專利名稱：流感病毒疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于預防和治療涉及流感病毒疾病的疫苗、接種和治療領域。
背景技術：
流感病毒，有包膜、分段的負鏈RNA病毒以兩種主要類型存在，甲型流感和乙型流感。該病毒是引起人類流感的傳染性物質(zhì)。根據(jù)兩種病毒跨膜蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原性差異，甲型流感病毒進一步分為亞型。迄今為止，在人類中已經(jīng)鑒定了甲型流感的三種亞型，H1N1，H2N2，和H3N2(Hilleman，Vaccine20，3068-3087，2002)。幾乎僅在人類循環(huán)的乙型流感病毒特征在于抗原改變比率比較低。最近得到的乙型流感病毒的分離物分類為兩個主要系統(tǒng)樹，乙型流感病毒/維多利亞/2/87亞類和乙型流感病毒/Yamagata/16/88亞類。這兩種譜系在抗原上和遺傳上是不同的，使得在白鼬幾乎沒有或沒有發(fā)現(xiàn)感染后交叉-中和抗體反應(Rota等，J GenVirol 73(Pt 10)，2737-42(1992))。
流感病毒基因組的分段性質(zhì)使得超感染細胞中病毒復制期間能夠進行節(jié)段重新分配。節(jié)段重新分配，結(jié)合基因突變和漂移，隨著時間產(chǎn)生各種血清型組中流感病毒的多種趨異株。新病毒株表現(xiàn)出血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白質(zhì)中抗原性的變異。
目前預防流感的主要措施是每年接種。最常見的是使用全病毒疫苗。它們必須含有甲型流感H1N1株，甲型流感H3N2株，和乙型流感株。然而，由于流感跨膜蛋白的連續(xù)抗原變異，單一的抗那些蛋白質(zhì)的疫苗對于年復一年地使用是不合適的。因此，大群體的流感病毒許多株得以表征、示蹤和預測。根據(jù)指定一年期間各病毒株的流行和預測，設計一種疫苗來刺激抗優(yōu)勢和預期病毒株的保護性免疫應答。
與一次接種提供幾年或終生保護的疫苗的使用相比，每年接種的方法對于患者和內(nèi)科醫(yī)師是不方便的，對患者人群施用是易變的，不提供抗給定血清型組中其他流感病毒株的交叉保護作用，并且導致流感感染而喪失生命。因此，能一次接種、能提供抗高度趨異病毒群中新病毒株的交叉保護作用，并且能提供疫苗的多年或終生的所述保護作用的抗流感疫苗大有裨益。
對于給定流感類型的所有病毒株都有穩(wěn)定流感抗原基礎上的疫苗能提供這樣的裨益。最近，甲型流感的M2蛋白質(zhì)經(jīng)研究是抗原性蛋白質(zhì)，其是形成這樣的疫苗的基礎(Slepushkin等，1995 Vaccine 131399-1402)。M2蛋白質(zhì)是結(jié)構(gòu)保守的病毒表面蛋白質(zhì)。M2是流感病毒體相對次要的成分(Zebedee和Lamb，1988 J.Virol.622762-2772)，但是在病毒感染期間在受感染細胞中大量表達(Lamb等，1985Cell 40627-633)。在受感染細胞中，M2出現(xiàn)在細胞膜中并且提供病毒復制的質(zhì)子流(Helenius，1992 Cell 69577-578)。
有人闡述在感染的體內(nèi)和體外模型中甲型流感病毒的復制受到抗M2抗體的抑制(Zebedee和Lamb，1988 J.Virol.622762-2772；Hughey等，1995 Virology 212411-421)。Slepushkin等，1995Vaccine 131399-1402，描述了一個實驗，其中用全長M2接種的小鼠受到抗異源甲型流感致命侵襲的保護，并且顯示病毒從感染的肺組織清除的提高的清除率。
最近，有報道說其中去除了疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域的修飾的M2蛋白質(zhì)對于制備疫苗是有用的(美國專利6,169,175)。另一觀點中，Neirynck等，1999 Nature Med.51157-1163，描述了利用M2的胞外結(jié)構(gòu)域與乙型肝炎核心抗原N-末端的融合。當將肝炎核心抗原摻入到病毒樣顆粒中時，據(jù)說M2表位作為乙型肝炎核心抗原暴露的N-末端的部分而呈遞。作者闡明，在它們的系統(tǒng)中，與乙型肝炎核心抗原的N-末端的融合，以模擬病毒顆粒和感染細胞中M2蛋白質(zhì)野生型結(jié)構(gòu)的方式呈遞M2表位。
但是，這種方法不能延伸至乙型流感病毒，因為沒有等價于M2的疫苗靶。乙型流感病毒M2-等價功能最可能的候選蛋白質(zhì)，BM2，具有只有5-7個氨基酸的極短的胞外結(jié)構(gòu)域(Mould等，DevelopmentalCell 5，175-184，2003)。另一種候選蛋白質(zhì)，NB，最近被證明對于體外病毒復制不是必要的(Hatta等，J.Virol.77，6050-6054，2003)。
開發(fā)通用乙型流感病毒疫苗的另一種方法以稱作HA0的HA前體的成熟切割位點為基礎。導向于HA的保守表位，特別是HA0的保守表位的疫苗，將適用于甲型流感和乙型流感。
包膜糖蛋白HA介導病毒的最初附著和接著的內(nèi)化(Skehel等，Annual Review of Biochemistry 69，531-69，2000)。HA由HA1和HA2兩個亞基構(gòu)成，這兩個亞基是由它們的前體HA0的切割而來的(Skehel等，Proc Natl Acad Sci USA 72，93-7(1975；Chen等，Cell 95，409-17，1998)。HA0成熟是細胞-相關過程，由其中復制病毒的細胞分泌的蛋白酶介導(Zhirnov，Biochemistry(Mosc)68，1020-6(2003)。很多分泌的酶都與HA0裂解有關，包括纖維蛋白溶酶，激肽釋放酶，尿激酶，凝血酶，血液凝固因子Xa，頂體蛋白，類胰蛋白酶Clara，類胰蛋白酶TC30，小-纖維蛋白溶酶，來自人呼吸道灌洗液的蛋白酶，和來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的細菌蛋白酶。HA0裂解成HA1-HA2激活病毒傳染性(Klenk等，Virology 68，426-39，1975；Lazarowiz & Choppin，Virology 68，440-54(1975)，并且對于人和鳥類宿主致病性起決定作用(Klenk & Garten，Trends Microbiol2，39-43 1994；Steinhauer，Virology 258，1-20，1999)。
決定其對宿主蛋白酶敏感性的HA的主要特征是HA0前體的蛋白質(zhì)水解位點的構(gòu)成，最近通過X-射線結(jié)晶學解決了甲型流感病毒的結(jié)構(gòu)(Chen等，Cell 95，409-17，1998)。HA0幾乎與成熟加工的HA1-HA2蛋白質(zhì)相同，主要不同在于切割位點周圍18個殘基。在前體中，這些殘基折疊成延伸的沒有切割的環(huán)。亞基間切割位點的氨基酸序列在各個流感亞型中，和在乙型流感病毒的兩個系中是高度保守的。HA2側(cè)，其相應于融合肽，在甲型流感亞型中也是保守的，與H3和H1，以及和乙型流感幾乎相同。
在本說明書中，術語HA0肽類用來指從HA0的一級序列衍生的任何肽。這包括對于HA0獨特的切割位點序列，但是還有HA0前體和成熟HA共有的任何序列。成熟HA由兩個共價連接的亞基HA1和HA2構(gòu)成。因為這個原因，與切割位點序列不同的HA0肽指，或者是作為HA肽，或HA2肽。這些術語的每一個指這里稱作HA0肽中的肽的一個類型。
Nagy等首先披露了這種方法的可行性，他證明用相應于HA0的序列317-341(H1亞型)的合成肽接種的小鼠得以部分保護免受致病病毒侵襲(Nagy等，Scand J Immunol40，281-91，1994)。HA0向HA1-HA2轉(zhuǎn)化為疫苗靶的進一步證實來自蛋白酶抑制劑對病毒復制的作用。在帶有單堿基切割位點的流感病毒中，絲氨酸蛋白酶抑制劑能減少人呼吸上皮和受感染小鼠肺中HA0切割和病毒激活(Zhirnov等，J GenVirol 63，469-74，1982；Zhirnov等，J Gen Virol 65，191-6，1984；Zhirnov等，J Virol 76，8682-9，2002)。
發(fā)明概述本發(fā)明的一方面是蛋白質(zhì)-肽偶聯(lián)物，或者其藥學可接受鹽，其中各自包含甲型流感病毒M2蛋白質(zhì)的胞外表位的多個肽與載體蛋白質(zhì)的表面偶聯(lián)。
本發(fā)明的另一方面是蛋白質(zhì)-肽偶聯(lián)物，或者其藥學可接受鹽，其中各自包含甲型流感病毒HA0蛋白質(zhì)的表位的多個肽與載體蛋白質(zhì)的表面偶聯(lián)。
本發(fā)明的另一方面是蛋白質(zhì)-肽偶聯(lián)物，或者其藥學可接受鹽，其中各自包含乙型流感病毒HA0蛋白質(zhì)的表位的多個肽與載體蛋白質(zhì)的表面偶聯(lián)。
在特定的實施方案中，通過使肽與蛋白質(zhì)表面上的反應位點共價連接而將肽與蛋白質(zhì)偶聯(lián)。得到的結(jié)構(gòu)是一種偶聯(lián)物。蛋白質(zhì)表面上的反應位點是有化學活性的或者能被活化的并且空間上對于與肽的共價連接是可行的位點。優(yōu)選的反應位點是氨基酸賴氨酸的ε氮原子。共價連接指存在生理條件下對水解穩(wěn)定的共價鍵。優(yōu)選地，該共價鍵對于在包括加成物形成，氧化，和還原的生理條件下可能發(fā)生的其他反應是穩(wěn)定的。肽與蛋白質(zhì)的共價連接是通過“連接工具”實現(xiàn)的。這樣的工具包括相應的結(jié)構(gòu)，物質(zhì)，或這里描述的作用及其等價物。
在本發(fā)明這個方面的特定實施方案中，載體蛋白質(zhì)是疫苗接種領域中有用的抗原性蛋白質(zhì)。在本發(fā)明特定實施方案中，抗原蛋白質(zhì)是腦膜炎奈瑟氏球菌(Neiserria meningitidis)的外膜蛋白質(zhì)復合體(OMPC)。在其他實施方案中，載體蛋白質(zhì)可以是破傷風類毒素，白喉類毒素，乙肝表面抗原(HBsAg)，乙肝核心抗原(HBcAg)，匙孔血藍蛋白，輪狀病毒衣殼蛋白，或者?；蛉巳轭^瘤病毒病毒樣顆粒(VLP)的L1蛋白，例如6，11或16型HPV的VLP。
在本發(fā)明這個方面的其他實施方案中，肽通過它們的N-末端或者它們的C-末端與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
在其他實施方案中，肽通過接頭部分與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)。在特定實施方案中，接頭是單性或兩性間隔基。
在其他實施方案中，載體蛋白質(zhì)是腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白質(zhì)復合體(OMPC)，并且偶聯(lián)物有與各個OMPC表面偶聯(lián)的大約100至大約6000個肽。
在另外的實施方案中，其他氨基酸置換肽序列中的天然存在的氨基酸。在特定實施方案中，絲氨酸殘基置換半胱氨酸殘基。
在另外的實施方案中，對肽序列進行修飾，以改變肽的等電點。
本發(fā)明的另一方面是具有偶聯(lián)物，佐劑和生理可接受載體的疫苗。在具體實施方案中，佐劑是以鋁為基礎的佐劑。在具體實施方案中，疫苗進一步包括陽離子佐劑，例如QS21佐劑。
本發(fā)明的另一方面是具有M2偶聯(lián)物和來自乙型流感的HA0肽的偶聯(lián)物，佐劑和生理可接受載體的疫苗。
本發(fā)明的另一方面是具有M2偶聯(lián)物和來自甲型流感的HA0肽的偶聯(lián)物，來自乙型流感的HA0肽的偶聯(lián)物，佐劑和生理可接受載體的疫苗。
本發(fā)明的另一方面是用包括肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，或者其藥學可接受鹽的疫苗對患者進行抗甲型流感病毒感染引起的疾病的接種的方法，其中各自包含甲型流感病毒的M2蛋白的胞外表位的多個肽與載體蛋白質(zhì)表面偶聯(lián)。在優(yōu)選實施方案中，對患者施用有效量的本發(fā)明的疫苗。
本發(fā)明的另一方面是用包括肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，或者其藥學可接受鹽的疫苗對患者進行抗甲型流感病毒感染引起的疾病的接種的方法，其中各自包含甲型流感病毒的HA0蛋白表位的多個肽與載體蛋白質(zhì)表面偶聯(lián)。在優(yōu)選實施方案中，對患者施用有效量的本發(fā)明的疫苗。
本發(fā)明的另一方面是用包括肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，或者其藥學可接受鹽的疫苗對患者進行抗甲型或乙型流感病毒感染引起的疾病的接種的方法，其中各自包含甲型或乙型流感病毒的HA0蛋白表位的多個肽與載體蛋白質(zhì)表面偶聯(lián)。在優(yōu)選實施方案中，對患者施用有效量的本發(fā)明的疫苗。
本發(fā)明的另一方面是通過使具有流感病毒M2蛋白質(zhì)的胞外表位序列的肽與蛋白質(zhì)表面上的反應位點共價連接來制備肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的方法。
本發(fā)明的另一方面是通過將本發(fā)明的偶聯(lián)物配以佐劑并且用藥學可接受載體配制配以佐劑的偶聯(lián)物來制備疫苗的方法。
本發(fā)明的另一方面是聯(lián)合疫苗，其中抗原成分中的一個包括具有與載體蛋白質(zhì)表面的氨基酸偶聯(lián)的甲型流感病毒的M2蛋白質(zhì)胞外表位的肽。在具體實施方案中，聯(lián)合疫苗包括選自流感嗜血桿菌，甲型、乙型或丙型肝炎病毒，人乳頭瘤病毒，麻疹，腮腺炎，風疹，水痘，輪狀病毒，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原成分。另外，本發(fā)明的疫苗能與甲型流感病毒和乙型流感病毒的其他抗原成分，特別是從血凝素和神經(jīng)氨酸酶衍生的表位聯(lián)合使用。
附圖的簡要描述

圖1.硫醇化載體(1)與溴乙?；?2)或馬來酰亞胺化(3)肽反應，并且得到硫醇醚鍵(方案I)。
圖2.載體本身帶有的伯胺(1)與溴乙?；?2)或馬來酰亞胺化(3)肽反應，并且得到仲胺鍵(方案II)。
圖3.馬來酰亞胺化載體(1)與包含硫醇的肽(2)反應并且產(chǎn)生硫醇醚鍵(方案III)。對于含有多個硫醇的肽，單個肽能產(chǎn)生與載體馬來酰亞胺的多個鍵。這能減少加給載體的肽的總量。如果對獨立的蛋白質(zhì)上的馬來酰亞胺上產(chǎn)生多個鍵，則能發(fā)生通過肽的載體亞基的交聯(lián)。
圖4.鹵代烷載體(1)與含有硫醇的肽(2)反應并且產(chǎn)生硫醇醚鍵(方案IV)。對于含有多個硫醇的肽，單個肽能產(chǎn)生與載體鹵代烷的多個鍵(碘乙?；蜾逡阴?。這能減少加給載體的肽的總量。如果對獨立的蛋白質(zhì)上的碘乙?；鶊F產(chǎn)生多個鍵，則能發(fā)生通過肽的載體亞基的交聯(lián)。
圖5.交聯(lián)的馬來酰亞胺化流感肽和硫醇化OMPC的水解。能定量測定非蛋白質(zhì)氨基酸S-(1，2-二羧乙基)-高半胱氨酸，提供共價鍵的證據(jù)。能定量測定4-氨基丁酸和6-氨基己酸，來估計存在的總的肽(方案V)。
圖6.偶聯(lián)的溴乙?；鞲须暮土虼蓟疧MPC的水解。能定量測定非蛋白質(zhì)氨基酸S-(羧甲基)-高半胱氨酸，提供共價鍵證據(jù)。能定量測定6-氨基己酸，來估計存在的總的肽(方案VI)。
圖7.含有流感肽和碘乙酰化OMPC的偶聯(lián)半胱氨酸的水解。能定量測定非蛋白質(zhì)氨基酸S-羧甲基-半胱氨酸，提供共價鍵證據(jù)。能定量測定6-氨基己酸，來估計存在的總的肽。能定量測定4-氨基苯甲酸來估計與OMPC締合的交聯(lián)劑的總量(方案VII)。
圖8.包含F(xiàn)lu M2肽和馬來酰亞胺化OMPC的偶聯(lián)半胱氨酸的水解。能定量測定非蛋白質(zhì)氨基酸S-(1，2-二羧乙基)-半胱氨酸，提供共價鍵證據(jù)。能定量測定6-氨基己酸，來估計存在的總的肽。能定量測定4-氨基苯甲酸來估計與OMPC締合的交聯(lián)劑的總量(方案VII)。能定量測定凝血酸來估計與OMPC締合的交聯(lián)劑的總量(方案VIII)。
圖9.在小鼠中用M2肽偶聯(lián)物疫苗誘導M2-特異性抗體應答。雌性Balb/c小鼠，每組10只，用0.01微克，0.1微克或1微克指定偶聯(lián)物肌內(nèi)免疫接種(劑量基于肽的重量)，三周之后用相同劑量加強接種一次。第一次接種(PD1)之后兩周和加強接種(PD2)之后三周采集血樣。通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(Elisa)測定M2-特異性抗體滴度。數(shù)據(jù)代表組幾何平均值+/-標準誤(GMT+/-SE)。CT M2 15聚體ma-OMPC，是通過C-末端半胱氨酸與馬來酰亞胺-活化的OMPC偶聯(lián)的M2 15-聚體(SEQ ID NO10)；CT BrAc-M2 15聚體OMPC，是與硫醇化OMPC偶聯(lián)的C-末端溴乙?；疢2 15-聚體(SEQ ID NO13)；NT BrAc-M2 15聚體OMPC，是與硫醇化OMPC偶聯(lián)的N-末端溴乙?；?5-聚體M2肽(SEQ ID NO11)；CT BrAc-M2(SRS)OMPC，是與硫醇化OMPC偶聯(lián)的C-末端溴乙?；疢2 23-聚體(SRS)(SEQ ID NO39)。GMT＝幾何平均滴度。
圖10.按照圖9圖示說明的動物免疫方法，CT M2 15聚體ma-OMPC和CT BrAc-M2 15聚體OMPC抗致命流感侵襲的保護作用。加強免疫之后四周用流感A/HK/68重分配體的LD90鼻內(nèi)侵襲動物。如下計算重量變化百分比實驗這天的組平均重量/侵襲后第0天的組平均重量×100％。如下計算存活百分比實驗這天的動物數(shù)量/侵襲后第0天的動物數(shù)量×100％。
圖11.CT BrAc-M2 15聚體OMPC和CT BrAc-M2(SRS)OMPC抗致命流感侵襲的保護作用。按照圖9和圖10的說明。
圖12.CT BrAc-M2 15聚體OMPC和NT M2 15聚體ma-OMPC抗致命流感侵襲的保護作用。按照圖9和圖10的說明。
圖13A馬來酰亞胺衍生化流感肽與硫醇化OMPC的偶聯(lián)。
圖13B溴乙?；鞲须呐c硫醇化OMPC的偶聯(lián)。
圖14肽SEQ ID NO12和SEQ ID NO14是如圖13A所示能與載體蛋白質(zhì)連接的肽的例子。肽SEQ ID NO11和SEQ ID NO13是如圖13B所示能與載體蛋白質(zhì)連接的肽的例子。肽SEQ ID NO39是帶有能與OMPC或者其他載體蛋白質(zhì)的硫醇反應性衍生物偶聯(lián)的C-末端半胱氨酸的SRS M2序列的截短的形式。SEQ ID NO2代表更長的M2相應物。
圖15.賴氨酸支架上多個M2肽的圖示說明。
R＝SEQ ID NO8.
圖16.賴氨酸支架上多個M2肽的圖示說明。
R＝SEQ ID NO1.
圖17.賴氨酸支架上多個M2肽的圖示說明。
R＝SEQ ID NO2.
圖18.賴氨酸支架上多個M2肽的圖示說明。
R＝SEQ ID NO2.
