專利名稱：無動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在沒有一級(jí)動(dòng)物來源的外源成分的條件下培養(yǎng)動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物的細(xì)胞的方法，具體地講，用于培養(yǎng)動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物或優(yōu)選人，二倍體貼壁依賴性細(xì)胞，并且涉及基本上不含一級(jí)動(dòng)物來源的外源成分的、適合執(zhí)行所述方法的細(xì)胞培養(yǎng)基。具體地講，本發(fā)明涉及包括至少一種，更優(yōu)選若干種，無外源動(dòng)物的生長因子的細(xì)胞培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基特別適合培養(yǎng)動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，或優(yōu)選人類二倍體貼壁依賴性細(xì)胞，例如，與用于所述細(xì)胞類型的補(bǔ)充了合適血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基具有等同的性能。本發(fā)明還涉及在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人二倍體貼壁依賴性細(xì)胞的方法，包括將非動(dòng)物來源的胰蛋白酶代用品用于使細(xì)胞傳代。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)病毒，和人病毒疫苗等的方法。
背景技術(shù)：
貼壁依賴性細(xì)胞，特別是二倍體貼壁依賴性細(xì)胞被用于多種方法中用于大規(guī)模生物方法中生產(chǎn)保健品，如疫苗和重組蛋白，用于制備用來治療人體損傷的人工組織，用于實(shí)驗(yàn)研究，用于體外毒理學(xué)研究，用于篩選和測試新的藥物等。
通常，貼壁依賴性細(xì)胞是在含有血清或作為血清代用品的動(dòng)物來源的成分，如牛血清白蛋白(BSA)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。血清或動(dòng)物來源的成分還用在細(xì)胞轉(zhuǎn)種和細(xì)胞低溫貯藏期間。血清是代謝物，激素，維生素，鐵(轉(zhuǎn)鐵蛋白)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，附著因子(例如，粘連蛋白)，擴(kuò)散和生長因子的主要來源。它是很多動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物在體外生長所需要的。另外，血清起著抗多種干擾和毒性作用，如pH改變，重金屬離子的存在，蛋白質(zhì)水解活性，或內(nèi)毒素的緩沖劑的作用。白蛋白是血清的主要蛋白成分，并且能產(chǎn)生若干種作用，這些作用導(dǎo)致了細(xì)胞在培養(yǎng)物中的生長和維持它起著多種小分子的載體蛋白的作用，并且起著脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用，這些脂肪酸是細(xì)胞所必需的，但是在非結(jié)合形式下是有毒的。
二倍體貼壁依賴性細(xì)胞通常在塑料表面，玻璃表面或微載體上生長。所述細(xì)胞通過諸如粘連蛋白的附著因子附著和擴(kuò)散(F.Grinnel &M.K.Feld Cell，1979，17，117-129)。胰蛋白酶是在細(xì)胞傳代期間用于細(xì)胞脫離的最常見的動(dòng)物來源的成分之一(M.Schrder & P.Friedl，Methods in Cell Science，1997，19，137-147；O.W.Mertens，Dev Biol Stand.，1999，Vol 99，pp167-180)。在細(xì)胞脫離之后，必須通過血清或大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)它進(jìn)行抑制，以便避免細(xì)胞損傷。在脫離之后，細(xì)胞以低密度接種在新的表面上，在這里，它們能夠增殖，并且形成匯合的細(xì)胞層，然后進(jìn)行下一次轉(zhuǎn)種。對(duì)粘附細(xì)胞進(jìn)行傳代的目的是增殖，并且獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞，以便實(shí)施上述方法。
有多種與將血清和動(dòng)物來源的成分用于上述方法中相關(guān)的缺陷，主要是它們的成本，它們的組成在不同批次之間的波動(dòng)性，它們與被外來制劑污染的較高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性，以及隨后在后續(xù)處理中遇到的難題(例如，純化，以便消除血清-蛋白或所述導(dǎo)入的動(dòng)物來源的蛋白)。另外，據(jù)報(bào)導(dǎo)無血清培養(yǎng)基不適合貼壁依賴性二倍體細(xì)胞(O.W.Mertens，Dev Biol Stand.，1999，Vol 99，pp 167-180；O.W.Merten，Dev.Biol.2002，101，233-257)。
