，MnCl2·4H2O0.5克，Na2MoO4·2H2O 0.1克，CuCl2·2H2O 0.05克，Na2WO4·2H2O 0.05克，HCl120毫摩爾/升。
10.如權(quán)利要求8所述的短小芽孢桿菌，其特征在于所述蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方中維生素混合液組成為1升蒸餾水中含400毫克泛酸鈣，200毫克肌醇，400毫克尼克酸，400毫克VB6，200毫克對氨基苯甲酸，0.5毫克VB12。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株高產(chǎn)3－羥基丁酮的短小芽孢桿菌，名為Bacillus pumilus XH195，于2004年1月27日保藏于“德國微生物菌種保藏中心”，保藏號為DSM 16187。該菌的細(xì)菌學(xué)特征是形態(tài)為棒桿狀，長1.5μm～3.0μm，直徑0.6μm～0.7μm，菌落顏色為黃色或白色，具有典型的短小芽孢桿菌的生理生化特征和典型的芽孢桿菌的脂肪酸圖譜。利用該菌株以葡萄糖或蔗糖為底物在37℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)60h分別可產(chǎn)生63.0g/L或58.1g/L的3－羥基丁酮。
文檔編號C12N1/20GK1778892SQ20041008438
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月19日
發(fā)明者許平, 肖梓軍, 杜毅, 魏中浩 申請人:上海愛普香料有限公司