圖19.A連接成二聚體的多個M2肽的圖示說明。DAP＝L-2，3-二氨基丙氨酸。上面的二聚體包括SEQ ID NOs55 & 56。下面的二聚體包括SEQ ID NOs57 & 58。
圖20.賴氨酸支架上多個M2肽的圖示說明。
R＝SEQ ID NO2。向圖18所示結(jié)構(gòu)導入Cys殘基提供如圖17和20所示帶有自由硫醇官能團的MAP。這樣的MAPs可以用于偶聯(lián)包含溴乙?；?，馬來酰亞胺或其他硫醇反應團的載體蛋白質(zhì)。
圖21.賴氨酸支架上多個M2肽的圖示說明，其中支架結(jié)構(gòu)連接在一起。R＝SEQ ID NO2。
圖22A.HA0-特異性抗體反應抗乙型流感肽-偶聯(lián)物疫苗。
圖22B.對用乙型流感肽-偶聯(lián)物疫苗接種小鼠進行乙型流感病毒侵襲之后的存活曲線。
圖23.在亞致死侵襲模型中試驗乙型流感疫苗成分對體內(nèi)病毒復制的作用。
圖24.用甲型流感HA2肽偶聯(lián)物疫苗免疫的小鼠的存活曲線。
圖25.通過X-射線在12-殼粒VLP中測定的L1蛋白質(zhì)的帶狀圖(Chen等，″Structure of small virus-like-particles assembledfrom the L1 protein of human papillomavirus 16″，Mol.Cell.，Vol.5，pp.557-567，2000)。各個中等灰色小球代表位于VLP外表面上19 Lys鏈的NZ原子。暗灰色簇是Phe 50，它是H16.V5和H16E70抗體兩者表位的部分。淺灰色簇代表對于H16.J4抗體的結(jié)合環(huán)。使用MolMol程序制圖(Koradi，R.，Billeter，M.，和Wutrich，K.1996。MOLMOLa program for display and analysis ofmacromolecular structures.J.Mol.Graphics 14，51-55)。
圖26A & 26B.(27A)SEC-BLC和(27B)分析超速離心測定的HPVVLP 16型(實心線)，活化/淬火的HPV-VLP(虛線)和偶聯(lián)的M2-HPV VLP(帶圈的實線)的顆粒大小分布。
圖27.M2-HPV VLP的電子顯微鏡圖像。
圖28.對于HPV VLP 16型(實心線)，活化/淬火的HPV-VLP(虛線)和偶聯(lián)的M2-HPV VLP(帶圈的實線)，通過350nm OD監(jiān)測的溫度-誘導的聚集作用。
圖29A & 29B.29A在T＝0和T＝4周用含有不同肽劑量的M2-BPV VLP的疫苗接種之后T＝2和6周在小鼠體內(nèi)M2-HPV VLP誘導的抗-M2抗體的幾何平均滴度(GMT)。29B用含有不同肽劑量的M2-BPV VLP的疫苗接種小鼠后抗致命侵襲成活率。
圖30.用M2-KLH偶聯(lián)物疫苗接種，抗小鼠鼻和肺病毒脫落的保護作用。對小鼠亞致死病毒侵襲之后上下呼吸道病毒脫落曲線。數(shù)據(jù)代表每個數(shù)據(jù)時間點上八只小鼠的GMT+/-S.E.。虛線是分析測定閾值。GMT＝幾何平均滴度。
圖3l.M2-OMPC偶聯(lián)物疫苗在獼猴中誘導抗體反應。將三十只獼猴分為十組，每組三只。每個數(shù)據(jù)點代表每組三只動物的平均GMT。Mean/Alum代表所有四組接受明礬配制的M2-OMPC的OMPC免疫或未接觸過OMPC的猴的GMT。GMT＝幾何平均滴度。
本發(fā)明詳細描述本發(fā)明提供一種流感疫苗，其中包含甲型流感病毒的M2蛋白質(zhì)的胞外表位的多個肽與載體蛋白質(zhì)表面上的氨基酸偶聯(lián)。本說明書提供了制備偶聯(lián)物和配制疫苗的方法。本發(fā)明還提供了對患者接種的方法，其中患者實現(xiàn)了長期抵抗疾病的保護作用并且減弱了甲型流感病毒感染引起的癥狀。
肽甲型流感病毒的M2蛋白質(zhì)的胞外部分一般認為是蛋白質(zhì)的24個N-末端氨基酸。疫苗中使用的肽具有從這24個氨基酸序列中選擇的氨基酸序列。特定的肽序列可以是整個24個氨基酸的序列或者是具有至少7個氨基酸并且包括抗原性表位的其子集。
應該注意流感病毒M2蛋白質(zhì)的第一個氨基酸是甲硫氨酸。在本發(fā)明的所有實施方案中，末端甲硫氨酸的存在是任選的。
例如通過下面的方法能確定24個N-末端氨基酸的有效序列。首先，分析具有該子序列的肽是否被產(chǎn)生的抗24氨基酸序列的抗體結(jié)合。然后將肽與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)并且使用得到的偶聯(lián)物接種動物例如小鼠，白鼬或猴。對來自動物的血清測定該肽的抗體的存在。最后，用流感病毒侵襲動物。評價感染過程和產(chǎn)生的疾病的嚴重程度。使用多個動物進行該評價最好，結(jié)果是對所有動物的評價。如果用偶聯(lián)物接種減小了感染水平或產(chǎn)生的疾病的嚴重程度，則認為這種肽在疫苗的制備中是有用的。
在優(yōu)選實施方案中，肽的氨基酸序列包括M2蛋白質(zhì)的24，23，22，21，20，19，18，17，16，15，14個或其它數(shù)目的N-末端氨基酸。最小大小只受人們期望對患者免疫系統(tǒng)呈遞的表位的大小。一些優(yōu)選的氨基酸序列是SEQ ID NOs1，10和39。
在其中肽的氨基酸序列包括M2蛋白質(zhì)的17位或19位半胱氨酸的實施方案中，半胱氨酸可以優(yōu)選地被絲氨酸取代。絲氨酸取代半胱氨酸是有用的，因為根據(jù)使用的偶聯(lián)技術，半胱氨酸的反應性能導致在內(nèi)部半胱氨酸處而不是在肽的添加的末端半胱氨酸處的肽的多聚化，肽與肽的偶聯(lián)，或者肽與載體蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。這些副反應對于偶聯(lián)物能產(chǎn)生較低的肽加載產(chǎn)率。但是，應該注意肽與載體蛋白質(zhì)在肽的內(nèi)部半胱氨酸處的偶聯(lián)不會產(chǎn)生無效疫苗并且是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的。
HA0的一些片段，特別是位于亞基內(nèi)切割位點區(qū)和HA2亞基中的那些，是高度保守的。根據(jù)大量系列重疊HA0肽的體內(nèi)免疫原性和保護作用研究，我們鑒定了幾個包含保護性表位的HA0區(qū)。一個區(qū)包括HA0的切割位點，并且其他的區(qū)位于HA2亞基中(見下表)。
此外，與單獨給出的偶聯(lián)物相比，用HA肽制備的偶聯(lián)物和用M2肽制備的偶聯(lián)物的聯(lián)合能提供抗甲型流感病毒引起的疾病的卓越保護作用。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是含有M2肽偶聯(lián)物和其他保守的、保護性流感病毒肽構(gòu)成的偶聯(lián)物的疫苗。本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案是對患者施用這樣的疫苗，患者產(chǎn)生抗甲型流感病毒的免疫應答，比施用只有M2肽偶聯(lián)物的疫苗產(chǎn)生的免疫應答優(yōu)越。
HA肽可選自下組
HA肽可選自下組
BrAc＝溴乙酰基Ac＝乙?；鵐al＝馬來酰亞胺基Suc＝琥珀酰Ahx＝6-氨基己酸b＝β-丙氨酸Abu＝2-氨基丁酸此外，乙型流感病毒HA0切割位點肽制備的偶聯(lián)物和用甲型流感病毒M2肽制備的偶聯(lián)物的組合能提供抗甲型流感病毒和乙型流感病毒兩者引起的疾病的保護作用。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案是包含M2肽偶聯(lián)物和來自乙型流感病毒的其他保守的保護性肽構(gòu)成的偶聯(lián)物的疫苗。本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案是包含M2肽偶聯(lián)物和來自甲型流感病毒的其他保守的保護性肽構(gòu)成的偶聯(lián)物以及來自乙型流感病毒的其他保守的保護性肽構(gòu)成的偶聯(lián)物的疫苗。本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案是對患者施用這樣的疫苗，患者產(chǎn)生抗甲型流感病毒的免疫應答，比施用只有M2肽偶聯(lián)物的疫苗產(chǎn)生的免疫應答優(yōu)越。
M2或HA2肽抗原也可以由賴氨酸或其他合適的支架上多個抗原肽(MAPs)表示。以這樣的方式排列的肽能在本發(fā)明的偶聯(lián)物疫苗中使用。實例參見圖.15-18 & 20-21。本發(fā)明的偶聯(lián)物疫苗中肽的另一個可選擇的代表是二聚體M2或HA0肽。在這個形式中，利用連接鍵，優(yōu)選共價鍵，交聯(lián)兩個肽，形成二聚體。M2肽的例子見圖19。肽以這種方式排列的偶聯(lián)物疫苗比用相應的單體肽偶聯(lián)物制備的疫苗更具有抗原性。
利用本領域共知的技術能制備肽。這樣的技術包括化學和生物化學合成。Vincent，在Peptide and Protein Drug Delivery，New York，N.Y.，Dekker，1990中提供了肽的化學合成技術的例子。Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley，1987-1998，和Sambrook，等，在Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989中提供了生物化學合成技術的例子，涉及將核酸導入細胞并表達核酸。
載體蛋白質(zhì)這里所指的載體蛋白質(zhì)意思是肽與之偶聯(lián)的免疫原性蛋白質(zhì)。各種各樣的載體蛋白質(zhì)是本領域已知的并且用于多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物疫苗。這些和其他免疫原性蛋白質(zhì)也可以在本發(fā)明疫苗中使用。優(yōu)選的載體蛋白質(zhì)是腦膜炎奈瑟氏球菌(Neiserria meningitidis)外膜蛋白復合體(OMPC)，破傷風類毒素蛋白質(zhì)，包括表面抗原蛋白(HBsAg)和核心抗原蛋白(HB Core)的乙肝病毒蛋白，匙孔血藍蛋白(KLH)，輪狀病毒衣殼蛋白和牛乳頭瘤病毒VLP或人乳頭瘤病毒VLP，例如，6，11或16型HPV的VLPs。
為了制備方便，可以使用一種類型的載體蛋白質(zhì)制備偶聯(lián)物。但是，人們也可以使用不同的載體蛋白質(zhì)一次制備一種以上的偶聯(lián)物。然后，人們可將偶聯(lián)物混合配制疫苗。用這種方式，人們能提供疫苗，其除了產(chǎn)生抗流感免疫應答外，還產(chǎn)生抗偶聯(lián)物中使用的不同載體蛋白質(zhì)的免疫應答。如果期望，進一步排列組合了各種肽和載體蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物也是可能的。
優(yōu)選的載體蛋白質(zhì)是OMPC。OMPC包含多個可用于偶聯(lián)的反應位點。通過OMPC中存在的原子形成基團和基團的位置來確定偶聯(lián)的反應位點的可利用性。利用本領域共知的技術能確定可用于偶聯(lián)的親核性官能團(參見Emini，等美國專利No.5,606,030)。能用作偶聯(lián)的反應位點的一種類型的基團是氨基酸上存在的伯氨基，例如賴氨酸的ε氨基和蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸的α氨基。另外，給出OMPC硫醇化形式的這些氨基的轉(zhuǎn)化作用提供了可以用于與硫醇反應肽偶聯(lián)的反應官能團。硫醇反應肽的例子是如圖13詳細描述的溴乙?；幕蝰R來酰亞胺衍生的肽。利用本領域共知的技術，例如Fu，美國專利No.5,494,808描述的那些，能獲得OMPC。
另一類優(yōu)選的載體蛋白質(zhì)的代表是具有自組裝成病毒樣顆粒(VLPs)能力的病毒衣殼蛋白。用作肽載體的VLPs的例子是乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和核心抗原(HBcAg)(Pumpens等，″Evaluationof HBs，HBc，and frCP virus-like particles for expression ofhuman papillomavirus 16 E7 oncoprotein epitopes″，Intervirology，Vol.45，pp.24-32，2002)，戊型肝炎病毒顆粒(Niikura等，″Chimeric recombinant hepatitis E virus-likeparticles as an oral vaccine vehicle presenting foreignepitopes″，Virology，Vol.293，pp.273-280，2002)，多形瘤病毒(Gedvilaite等，″Formation of Immunogenic Virus-likeparticles by inserting epitopes into surface-exposed regionsof hamster polyomavirus major capsid protein″，Virology，Vol.273，pp.21-35，2000)，和牛乳頭瘤病毒(Chackerian等，″Conjugation of self-antigen to papillomavirus-likeparticles allows for efficient induction of protectiveautoantibodies″，J.Clin.Invest.，Vol.108(3)，pp.415-423，2001)。最近，構(gòu)建了模擬真實病毒顆粒分子量和大小的抗原呈遞人工VLPs(Karpenko等，″Construction of artificial virus-likeparticles exposing HIV epitopes and the study of theirimmunogenic properties″，Vaccine，pp.386-392，2003)。
利用乳頭瘤病毒VLP作為肽抗原載體的預期好處是抗原序列以有序排列呈遞，確保來自免疫系統(tǒng)的最佳應答。在一份報告中，發(fā)現(xiàn)模擬二十面體病毒體的基質(zhì)中抗原序列的暴露消除了體液免疫系統(tǒng)區(qū)分自身和外來者的能力(Chackerian等，″Induction ofautoantibodies to mouse CCR5 with recombinant papillomavirusparticles″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.96，pp.2373-2378，1999)。通過連接小鼠自身-肽TNF-α和乳頭瘤病毒，誘導了小鼠VLP高滴度持續(xù)時間長的抗體。使用VLP作為最小抗原載體的一個挑戰(zhàn)是要避免由于預先接觸VLP載體而誘導的抗-載體抗體的存在而使產(chǎn)生的偶聯(lián)物疫苗的免疫原性降低。
人乳頭瘤病毒(HPV)VLP具有大約60nm大小典型的二十面體晶格結(jié)構(gòu)，每一個通過72 L1蛋白質(zhì)五聚物的裝配而形成(稱作殼粒)(Chen等，2000；Modis等，″Atomic model of the papilloma viruscapsid″，EMBO J.，Vol.21，pp.4754-4762，2002)。牛乳頭瘤病毒VLP已經(jīng)被成功用于攜帶抗原序列，所述抗原序列通過基因融合插入到VLP的L1蛋白質(zhì)(Chackerian等，1999)，或L2(Greenstone等，″Chimeric papillomavirus virus-like particle elicitantitumor immunity against the E7 oncoprotein in an HPV 16tumor model″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.95，pp.1800-1805，1998)蛋白質(zhì)，或者融合鏈霉抗生物素蛋白，然后與生物素化VLPs結(jié)合(Chackerian等，2001)。
根據(jù)上述參考文獻指明的以及下面舉例的專利和專利申請，人和牛乳頭瘤病毒VLP的制備是本領域共知的US 6,159,729，US 5,840,306，US 5,820,870和WO01/14416。
下面的實施例描述通過流感病毒肽片段與人乳頭瘤病毒(HPV)病毒樣顆粒(VLP)的化學偶聯(lián)而獲得的示例性偶聯(lián)物疫苗的制備和免疫原性。得到的偶聯(lián)物分子每個VLP由抗原肽的大約800至4,000個拷貝構(gòu)成，它是通過肽上C-末端半胱氨酸殘基與馬來酰亞胺活化的HPVVLP反應而獲得的。這些偶聯(lián)物具有比單獨的VLP載體稍大一些的平均粒度，并且表現(xiàn)出增強的總的抗化學和熱誘導的變性的穩(wěn)定性。M2-HPV VLP偶聯(lián)物喪失了對于一些抗-HPV構(gòu)象抗體的結(jié)合親和性，但是被抗-M2抗體完全識別。用鋁佐劑配制流感M2肽-HPV VLP偶聯(lián)物疫苗。發(fā)現(xiàn)兩劑30-ng肽是高度免疫原性的，并且在小鼠中帶來好的抗流感病毒致命侵襲的保護作用。這些結(jié)果表明HPV VLP能用作偶聯(lián)物疫苗中流感病毒肽的載體。
使用人乳頭瘤病毒VLP系統(tǒng)作為抗原載體，用于開發(fā)化學偶聯(lián)的流感肽偶聯(lián)物疫苗提供一些優(yōu)點。化學偶聯(lián)避免能干擾VLPs的適當組裝的肽插入L1序列的可能的問題，并且比生物素化作用和結(jié)合過程簡單的多。此外，得到的結(jié)果表明化學偶聯(lián)使得與先前報道的方法相比每個VLP的肽加載量高得多。此外，在下面的實施例中，肽偶聯(lián)過程不引起HPV VLP形態(tài)的顯著改變。因此，VLPs，包括HPV VLPs和類似的牛乳頭瘤病毒VLP，能用來構(gòu)建本發(fā)明中的疫苗。
偶聯(lián)作用利用本領域任何偶聯(lián)方法都能偶聯(lián)本發(fā)明的肽和載體。例如，使用4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯(sSMCC)，N-[ε-馬來酰亞胺基己酰氧]磺基琥珀酰亞胺酯(sEMCS)，N-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)，戊二醛，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDCI)，雙-重氮聯(lián)苯胺(BDB)，或N-乙?；甙腚装彼崃騼?nèi)酯(NAHT)能實現(xiàn)偶聯(lián)。
在載體馬來酰亞胺-活化方法中，使用4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯(sSMCC)，或N-馬來酰亞胺基苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯實現(xiàn)偶聯(lián)。使用sSMCC的方法被廣泛使用并且是高特異性的(參見，例如，Meyer等，2002，J.of Virol.76，2150-2158)。sSMCC將半胱氨酸殘基的SH-基團與載體蛋白質(zhì)上賴氨酸殘基的氨基偶聯(lián)。
在使用sSMCC的偶聯(lián)反應中，首先通過sSMCC試劑與載體的胺(例如賴氨酸)殘基結(jié)合而活化載體。從過量試劑和副產(chǎn)物分離活化載體之后，加入含有半胱氨酸的肽，并且通過向活化載體的馬來酰亞胺官能團加SH-基團而發(fā)生連接。使用MBS的方法通過相似機理偶聯(lián)肽和載體。
使用sSMCC的偶聯(lián)對于SH-基團可以是高度特異性的。因此，肽中半胱氨酸殘基對于容易偶聯(lián)是必需的。如果肽沒有半胱氨酸殘基，應該給肽加上半胱氨酸殘基，優(yōu)選在N-末端或C-末端。如果肽中期望的表位包含半胱氨酸，應該利用不使用sSMCC活化載體的方法實現(xiàn)偶聯(lián)。如果肽包含一個以上的半胱氨酸殘基，使用sSMCC，肽不與載體偶聯(lián)，除非過量的半胱氨酸殘基能被置換或修飾。