業(yè)已開發(fā)出了用于培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞具體地講，用于培養(yǎng)二倍體貼壁依賴性細(xì)胞的多種低血清或無血清培養(yǎng)基配方。(M.Kan & I.Yamane，Journal of Cellular Physiology，1982，111，155-162；S.P.Forestell等Biotechnology and Bioenineering，1992，Vol 40，pp1039-1044)。用所述培養(yǎng)基進(jìn)行的嘗試一直是令人不滿意的，主要是因?yàn)槲崔D(zhuǎn)化過的二倍體貼壁依賴性細(xì)胞需要相當(dāng)復(fù)雜的無血清培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基補(bǔ)充了若干種生長因子和激素，并且還因?yàn)閷?duì)于所述細(xì)胞的生產(chǎn)過程來說，通常至少在生物物質(zhì)生產(chǎn)階段使用血清(O.W.Merten，Dev.Biol.2002，101，233-257)。另外，所述培養(yǎng)基仍然含有動(dòng)物來源的成分，如BSA，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，生長因子，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，氨基酸，維生素等。在開發(fā)用于貼壁依賴性細(xì)胞的完全不含動(dòng)物來源的成分的培養(yǎng)基配方方面所做的努力非常有限。根據(jù)報(bào)導(dǎo)，大部分無動(dòng)物的配方不能夠支持與用血清觀察到的生長速度相當(dāng)?shù)募?xì)胞生長速度，并且只能夠在出現(xiàn)早期衰老之前進(jìn)行幾個(gè)轉(zhuǎn)種步驟(B.J.Walthall & R.Ham Experimental Cell Research(1981)134 303-311)。另外，來自貼壁依賴性細(xì)胞的原代細(xì)胞培養(yǎng)物幾乎總是與使用動(dòng)物來源的蛋白酶，主要是絲氨酸-蛋白酶分離細(xì)胞層或組織相關(guān)，因此，涉及到由外來病毒污染所述細(xì)胞培養(yǎng)物的危險(xiǎn)，并且導(dǎo)致細(xì)胞生長的不可接受的波動(dòng)性，因?yàn)椴煌沃g的蛋白酶的酶活性有所不同。例如，將豬/牛胰蛋白酶用于傳代貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物是眾所周知的技術(shù)(O.W.Mertens，Cytotechnology，2000，34，181-183)。
因此，在二倍體貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物領(lǐng)域，需要開發(fā)基本上不含，優(yōu)選完全缺乏動(dòng)物來源的成分，并且，適合執(zhí)行二倍體貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物的方法的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基與補(bǔ)充了合適血清的細(xì)胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基具有等同的性能，所述性能是指，例如，與用含有血清的方法獲得的細(xì)胞具有等同的細(xì)胞生長速度，衰老，細(xì)胞形態(tài)學(xué)，病毒或蛋白生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
業(yè)已發(fā)現(xiàn)使用基本上不含一級(jí)動(dòng)物來源的外源成分并且包括至少一種非動(dòng)物二級(jí)來源的外源生長因子的細(xì)胞培養(yǎng)基，可以有利地取代常規(guī)培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基，已知這些培養(yǎng)基含有來自外源一級(jí)和/或二級(jí)動(dòng)物來源的成分。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)方法涉及使用所述培養(yǎng)基，并且還包括對(duì)動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，或優(yōu)選人類細(xì)胞，優(yōu)選貼壁依賴性細(xì)胞傳代一次或多次，傳代是在存在不是來自動(dòng)物來源的蛋白酶代用品的條件下進(jìn)行的，并且還能夠以與用傳統(tǒng)方法獲得的水平相當(dāng)?shù)乃酵瓿?，傳統(tǒng)方法是使用補(bǔ)充了合適血清的細(xì)胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行的。