鍵不應該干擾肽中期望的表位。優(yōu)選地，半胱氨酸和期望的表位序列間隔至少一個氨基酸的距離作為間隔區(qū)。
本發(fā)明中有用的另一種偶聯(lián)是使用N-乙?；甙腚装彼崃騼?nèi)酯(NAHT)實現(xiàn)的。例如，硫內(nèi)酯能被用來將硫醇官能團加到OMPC上，允許與馬來酰亞胺化或溴-乙?；呐悸?lián)(Tolman等，Int.J.PeptideProtein Res.41，1993，455-466；Conley等，Vaccine 1994，12，445-451)。
在本發(fā)明特定實施方案中，偶聯(lián)肽和載體蛋白質(zhì)的偶聯(lián)反應涉及在一種反應物上導入和/或使用內(nèi)在的親核基團并且在另一種反應物中導入和/或使用內(nèi)在的親電基團。優(yōu)選的活化方案(I)(圖1)是向載體蛋白質(zhì)(優(yōu)選OMPC)導入親核硫醇基團并且向肽加親電基團(優(yōu)選烷基鹵化物或馬來酰亞胺)。得到的偶聯(lián)物具有連接肽和載體的硫醇醚鍵。肽親電基團(馬來酰亞胺或烷基鹵化物)和載體蛋白質(zhì)的內(nèi)在親核基團(優(yōu)選伯胺或硫醇)的直接反應，產(chǎn)生仲胺鍵(方案(II)圖2)或者硫醇醚鍵。然而，在相似反應條件下預期硫醇親核基團的反應性比胺高使得方案I是優(yōu)選的。另一個方案涉及向載體加馬來酰亞胺基團(III)圖3或者烷基鹵化物(IV)圖4并且向肽導入末端半胱氨酸和/或再次使用內(nèi)在肽硫醇產(chǎn)生硫醇醚鍵。
鍵含有硫的氨基酸包含反應性硫基團。含有硫的氨基酸的例子包括半胱氨酸和非蛋白質(zhì)氨基酸如高半胱氨酸。另外，在活化并且與載體反應之前二硫化物形式中可以存在反應性硫原子。與用親電基團例如馬來酰亞胺或烷基鹵化物活化的載體的偶聯(lián)反應中能使用M2序列中存在的半胱氨酸17和19(方案III(圖3)和IV(圖4))。利用包含反應性馬來酰亞胺和活化酯的雜雙功能交聯(lián)劑導入馬來酰亞胺基團是常見的。實現(xiàn)多聚蛋白質(zhì)馬來酰亞胺活化的高水平的嘗試能導致交聯(lián)反應，其中胺基能與交聯(lián)劑的兩個官能團反應。這會產(chǎn)生較低水平的可利用的馬來酰亞胺基團，因此產(chǎn)生較低的肽加載量。多聚載體亞基的交聯(lián)也可能影響偶聯(lián)物的免疫原性和/或穩(wěn)定性。對于具有多個半胱氨酸的肽，單個肽可以存以與載體馬來酰亞胺或烷基鹵化物基團的多個連接。這可能減小肽加載水平。如果通過不同載體蛋白質(zhì)上馬來酰亞胺發(fā)生多個連接，則能產(chǎn)生通過肽的載體蛋白質(zhì)亞基交聯(lián)的可能性。N-乙?；腚装彼醿?nèi)酯對OMPC伯胺的硫醇化作用能實現(xiàn)高水平硫醇基團，其在合適的緩沖反應條件下產(chǎn)生載體亞基最小限度交聯(lián)(通過二硫鍵形成)(Marburg等，1986 J.Am.Chem.Soc.1085282-5287)。單一末端親電基團對肽的活化作用(馬來酰亞胺或烷基鹵化物)能導致高水平肽加載量，高度指導肽與載體偶聯(lián)。
接頭連接肽和載體的共價接頭在生理條件下是穩(wěn)定的。這樣的接頭的例子是非特異性交聯(lián)試劑，單性間隔區(qū)和兩性間隔區(qū)。非特異性交聯(lián)試劑和它們的使用是本領域公知的。這樣的試劑及其應用的例子包括與戊二醛的反應；與N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺的反應，有或沒有琥珀?；d體的混合物；糖基化取代基的高碘酸鹽氧化作用之后接著在氫硼化鈉或氰基氫硼化鈉的存在下與蛋白質(zhì)載體的游離氨基偶聯(lián)；沒有乙?；哪┒私z氨酸和蘇氨酸殘基的高碘酸鹽氧化作用能產(chǎn)生末端醛，其然后能與胺或酰肼反應產(chǎn)生Schiff堿或腙，然后用氰基氫硼化物將其還原為仲胺；芳香氨基的重氮化后接著在蛋白質(zhì)的酪氨酸側(cè)鏈殘基上偶聯(lián)；與異氰酸酯反應；或者混合的酸酐的反應。參見，一般性地，Briand，等，1985 J.Imm.Meth.7859。
單性間隔區(qū)及其應用是本領域公知的。單性間隔區(qū)是雙功能的，并且要求在發(fā)生偶聯(lián)之前將反應對配偶體中的一個官能化。單性間隔區(qū)及其應用的例子涉及在碳二亞胺的存在下將免疫原性HCV肽與雙功能分子脂肪酸二肼的一個末端偶聯(lián)。推測二乙?；掠奢d體的下垂的谷氨酸或天冬氨酸羧基形成。然后通過在碳二亞胺的存在下與載體蛋白質(zhì)的第二偶聯(lián)反應進行偶聯(lián)。
兩性間隔區(qū)及其應用是本領域公知的。在反應對的每一個配偶體官能化之后形成兩性間隔區(qū)。當每個官能化配偶體與其相對配偶體反應形成穩(wěn)定共價鍵時發(fā)生偶聯(lián)作用(參見，例如，Marburg，等，1986 J.Am.Chem.Soc.1085282-5287；和Marburg，等，美國專利No.4,695,624.)。
肽偶聯(lián)載荷量本發(fā)明的優(yōu)點在于人們在偶聯(lián)物中能實現(xiàn)肽與載體蛋白質(zhì)的各種摩爾比。通過改變試驗和誤差方式中偶聯(lián)程序的某些方面，實現(xiàn)具有期望性質(zhì)的偶聯(lián)物，使得載體蛋白質(zhì)上“肽偶聯(lián)載荷量”可以是不同的。例如，如果期望高偶聯(lián)載荷量使得載體蛋白質(zhì)上每個反應位點與肽偶聯(lián)，人們能估計載體上的反應位點并且包括偶聯(lián)反應中大量摩爾過量的肽。如果期望低密度偶聯(lián)加載，可包括每摩爾載體蛋白質(zhì)上的反應位點小于1摩爾肽的摩爾比。
最終，實現(xiàn)的產(chǎn)率，偶聯(lián)物的物理性質(zhì)，得到的偶聯(lián)物的效力，患者群和希望給藥的期望劑量指導人們選擇特定條件。如果疫苗中總的蛋白質(zhì)不是重要的考慮因素，人們能配制不同偶聯(lián)載荷量和不同免疫原性偶聯(lián)物的劑量，以送遞相同有效劑量。然而，如果總的蛋白質(zhì)或體積是重要的考慮因素，例如，如果意在聯(lián)合疫苗中使用偶聯(lián)物，人們可以留心偶聯(lián)物對最終聯(lián)合疫苗貢獻的總的體積或蛋白質(zhì)。人們?nèi)缓罂梢怨烙嬀哂胁煌悸?lián)載荷量的幾種偶聯(lián)物的免疫原性，然后選擇使用具有合適免疫原性和加給聯(lián)合疫苗的可接受的總的蛋白質(zhì)或體積水平的偶聯(lián)物。
一般情況下，獲得高的肽載荷量有兩個主要障礙(i)偶聯(lián)物的溶解度，和(ii)肽的溶解度。這些性質(zhì)不是獨立的，改善后者的操作對前者是不利的。因此，通常難以獲得高的肽載荷量。
因此，期望修飾2003年12月18日提交的美國專利申請60/530,867描述的肽的序列。這篇專利申請描述了提高肽的免疫原性的方法。所述方法包括通過修飾肽，并且使肽與載體偶聯(lián)來調(diào)節(jié)肽的等電點(pI)。根據(jù)這里使用的，″調(diào)節(jié)肽的pI″意思是將肽的pI改變成這樣一個范圍，使得提高偶聯(lián)物的肽載荷量和溶解度。經(jīng)常，肽的pI低于這個范圍。
利用象等電點聚焦(IEF)這樣的實驗，或者利用合適軟件計算能確定肽的pI。根據(jù)美國專利申請60/530,867所述，用改變肽的總電荷的各種方法能改變肽的pI。修飾作用可以是導致肽電荷改變的對肽的任何改變。修飾作用可包括肽中置換，添加，或缺失氨基酸殘基。修飾作用還可以包括肽的殘基側(cè)鏈或N-末端氨基或C-末端羧基的修飾。這樣的修飾方法在本領域技術人員知識之內(nèi)。
應該在免疫原性活性序列，即期望的表位之外修飾肽，這樣保證保持免疫特性。修飾作用應該即不涉及也不干擾肽中期望的表位。因為修飾作用對肽-偶聯(lián)物的免疫特性沒有影響，優(yōu)選在肽的N和/或C末端引入改變。
人們還應該記住最高偶聯(lián)載荷量不一定總是得到最具有免疫原性的偶聯(lián)物。對于任何給定載體蛋白質(zhì)的肽長度和偶聯(lián)載荷量可以影響偶聯(lián)物總的免疫原性。因此，人們應該評定任何特定載體蛋白質(zhì)上任何特定肽的偶聯(lián)載荷量的范圍的免疫原性。利用此信息，人們?nèi)缓竽苤苽浜团渲埔呙?，提供合適劑量的偶聯(lián)物，以刺激患者中可接受的免疫原應答。
制劑根據(jù)本領域公知和使用的方法能配制本發(fā)明的疫苗。一般給藥標準在下面的文獻中提供，例如，Modern Vaccinology，Kurstak編著，Plenum Med.Co.1994；Remington′s Pharmaceutical Sciences第18版，Gennaro編著，Mack Publishing，1990；和ModernPhannaceutics第二版，Banker和Rhodes編著，Marcel Dekker，Inc.，1990。
本發(fā)明的偶聯(lián)物能制備成酸式鹽或堿式鹽。藥學可接受鹽(水溶性或油溶性或可分散性產(chǎn)物形式)包括例如從無機或有機酸或堿形成的常規(guī)無毒鹽或季銨鹽。這樣的鹽的例子包括酸加成鹽，例如乙酸鹽，己二酸鹽，藻酸鹽，天冬氨酸鹽，苯甲酸鹽，苯磺酸鹽，亞硫酸鹽，丁酸鹽，檸檬酸鹽，樟腦酸鹽，樟腦磺酸鹽，環(huán)戊烷丙酸鹽，二葡糖酸鹽，十二烷基硫酸鹽，乙磺酸鹽，延胡索酸鹽，葡糖庚酸鹽，甘油磷酸鹽，半硫酸鹽，庚酸鹽，己酸鹽，鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，2-羥基乙磺酸鹽，乳酸鹽，馬來酸鹽，甲磺酸鹽，2-萘磺酸鹽，煙酸鹽，草酸鹽，棕櫚酸鹽，果膠酸鹽，過硫酸鹽，3-苯基丙酸鹽，苦味酸鹽，新戊酸鹽，丙酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，硫氰酸鹽，甲苯磺酸鹽，和十一酸鹽；和堿加成鹽，例如銨鹽，堿金屬鹽，例如鈉鹽和鉀鹽，堿土金屬鹽，例如鈣鹽和鎂鹽，與有機堿的鹽，例如二環(huán)己基胺鹽，N-甲基-D-葡糖胺鹽，和與氨基酸例如精氨酸和賴氨酸的鹽。
優(yōu)選地，選擇佐劑，使適合與偶聯(lián)物中使用的特定載體蛋白質(zhì)一起使用以及最后制劑中的離子組成。還應該考慮單獨的偶聯(lián)物是否配制成疫苗或者偶聯(lián)物是否配制成聯(lián)合疫苗。在后一種情況下，應該考慮緩沖液，佐劑和最終聯(lián)合疫苗中存在的其他制劑成分。
以鋁為基礎的佐劑是本領域常規(guī)使用的，并且包括磷酸鋁，氫氧化鋁，羥基磷酸鋁和羥基-硫酸鹽磷酸鋁。通常使用的佐劑的商品名包括ADJUPHOS，MERCK ALUM和ALHYDROGEL。根據(jù)所期望的和根據(jù)使用的特定佐劑所適合的，偶聯(lián)物可以與佐劑結(jié)合或者與之共同沉淀。
也可以使用非鋁佐劑。非鋁佐劑包括QS21，脂質(zhì)-A和它們的衍生物或變體，弗氏完全或不完全佐劑，中性脂質(zhì)體，含有疫苗和細胞因子或趨化因子的脂質(zhì)體。
優(yōu)選的是用鋁佐劑配制疫苗。在其他優(yōu)選實施方針中，用鋁佐劑和QS21兩者配制疫苗。
在一些實施方案中，優(yōu)選使用來自乙型流感病毒的免疫原，象本申請中描述的那些，和/或使用來自流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenza)，甲肝、乙肝或丙肝，人乳頭瘤病毒，麻疹，流行性腮腺炎，風疹，水痘，輪狀病毒，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的免疫原配制M2肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。另外，本發(fā)明的疫苗可以與特別包括從血細胞凝集素和神經(jīng)氨酸苷酶衍生的表位的甲型流感病毒的其他抗原成分聯(lián)合。以該方法能制備聯(lián)合疫苗。由于要求的接種量較少，聯(lián)合疫苗具有提高患者舒適性并且給藥成本更低的優(yōu)點。
在配制聯(lián)合疫苗時應該留心各種緩沖液和與其他免疫原使用的佐劑。一些緩沖液可能對于一些免疫原-佐劑對合適而對于其他的不合適。特別地，人們應該估計磷酸鹽水平對各種免疫原-佐劑對的作用，以確保在最終制劑中的相容性。
免疫接種通過不同的途徑能施用本發(fā)明的疫苗，例如靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下，或肌肉內(nèi)。優(yōu)選的途徑是肌肉內(nèi)。優(yōu)選考慮本領域公知的因素，包括患者的年齡，體重，性別和醫(yī)學狀況；給藥途徑；期望的效果；使用的特定偶聯(lián)物(例如，肽，載體上加載的肽等)，確定合適的給藥方案。能以多劑接種形式使用疫苗。期望一劑由1微克至1.0毫克范圍總蛋白質(zhì)構(gòu)成。在本發(fā)明的實施方案中，這個范圍是0.1mg至1.0mg。然而，優(yōu)選根據(jù)送遞的肽的量調(diào)節(jié)劑量。在任何情況下這些范圍是指導性的。應該通過評估產(chǎn)生的偶聯(lián)物的免疫原性確定更精確劑量，從而送遞免疫有效劑量。免疫有效劑量是刺激患者的免疫系統(tǒng)，建立足以提供抗流感病毒感染引起的疾病的長期保護作用的免疫記憶水平的劑量。偶聯(lián)物優(yōu)選用佐劑配制。
給藥時間取決于本領域公知的因素。開始給藥之后，可以接著給與一次或多次加強劑量以保持抗體滴度。給藥方案的例子可以是第一天給一劑，一個月或兩個月時給第二劑，4，6或12個月時給第三劑，根據(jù)需要，在遠期時間進行附加的加強。
這里使用的患者或受試者，是動物。哺乳動物和鳥類，特別是家禽，是合適的接種受試者。優(yōu)選地，患者是人?；颊呖梢允侨魏文挲g，這個年齡的患者能通過產(chǎn)生免疫應答而對用本發(fā)明疫苗的接種有所反應。這樣產(chǎn)生的免疫應答能完全或部分保護以抵抗流感病毒感染引起的疾病和使癥狀減輕。
應該注意只有M2肽的本發(fā)明的疫苗不預防患者細胞的感染。這是因為當進入患者并且開始感染之時，疫苗肽中M2表位在流感病毒上以非常低的拷貝數(shù)存在。典型地，只在病毒感染的細胞表面上看到M2表位。因此，用M2肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物為基礎的疫苗進行接種產(chǎn)生的免疫應答定向于感染的細胞。不受有效性特定理論的制約，相信患者免疫應答減小病毒爆發(fā)規(guī)模，減弱總的病毒感染，從而基本上限制對最初感染的細胞的感染。
本發(fā)明疫苗的一個優(yōu)點是產(chǎn)生抗流感病毒保守表位的免疫應答。因此，施用本發(fā)明疫苗會避免每年接種的必要性，以保持患者抵抗流感感染的保護作用。
本發(fā)明M2肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物疫苗能與其他疫苗一起配制，得到如上所述的聯(lián)合疫苗。然后能使用聯(lián)合疫苗對患者接種，產(chǎn)生抗M2表位以及聯(lián)合疫苗中其他免疫原的免疫應答。
實施例1肽的制備通過本領域常用的固相化學合成方法制備代表M2蛋白質(zhì)序列部分并且包含C-末端或N-末端反應性溴乙酰基或馬來酰亞胺基團的合成肽。
例如，C-末端溴乙?；疢215-聚體，CT-BrAcM2-15聚體，Ac-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Aha-Lys(Nε-BrAc)-NH2 TFA鹽(SEQ ID NO13)，在APPLIEDBIOSYSTEMS 430A肽合成儀(APPLIED BIOSYSTEMS，CITY STATE)上合成為與保護的樹脂結(jié)合的肽。用0.5毫摩爾對-甲基二苯甲胺(MBHA)樹脂起始，該方法使用4倍過量的(2毫摩爾)的各種Nα-Boc保護的氨基酸。側(cè)鏈保護作用是Lys(Fmoc)，Trp(甲?；?，Glu(OcHex)，Arg(Tos)，Thr(Bzl)。利用甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中DCC和HOBT活化作用實現(xiàn)偶聯(lián)。偶聯(lián)乙酸，導入N-末端乙?；?。使用1∶1TFA和二氯甲烷(MeCl2)和用二異丙基乙胺中和TFA鹽進行Boc基團的去除。
裝配保護的肽樹脂之后，通過用25％吡啶的NMP溶液手工處理10分鐘，去除Trp殘基上的甲酰基和Nε-Lys殘基上的Fmoc保護。用NMP和MeCl2洗滌樹脂之后，Lys上的Nε氨基與溴乙酸酐(1g/20mlMeCl2)反應1小時或者直到觀察到陰性茚三酮反應。用MeCl2洗滌之后，將樹脂干燥至恒重(2.70g)。
0℃下，用HF(30ml)和作為清除劑的茴香醚(3ml)處理保護的肽樹脂(2.70g)1小時。蒸發(fā)HF和茴香醚之后，用乙醚充分洗滌殘余物，過濾并且用25％乙酸的水溶液(200ml)萃取。將濾液凍干，得到1.5g粗產(chǎn)物。
通過制備HPLC，緩沖液A＝0.1％TFA-H2O；B＝0.1％TFA-CH3CN實現(xiàn)粗產(chǎn)物的純化。粗產(chǎn)物(0.75g)溶解于最小體積的20％乙酸-H2O(約100ml)并且用泵加到C-18反相HPLC離心式壓縮柱(WATERS，Milford，MA，DELTA-PAK，15微米，100埃，5×30cm)上，這個柱子在90％A-10％B緩沖液中平衡過。
裝載肽之后裝載1升90％A-10％B緩沖液混合物。從1升各自連續(xù)增加濃度(5％)的流動相產(chǎn)生步進梯度(10％B至40％B)(100mL增量)。使用80mL/min流速洗脫產(chǎn)物。通過監(jiān)測214nm的UV吸收進行檢測。將均質(zhì)產(chǎn)物級分(通過HPLC分析＞98％純)合并并且凍干，提供200mg CT-BrAcM2-15聚體肽。通過氨基酸分析和質(zhì)譜分析證實身份。
類似地進行其他C-末端溴乙?；牡暮铣伞＠纾珻-末端溴乙?；疢223-聚體肽，CT-BrAc-M2-23聚體，Ac-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Ser-Arg-Ser-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp-Aha-Lys(Nε-BrAc)-NH2 TFA鹽，(SEQ ID NO39)，被如下在APPLIED BIOSYSTEMS 430A肽合成儀(APPLIED BIOSYSTEMS，CITY STATE)上合成為與保護的樹脂結(jié)合的肽。用0.75毫摩爾對-甲基二苯甲胺(MBHA)樹脂起始，該雙偶聯(lián)方法使用過量的(2毫摩爾)的各種Nα-Boc保護的氨基酸。側(cè)鏈保護作用是Ser(Bzl)Lys(Fmoc)，Trp(甲?；?，Glu(OcHex)，Arg(Tos)，Thr(Bzl)，Asp(OcHex)。利用甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中DCC和HOBT活化作用實現(xiàn)偶聯(lián)。偶聯(lián)乙酸，用于導入N-末端乙?；?。使用1∶1TFA和二氯甲烷(MeCl2)和用二異丙基乙胺中和的TFA鹽進行Boc基團的去除。裝配保護的肽樹脂之后，通過用25％吡啶的NMP溶液手工處理10分鐘，去除Trp殘基上的甲酰基和Nε-Lys殘基上的Fmoc保護。用NMP和MeCl2洗滌樹脂之后，Lys上的Nε氨基與溴乙酸酐(1g/20ml MeCl2)反應1小時或者直到觀察到陰性茚三酮反應。用MeCl2洗滌之后，將樹脂干燥至恒重。
0℃下，用HF(20ml)和作為清除劑的茴香醚(2ml)處理保護的肽樹脂(1.83g)的一半1小時。蒸發(fā)HF和茴香醚之后，用乙醚充分洗滌殘余物，過濾并且用25％乙酸的水溶液(200ml)萃取。將濾液凍干，得到1.1g粗產(chǎn)物。
通過制備HPLC，緩沖液A＝0.1％TFA-H2O；B＝0.1％TFA-CH3CN實現(xiàn)粗產(chǎn)物的純化。粗產(chǎn)物(1.1g)溶解于最小體積的20％乙酸-H2O(≈100ml)并且用泵加到C-18反相HPLC離心式壓縮柱(WATERS，DELTA-PAK，Milford，MA，15微米，100埃，5×30cm)上，這個柱子在90％A-10％B緩沖液中平衡過。裝載肽之后裝載1升90％A-10％B緩沖液混合物。從1升各自連續(xù)增加濃度(5％)的流動相產(chǎn)生步進梯度(10％B至40％B)(100mL增量)。使用80mL/min流速洗脫產(chǎn)物。通過監(jiān)測214nm的UV吸收進行檢測。將均質(zhì)產(chǎn)物級分(通過HPLC分析＞98％純)合并并且凍干，提供224mg產(chǎn)物CT-BrAcM2-23聚體。通過氨基酸分析和質(zhì)譜分析證實身份。
如下詳細說明馬來酰亞胺化肽的合成。用0.75毫摩爾對-甲基二苯甲胺(MBHA)樹脂起始，合成肽Ac-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Aha-Lys(Nε-4-馬來酰亞胺基丁酰-NH2TFA鹽(SEQ ID NO14)。在APPLIED BIOSYSTEMS 430A肽合成儀(APPLIED BIOSYSTEMS，CITY STATE)上合成與保護的樹脂結(jié)合的肽。該方法使用4倍過量的(2毫摩爾)的各種Nα-Boc保護的氨基酸。側(cè)鏈保護作用是Lys(Fmoc)，Trp(甲酰基)，Glu(OcHex)，Arg(Tos)，Thr(Bzl)。利用甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中DCC和HOBT活化作用實現(xiàn)偶聯(lián)。偶聯(lián)乙酸，以導入N-末端乙?；?。使用1∶1TFA和二氯甲烷(MeCl2)和用二異丙基乙胺中和的TFA鹽進行Boc基團的去除。裝配保護的肽樹脂之后，通過用25％吡啶的NMP溶液手工處理10分鐘，去除Trp殘基上的甲?；蚇ε-Lys殘基上的Fmoc保護。用NMP和MeCl2洗滌樹脂之后，去除樹脂的25％部分(0.188毫摩爾)，Lys上的Nε氨基與4-馬來酰亞胺丁酸(2毫摩爾)和2毫摩爾的DCC和HOBT在NMP中反應3小時或者直到觀察到陰性茚三酮反應。用NMP和MeCl2洗滌之后，將樹脂干燥至恒重(0.7克)。
0℃下，用HF(15ml)和作為清除劑的茴香醚(1.5ml)處理保護的肽樹脂(0.70g)。蒸發(fā)HF和茴香醚之后，用乙醚充分洗滌殘余物，過濾并且用25％乙酸的水溶液(100ml)萃取。將濾液凍干，得到0.40g粗產(chǎn)物。
通過制備HPLC，緩沖液A＝0.1％TFA-H2O；B＝0.1％TFA-CH3CN實現(xiàn)粗產(chǎn)物的純化。粗產(chǎn)物(0.40g)溶解于最小體積的20％乙酸-H2O(≈100ml)并且用泵加到C-18反相HPLC離心式壓縮柱(DELTA-PAK，15微米，100埃，5×30cm，WATERS，Milford，MA)上，這個柱子在90％A-10％B緩沖液中平衡過。裝載肽之后裝載1升90％A-10％B緩沖液混合物。從1升各自連續(xù)增加濃度(5％)的流動相產(chǎn)生步進梯度(10％B至35％B)(100mL增量)。使用80mL/min流速洗脫產(chǎn)物。通過監(jiān)測214nm的UV吸收度進行檢測。將均質(zhì)產(chǎn)物級分(通過HPLC分析＞98％純)合并并且凍干，提供94mg產(chǎn)物。通過氨基酸分析和質(zhì)譜分析證實身份。
HPLC分析條件柱子Vydac 15cm #218TP5415，C18。
洗脫劑梯度95∶5(0.1％TFA/乙腈)至5∶95(0.1％TFA/乙腈)，經(jīng)45分鐘。
流速1.5ml/min。
波長214nM，254nM。
滯留時間16.9min。
分子式C99H155N25O31。
分子量2190.13。
如下詳細說明第二種馬來酰亞胺化肽，Ac-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Ser-Arg-Ser-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp-Aha-Lys(Nε-4-馬來酰亞胺基丁酰)-NH2TFA鹽(SEQ ID NO23)的合成。用0.50毫摩爾對-甲基二苯甲胺(MBHA)樹脂起始，在APPLIED BIOSYSTEMS 430A肽合成儀(APPLIEDBIOSYSTEMS，CITY STATE)上合成與保護的樹脂結(jié)合的肽。該雙偶聯(lián)方法使用過量的(2毫摩爾)的各種Nα-Boc保護的氨基酸。側(cè)鏈保護作用是Ser(Bzl)，Lys(Fmoc)，Trp(甲?；?，Glu(OcHex)，Arg(Tos)，Thr(Bzl)，Asp(OcHex)。利用甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中DCC和HOBT活化作用實現(xiàn)偶聯(lián)。偶聯(lián)乙酸，導入N-末端乙?；Ｊ褂?∶1TFA和二氯甲烷(MeCl2)和用二異丙基乙胺中和的TFA鹽進行Boc基團的去除。裝配保護的肽樹脂之后，通過用25％吡啶的NMP溶液手工處理10分鐘，去除Trp殘基上的甲?；蚇ε-Lys殘基上的Fmoc保護。用NMP和MeCl2洗滌樹脂之后，50％部分(0.25毫摩爾)樹脂與4-馬來酰亞胺丁酸(2毫摩爾)和2毫摩爾的DCC和HOBT反應3小時或者直到觀察到陰性茚三酮反應。用NMP和MeCl2洗滌之后，將樹脂干燥至恒重(2.0克)。
0℃下，用HF(20ml)和作為清除劑的茴香醚(2ml)處理保護的肽樹脂(2.0g)。蒸發(fā)HF和茴香醚之后，用乙醚充分洗滌殘余物，過濾并且用50％乙酸的水溶液(200ml)萃取。將濾液凍干，得到1.0g粗產(chǎn)物。
通過制備HPLC，緩沖液A＝0.1％TFA-H2O；B＝0.1％TFA-CH3CN實現(xiàn)粗產(chǎn)物的純化。粗產(chǎn)物(1.0g)溶解于最小體積的10％乙酸-H2O(≈100ml)并且用泵加到C-18反相HPLC離心式壓縮柱(DELTA-PAK，15微米，100埃，5×30cm，WATERS，Milford，MA)上，這個柱子在85％A-15％B緩沖液中平衡過。裝載肽之后經(jīng)90分鐘15％B-45％B梯度洗脫。使用80mL/min流速洗脫產(chǎn)物。通過監(jiān)測214nm的UV吸收進行檢測。將均質(zhì)產(chǎn)物級分(通過HPLC分析＞98％純)合并并且凍干，提供320mg產(chǎn)物。通過氨基酸分析和質(zhì)譜分析證實身份。
HPLC分析條件柱子Vydac 15cm #218TP5415，C18。
洗脫劑梯度95∶5(0.1％TFA/乙腈)至5∶95(0.1％TFA/乙腈)，經(jīng)45分鐘。
流速1.5ml/min。
波長214nM，254nM。
滯留時間16.4min。
分子式C129H203N37O48。
分子量3038.46。
測定合成肽的硫醇當量。例如，NT-BrAcM2-15(N-末端溴乙?；疢215-聚體SEQ ID NO11)和CT-BrAcM2-15(C-末端溴乙酰化M2 15-聚體SEQ ID NO13)溶解于N2-噴灑的25mM硼酸鹽，0.15M NaCl，2mM EDTA，pH 8.5緩沖液，最終濃度為7.5mg肽粉末/毫升。用0.97NaOH將pH調(diào)節(jié)至8.5。溶液經(jīng)0.2微米過濾。如下通過硫醇消耗分析測定等分樣品的溴乙?；斄俊Ｏ螂牡倪m當稀釋液(約15-30μM終濃度)和等體積的緩沖液加入溶解于N2-噴灑的25mM硼酸鹽，0.15M NaCl，2mM EDTA，pH 8.5緩沖液中的N-乙?；?半胱氨酸，并且在室溫下溫育30分鐘。溫育之后，加入5，5’-二硫-雙[2-硝基苯甲酸](DTNB；Ellman’s試劑)(使用N2飽和的0.1M磷酸鈉，0.1M NaCl，2mMEDTA，pH7中的50mM DTNB原液，5mM終濃度)。室溫下溫育15分鐘之后，減去合適的DTNB空白之后，使用ε412nm，測定硫醇濃度，1cm＝14.15×103M-1cm-1。存在肽和不存在肽情況下游離硫醇的差異估計硫醇反應當量。
類似地，NT-MalM2-15(N-末端馬來酰亞胺化M2 15-聚體SEQ IDNO12)和CT-MalM2-15(C-末端馬來酰亞胺化M2 15-聚體SEQ ID NO14)溶解于N2-噴灑的0.1M HEPES，0.15M NaCl，2mM EDTA，pH 7.3緩沖液，最終濃度為7.5mg肽粉末/毫升。用0.97NaOH將pH調(diào)節(jié)至7.3。溶液經(jīng)0.2微米過濾。如下通過硫醇消耗分析測定等分樣品的馬來酰亞胺當量。向肽的適當稀釋液(約15-30μM終濃度)和等體積的緩沖液加入溶解于N2-噴灑的20mM HEPES，0.15M NaCl，2mM EDTA，pH 7.3緩沖液中的N-乙酰基-半胱氨酸，并且在室溫下溫育30分鐘。溫育之后，加入DTNB(使用0.1M磷酸鈉，0.1M NaCl，2mM EDTA，pH7中50mM DTNB原液，5mM終濃度)。室溫下溫育15分鐘之后，減去合適的DTNB空白之后，使用ε412nm，測定硫醇濃度，1cm＝14.15×103M-1cm-1。存在肽和不存在肽情況下游離硫醇的差異估計硫醇反應當量。
對于包含硫醇的肽(例如SEQ ID NO1，2，3，4，10等)，肽溶解于(2.5-7.5毫克/毫升)冰冷N2飽和的0.1M HEPES，2mM EDTA，0.15M NaCl，pH7.3并且0.2微米過濾。通過將合適體積的肽稀釋到N2飽和的0.1M磷酸鈉，0.1MNaCl，2mM EDTA，pH7緩沖液中測定硫醇含量。加入DTNB，使用0.1M磷酸鈉，0.1M NaCl，2mM EDTA，pH7緩沖液中的50mM DTNB原液，達到5mM終濃度。室溫下溫育15分鐘之后，減去合適的DTNB空白之后，使用ε412nm，測定硫醇濃度，1cm＝14.15×103M-1cm-1。
過濾的溴乙?；蝰R來酰亞胺化肽的硫醇反應當量
a通過硫醇消耗量分析測定b通過asp，glu，gly，val，ile，leu，& arg值的AAA平均值測定c注由于在硫醇消耗分析中溴乙?；^低的反應性，NT-BrAcM2-15的[硫醇反應當量]可能被低估大約3-5倍。
含有半胱氨酸的過濾的M2肽的硫醇含量
a以肽序列為基礎。
b以改進的Ellman′s分析為基礎的硫醇含量。肽濃度以M2肽的單一色氨酸為基礎(假定ε278nm，1cm＝5,550M-1cm-1和ε288nm，1cm＝4,550M-1cm-1。使用的濃度是在這兩個波長下測定的平均值。
實施例2腦膜炎奈瑟氏球菌的硫醇化外膜蛋白復合體(OMPC)的制備利用本領域公知的和美國專利No.5,494,808描述的技術獲得OMPC。使用Marburg等1986描述的通用方法，通過使用無菌技術制備帶有N-乙?；甙腚装彼醿?nèi)酯的硫醇化作用。對于NT-BrAcM2-15和CT-BrAcM2-15，硫醇化OMPC最后重新懸浮于N2飽和的25mM硼酸鹽，0.15M NaCl，2mM EDTA，pH 8.5；對于與NT-MalM2-15和CT-MalM2-15反應，重新懸浮于20mM HEPES，0.15M NaCl，2mM EDTA，pH 7.3。通過將硫醇化OMPC適當稀釋到N2飽和的0.1M磷酸鈉，0.1MNaCl，2mM EDTA，pH 7緩沖液中測定硫醇含量。使用N2飽和的0.1M磷酸鈉，0.1M NaCl，2mM EDTA，pH 7緩沖液中50mM DTNB原液將DTNB加到5mM最終濃度。室溫下溫育15分鐘之后，減去合適的DTNB空白和OMPC空白(沒有DTNB)之后，使用ε412nm，測定硫醇濃度，1cm＝14.15×13M-1cm-1。
硫醇化OMPC的性質(zhì)
a通過改進的Ellman′s分析測定。
b通過改進的Lowry分析測定。
實施例3馬來酰亞胺化或烷基鹵化物-活化的OMPC的制備所有操作無菌進行。通過加入合適體積的無菌0.5M NaHCO3在NaHCO3pH 8.5±0.1中制備50mM無菌OMPC的水溶液(5.5mg/mL)。溫和攪拌下向緩沖的OMPC滴加4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯(sSMCC)或(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亞胺酯(sSIAB)(10mM冰冷H2O中的原液；從PIERCE CHEMICAL CO.，ROCKFORD，IL購得的化學品)，給出最終濃度2.5mM sSIAB或sSMCC和大約3.8mg/mL的OMPC濃度。也能使用溴乙酸N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯。反應在4℃避光老化1小時。1小時之后，用無菌1M磷酸鈉將反應混合物調(diào)節(jié)至pH 7.3，并且以300K分子量截留量(MWCO)DISPODIALYZER(SPECTRUM INDUSTRIES，INC.，RANCODOMINGUEZ，CA)用無菌6.3mM磷酸鈉，pH 7.3，0.15M NaCl在4℃下經(jīng)12-24小時徹底透析。或者，可以省去pH-調(diào)節(jié)而直接透析反應混合物。透析可以使用20mM HEPES，0.15M NaCl，2mM EDTA，pH7.3，其他合適的緩沖液，或者水。SIAB透析避光進行?？梢约覰2-噴灑透析緩沖液。
對于SIAB活化的OMPC混合物，優(yōu)選的透析緩沖液是50mM，溶于NaHCO3pH 8.5+0.1。使用上述對于肽描述的N-乙?；?半胱氨酸消耗分析對透析的活化的OMPC測定硫醇反應當量，除了分析緩沖液是0.1M磷酸鈉，0.1M NaCl，2mM EDTA，pH 7并且N-乙?；腚装彼釡赜龝r間是15分鐘。進行OMPC空白實驗(沒有DTNB)校正其在412nm時的貢獻。通過改進的Lowry測定蛋白質(zhì)。對于pH 8.5下馬來酰亞胺活化作用，一般實現(xiàn)0.09-0.12毫摩爾馬來酰亞胺當量/毫克Lowry蛋白質(zhì)水平。該水平比pH 7.3獲得的值高大約2-3倍。使用無菌0.5M EDTA，pH 8原液將活化的OMPC制成2mM EDTA終濃度。
實施例4M2肽與硫醇化OMPC的偶聯(lián)利用無菌技術，如下使硫醇化OMPC偶聯(lián)于M2肽NT-BrAcM2-15(N-末端溴乙?；疢2 15-聚體SEQ ID NO11)，CT-BrAcM2-15(C-末端溴乙?；疢2 15-聚體SEQ ID NO13)，NT-MalM2-15(N-末端馬來酰亞胺化M2 15-聚體SEQ ID NO12)，和CT-MalM2-15(C-末端馬來酰亞胺化M2 15-聚體SEQ ID NO14)。硫醇化OMPC加給不同量的肽并且溫和攪拌。不用混合，4℃下反應混合物避光老化過夜。
然后利用無菌技術將反應封端并且脫鹽。通過在N-乙基馬來酰亞胺(NEM)中使反應混合物成為5mM而與過量OMPC上的硫醇反應并且4℃下避光老化4小時進行NT-BrAcM2-15和CT-BrAcM2-15/硫醇化OMPC偶聯(lián)反應封端。通過4℃下在300K MWCO DISPODIALYZER中用0.15M NaCl透析，使封端的反應混合物脫鹽。通過在碘乙酰胺中使反應混合物成為5mM并且4℃下避光老化4小時進行NT-MalM2-15/硫醇化OMPC偶聯(lián)反應封端。通過4℃下在300K MWCO DISPODIALYZER中用0.15M NaCl透析，使封端反應混合物脫鹽。
實施例5M2肽與馬來酰亞胺化或碘乙?；疧MPC的偶聯(lián)使用無菌技術如下進行馬來酰亞胺化OMPC或碘乙?；疧MPC(或者溴乙?；疧MPC)與含有硫醇的M2肽(SEQ ID NO1)的偶聯(lián)。以硫醇/馬來酰亞胺摩爾比大約3的比例向溫和混合的馬來酰亞胺化或碘乙酰化OMPC滴加M2肽。也可以反過來加入，例如向肽加入OMPC，并且是優(yōu)選的。反應混合物不用混合，在4℃下避光老化12-24小時。使用0.2微米過濾的β-巰基甲醇(15mM終濃度)接著使試劑不用混合，在4℃下避光與偶聯(lián)物反應3-4小時，終止(“封端”)OMPC上過量硫醇反應基團。4℃下在300K MWCO DISPODIALYZER中用0.15M NaCl徹底透析封端的反應。
實施例6偶聯(lián)物分析對于測定OMPC蛋白質(zhì)或者測定偶聯(lián)物中蛋白質(zhì)加肽，使用改進的Lowry分析。在該項分析中，在載體脫氧膽酸鈉的存在下用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)樣品(Bensadoun和Weinstein1976，Anal.Biochem.70241-250)。用含有Lowry試劑A的SDS溶解蛋白質(zhì)沉淀。用類似方法處理BSA標準物。
對于氨基酸分析(AAA)，用內(nèi)部標準物正亮氨酸處理樣品，并且在真空下在110℃用6N HCl，0.2％苯酚(w/v)處理70小時。見方案V-VIII，圖5-8，用于預期的氨基酸水解產(chǎn)物。水解之后，將樣品干燥并且重新懸浮于樣品緩沖液中并且通過陽離子交換色譜法分析，使用過柱后茚三酮檢測(BECKMAN Model 6300，Palo Alto，CA)。也能利用其他系統(tǒng)，包括ACCUTAGTM(WATERS CORP.，MILFORD，MA)或AMINOACID DIRECTTM(DIONEX CORP.，SUNNYVALE，CA)進行氨基酸分析，它們可以提供靈敏性和/或分辨率的優(yōu)勢。
通過至少兩種方法能從氨基酸數(shù)據(jù)測定偶聯(lián)物的肽載荷量。從肽中獨特的氨基酸(例如，6-氨基己酸，AHA)能估計肽的量。從OMPC中存在的但是肽中不存在的氨基的量能估計OMPC蛋白質(zhì)的量。Lowry蛋白質(zhì)數(shù)目獲得來自肽的貢獻，而且高肽載荷量能對獲得的值有重要的貢獻。另一種方法涉及以分散層形式使用AAA數(shù)據(jù)的多重回歸分析，最小二乘分析(Shuler等，1992 J.Immunol.Meth.156137-149)。一般情況下，兩種方法產(chǎn)生彼此20％之內(nèi)的吻合。
還原偶聯(lián)物樣品的SDS-PAGE/染色分析能提供肽偶聯(lián)物的定性證據(jù)。對于馬來酰亞胺或碘乙?；?活化的OMPC/含有硫醇的M2肽，猝滅/活化OMPC的偶聯(lián)物分析能提供導致以三聚體存在的主要2類OMPC蛋白質(zhì)的交聯(lián)的SMCC或SIAB副反應的證據(jù)。
實施例7硫醇化OMPC/馬來酰亞胺化或溴乙?；疢2偶聯(lián)物的性質(zhì)透析的NT-BrAcM2-15/硫醇化OMPC偶聯(lián)物的性質(zhì)
a改進的Lowry測定法。
b以從AAA數(shù)據(jù)計算的值的平均值為基礎，假設0.42微摩爾賴氨酸/毫克Lowry蛋白質(zhì)和0.63微摩爾丙氨酸/毫克Lowry蛋白質(zhì)。
cS-羧甲基半胱氨酸分析是定性的。
d以通過AAA測定的蛋白質(zhì)值，假設的OMPC MW＝40×106，以及AAA蛋白質(zhì)/6-氨基己酸(Aha)值為基礎，給出肽的摩爾數(shù)。
透析的NT-MalM2-15/硫醇化OMPC偶聯(lián)物的性質(zhì)
a改進的Lowry測定法。
b以從AAA數(shù)據(jù)計算的值的平均值為基礎，假設0.42微摩爾賴氨酸/毫克Lowry蛋白質(zhì)和0.63微摩爾丙氨酸/毫克Lowry蛋白質(zhì)。
cS-二羧乙基高半胱氨酸分析是定性的。
d以通過AAA測定的蛋白質(zhì)值，假設的OMPC MW＝40×106，以及AAA蛋白質(zhì)/6-氨基己酸(Aha)值為基礎給出肽的摩爾數(shù)。
透析的CT-BrAcM2-15/硫醇化OMPC偶聯(lián)物的性質(zhì)
a改進的Lowry測定法。
b以從AAA數(shù)據(jù)計算的值為基礎，假設0.63微摩爾丙氨酸/毫克Lowry蛋白質(zhì)。
cS-羧甲基高半胱氨酸分析是定性的。
d以通過AAA測定的蛋白質(zhì)值，假設的OMPC MW＝40×106，以及AAA蛋白質(zhì)/6-氨基己酸(Aha)值為基礎，給出肽的摩爾數(shù)。
透析的CT-MalM2-15/硫醇化OMPC偶聯(lián)物的性質(zhì)
a改進的Lowry測定法。
b以從AAA數(shù)據(jù)計算的值為基礎，0.63微摩爾丙氨酸/毫克Lowry蛋白質(zhì)。
cS-二羧乙基高半胱氨酸分析是定性的。
d以通過AAA測定的蛋白質(zhì)值，假設的OMPC MW＝40×106，以及AAA蛋白質(zhì)/6-氨基己酸(Aha)值為基礎，給出肽的摩爾數(shù)。
一般情況下，以肽的等(摩爾)電荷，馬來酰亞胺化肽比溴乙酰化肽產(chǎn)生更高的偶聯(lián)物中的肽載荷量。與馬來酰亞胺基團相比，溴乙?；鶊F較低的硫醇動力學反應性可能是差異的原因。
實施例8.