因此，第一方面，本發(fā)明涉及基本上不含，優(yōu)選缺少一級(jí)動(dòng)物來源的外源成分的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中包含至少一種，優(yōu)選一種以上選自下組的非動(dòng)物二級(jí)來源的外源生長因子EGF，F(xiàn)GF，三-碘-L tyronine和氫化可的松以及非動(dòng)物二級(jí)來源的IGF-1和/或胰島素中的至少一種。所述培養(yǎng)基適合培養(yǎng)動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，或優(yōu)選人類貼壁依賴性細(xì)胞，優(yōu)選二倍體細(xì)胞，例如，與補(bǔ)充了合適血清的細(xì)胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基具有等同的性能。
本發(fā)明的培養(yǎng)基任選還包括非動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。優(yōu)選存在所述蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物優(yōu)選是小麥水解產(chǎn)物。
另外，本發(fā)明涉及將所述培養(yǎng)基用于培養(yǎng)動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，或優(yōu)選人類貼壁依賴性細(xì)胞，優(yōu)選貼壁依賴性二倍體細(xì)胞，所述細(xì)胞具有與補(bǔ)充了合適血清的細(xì)胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基獲得的細(xì)胞等同的性能。
我們業(yè)已出乎意料地確定了本發(fā)明的培養(yǎng)基特別適合培養(yǎng)動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，或優(yōu)選人類貼壁依賴性細(xì)胞，特別是貼壁依賴性二倍體細(xì)胞，例如，與用補(bǔ)充了動(dòng)物來源的成分如血清的細(xì)胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基獲得的性能相當(dāng)?shù)男阅?例如，細(xì)胞生長速度，衰老，細(xì)胞形態(tài)學(xué)，病毒或蛋白生產(chǎn))。
因此，本發(fā)明特別涉及在本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中生產(chǎn)動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，或優(yōu)選人類貼壁依賴性細(xì)胞，優(yōu)選二倍體細(xì)胞的方法，所述方法包括a)將所述細(xì)胞接種在上文所述的培養(yǎng)基中，并且讓所述細(xì)胞附著在基質(zhì)上；b)收獲來自步驟a)的條件培養(yǎng)基，并且從它的基質(zhì)上分離細(xì)胞層，并且用非動(dòng)物來源的蛋白酶解離細(xì)胞，以便形成細(xì)胞懸浮液；c)將步驟b)的細(xì)胞懸浮液接種到裝在包括附著支持物的培養(yǎng)裝置中的所述培養(yǎng)基中，使得細(xì)胞可以附著；和d)在所述培養(yǎng)基中生長所述細(xì)胞。
可以重復(fù)b)-d)若干次。
所述方法還可任選地包括冷凍從步驟b)中收獲的細(xì)胞的步驟，以便產(chǎn)生細(xì)胞庫。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在不含外源的動(dòng)物來源的成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞之前，所述用于生產(chǎn)細(xì)胞的方法不需要任何適應(yīng)步驟，并且，所述細(xì)胞的衰老不受該適應(yīng)步驟缺乏的影響。
因此，本發(fā)明的另一方面是提供細(xì)胞系，具體地講，提供動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，或優(yōu)選人類二倍體貼壁依賴性細(xì)胞系，它適合在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生長，并且具體地講，提供細(xì)胞系，特別是提供動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，或優(yōu)選人類二倍體貼壁依賴性細(xì)胞系，它適合生產(chǎn)生物學(xué)活性產(chǎn)物，優(yōu)選病毒，特別是用作疫苗的活病毒。