馬來酰亞胺化OMPC和選擇的含有半胱氨酸的肽偶聯(lián)物的性質(zhì)透析的含有半胱氨酸的肽/馬來酰亞胺化OMPC偶聯(lián)物的性質(zhì)
a改進的Lowry測定法。
b通過AAA對S-二羧乙基半胱氨酸(DCEC)和6-氨基己酸(AHA)的定量分析。DCEC反應因子/ASP反應因子＝1.285。
c以通過AAA測定的蛋白質(zhì)值，假設0.63微摩爾丙氨酸/毫克Lowry蛋白質(zhì)，假設的OMPC MW＝40×106，和6-氨基己酸(AHA)值為基礎，給出肽的摩爾數(shù)。
含有多個半胱氨酸殘基的M2肽(例如，SEQ ID NO1)與帶有單一半胱氨酸的肽(例如，SEQ ID NO2)相比的較高DCEC/AHA水平提示每個單一M2肽有多個馬來酰亞胺/半胱氨酸連接。這可能導致偶聯(lián)物中較低的肽載荷量并且可能影響偶聯(lián)物的免疫原性。較小的肽(例如，SEQ ID NO10)表現(xiàn)出對于含有單一半胱氨酸的M2肽偶聯(lián)物的反應在相等肽電荷下給出較高的肽載荷量。這種作用可能由于OMPC上馬來酰亞胺位點處的空間束縛和/或肽上反應性半胱氨酸附近的電荷差異。對于淬滅/馬來酰亞胺活化的OMPC，SDS-PAGE提示活化和脫鹽步驟中馬來酰亞胺與OMPC中內(nèi)在親核試劑反應(參見Brewer和Riehm 1967 Anal.Biochem.18248-255)發(fā)生交聯(lián)。在較低pH下發(fā)生較少明顯的交聯(lián)。SIAB-活化的OMPC表現(xiàn)出最少的交聯(lián)。通過酰亞胺的開環(huán)反應，也可以將一些馬來酰亞胺基團轉(zhuǎn)化為馬來酰胺酸。馬來酰胺酸的硫醇反應性不足。一般情況下，發(fā)現(xiàn)使用馬來酰亞胺化肽和硫醇化OMPC制備的偶聯(lián)物相對于含有單一半胱氨酸的肽和馬來酰亞胺活化的OMPC的類似肽反應有更高的肽載荷量。使用硫醇化作用(大約0.26微摩爾硫醇/毫克蛋白質(zhì))相對于馬來酰亞胺化作用(0.09-0.12微摩爾馬來酰亞胺/毫克蛋白質(zhì))的OMPC活化水平更高，揭示這個發(fā)現(xiàn)的原因。
實施例9偶聯(lián)物的動物研究對于動物研究，除了對NT-BrAcM2-15使用大約2的比例之外，都使用大約1的肽/OMPC硫醇電荷比例(mol/mol)制備偶聯(lián)物。轉(zhuǎn)移在0.15M NaCl中的無菌制備的偶聯(lián)物，以便用鋁佐劑(MERCK明礬)配制。
動物研究中使用的偶聯(lián)物的性質(zhì)
a以從AAA數(shù)據(jù)計算的值為基礎，假設0.63微摩爾丙氨酸/毫克Lowry蛋白質(zhì)。
b以通過AAA測定的蛋白質(zhì)值，假設的OMPC MW＝40×106，和6-氨基己酸(AHA)值為基礎，給出肽的摩爾數(shù)。
實施例10疫苗配制實施例11中使用下面的偶聯(lián)物?！敖M”號指接種動物的組。制劑中使用的偶聯(lián)物是CT-M2-15聚體-ma-OMPC(進一步指作偶聯(lián)物″A″)，在第1-3組中使用；CT-BrAcM2-15聚體-OMPC(進一步指作偶聯(lián)物″B″)，在第4-6組中使用；NT-BrAcM2-15-聚體-OMPC(進一步指作偶聯(lián)物″C″)，在第7-9組中使用；CT-BrAcM2(SRS)-23-聚體-OMPC(進一步指作偶聯(lián)物″D″)，在第10-12組中使用?；罨?淬滅的OMPC(進一步指作偶聯(lián)物″E″)，在第13組中使用。稀釋度是根據(jù)通過Lowry方法測定的原液的蛋白質(zhì)濃度和通過氨基酸分析測定的肽載荷量。
步驟1.用1x鹽水將偶聯(lián)物A至D稀釋至0.1mg/mL肽濃度。將化合物E稀釋至0.5mg/mL蛋白質(zhì)濃度。
步驟2.以1∶1的比例向預先攪拌的2x明礬(MERCK ALUM，Prod.#39943，MERCK & CO，West Point，PA)加入來自步驟1的各種溶液，使得1x明礬中最終含50mcg/mL蛋白質(zhì)(對于化合物E，最終蛋白質(zhì)濃度是1x明礬中0.25mg/mL蛋白質(zhì))。
步驟3.室溫下在旋轉(zhuǎn)盤上混合2小時。
步驟4.用1x明礬將偶聯(lián)物稀釋，達到目標肽濃度。
4.1如下用1x明礬稀釋來自步驟3的溶液1份溶液用4份1x明礬(v/v)。
4.2室溫下在旋轉(zhuǎn)盤上混合1小時。
4.3對于第3，6，9，12組(接受1mcg肽)和第13組(接受5mcg活化/淬火OMPC)留出必要體積的步驟4.2的溶液。
4.4如下用1x明礬混合來自4.2的殘留溶液1份溶液用9份1x明礬(v/v)。
4.5室溫下在旋轉(zhuǎn)盤上混合1小時。
4.6對于接受0.1mcg肽的第2，5，8，11組留出必要體積的步驟4.5的溶液。
4.7如下用1x明礬混合來自4.5的殘留溶液1份溶液用9份1x明礬(v/v)。
4.8室溫下在旋轉(zhuǎn)盤上混合1小時。
4.9步驟4.8的溶液代表接受0.01mcg肽的第1，4，7，10組的制劑。
步驟5.分配到小瓶中。
所有的樣品操作都在無菌條件下進行。
實施例11對哺乳動物施用疫苗對小鼠侵襲模型試驗M2肽偶聯(lián)物疫苗的免疫原性和保護作用。
對四種不同的M2肽偶聯(lián)物評價它們激發(fā)M2肽特異性抗體應答的能力以及帶來的抗小鼠致命流感病毒侵襲的保護作用。下面表中給出試驗偶聯(lián)物。
如實施例10所述，所有的偶聯(lián)物在MERCK ALUM上配制。對每組由10只雌性Balb/c小鼠組成的每組動物，用100微升偶聯(lián)物肌內(nèi)免疫，并且3周之后用相同的偶聯(lián)物加強免疫一次。以三種不同的劑量對動物試驗各種偶聯(lián)物，即，0.01微克，0.1微克和1微克，以肽含量為基礎。例如，實施例10的配制的偶聯(lián)物A對第1組施用0.01微克，對第2組施用0.1微克，對第3組施用1微克，而配制的偶聯(lián)物B對第4組施用0.01微克，對第5組施用0.1微克，對第6組施用1微克，以此類推。
用MERCK ALUM中配制的非偶聯(lián)OMPC按照相同的方案免疫對照動物。第2周(第一次給藥后)和第6周(第二次給藥后)采集血樣。加強免疫之后4周，用LD90(引起90％死亡率的劑量)的小鼠的適應的A/Hong Kong/68重分配體(來自A/HK/68的HA基因和來自A/PR/8/34的M2基因)(H2N2)(這里稱作“A/HK/68重分配體″)鼻內(nèi)侵襲動物。侵襲之后，對小鼠監(jiān)測每天的體重減輕和死亡率，共監(jiān)測20天。
通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(Elisa)，使用沒有修飾的23氨基酸M2肽作為檢測抗原，測定M12-特異性抗體滴度。未接觸過抗原的和OMPC對照組都顯示沒有可檢測的抗-M2抗體滴度。圖9給出偶聯(lián)物免疫接種組的結(jié)果。所有疫苗組，對PD1和PD2樣品都觀察到了清楚的劑量效果，表明在合適的劑量范圍內(nèi)測試疫苗。所有的偶聯(lián)物能顯著激發(fā)M2-特異性免疫應答。加強免疫之后，以1微克劑量的給予偶聯(lián)物都激發(fā)特異性抗體滴度至五十萬或更高。不同疫苗之間，CT BrAc 23聚體(SRS)-OMPC激發(fā)最高滴度，而CT 15聚體-ma-OMPC激發(fā)最低滴度。CT BrAc-15聚體-OMPC和NT BrAc-15聚體-OMPC之間沒有觀察到明顯差異，表明通過N-末端偶聯(lián)的肽和通過C-末端偶聯(lián)的肽免疫原性相當。
致命病毒侵襲之后，正如所預期的，對照組表現(xiàn)出90至100％死亡率。相反，接受了1微克劑量的所有疫苗組有80至100％存活率。這證實試驗的疫苗能帶來抗死亡的保護作用。圖10顯示CT BrAc-15聚體-OMPC和CT 15-ma-OMPC之間的比較。兩種偶聯(lián)物之間最顯著的差異是0.01微克劑量時，接受CT BrAc-15聚體-OMPC的小鼠有80％存活率，而接受CT 15-ma-OMPC的小鼠和對照組基本上有相同的死亡率。這表明就抗致死侵襲的保護作用來說，CT BrAc-15聚體-OMPC比CT15-ma-OMPC更有效。這個論點是與這兩個組表現(xiàn)出的相對M2抗體滴度相吻合的事實。圖11顯示CT BrAc-15聚體-OMPC和CT BrAc-23聚體(SRS)-OMPC之間的比較。在這種情況下，就死亡率來說，兩組之間的差異不明顯。然而，接受CT BrAc 23聚體(SRS)-OMPC的組比接受CTBrAc-15聚體-OMPC的組顯示總的較少體重減輕，揭示前者可能有更有效的保護作用的傾向。圖12顯示CT BrAc 15聚體-OMPC和NTBrAc-15聚體-OMPC之間的比較。總之，接受CT BrAc-15聚體偶聯(lián)物的組比接受NT BrAc-15聚體偶聯(lián)物的組表現(xiàn)出更高的成活率。在該項實驗中，所有M2肽偶聯(lián)物具有抗致命病毒侵襲的保護作用，而通過C-末端與硫醇化OMPC偶聯(lián)的M223聚體(SRS)表現(xiàn)出是最有效的疫苗。
實施例12肽A/H3/HA0-2
A/H3/HA0-2的肽序列相應于跨越甲型流感序列，H3亞型，HongKong A/68的血細胞凝集素蛋白質(zhì)前體HA0的切割位點的亞基內(nèi)區(qū)。粗體是N-末端殘基，例如甘氨酸和半胱氨酸殘基。這些是通過硫醚鍵與馬來酰亞胺活化的OMPC載體反應產(chǎn)生肽-OMPC偶聯(lián)物所必須的間隔區(qū)并且作為半胱氨酰配體。
A/H3/HA0-2的肽合成在先鋒肽合成儀(APPLIED BIOSYSTEMS，F(xiàn)oster City，CA)上利用Fmoc/t-Bu化學通過固相法合成肽。使用的樹脂是用修飾的Rink接頭p-[(R，S)-α-[9H-芴-9-基-甲氧基甲酰胺基]-2，4-二甲氧基芐基]-苯氧基乙酸衍生的，F(xiàn)moc-接頭AM-Champion，1％交聯(lián)的(BIOSEARCH TECHNOLOGIES，INC.，Novato，CA)PEG-PS為基礎的樹脂(Rink，H.(1987)Tetrahedron Lett.28，3787-3789；Bernatowicz，M.S.，Daniels，S.B.和Koster，H.(1989)Tetrahedron Lett.30，4645-4667)。
所有的?；磻帽葮渲坞x氨基4倍過量的活化氨基酸進行60分鐘。用等摩爾量的HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓六氟磷酸酯)和2倍摩爾過量的DIEA(N，N-二異丙基乙胺)活化氨基酸。側(cè)鏈保護基團是對于Asp，Glu，Ser，Thr和Tyr是叔丁基；對于Cys，Asn，His和Gln是三苯甲基；對于Lys，Trp是叔丁氧羰基。在組裝結(jié)束時，室溫下，用88％TFA，5％苯酚，2％三異丙基硅烷和5％水(Sole，N.A.，和Barany，G.(1992)J.Org.Chem.，57，5399-5403)對干燥肽-樹脂處理1.5小時。
將樹脂過濾，為了使肽沉淀，向冷的甲基叔丁基醚加溶液。將肽離心之后，用新鮮的冷的甲基叔丁基醚洗滌肽沉淀物，去除有機清除劑。將該過程重復兩次。將最終的沉淀物干燥，重新懸浮于H2O，20％乙腈，并且凍干。
利用半制備WATERS(MILORD，MA)RCM DELTA-PAKTMC18柱(40×100mm，15微米)通過反相HPLC純化粗制肽，使用洗脫劑(A)0.1％三氟乙酸水溶液和(B)0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。我們使用下面的B梯度25％-40％經(jīng)20分鐘，流速80ml/min，峰相當于產(chǎn)物，在16’的滯留時間(tR)洗脫。在ULTRASHPERE，C18柱，25×4.6mm，5微米上進行分析HPLC，用下面的B梯度20％-50％B，以20′，流速1ml/min。通過在PERKIN-ELMER(WELLESLEY，MA)API-100上進行電子噴射質(zhì)譜來表征純化的肽理論平均mw是2163.48Da，實測值2163.6Da。
A/H3/HA0-2與OMPC的偶聯(lián)設計了從革蘭氏陰性細菌純化OMPC的各種方法(Frasch等，J.Exp.Med.140，87(1974)；Frasch等，J.Exp.Med.147，629(1978)；Zollinger等，美國專利No.4,707,543(1987)；Helting等，ActaPath.Microbiol.Scand.Sect.C.89，69(1981)；Helting等，美國專利No.4,271,147)；利用本領域公知的技術，例如Fu，美國專利No.5,494,808描述的那些，能獲得腦膜炎奈瑟氏球菌B改進的外膜蛋白質(zhì)復合體(iOMPC)。
向2.9mL腦膜炎奈瑟氏球菌改進的外膜蛋白質(zhì)復合體(iOMPC)溶液(6.84mg/ml)加入0.5M NaHCO3(0.322mL)至50mM，pH 8.5的最終濃度。向其中滴加0.83mL的20μM二倍過量的(關于OMPC的賴氨酸殘基，0.42微摩爾賴氨酸/毫克OMPC蛋白質(zhì))雜雙功能交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯(sSMCC，PIERCE CHEMICAL CO.，Rockford，I1)溶液。溶液在4℃下避光老化1小時之后，通過加入1M NaH2PO4溶液(46微升)將pH降至中性。使用300K MWCO DISPODIALYZER(SPECTRUM LABORATORIES INC.，Rancho Dominguez CA)，使用2升20mM HEPES pH 7.3(4-(2-羥乙基哌嗪-1-乙磺酸)，2mM EDTA(乙二胺四乙酸)的6-緩沖液改變(每2小時)4℃下將溶液透析，去除過量的試劑。透析后共回收8.08mL活化OMPC(OMPC)。
在脫氣的0.1M HEPES，2mM EDTA pH 7.3溶液中制備0.7mg/ml含有Cys的肽配體A/H3/HA0-2的原溶液。通過Ellman分析(Ellman，G.L.(1959)，Arch.Biochem.Biophys.，82，70)測定肽溶液的硫醇含量，并且顯示230μM的-SH滴度。
為了確定能安全摻入OMPC上并且不引起沉淀的肽配體的最大量，首先以小規(guī)模試驗進行偶聯(lián)反應，其中OMPC與漸增量的肽配體一起溫育。OMPC上能摻入的馬來酰亞胺基團最大數(shù)目受到OMPC上總的賴氨酸殘基的限制，即0.42微摩爾賴氨酸/毫克OMPC。如果考慮對于OMPC是40×106Da的平均MW，這相當于16,000賴氨酸摩爾/OMPC摩爾。其中只有一部分實際上被sSMCC活化最多35％，這相當于可獲得大約5000摩爾的最大肽載荷量。因此，OMPC與每OMPC摩爾的以下摩爾過量的肽一起溫育500，1000，2000，3000。1小時之后，樣品與OMPC樣品相比較，檢查任何沉淀的存在或者濁度的增加。
在A/H3/HA0-2的情況下，只有當使用最多2000(Cys-肽/OMPC摩爾的摩爾數(shù))摩爾過量進行1小時溫育反應時，偶聯(lián)反應給出可溶性產(chǎn)物。高于該比例，發(fā)生OMPC溶液的完全沉淀。
以這些發(fā)現(xiàn)為基礎進行大規(guī)模反應用2.08mL的20mM HEPES，2mM EDTA pH 7.3稀釋4mL(9.8mg)的OMPC。輕輕渦旋下滴加2.08ml肽原液，相當于2000摩爾過量的肽摩爾數(shù)/OMPC摩爾。馬來酰亞胺活化的OMPC溶液樣品留作測定最終偶聯(lián)物的肽載荷量的空白樣品。讓偶聯(lián)反應混合物4℃下避光老化17小時。然后4℃下避光用β-巰基乙醇將OMPC上所有殘留的馬來酰亞胺基團淬滅1小時至15mM終濃度(加入8.6微升總體積)。4℃下使用300K MWCO DISPODIALYZER，用1升20mM HEPES pH 7.3將溶液透析4次，4小時/改變，去除沒有偶聯(lián)的肽和β-巰基乙醇。
通過Lowry分析(Lowry，O.H.，Rosebrough，N.J.，F(xiàn)arr，A.L.和Randall，R.J.(1951)，J.Biol.Chem.，193，265)測定濃度，對于OMPC-A/H3/HA0-2測得1.0mg/mL。110℃下用共沸HCl，在抽空的密封玻璃試管中將偶聯(lián)物和OMPC樣品水解70小時。通過氨基酸分析測定氨基酸組成。通過將偶聯(lián)物氨基酸組成與OMPC載體的和肽配體的相比較，并且通過對數(shù)據(jù)的多重回歸分析，最小二乘分析(Shuler等Journal of Immunological Methods，156，(1992)137-149)，測定肽與OMPC蛋白質(zhì)的偶聯(lián)載荷量。對于偶聯(lián)物OMPC和A/H3/HA0-2，獲得1160的肽對OMPC摩爾數(shù)的摩爾比。
實施例13肽A/H3/HA0-18根據(jù)ProMaC(Protein Mass Calculator軟件v.1.5.3計算的，A/H3/HA0-2肽序列的pI是8.4。為了將肽的pI值降低至4.1，對序列進行工程處理，獲得肽HA0-18，它和A/H3/HA0-2有著來自流感HA0前體的相同的序列。粗體是偶聯(lián)，間隔和pI工程處理所必需的殘基。
1Ac-，乙?；?，CH3-CO-A/H3/HA0-18的肽合成根據(jù)對A/H3/HA0-2所述合成這種肽。為了制備肽C-末端酸，在事先用DIPCDI/HOBt作為活化劑用4-羥甲基苯氧基乙酸接頭衍生化的Champion PEG-PS樹脂(BIOSEARCH TECHNOLOGIES，INC.，Novato，CA)上合成肽。第一個氨基酸，谷氨酸，在催化量的DMAP(二甲基氨基吡啶)存在下，用DIPC(二異丙基碳二亞胺)將其活化為對稱酸酐，并且酯化成樹脂。通過在DMF中與10倍過量的乙酸酐反應在組裝的肽末端進行?；磻?。
利用半制備(WATERS MILORD，MA)RCM DELTA-PAKTMC18柱(40×100mm，15微米)通過反相HPLC純化粗制肽HA0-18，使用洗脫劑(A)0.1％三氟乙酸水溶液和(B)0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。我們使用下面的B梯度30％-45％經(jīng)20分鐘，流速80ml/min。在ULTRASHPERE，C18柱(BECKMAN，F(xiàn)ULLERTON，CA)，25×4.6mm，5微米上進行分析HPLC，用下面的B梯度30％-45％B，以20′，80％，3’，流速1ml/min。通過在PERKIN-ELMER(WELLESLEY，MA)API-100上進行電子噴射質(zhì)譜來表征純化的肽理論平均MW是2336.83Da，實測值2336Da。
A/H3/HA0-18與OMPC的偶聯(lián)根據(jù)實施例12中對于A/H3/HA0-2所述活化iOMPC。在脫氣的0.1MHEPES，2mM EDTA pH 7.3溶液中制備含有Cys肽配體A/H3/HA0-18原液。通過Ellman分析測定肽溶液的硫醇含量，并且顯示230μM的-SH滴度。為了確定能安全摻入OMPC上并且不引起沉淀的肽配體的最大量，還是首先以小規(guī)模試驗進行偶聯(lián)反應，其中OMPC與漸增量的肽配體一起溫育。即，OMPC與每OMPC摩爾的以下摩爾過量的肽配體一起溫育1000，2000，3000。1小時之后，樣品與對照OMPC樣品相比較，檢查任何沉淀的存在或者濁度的增加。使用較低pI的工程化序列，在使用最大摩爾過量配體3000摩爾/OMPC摩爾下沒有見到沉淀或濁度增加。
根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，向2mL(4.6mg)的OMPC溶液加入1.68mL的肽原液(根據(jù)Ellman分析是200μM，相當于3000摩爾過量)。讓偶聯(lián)反應混合物4℃下避光老化17小時。然后4℃下避光用β-巰基乙醇將OMPC上所有殘留的馬來酰亞胺基團淬滅1小時至15mM終濃度。4℃下使用300K MWCO DISPODIALYZER，用20mM HEPES pH 7.3將溶液充分透析，去除沒有偶聯(lián)的肽和β-巰基乙醇。通過對A/H3/HA0-2所述的Lowry分析和氨基酸分析來分析最終的偶聯(lián)物。對于偶聯(lián)物OMPC和A/H3/HA0-18，獲得2542的肽對OMPC摩爾的摩爾比。
實施例14肽A/H3/HA0-17
1Suc-，琥珀酰，HOOC-(CH2)2-CO-A/H3/HA0-17的肽序列相應于甲型流感序列，HK A/68，H3亞型的血細胞凝集素蛋白質(zhì)前體HA0的切割位點。該序列類似于實施例1中的A/H3/HA0-2，但是在這種情況下，與馬來酰亞胺活化的載體偶聯(lián)所需要的半胱氨酸殘基在C-末端。該序列進一步被修飾，將肽的pI值調(diào)節(jié)至4。修飾包括Cys末端羧酸被酰胺代替，在N-末端加谷氨酸和琥珀酰。
A/H3/HA0-17的肽合成為了制備肽C-末端酸，在事先用DIPCDI/HOBt作為活化劑用4-羥甲基苯氧基乙酸接頭衍生化的Champion PEG-PS樹脂(BIOSEARCHTECHNOLOGIES，INC.)上進行合成。第一個氨基酸，谷氨酸，在催化量的DMAP(二甲基氨基吡啶)存在下，用DIPC(二異丙基碳二亞胺)將其活化為對稱酸酐，并且酯化成樹脂。根據(jù)對A/H3/HA0-2所述進行組裝。通過在DMF中與10倍過量的琥珀酸酐反應在組裝的肽末端進行琥珀?；磻?br> 利用半制備WATERS(MILORD，MA)RCM DELTA-PAKTMC18柱(40×100mm，15微米)通過反相HPLC純化粗制肽A/H3/HA0-17，使用洗脫劑(A)0.1％三氟乙酸水溶液和(B)0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。我們使用下面的B梯度30％-45％經(jīng)20分鐘，流速80ml/min。在ULTRASHPERE，C18柱(BECKMAN，F(xiàn)ULLERTON，CA)，25×4.6mm，5微米上進行分析HPLC，用下面的B梯度30％-45％B，以20′，80％，3’，流速1ml/min。通過在PERKIN-ELMER(WELLESLEY，MA)API-100上進行電子噴射質(zhì)譜來表征純化的肽理論平均MW是2337.62Da，實測值2336.8Da。
A/H3/HA0-17與OMPC的偶聯(lián)根據(jù)實施例12所述活化iOMPC。在脫氣的0.1M HEPES，2mM EDTApH 7.3溶液中制備HA0-17的原液。通過Ellman分析測定肽溶液的硫醇含量，并且顯示200μM的-SH滴度。為了確定能安全摻入到OMPC上并且不引起沉淀的肽配體的最大量，首先以小規(guī)模試驗進行偶聯(lián)反應，其中OMPC與漸增量的A/H3/HA0-17一起溫育。即，OMPC與每OMPC摩爾以下摩爾過量的肽配體一起溫育1000，2000，3500。1小時之后，樣品與OMPC樣品相比較，檢查任何沉淀的存在或者濁度的增加。使用較低pI的工程化序列，在使用最大摩爾過量配體3000摩爾/OMPC摩爾下沒有見到沉淀或濁度增加。
在這些發(fā)現(xiàn)的基礎上，對3mg(0.94ml)OMPC進行大規(guī)模反應。輕輕渦流下，向該溶液滴加1.334ml肽原液，相當于3500摩爾過量的肽摩爾數(shù)/OMPC摩爾。讓偶聯(lián)反應混合物4℃下避光老化17小時。然后4℃下避光用β-巰基乙醇與OMPC上所有沒有反應的馬來酰亞胺基團反應1小時至15mM終濃度。4℃下使用300K MWCO DISPODIALYZER(SPECTRUM LABORATORIES，INC.，RANCHO DOMINGUEZ，CA)，用20mMHEPES pH 7.3將溶液充分透析，去除沒有偶聯(lián)的肽和β-巰基乙醇。通過對A/H3/HA0-2所述的Lowry分析和氨基酸分析來分析最終的偶聯(lián)物。分析得出摻入1860摩爾A/H3/HA0-17肽/摩爾OMPC的水平。
實施例15肽A/H3/HA2-25
A/H3/HA2-25的肽序列相應于甲型流感序列，H3亞型，HongKongA/68的血細胞凝集素蛋白質(zhì)HA2的融合蛋白區(qū)。該序列包含用于與馬來酰亞胺活化的OMPC偶聯(lián)的半胱氨酸(粗體)，作為間隔區(qū)的甘氨酸殘基，和作為C-末端殘基將pI調(diào)節(jié)至3.4值的谷氨酸的插入。
A/H3/HA2-25的肽合成為了制備肽C-末端酸，在事先用DIPCDI/HOBt作為活化劑用4-羥甲基苯氧基乙酸接頭衍生化的Champion PEG-PS樹脂(BIOSEARCHTECHNOLOGIES，INC.)上進行合成。第一個氨基酸，谷氨酸，在催化量的DMAP(二甲基氨基吡啶)存在下，用DIPC(二異丙基碳二亞胺)將其活化為對稱酸酐，并且酯化成樹脂。根據(jù)對A/H3/HA0-2所述進行組裝。
利用半制備WATERS(MILORD，MA)RCM DELTA-PAKTMC4柱(40×100mm，15微米)通過反相HPLC純化粗制肽A/H3/HA2-25，使用洗脫劑(A)0.1％三氟乙酸水溶液和(B)0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。我們使用下面的B梯度40％-40％(5’)-60％(20’)，流速80ml/min。在Phenomenex，Jupiter C4柱，15×4.6mm，5微米上進行分析HPLC，用下面的B梯度35％-55％B，以20′，至80％，3’，流速1ml/min。通過在PERKIN-ELMER(WELLESLEY，MA)API-100上進行電子噴射質(zhì)譜來表征純化的肽理論平均MW是2271.55Da，實測值2271.2Da。
A/H3/HA2-25與OMPC的偶聯(lián)根據(jù)實施例12所述活化iOMPC。
在脫氣的0.1M HEPES，2mM EDTA pH 7.3溶液中制備A/H3/HA2-25的溶液。通過Ellman分析測定肽溶液的硫醇含量，并且顯示250μM的-SH滴度。
為了確定能安全摻入OMPC上并且不引起沉淀的肽配體的最大量，首先以小規(guī)模試驗進行偶聯(lián)反應，其中OMPC與漸增量的A/H3/HA2-25一起溫育。即，OMPC與每OMPC摩爾以下摩爾過量的肽配體一起溫育500，1000，2000，4000，6000。1小時之后，樣品與OMPC樣品相比較，檢查任何沉淀的存在或者濁度的增加。使用較低pI的工程化序列，在使用最大摩爾過量配體6000摩爾/OMPC摩爾下沒有見到沉淀或濁度增加。
根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，對6.3mg(2.57ml)OMPC進行大規(guī)模反應。輕輕渦流下，向該溶液滴加3.85ml肽原液，相當于6000摩爾過量的肽摩爾數(shù)/OMPC摩爾。讓偶聯(lián)反應混合物4℃下避光老化17小時。然后4℃下避光用β-巰基乙醇與OMPC上所有沒有反應的馬來酰亞胺基團反應1小時至15mM終濃度。4℃下使用300K MWCO DISPODIALYZER，用20mM HEPES pH 7.3將溶液充分透析，去除沒有偶聯(lián)的肽和β-巰基乙醇。通過對A/H3/HA0-2所述的Lowry分析和氨基酸分析來分析最終的偶聯(lián)物。分析得出對于A/H3/HA2-25摻入2436摩爾肽/摩爾OMPC的水平。
實施例16肽B/HA0-22B/HA0-22的肽序列相應于乙型流感序列的血細胞凝集素前體HA0的切割位點，它與Victoria和Yamagata系的乙型流感病毒中的相同，例如B/Ann Arbor/54，B/Hong Kong/330/2001，和B/Yamanashi/166/1998。
在N-末端導入溴乙酰基使得與甘氨酸間隔區(qū)的硫醇化OMPC偶聯(lián)，從而修飾該序列(Tolman等Int.J.Peptide Protein Res.41，1993，455-466；Conley等Vaccine 1994，12，445-451)，并且進行修飾來調(diào)節(jié)肽的pI值。修飾作用包括C-末端羧酸被羧酰胺代替，和在N-和C-末端加谷氨酸。
B/HA0-22的肽合成在先鋒肽合成儀(APPLIED BIOSYSTEMS，F(xiàn)oster City，CA)上利用Fmoc/t-Bu化學通過固相法合成肽。為了制備肽C-末端酸，在事先用DIPCDI/HOBt作為活化劑用4-羥甲基苯氧基乙酸接頭衍生化的Champion PEG-PS樹脂(BIOSEARCH TECHNOLOGIES，INC.，Novato，CA)上合成肽。第一個氨基酸，谷氨酸，在催化量的DMAP(二甲基氨基吡啶)存在下，用DIPC(二異丙基碳二亞胺)將其活化為對稱酸酐，并且酯化成樹脂。通過使用DIPCDI/HOBt作為活化劑，與3倍過量的溴乙酸反應，在組裝的肽的末端進行溴乙?；磻?。
所有的?；磻獙渲坞x氨基用4倍過量的活化氨基酸進行60分鐘。用等摩爾量的HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓六氟磷酸酯)和2倍過量的DIEA(N，N-二異丙基乙胺)活化氨基酸。側(cè)鏈保護基團是對于Glu是叔丁基；對于Lys是叔丁氧羰基；對于Arg是2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；Ｔ诮M裝之后，室溫下，用88％TFA，5％苯酚，2％三異丙基硅烷和5％水(Sole，N.A.，和Barany，G.(1992)J.Org.Chem.，57，5399-5403)處理干燥的肽-樹脂1.5小時。將樹脂過濾，為了使肽沉淀，向冷的甲基叔丁基醚加該溶液。將肽離心之后，用新鮮的冷的甲基叔丁基醚洗滌肽沉淀物，去除有機清除劑。將該過程重復兩次。將最終的沉淀物干燥，重新懸浮于H2O，20％乙腈，并且凍干。
利用半制備WATERS(MILORD，MA)RCM DELTA-PAKTMC18柱(40×100mm，15微米)通過反相HPLC純化粗制肽，使用洗脫劑(A)0.1％三氟乙酸水溶液和(B)0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。我們使用下面的B梯度30％-45％經(jīng)20分鐘，流速80ml/min。在ULTRASHPERE(BECKMAN，F(xiàn)ULLERTON，CA)，C18柱，25×4.6mm，5微米上進行分析HPLC，用下面的B梯度30％-50％B，以20′，至80％，3’，流速1ml/min。通過在PERKIN-ELMER API-100上進行電子噴射質(zhì)譜來表征純化的肽理論平均MW是2500.7Da，實測值2500.4Da。
B/HA0-22與OMPC的偶聯(lián)首先通過超速離心(Ti-70轉(zhuǎn)子，50,000RPM，45min，4℃)將iOMPC起始物(150mg)轉(zhuǎn)移到噴灑氮氣的無菌過濾的CM761(0.11M硼酸鈉，pH 11.3)，并且以10mg/mL的濃度dounce勻化/再懸浮。然后與EDTA-DTT溶液(0.57g EDTA/g OMPC，0.11gDTT/g OMPC，在CM761中)聯(lián)合，用N-乙?；甙腚装彼崃騼?nèi)酯(NAHT)溶液(0.89gNAHT/gOMPC，在通入氮氣的水中)將蛋白質(zhì)硫醇化。硫醇化反應在室溫(大約20℃)下進行4小時。然后通過超速離心(50,000RPM，45min，4℃)和dounce勻化/再懸浮步驟，將硫醇化iOMPC轉(zhuǎn)移到25mM硼酸鈉，pH 8.0緩沖液中。硫醇化作用之后，進行Lowry分析和Ellman′s分析，然后進行下面的步驟。硫醇化OMPC的硫醇含量是0.25微摩爾硫醇/毫克。
首先以5mg/mL的濃度將65mg的B/HA0-22溶解于25mM硼酸鈉，pH 8.0緩沖液中。然后使用1N NaOH將肽溶液的pH調(diào)節(jié)回8.0，然后用0.22微米無菌過濾器過濾。然后輕微攪拌下將53mg的硫醇化OMPC(以1.2克肽/克OMPC的質(zhì)量電荷比)滴加給肽貯存溶液。室溫下不用攪拌，讓偶聯(lián)反應進行15.5小時。
偶聯(lián)反應結(jié)束時，將偶聯(lián)物溶液轉(zhuǎn)移到六個300kDMWCODISPODIALYZERs中，每個操作體積是5mL。將三個DISPODIALYZERs放入4升燒杯中，每個有3.5至4升無菌過濾水。通過使用3-英寸磁攪拌棒和速度可調(diào)節(jié)攪拌平板，對含有偶聯(lián)物和3.5至4升無菌過濾水的每個4升玻璃燒杯施加輕微攪拌?？偣策M行5次對無菌過濾水進行的透析更換，每次更換至少6小時，去除反應副產(chǎn)物和過量的游離肽。
通過對A/H3/HA0-2所述的Lowry分析和氨基酸分析來分析最終的偶聯(lián)物。分析得出對于B/HA0-22摻入6500摩爾肽/摩爾OMPC的水平。
實施例17對接種HA0肽-OMPC偶聯(lián)物的小鼠用甲型流感病毒的小鼠侵襲實驗用與OMPC偶聯(lián)的HA肽的偶聯(lián)物對雌性Balb/c小鼠肌內(nèi)免疫接種。在使用HA0-21(H1)和HA0-22(H3)的實驗中，偶聯(lián)使用的化合物是硫醇化OMPC和溴乙酰化肽。在使用HA0-25(H3L)和HA0-25(H1)的實驗中，使用的化合物是馬來酰亞胺基-OMPC和半胱氨酰-肽。利用標準方法純化偶聯(lián)物并且制備制劑。
所有的疫苗用Merck Alum或20微克的QS21佐劑配制，并且每次注射以每只小鼠100微升體積給藥。在第0，2和4周對小鼠接種。在第7周，用致死劑量的流感病毒PR8或HK對小鼠鼻內(nèi)侵襲。下面給出數(shù)據(jù)。
使用HA肽/OMPC偶聯(lián)物疫苗的小鼠侵襲實驗
a各肽-OMPC偶聯(lián)物制劑中肽的量根據(jù)如上所述的標準ELISA形式收集和分析血清樣品。
Elisa滴度ELISA SEQ ID疫苗 序列 滴度NOA/H1/HA0-21 BrAc-GPSIQSRGLFGAIAGFIEE-OH 9×10563A/H3/HA0-22 BrAc-EGPEKQTRGIFGAIAGFIEE-OH 2×10764A/H1/HA0-25 Ac-CEGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGE-OH4×10561A/H3(L)/HA0-25Ac-CEGMRNVPEKQTRGLFGAIAGFIENGE-OH3×10762實施例18對用與OMPC偶聯(lián)的來自乙型流感病毒的HA0肽接種的小鼠的乙型流感病毒侵襲實驗根據(jù)如上所述制備乙型流感HA0偶聯(lián)物(見上面實施例)。對于B型/HA0-22 EGPAKLLKERGFFGAIAGFLEE(SEQ ID NO60)肽-OMPC偶聯(lián)物使用的偶聯(lián)作用是與硫醇化OMPC偶聯(lián)的溴乙酰化肽。
用1，10，100或1000ng的B/HA0-22對雌性Balb/c小鼠肌內(nèi)免疫接種第0和28周，在Merck Alum中配制(ng基于制劑中偶聯(lián)物的肽含量)。第2和4周采集血清樣品，并且通過ELISA測定HA0-特異性抗體滴度。
第二次接種之后三周，用LD90(90％小鼠致死劑量)的適應小鼠的乙型流感病毒B/Ann Arbor/54對小鼠鼻內(nèi)侵襲。監(jiān)測小鼠存活率和體重變化，觀察20天。
B/HA0-OMPC偶聯(lián)物疫苗激發(fā)有效HA0-特異性抗體應答(圖22A)。抗體應答是劑量依賴性的。1ng疫苗能激發(fā)可感知的HA0-特異性抗體滴度，1000ng疫苗激發(fā)大約一百萬滴度。
B/HA0-OMPC偶聯(lián)物疫苗抗致死病毒侵襲是高效的。如存活率曲線所示(圖22B)，接受10ng，100ng或1000ng的B/HA0-OMPC疫苗的小鼠顯示100％存活率，接受1ng疫苗的小鼠有70％存活率。正如所預期的，天然對照顯示90％死亡率。B/HA0-OMPC疫苗還表現(xiàn)出抗體重減輕的顯著保護作用。例如，接受100ng或1000ng疫苗的小鼠與對照小鼠30％體重減輕相比，只有最大10％減輕。
在亞致死侵襲模型中試驗了乙型流感疫苗對體內(nèi)病毒復制的作用。以四周間隔對小鼠接種兩次并且用亞致死劑量的B/Ann Arhor/54侵襲。第1，3，5和7天收集鼻和肺清洗物。就鼻病毒脫落物來說，疫苗和對照物沒有明顯差異。然而，與對照相比較，免疫小鼠肺病毒脫落物大大減少(圖23.)。
實施例19在A/H3/HA2肽-KLH偶聯(lián)物接種的小鼠中用甲型流感病毒進行的小鼠侵襲實驗通過向肽的N-末端加半胱氨酸殘基，提供用于與馬來酰亞胺活化的KLH反應的硫醇基團，制備A/H3/HA2-6KLH偶聯(lián)物(KIDLWSYNAELLVALENQHT)(SEQ ID NO.59)。第0，3和5周，用20QS21中的20微克A/H3/HA2肽-KLH偶聯(lián)物對每組10只Balb/c小鼠皮下接種。最后接種之后兩周，用LD90的流感HK重分配體鼻內(nèi)侵襲小鼠。HA6-KLH顯示抗致死侵襲的部分保護作用。例如，侵襲之后，對照組表現(xiàn)90％死亡率，而疫苗組顯示60％死亡率。另外，接受疫苗的小鼠與沒有接種的對照組相比，總的嚴重體重減輕程度較小(圖24)。
實施例20M2肽與HPV VLPs的偶聯(lián)根據(jù)(Tobery等，2003)所述，從釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表達并純化HPV型16VLPs。該項研究中使用的抗原是通過標準t-Boc固相合成法制備的合成25-殘基M2-肽。肽的序列類似于流感病毒株A/Aichi/470/68(H3N1)中的M2蛋白質(zhì)的胞外片段，Ac-SLLTEVETPIRNEWGSRSND-Aha-C-NH2(SEQ ID NO2)，并且包括非天然氨基酸，6-氨基己酸(Aha)。
抗原-載體偶聯(lián)物L1蛋白質(zhì)濃度是14μM的50mM NaHCO3，pH8.4中的HPL VLPs與商購雜雙功能交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯(sSMCC，PIERCE CHEMICAL CO.，Rockford，IL)混合至約100的最終sSMCC/L1蛋白質(zhì)(摩爾/摩爾)之比。反應在2-8℃下進行1小時后通過用含有10mM組氨酸，0.5M NaCl，0.015％吐溫80的pH6.2緩沖液透析脫鹽，產(chǎn)生sSMCC-活化的HPV VLPs。根據(jù)實施例1所述，通過DTNB分析測定馬來酰亞胺當量。溶解于N2-噴灑的緩沖液中的M2-肽與sSMCC-活化的HPV VLPs混合，達到大約3的硫醇/馬來酰亞胺(摩爾/摩爾)之比?；蛘?，通過以一定硫醇/馬來酰亞胺(摩爾/摩爾)之比將sSMCC-活化的IPV VLPs與N-乙?；腚装彼峄旌?，來制備活化/淬滅的BPV VLP(A/QHPV VLP)。反應在2-8℃下進行約15小時。然后用β-巰基乙醇處理兩種樣品，將所有過量的馬來酰亞胺淬滅。最后，用0.5M NaCl和0.015％吐溫80將樣品透析(DISPODIALYSER MWCO 300,000 SPECTRUMINDUSTRIES INC.，RANCHO DOMINGUEZ，CA)。當在偶聯(lián)之前用碘代乙酰胺淬滅HPAI VLPs中的游離硫醇時獲得相似結(jié)果。
蛋白質(zhì)濃度和每VLP的肽載荷量的測定通過比色bicinchoninic acid(BCA)分析測定溶液中蛋白質(zhì)的濃度。通過氨基酸分析測定每VLP的肽載荷量。樣品在6N HCl中在110℃下水解70小時，然后在陽離子交換色譜法處理(AAA SERVICESINC.，BORING，OR)之后定量測定。參照Aha含量或者在Shuler等，1992描述的方法的基礎上進行分析，測定肽的量。兩種方法給出相同結(jié)果。
病毒-樣顆粒上抗原肽的載荷量通過定量測定肽中的非天然氨基酸(Aha，6-氨基己酸)或者通過數(shù)據(jù)的多重回歸最小二乘分析(Shuler等，″A simplified methodfor determination of peptide-protein molar ratios using aminoacid analysis″，J.Immunol.Meth.，Vol.156 pp.137-149，1992)，測定HPV VLP上的肽載荷量。兩種方法顯示每LI蛋白質(zhì)的肽載荷量大約是11肽。一個HPV VLP中有360個LI蛋白質(zhì)拷貝(一個VLP包含72個L1蛋白質(zhì)五聚體或殼粒)，這樣產(chǎn)生每VLP大約4000肽拷貝的總的載荷量。這個數(shù)字明顯大于以前報道的牛乳頭瘤病毒顆粒上攜帶的肽的總數(shù)(Chackerian等，2001)。在牛乳頭瘤病毒情況下，抗原性肽與鏈霉抗生物素蛋白(SA)融合，并且融合構(gòu)建體與生物素化VLPs相互作用。發(fā)現(xiàn)VLPs的L1蛋白質(zhì)提供約1.5SA四聚體，導致每L1單體約6肽的比例。這個載荷量是用我們的M2肽與HPV VLP的偶聯(lián)物發(fā)現(xiàn)的大約一半。有可能是SA四聚體的龐大阻礙了所報道的情況中較高的抗原載荷量。
通過測定肽偶聯(lián)產(chǎn)生的sSMCC活化的最初的位點有多少能監(jiān)測偶聯(lián)效率。氨基酸分析能提供TXA(凝血酸)的定量估計，其中凝血酸是sSMCC交聯(lián)劑在水解步驟中的產(chǎn)物。測定的TXA的平均量指示每L1蛋白質(zhì)約19個活化位點，提示肽偶聯(lián)中只涉及活化位點的58％(或11/19)。有可能一些活化位點可能與蛋白質(zhì)交聯(lián)中產(chǎn)生的Cys，Lys或His的鄰近側(cè)鏈相互作用。我們發(fā)現(xiàn)M2-HPV VLP和活化的/淬滅的(A/Q)HPV VLPs在還原條件下不能滲透10％SDS-Bis-Tris凝膠，即使在70℃下用變性溶液處理10分鐘也是如此。在加載到凝膠之前在相同的條件下處理之后，未活化的HPV VLPs給出預期活動性的蛋白質(zhì)帶。因此，顯示在馬來酰亞胺活化之后發(fā)生顯著VLP內(nèi)交聯(lián)。正如下面所看到的，VLP大小量度證明VLP內(nèi)交聯(lián)對VLP顆粒大小分布的影響可以忽略不計。
當考慮抗原性肽在HPV VLPs表面上的空間分布時，Lys側(cè)鏈的伯胺最可能是sSMCC活化位點。16型HPV的L1蛋白質(zhì)中有34個Lys，這些賴氨酸中有9個位于C-末端。圖25所示分子圖揭示HPV 16型VLPs上推定的活化位點平均散布在VLP表面。圖25顯示的Lys殘基的NZ原子朝著VLP外面取向。除了Lys 230，所有Lys殘基大于25％的表面暴露給溶劑。C-末端區(qū)非常柔順并且易接近蛋白酶，所以非常有可能位于該區(qū)的Lys的側(cè)鏈可被活化。遺憾的是，X-射線結(jié)構(gòu)中不能確定C-末端區(qū)(Chen等，2000)。
實施例21M2-HPV VLP偶聯(lián)物的藥學表征使用高放大倍數(shù)的JEOL 1200 EX透射式電子顯微鏡通過ELECTRONMICROSCOPYBIOSERVICES(MONROVIA，MD)進行電子顯微鏡測量。用2％磷鎢酸對空氣風干的樣品染色。90°室溫下在Malvern 4700儀器上進行動力學光散射測量。輸出功率是0.25W，孔徑100，總蛋白質(zhì)濃度0.1mg/mL。報道的大小代表Z-平均水動力學直徑，是從對相同樣品五個連續(xù)測量中獲得的數(shù)據(jù)的單模型分析得到的結(jié)果。在裝備有89090A型熱控制器的分光光度計HP8453上監(jiān)測HPV VLP或M2-EIPVVLP偶聯(lián)物溶液由熱引起的濁度增加。以約1.5℃/分鐘的速度，根據(jù)溫度從24℃升高至74℃，記錄350nm光密度變化。使用轉(zhuǎn)子An6Ti和雙扇形區(qū)室在分析型超速離心機Beckman XL-I上進行沉降速度實驗。轉(zhuǎn)子速度是10,000rpm并且通過280nm的吸光度觀察邊界變化。應用程序DCDT+(http//www jphilo.mailway.com)分析數(shù)據(jù)。在裝備有Shodex Ohpak SB-805柱的HP 1100系統(tǒng)上進行SEC-HPLC，并且洗脫緩沖液含有25mM磷酸鹽，0.75M NaCl pH7.0。