本發(fā)明還涉及在適合病毒生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)基中，在動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物或優(yōu)選人類貼壁依賴性細(xì)胞中生產(chǎn)病毒的方法，所述培養(yǎng)基缺少一級(jí)動(dòng)物來源的成分，并且包括至少一種非動(dòng)物二級(jí)來源的外源生長因子，并且任選包括一種非動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，所述方法包括以下步驟a)用所述病毒感染所述細(xì)胞b)繁殖所述病毒，和c)收獲所述病毒。
所述方法可以包括對(duì)收獲的病毒進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)純化步驟。所述病毒能夠與可以藥用的載體，賦形劑和/或佐劑適當(dāng)?shù)嘏渲瞥梢呙纭?br> 詳細(xì)說明在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基是基本上不含，優(yōu)選完全缺乏一級(jí)動(dòng)物來源的外源成分的，優(yōu)選它不含一級(jí)和二級(jí)動(dòng)物來源的外源動(dòng)物來源的成分。所述培養(yǎng)基適當(dāng)?shù)剡m合培養(yǎng)動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，或優(yōu)選人貼壁依賴性細(xì)胞，特別是貼壁依賴性二倍體細(xì)胞，例如，其性能，例如，細(xì)胞生長速度，細(xì)胞形態(tài)學(xué)，衰老或病毒生產(chǎn)，與用補(bǔ)充了合適血清的細(xì)胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基獲得的細(xì)胞的性能相當(dāng)。例如，用于動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物或優(yōu)選人類細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以從ATCC目錄中查閱到，并且，在表1中另外提供了用于特定細(xì)胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的例子。用于比較目的的血清通常是牛血清，特別是胎牛血清。因此，最好在與表1所示基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行比較時(shí)評(píng)估等同性，并且該基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有牛血清，通常其濃度為10％v/v。
表1

*按照ATCC或NIA的說明，補(bǔ)充了氨基酸和維生素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基″細(xì)胞生長速度″表示細(xì)胞從細(xì)胞庫中解凍和它們的衰老之間的細(xì)胞生長的平均速度。它是用群體加倍(PD)/天表示的，并且是通過計(jì)算在細(xì)胞解凍和它們的衰老之間群體加倍的次數(shù)與細(xì)胞解凍和它們的衰老之間的持續(xù)時(shí)間(用天表示)的比例獲得的。本發(fā)明的等同的細(xì)胞生長速度，表示細(xì)胞生長速度為用在補(bǔ)充了合適血清的細(xì)胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(通常補(bǔ)充了濃度為10％的牛血清(用作對(duì)照))獲得的生長速度的至少80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選至少95％或更高。最優(yōu)選的是細(xì)胞生長速度高于用在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞獲得的速度。
″細(xì)胞形態(tài)學(xué)″表示通過光學(xué)顯微術(shù)評(píng)估的細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。形態(tài)學(xué)方面的等同的性能表示所述細(xì)胞保留了在存在牛血清的條件下培養(yǎng)時(shí)所出現(xiàn)的形態(tài)學(xué)。作為例子，MRC-5細(xì)胞在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)之后，保留了它們的成纖維細(xì)胞性質(zhì)。