動力學光散射(DLS)測量表明M2-HPV VLP偶聯(lián)物的平均粒度稍微有所增加，從未處理的HPV VLP載體的約60nm至偶聯(lián)物M2-HPV VLP的約80nm。A/Q HPV VLP揭示平均流體動力學大小是約65nm，非常接近沒有處理的載體大小的值。SEC-HPLC結(jié)果(圖26A)呈現(xiàn)在與A/Q或未處理HPV VLP相比更短滯留時間洗脫的M2-HPV VLP偶聯(lián)物的主峰；其相應于比A/Q或未處理HPV VLP更大的偶聯(lián)物的粒度。色譜圖中小的肩峰揭示偶聯(lián)之前和之后聚集材料小級分的存在。最后，沉降速度數(shù)據(jù)(圖26B)呈現(xiàn)以比未處理的或A/Q HPV VLP更大的s*值為中心的M2-HPV VLP沉降系數(shù)分布。與單獨的載體相比偶聯(lián)物的沉降系數(shù)稍有增加，與DLS和色譜法測量揭示的偶聯(lián)時分子大小有小程度增加的結(jié)果相吻合。總的結(jié)果還提示偶聯(lián)過程中沒有發(fā)生顯著的VLP間交聯(lián)(并暗示聚集作用)。
EM(圖27)觀察到的M2-HPV VLP偶聯(lián)物呈現(xiàn)40-95nm之間的大小分布，平均值在大約65nm。這個值非常接近沒有處理的HPV VLP。然而，與沒有偶聯(lián)的載體相反，發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)物在M2-HPV VLP具有“微毛表觀”，這可能由于存在偶聯(lián)的肽。對HPV VLP也觀察到EM圖象中所示的多-VLP聚集體；因此它們可能是EM測量中樣品處理的結(jié)果，并且不代表溶液中的樣品。結(jié)論是，EM結(jié)果證明在化學偶聯(lián)過程中保留HPVVLP的形態(tài)，并且沒有發(fā)生HPV VLP骨架的主要破壞。
圖28給出對于處理的和沒有處理的HPV VLPs或偶聯(lián)物通過溶液濁度試驗測定的熱誘導聚集作用曲線。對于沒有處理的HPV VLPs，熱誘導聚集作用(根據(jù)由于光散射的光密度的增加所揭示的)在60℃變得可檢測，并且如果溫度進一步升高，則以突然的方式增加。對于A/QVLPs或M2-HPAT VLP偶聯(lián)物，溶液濁度在低于70℃時不存在可檢測聚集作用。非?？赡艿氖?，抗熱誘導聚集作用的增強的穩(wěn)定性是由于sSMCC處理引起的VLP內(nèi)交聯(lián)。通過sSMCC形成的附加的-YLP內(nèi)鍵可能阻止L1蛋白質(zhì)部分解折疊和接著的與疏水性表面的接觸。值得注意的是偶聯(lián)或sSMCC處理導致HPV VLPs表面性質(zhì)的改變，這可能部分有助于載體穩(wěn)定性的提高。
實施例22M2-HPV偶聯(lián)物的體外抗原性分析偶聯(lián)物與抗-HPV和抗-M2抗體相互作用的測定通過在Biacore 2000儀器上利用表面等離子共振技術評價HPV 16型VLPs和M2-HPV VLP偶聯(lián)物與M2或HPV 16型特異性抗體的結(jié)合?？?HPV抗體(構(gòu)象抗體H16.V5，H16.E70和線性表位結(jié)合抗體H16.J4)和抗-M2抗體與CM5型傳感器片表面上化學固定的大鼠抗-小鼠Fcγ抗體結(jié)合。
通過測定M2-HPV VLP偶聯(lián)物和A/Q HPV VLP與線性和構(gòu)象抗-HPV小鼠抗體(mAB)的結(jié)合，進一步研究抗原的空間分布。發(fā)現(xiàn)對于構(gòu)象或中和抗體H16.V5和H16.E70的結(jié)合親和性顯著降低，而與線性抗體H16.J4的結(jié)合只是稍微受偶聯(lián)作用影響。構(gòu)象抗體H16.V5和H16.E70的結(jié)合中涉及的表位包括Phe 50(White等，″Characterization ofa Major Neutralizing Epitope on Human Papillomavirus Type 16L1″，J.Virol.，Vol.73(6)，pp.4882-4889，1999)。如圖25所示，有6個Lys殘基，其在Phe 50側(cè)翼?？赡苁?，肽與Phe 50周圍任何Lys殘基的偶聯(lián)會干擾抗體結(jié)合。H16.J4結(jié)合VLP中L1蛋白質(zhì)頂部的環(huán)。沿著這個環(huán)只有一個Lys，它不會與肽偶聯(lián)，因為在M2-HPVVLP中不改變與H16.J4結(jié)合。
一個關注點是肽在載體表面是否以正確的3-D構(gòu)象存在。M2蛋白質(zhì)是甲型流感病毒的整合膜蛋白，并且選擇的抗原序列代表M2的胞外部分。M2蛋白質(zhì)是通過兩個二硫鍵鍵合的二聚體的同四聚體(Tian等，″Initial structural and dynamic characterization of theM2 protein transmembrane and amphipathic helices in lipidbilayer″，Prot.Sci.，Vol.12，pp.2597-2605，2003)，根據(jù)我們的知識，文獻中關于M2的胞外片段沒有報道詳細的3D-結(jié)構(gòu)。CD和熒光測定提示溶液中沒有偶聯(lián)的肽主要是隨機結(jié)構(gòu)構(gòu)象。雖然這些發(fā)現(xiàn)不贊成VLP表面上肽以確定的結(jié)構(gòu)構(gòu)象存在，但是表面等離子共振獲得的初步結(jié)果指明M2-HPV VLP偶聯(lián)物結(jié)合抗-M2抗體L18.H12和P6C8。在相似條件下使用HPV VLPs或(A/Q)HPV VLP沒有檢測到與抗-M2抗體的結(jié)合。
實施例23體內(nèi)免疫學評價從CHARLES RIVER LABORATORIES(Wilmington，MA)獲得4-10周的雌性Balb/c小鼠。間隔四周兩次注射用0.1mL I.M.送遞的吸附在Merck Aluminum Adjuvant(MAA)上的不同肽劑量的M2-HPVVLP。第二次注射后三周侵襲小鼠。3、30和300ng肽劑量相當于大約5、50和500ng的HPV VLP。每次注射送遞的MAA劑量是45mcg。每次注射后兩周測定抗-M2幾何平均滴度。對于M2抗體ELISA，每孔用50微升的M2肽，濃度是每毫升50mM碳酸氫鹽緩沖液，pH 9.6中4微克，在4℃下將96-孔板包被過夜。平板用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌并且在含有0.05％Tween-20(乳-PBST)的PBS中用3％脫脂乳封閉。用PBST將試驗樣品稀釋4倍。各個孔中加入100微升稀釋的樣品，培養(yǎng)板在24℃下溫育2小時后用PBST洗滌。每孔加入50微升乳PBST中的HRP-偶聯(lián)的二抗的預定的稀釋液，培養(yǎng)板在24℃下溫育1小時。洗滌培養(yǎng)板并且每孔加入100微升的100mM檸檬酸鈉，pH 4.5中的1mg/ml鄰-苯二胺二鹽酸。24℃下溫育30分鐘之后，通過加入100微升的1N H2SO4終止反應，并且使用ELISA平板讀數(shù)器在490nm下對平板讀數(shù)。抗體滴度定義為給出高于偶聯(lián)物對照孔平均值加兩個標準差的OD490nm值的最高稀釋度的倒數(shù)。對于病毒侵襲，小鼠適應的病毒A/Puerto Rico/8/34(PR8；H1N1)和X-31(H3N2)，PR8和A/Aichi/68(H3N2)之間的重分配體，在10天齡胚胎卵的尿囊液中繁殖。用氯胺酮/塞拉嗪麻醉小鼠。20微升帶有1LD90的病毒滴入到鼻孔中。侵襲之后，每天記錄小鼠成活率。如下計算死亡率(具體這天小鼠數(shù)目/第0天小鼠數(shù)目)×100％。
每次免疫之后兩周采取的血樣的ELISA測定結(jié)果表明偶聯(lián)物激發(fā)高抗-M2抗體應答(圖29A)。雖然滴度增加以系統(tǒng)方式隨M2肽劑量從3ng增加至300ng而增加，最低和最高劑量之間滴度的差異在一個對數(shù)單位之內(nèi)。這些結(jié)果表明納克劑量的抗原性肽當在合適的載體上呈遞時能誘導顯著免疫應答。值得注意的是，當M2肽在較大的載體上偶聯(lián)時，如上所述的腦膜炎奈瑟氏球菌(Neiserria meningitidis)的外膜蛋白質(zhì)復合體(OMPC)，在小鼠中發(fā)現(xiàn)相似的滴度。
圖29B給出小鼠抗致命侵襲的存活率。接受最低劑量(3ng)肽的組只顯示60％存活率，而接受更高劑量30或300ng肽的組的保護作用是100％。對照物侵襲之后沒有發(fā)現(xiàn)存活，證實病毒侵襲和疫苗保護都是有效的。正如上文對于M2-OMPC偶聯(lián)物疫苗所見到的，即使100％存活率的組侵襲之后也觀察到體重有一定程度減輕。結(jié)論是，用M2-HPV VLP偶聯(lián)物疫苗對Balb/c小鼠接種有效保護動物抵抗活病毒侵襲。
文獻中描述過載體-誘導的表位-特異性抑制(Rauly等，1999)。因此，未來試驗應該測定體內(nèi)抗-載體抗體的存在怎樣影響偶聯(lián)物的免疫原性。使用M2-OMPC偶聯(lián)物疫苗的實施例26的試驗表明預先接觸載體不消除但是稍微減小對流感肽偶聯(lián)物疫苗的應答。然而，它提示接下來的加強會克服預先存在的抗-載體抗體的任何有害作用。
盡管用載體預先免疫表現(xiàn)出損害抗體應答占絕大多數(shù)情況，人們不能簡單提出這樣一個因果關系，即抗-載體抗體的存在對偶聯(lián)物疫苗的免疫原性有副作用。據(jù)報道，對載體的預先免疫(破傷風類毒素)是有益的，不管是對抗-hCG(人絨毛膜促性腺激素(Shah等，“Priorimmunity to a carrier enhances antibody responses to hCG inrecipients of an hCG-carrier conjugate vaccine″，Vaccine，Vol.17，pp.3116-3123，1999)，還是對瘧疾肽(Lise等，″Enhancedepitopic response to a synthetic human malarial peptide bypreimmunization with tetanus toxid carrier″，Infect.Immun.，Vol.55，pp.2658-2661，1987)應答。在描述重組鞭毛作為流感肽表位的載體的不同情況下，發(fā)現(xiàn)預先暴露于載體沒有作用(Ben-Yedidia和Arnon，″Effect of pre-existing immunity on theefficacy of synthetic influenza vaccine″，Immunol.Lett.，Vol.64，pp.9-15，1998)?，F(xiàn)在還沒有確定，在HPV VLPs情況下，預先暴露于沒有處理形式(作為抗-HPV疫苗)或處理形式(作為載體呈遞不同抗原)的載體，在動物模型中是否有任何差異。發(fā)現(xiàn)H16.V5抗體完全阻斷反應性人血清的75％以上(Wang等，″A monoclonalantibody against intact human papillomavirus type 16 capsidsblocks the serological reactivity of most human sera″，J.Gen.Virol.，Vol.78，pp.2209-2215，1997)。偶聯(lián)的M2-HPV VLP確實表現(xiàn)出H16.V5抗體結(jié)合的構(gòu)象表位的事實提示，對于預先暴露于HPV的情況來說，抗原和作為載體的HPV VLPs之間通過化學偶聯(lián)制備的疫苗的載體抑制不是主要要考慮的。
這里給出的使用M2-OMPC的試驗證明，抗流感病毒致死侵襲的保護作用能通過施用免疫的動物血清而被動轉(zhuǎn)移，表明中和抗體足以帶來保護作用。因為相同的抗原與HPV載體偶聯(lián)，預期使用M2-HPV VLP偶聯(lián)物免疫可引發(fā)相似的體液應答。關于細胞應答，先前的實驗表明，根據(jù)通過CD4+T細胞IL-4產(chǎn)生所測定的，HPV 16型VLPs誘導強Th2應答(Tobery等，″Effect of vaccine delivery system on theinduction of HPV16 L1-specific humoral and cell-mediatedimmune responses in immunized rhesus macaques″，Vaccine，Vol.21，pp.1539-1547，2003)。還提出，HPV VLPs I呈遞的非構(gòu)象抗原序列可能增強細胞介導的免疫應答(Greenstone等，1998)。
實施例24血細胞凝集素-衍生的肽與VLP的偶聯(lián)作用肽Cys-A/H3/HA0-22與HPV VLP偶聯(lián)
Cys-A/H3/HAO0-22的肽序列相應于跨越甲型流感共有序列，H3亞型的血細胞凝集素蛋白質(zhì)前體HA0的切割位點的區(qū)。粗體表示的是分別在N-末端和在C-末端實現(xiàn)不同功能所要求的殘基在N-末端，作為間隔區(qū)的甘氨酸，作為pI-修飾基團的谷氨酸(如這里描述的)，和作為與馬來酰亞胺活化的HPV VLP載體反應，通過硫醚鍵生成肽-VLP偶聯(lián)物的配體的半胱氨酸；在C-末端作為pI-修飾基團的谷氨酸。
Cys-A/H3/HA0-22的肽合成在先鋒肽合成儀(APPLIED BIOSYSTEMS，F(xiàn)oster City，CA)上利用Fmoc/t-Bu化學通過固相法合成肽。為了制備肽C-末端酸，在事先用DIPCDI/HOBt作為活化劑用4-羥甲基苯氧基乙酸接頭衍生化的Champion PEG-PS樹脂(BIOSEARCH TECHNOLOGIES，INC.，Novato，CA)上合成肽。第一個氨基酸，谷氨酸，在催化量的DMAP(二甲基氨基吡啶)存在下，用DIPC(二異丙基碳二亞胺)將其活化為對稱酸酐，并且酯化成樹脂。通過在DMF中與10倍過量的乙酸酐反應在組裝的肽末端進行酰化反應。
所有的酰化反應用比樹脂游離氨基4倍過量的活化氨基酸進行60分鐘。用等摩爾量的HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓六氟磷酸酯)和2倍摩爾過量的DIEA(N，N-二異丙基乙胺)活化氨基酸。一般側(cè)鏈保護基團是對于Asp，Glu，Ser，Thr和Tyr是叔丁基；對于Cys，Asn，His和Gln是三苯甲基；對于Arg是2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?；對于Lys，Trp是叔丁氧羰基。在組裝完成時，室溫下，用88％TFA，5％苯酚，2％三異丙基硅烷和5％水(Sole，N.A.，和Barany，G.(1992)J.Org.Chem.，57，5399-5403)對干燥肽-樹脂處理1.5小時。
將樹脂過濾，為了使肽沉淀，向冷的甲基叔丁基醚加溶液。將肽離心之后，用新鮮的冷的甲基叔丁基醚洗滌肽沉淀物，去除有機清除劑。將該過程重復兩次。將最終的沉淀物干燥，重新懸浮于H2O，20％乙腈，并且凍干。
利用半制備RCMDELTA-PAKTM(WATERS MILORD，MA)C18柱(40×200mm，15微米)通過反相HPLC純化粗制肽，使用洗脫劑(A)0.1％三氟乙酸水溶液和(B)0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。我們使用下面的B梯度30％-45％經(jīng)20分鐘，流速80ml/min。在ULTRASHPERE(BECKMAN，F(xiàn)ULLERTON，CA)，C18柱，25×4.6mm，5微米上進行分析HPLC，用下面的B梯度30％-45％B，以20′，流速1ml/min。通過在PERKIN-ELMER(WELLESLEY，MA)API-100上進行電子噴射質(zhì)譜來表征純化的肽理論平均mw是2293.4Da，實測值2293.8Da。
肽Cys-A/H3/HA0-22與HPV VLP的偶聯(lián)以0.5M NaCl，20mM His緩沖液，0.026％PS80，pH 6.2中0.869mg/ml的濃度制備HPV VLP16無菌貯存液。使用300K MWCODISPODIALYZER(SPECTRUM LABORATORIES INC.，Rancho DominguezCA)，使用2升的0.5M NaCl，0.026 PS80的6-緩沖液改變(每2小時)4℃下將2.5ml HPV VLP貯存液等份透析，以去除可能干擾活化反應的His緩沖液。向HPV VLP溶液(0.474mg/mL，4.58mL)加入0.5MNaHCO3(0.506mL)，達到50mM，pH 8.2的最終濃度。向該溶液滴加0.156mL的20μM雜雙功能交聯(lián)劑溶液，交聯(lián)劑是4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯(sSMCC，PIERCE CHEMICALCO，ROCKFORD，IL)，其相當于比可利用的賴氨酸殘基過量4倍。溶液在4℃下避光老化2小時之后，使用300K MWCO DISPODIALYZER(SPECTRUM LABORATORIES INC.，Rancho Dominguez CA)，使用2升的10mM His緩沖液，0.5M NaCl，0.015％PS80，pH 6.2的6-緩沖液改變(至少每2小時)4℃下將活化的HPV VLP透析，去除過量試劑。透析后回收共6.1mL，0.356mg/m1活化的HPV VLP(aVLP)。
在脫氣的0.1M His，0.5M NaCl，0.015％PS80 pH 7.2溶液中制備0.5mg/ml含有Cys肽配體Cys-A/H3/HA0-22的原液，并且0.2微米過濾。通過Ellman分析(Ellman，G.L.(1959)，Arch.Biochem.Biophys.，82，70)測定肽溶液的硫醇含量，并且顯示218μM的-SH滴度。
為了確定能安全摻入VLP上并且不引起沉淀的肽配體的最大量，首先以小規(guī)模試驗進行偶聯(lián)反應，其中VLP與漸增量的肽配體一起溫育。VLP上能摻入的馬來酰亞胺基團最大數(shù)目受到其外表面上展示的從而對于化學修飾可獲得的賴氨酸殘基數(shù)目的限制。根據(jù)L1蛋白質(zhì)的X-射線結(jié)構(gòu)，對于偶聯(lián)可獲得0.36微摩爾賴氨酸/毫克VLP。如果考慮對于VLP是20×106Da平均MW，這相當于7200賴氨酸摩爾/VLP摩爾。VLP與每VLP摩爾以下摩爾過量的肽一起溫育1000，2000，4000，6000。1小時之后，樣品與VLP樣品相比較，檢查任何沉淀的存在或者濁度。只有當使用至多1000摩爾過量(Cys-肽摩爾數(shù)/VLP摩爾)進行1小時溫育反應時，偶聯(lián)反應得到可溶性產(chǎn)物。高于該比例，發(fā)生VLP溶液的完全沉淀。
以這些發(fā)現(xiàn)為基礎進行大規(guī)模反應向3.5mL(1.25mg)的10mMHis，0.5M NaCl，加入56微升NaOH 0.25M，將pH提高至7.2。向其中加入2.08mL的肽原液，輕輕渦流下滴加，相當于1000摩爾過量的肽摩爾數(shù)/VLP摩爾。馬來酰亞胺活化的VLP溶液樣品留作測定最終偶聯(lián)物的肽載荷量的空白樣品。讓偶聯(lián)反應混合物4℃下避光老化17小時。然后4℃下避光用β-巰基乙醇將VLP上所有殘留的馬來酰亞胺基團淬滅1小時至15mM終濃度(加入4微升總體積)。4℃下使用300KMWCO DISPODIALYZER(SPECTRUM LABORATORIES，INC.，RANCHODOMINGUEZ，CA)，用1升0.5M NaCl，0.015％PS80將溶液透析4次，5小時/更換一次，去除沒有偶聯(lián)的肽和β-巰基乙醇。通過BCA-分析(PIERCE CHEMICAL CO.，ROCKFORD，IL)測定濃度，對于VLP-A/H3/HA0-22是0.131mg/mL(4.5mL)。
110℃下用共沸HCl，在抽空的密封玻璃試管中將偶聯(lián)物和OMPC樣品水解70小時。通過氨基酸分析測定氨基酸成分。通過將偶聯(lián)物氨基酸組成與VLP載體的和肽配體的相比較，并且通過對數(shù)據(jù)的多重回歸分析，最小二乘分析(Shuler等Journal of Immunological Methods，156，(1992)137-149)，測定肽與OMPC蛋白質(zhì)的偶聯(lián)載荷量。對于VLP和A/H3/HA0-22之間的偶聯(lián)，獲得770的摩爾比(肽/VLP摩爾/摩爾)。
實施例25M2偶聯(lián)物疫苗對病毒脫落的抑制對如實施例5所描述的用M2肽SEQ ID NO1制備M2-KLH偶聯(lián)物疫苗評價其對小鼠呼吸道中病毒復制的影響(圖30)。在第0、14和18天，用20微克偶聯(lián)物疫苗M2-KLH加20微克QS21(M2-KLH/QS21)或者只有20微克QS21(QS21)對每組Balb/c小鼠肌內(nèi)接種。第三次接種之后三周，用75 TCID50的A/HK/68重分配體的鼻內(nèi)侵襲小鼠。侵襲之后，在第1，3，5，7或9天解剖每組的8只小鼠，收集鼻和肺清洗物。測定各時間點的病毒滴度。與對照小鼠相比，接受免疫的小鼠鼻和肺樣品中有總的較低的病毒滴度。肺中病毒脫落減少更明顯。對照組和疫苗組之間肺內(nèi)病毒脫落差異是統(tǒng)計學顯著的(p＜0.05)。
實施例26恒河猴的M2偶聯(lián)物疫苗的免疫原性對根據(jù)實施例5用M2肽SEQ ID NO2制備的M2-OMPC偶聯(lián)物進行未接觸過抗原的和OMPC-免疫恒河猴試驗(圖31)。OMPC用作幾種細菌多糖偶聯(lián)物疫苗的載體，包括許可的嗜血桿菌流感疫苗(PEDVAXHIB，MERCK & CO.，INC.，WEST POINT，PA)。因此，該項實驗分析了對OMPC預先存在的免疫性是否明顯影響流感疫苗有效性。
將三十只猴子分成兩組，每組15只。為了誘導抗-OMPC抗體應答，用兩個人劑量的PEDVAXHIB對其中的一組預先接種。接受PEDVAXHIB免疫的猴子在M2-OMPC免疫之前六周產(chǎn)生14,703的OMPC GMTs。
然后將OMPC-免疫的猴子和未接觸過抗原的猴子分別分成五組，每組三只猴子，并且用在明礬中配制的10微克，30微克，100微克，和300微克的M2-OMPC偶聯(lián)物疫苗(以總的偶聯(lián)物蛋白質(zhì)為基礎的劑量)，或者100微克在明礬加QS21中配制的疫苗肌內(nèi)接種。應用0-，8-和25-周方案進行免疫。以4-5周間隔采集血樣，共33周。
單次接種之后，M2-OMPC疫苗激發(fā)顯著M2-特異性滴度。在第二次和第三次接種之后，這些應答進一步加強。在OMPC-免疫的和未接觸過OMPC-的猴子中沒有明顯的劑量影響，最低劑量，10微克，激發(fā)M2-特異性滴度，和最高劑量300微克激發(fā)的相當。在明礬加QS21中配制的疫苗表現(xiàn)出比相同劑量的在單獨的明礬中配制的偶聯(lián)物的抗體滴度高5-10倍。另外，接受明礬加QS21中配制的疫苗的猴子的抗體滴度表現(xiàn)出比接受在單獨的明礬中配制的疫苗的猴子更低的減弱速度。
當比較OMPC-免疫的和未接觸過OMPC的猴子時，第一次注射之后，前者表現(xiàn)出比未接觸過抗原的猴子低大約10倍的滴度。這表明預先存在載體的抗體對M2-OMPC偶聯(lián)物疫苗的免疫原性沒有負面影響。然而，預先存在的對載體的免疫性的有害影響通過接下來的加強免疫而被克服。第二次和第三次接種之后，兩個研究方向的組達到相當?shù)目?M2滴度。因此，結(jié)果表明，M2-OMPC疫苗對于非人靈長類是免疫原性的，不管是否預先存在載體的抗體。在另一項猴子研究中，我們還分析了涉及PEDVAXHIB和M2-OMPC偶聯(lián)物疫苗共同給藥的情況，并且發(fā)現(xiàn)對反應于M2肽的總的抗體應答沒有負面影響。因此，這種疫苗能對預先使用過其他基于OMPC的偶聯(lián)物疫苗的群體使用。
序列表<110>Merck & Co.，Inc.
Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P.Angeletti S.P.A.
<120>流感病毒疫苗<130>20963Y<150>60/530,690<151>2003-12-18<150>60/452,749<151>2003-03-07<160>168<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>23<212>PRT<213>流感病毒<400>1Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys1 5 10 15Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp20<210>2<211>23<212>PRT<213>流感病毒<400>2Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser1 5 10 15Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp20<210>3<211>23<212>PRT
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20 25<210>126<211>21<212>PRT<213>流感病毒<400>126Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala1 5 10 15Gly Phe Leu Glu Glu20<210>127<211>22<212>PRT<213>流感病毒<400>127Cys Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile1 5 10 15Ala Gly Phe Leu Glu Glu20<210>128<211>23<212>PRT<213>流感病毒<400>128Cys Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala1 5 10 15Ile Ala Gly Phe Leu Glu Glu20<210>129<211>21<212>PRT<213>流感病毒<400>129Glu Gly Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala1 5 10 15Gly Phe Leu Glu Glu
20<210>130<211>22<212>PRT<213>流感病毒<400>130Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile1 5 10 15Ala Gly Phe Leu Glu Glu20<210>131<211>22<212>PRT<213>流感病毒<400>131Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile1 5 10 15Ala Gly Phe Leu Glu Glu20<210>132<211>22<212>PRT<213>流感病毒<400>132Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile1 5 10 15Ala Gly Phe Leu Glu Glu20<210>133<211>22<212>PRT<213>流感病毒<400>133Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile1 5 10 15Ala Gly Phe Leu Glu Glu
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1 5 10<210>143<211>19<212>PRT<213>流感病毒<400>143Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala1 5 10 15Gly Phe Leu<210>144<211>18<212>PRT<213>流感病毒<400>144Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala1 5 10 15Gly Phe<210>145<211>17<212>PRT<213>流感病毒<400>145Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala1 5 10 15Gly<210>146<211>16<212>PRT<213>流感病毒<400>146Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala1 5 10 15
<210>147<211>15<212>PRT<213>流感病毒<400>147Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile1 5 10 15<210>148<211>14<212>PRT<213>流感病毒<400>148Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala1 5 10<210>149<211>13<212>PRT<213>流感病毒<400>149Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly1 5 10<210>150<211>12<212>PRT<213>流感病毒<400>150Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe1 5 10<210>151<211>11<212>PRT<213>流感病毒<400>151Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe
1 5 10<210>152<211>10<212>PRT<213>流感病毒<400>152Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly1 5 10<210>153<211>9<212>PRT<213>流感病毒<400>153Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg1 5<210>154<211>22<212>PRT<213>流感病毒<400>154Ala Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile1 5 10 15Ala Gly Phe Leu Glu Glu20<210>155<211>22<212>PRT<213>流感病毒<400>155Glu Gly Ala Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile1 5 10 15Ala Gly Phe Leu Glu Glu20<210>156
<211>22<212>PRT<213>流感病毒<400>156Glu Gly Pro Ala Ala Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile1 5 10 15Ala Gly Phe Leu Glu Glu20<210>157<211>22<212>PRT<213>流感病毒<400>157Glu Gly Pro Ala Lys Ala Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile1 5 10 15Ala Gly Phe Leu Glu Glu20<210>158<211>22<212>PRT<213>流感病毒<400>158Glu Gly Pro Ala Lys Leu Ala Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile15 10 15Ala Gly Phe Leu Glu Glu20<210>159<211>22<212>PRT<213>流感病毒<400>159Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Ala Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile1 5 10 15Ala Gly Phe Leu Glu Glu20<210>160
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<211>22<212>PRT<213>流感病毒<400>164Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ala1 5 10 15Ala Gly Phe Leu Glu Glu20<210>165<211>22<212>PRT<213>流感病毒<400>165Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile1 5 10 15Ala Gly Ala Leu Glu Glu20<210>166<211>22<212>PRT<213>流感病毒<400>166Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile1 5 10 15Ala Gly Phe Ala Glu Glu20<210>167<211>22<212>PRT<213>流感病毒<400>167Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile1 5 10 15Ala Gly Phe Leu Ala Glu20<210>168
<211>22<212>PRT<213>流感病毒<400>168Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile1 5 10 15Ala Gly Phe Leu Glu Ala20
權(quán)利要求
1.一種M2肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，或者其藥學可接受鹽，包含具有甲型流感病毒M2蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域衍生的氨基酸序列的多個肽，所述多個肽與載體蛋白質(zhì)的表面共價連接，并且每個鍵位于肽的一個末端和所述蛋白質(zhì)的表面上的反應位點之間，其中所述載體蛋白質(zhì)選自腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白質(zhì)復合體，破傷風類毒素，乙肝表面抗原，匙孔血藍蛋白，輪狀病毒衣殼蛋白，和?；蛉巳轭^瘤病毒VLP的L1蛋白。
2.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中肽的氨基酸序列選自SEQ ID NOs1，2，10和39。
3.權(quán)利要求2的偶聯(lián)物，其中所述肽具有SEQ ID NO39的序列。
4.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中所述載體蛋白質(zhì)是腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白質(zhì)復合體。
5.權(quán)利要求4的偶聯(lián)物，其中所述肽具有SEQ ID NO39的氨基酸序列，并且所述免疫原性蛋白質(zhì)是腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白質(zhì)復合體。
6.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中肽與蛋白質(zhì)通過硫醚接頭共價連接。
7.一種用于預防或改善哺乳動物感染甲型流感病毒的疫苗，所述疫苗含有至少一種權(quán)利要求1的肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，佐劑和生理可接受載體。
8.權(quán)利要求7的疫苗，其中所述佐劑包括含有鋁的佐劑。
9.權(quán)利要求7的疫苗，其中所述佐劑包括鋁和QS21。
10.權(quán)利要求7的疫苗，其中所述肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物包括多個具有SEQ ID NO39的氨基酸序列的肽，并且所述蛋白質(zhì)是腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白質(zhì)復合體。
11.一種對患者誘導免疫應答的方法，包括用有效量的權(quán)利要求1的偶聯(lián)物對患者接種的步驟。
12.權(quán)利要求11的方法，其中患者是人。
13.一種HA0肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，或者其藥學可接受鹽，包含具有甲型流感病毒HA0蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列的多個肽，所述多個肽與載體蛋白質(zhì)的表面共價連接，并且每個鍵位于肽的一個末端和所述蛋白質(zhì)的表面上的反應位點之間。
14.權(quán)利要求13的偶聯(lián)物，其中肽的氨基酸序列選自SEQ ID NOs59，60，61，和62。
15.權(quán)利要求14的偶聯(lián)物，其中所述肽具有SEQ ID NO62的序列。
16.權(quán)利要求13的偶聯(lián)物，其中所述載體蛋白質(zhì)選自腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白質(zhì)復合體，破傷風類毒素，乙肝表面抗原，乙肝核心抗原，匙孔血藍蛋白，輪狀病毒衣殼蛋白，和?；蛉巳轭^瘤病毒VLP的L1蛋白。
17.權(quán)利要求16的偶聯(lián)物，其中所述肽具有SEQ ID NO62的氨基酸序列，并且所述免疫原性蛋白質(zhì)是腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白質(zhì)復合體。
18.權(quán)利要求13的偶聯(lián)物，其中肽與蛋白質(zhì)通過硫醚接頭共價連接。
19.一種用于預防或改善受試者感染甲型流感病毒的疫苗，所述疫苗含有至少一種權(quán)利要求13的肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，佐劑和生理可接受載體。
20.權(quán)利要求19的疫苗，其中所述佐劑包括含有鋁的佐劑。
21.權(quán)利要求19的疫苗，其中所述佐劑包括鋁和QS21。
22.權(quán)利要求19的疫苗，其中所述肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物包括多個具有SEQ ID NO62的氨基酸序列的肽，并且所述蛋白質(zhì)是腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白質(zhì)復合體。
23.一種對患者誘導免疫應答的方法，包括用有效量的權(quán)利要求13的偶聯(lián)物對患者接種的步驟。
24.權(quán)利要求23的方法，其中患者是人。
25.一種HA0肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，或者其藥學可接受鹽，包含具有乙型流感病毒的HA0蛋白質(zhì)衍生的氨基酸序列的多個肽，所述多個肽與載體蛋白質(zhì)的表面共價連接，并且每個鍵位于肽的一個末端和所述蛋白質(zhì)的表面上的反應位點之間。
26.權(quán)利要求25的偶聯(lián)物，其中肽的氨基酸序列選自SEQ ID NOs60，126-168。
27.權(quán)利要求26的偶聯(lián)物，其中所述肽具有SEQ ID NO60的序列。
28.權(quán)利要求25的偶聯(lián)物，其中所述載體蛋白質(zhì)選自腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白質(zhì)復合體，破傷風類毒素，乙肝表面抗原，乙肝核心抗原，匙孔血藍蛋白，輪狀病毒衣殼蛋白，和?；蛉巳轭^瘤病毒VLP的L1蛋白。
29.權(quán)利要求28的偶聯(lián)物，其中所述肽具有SEQ ID NO60的氨基酸序列，并且所述免疫原性蛋白質(zhì)是腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白質(zhì)復合體。
30.權(quán)利要求25的偶聯(lián)物，其中肽與蛋白質(zhì)通過硫醚接頭共價連接。
31.一種用于預防或改善受試者感染乙型流感病毒的疫苗，所述疫苗含有至少一種權(quán)利要求25的肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，佐劑和生理可接受載體。
32.權(quán)利要求31的疫苗，其中所述佐劑包括含有鋁的佐劑。
33.權(quán)利要求31的疫苗，其中所述佐劑包括鋁和QS21。
34.權(quán)利要求31的疫苗，其中所述肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物包括多個具有SEQ ID NO60的氨基酸序列的肽，并且所述蛋白質(zhì)是腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白質(zhì)復合體。
35.一種對患者誘導免疫應答的方法，包括用有效量的權(quán)利要求25的偶聯(lián)物對患者接種的步驟。
36.權(quán)利要求35的方法，其中患者是人。
37.一種用于預防或改善患者感染流感病毒的疫苗，所述疫苗含有至少一種權(quán)利要求1的肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，至少一種權(quán)利要求13的肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，佐劑和生理可接受載體。
38.一種用于預防或改善患者感染流感病毒的疫苗，所述疫苗含有至少一種權(quán)利要求1的肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，至少一種權(quán)利要求25的肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，佐劑和生理可接受載體。
39.一種用于預防或改善患者感染流感病毒的疫苗，所述疫苗含有至少一種權(quán)利要求1的肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，至少一種權(quán)利要求13的肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，至少一種權(quán)利要求25的肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，佐劑和生理可接受載體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗流感病毒感染引起的疾病的疫苗，和免疫接種方法。所述疫苗含有與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)的從流感病毒的M2和/或HA蛋白質(zhì)衍生的肽。
文檔編號C12P19/00GK1756562SQ200480006107
公開日2006年4月5日 申請日期2004年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月7日
發(fā)明者V·M·加斯基, R·約內(nèi)斯庫, X·梁, C·T·普日西基, L·施, J·W·希弗, E·比安基, P·因加利內(nèi)拉, A·佩西 申請人:麥克公司, P·安杰萊蒂分子生物學研究所