″衰老″表示在均勻的，固定次數(shù)的群體加倍(群體加倍水平，PDL)之后出現(xiàn)的細(xì)胞復(fù)制能力的喪失，通常被稱作海弗利克極限(Harry Rubin，Nature Biotechnology，2002，20，675-681)。本發(fā)明的等同的衰老表示衰老至少為在補(bǔ)充了合適血清，通常是濃度為10％的牛血清(用作對(duì)照)的細(xì)胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞獲得的衰老的至少70％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選至少95％或更高。最優(yōu)選的衰老是以高于用在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞獲得的PDL發(fā)生的。通常，對(duì)于MRC-5細(xì)胞來說，優(yōu)選的是，對(duì)于在存在上文所述的血清的條件下培養(yǎng)的細(xì)胞來說，獲得了大約PDL60和大約PDL75之間的衰老。
″貼壁依賴性動(dòng)物細(xì)胞″或″貼壁依賴性人細(xì)胞″表示在來自動(dòng)物或人組織的細(xì)胞系或細(xì)胞中建立的細(xì)胞，它需要固體支持物，以便生長并且正常地?cái)U(kuò)增。所述固體支持物基本上是生長表面，如塑料或玻璃表面。合適的固體支持物的例子有陪替氏培養(yǎng)皿，組織培養(yǎng)燒瓶，細(xì)胞工廠，滾瓶或微載體。對(duì)于本發(fā)明的目的來說，所述表面是沒有用動(dòng)物來源的任何蛋白或用來自所述蛋白的肽包被過的。所述細(xì)胞附著并且通過附著擴(kuò)散，即通過分泌它們的自分泌附著因子。優(yōu)選的貼壁依賴性細(xì)胞是二倍體細(xì)胞。二倍體貼壁依賴性細(xì)胞的非限定性例子可以從ATCC目錄(WI38CCL-75，MRC-5CCL-171，IMR-90CCL-186，DBS-FRhL-2CCL-160，MRC-9CCL-212)或NIA目錄(TIG-1和TIG-7，為了NIA Aging Cell Repository開發(fā)的，TIG-1保存編號(hào)AG06173；IMR-91191L)中查閱到。優(yōu)選的細(xì)胞是MRC-5，WI-38，F(xiàn)RhL-2，MRC-9，最優(yōu)選的細(xì)胞系是MRC-5。
″基本上不含…的培養(yǎng)基″用于表示培養(yǎng)基，它包括新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基，它缺少血清以及任何一級(jí)動(dòng)物來源的外源成分(例如BSA)。所述新鮮培養(yǎng)基或條件培養(yǎng)基可以含有二級(jí)動(dòng)物來源的微量的外源成分?！宀缓瑒?dòng)物來源的成分的培養(yǎng)基″表示缺少血清和一級(jí)動(dòng)物來源的(例如BSA)和二級(jí)動(dòng)物來源的任何外源成分的培養(yǎng)基。一級(jí)動(dòng)物來源的外源成分包括，例如，來自牛(包括小牛)，人(如人血清白蛋白-HSA)或豬來源的成分。二級(jí)動(dòng)物來源的成分被定義為這樣的成分，這些成分是在它們的生產(chǎn)步驟之一中與動(dòng)物來源的產(chǎn)物接觸的成分。具體地講，常用的來自二級(jí)動(dòng)物來源的成分是重組生長因子，如胰島素，EGF和FGF和IGF-I。這些可以在大腸桿菌中生產(chǎn)的重組生長因子與用于發(fā)酵飼養(yǎng)和/或酶促裂解的?；蜇i的成分接觸。微量的來自二級(jí)動(dòng)物來源的成分的范圍為低于1％，優(yōu)選低于0.5％，更優(yōu)選低于0.01％，最優(yōu)選低于0.001％，最優(yōu)選不存在(0％)?；A(chǔ)無血清培養(yǎng)基和無動(dòng)物來源的成分的培養(yǎng)基可以通過商業(yè)渠道獲得或可以通過混合每一種成分制備。它們是用非動(dòng)物來源的生長因子適當(dāng)補(bǔ)充過的。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用這樣的培養(yǎng)基，它完全不含動(dòng)物來源的外源成分。盡管完全不含動(dòng)物來源的外源成分的培養(yǎng)基是優(yōu)選的實(shí)施方案，上述所有成分都可以被二級(jí)動(dòng)物來源的成分(如上文所述的生長因子，小麥蛋白胨，氨基酸，蛋白酶等)所取代，而又不會(huì)對(duì)所述方法的性能產(chǎn)生任何影響。
″動(dòng)物來源″或″動(dòng)物來源的″表示哺乳動(dòng)物，例如人，以及非哺乳動(dòng)物，如昆蟲，魚，禽類，兩棲類和爬行類。
術(shù)語″外源的″用于表示非動(dòng)物來源的成分，與細(xì)胞分泌的″內(nèi)源″成分不同，它是被添加到所述培養(yǎng)基中的。因此，比較而言，術(shù)語″內(nèi)源的″表示由細(xì)胞合成并且分泌(自分泌)的成分，它導(dǎo)致了細(xì)胞在合適基質(zhì)上的附著，擴(kuò)散和生長(粘連蛋白，膠原，蛋白聚糖，生長因子…)(M.R.Koller & E.T.Papoutsakis，Bioprocess Technol.，1995，60，61-110)。
所述細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選缺少一級(jí)動(dòng)物來源的外源成分，并且包括至少一種非動(dòng)物二級(jí)來源的外源生長因子，優(yōu)選至少兩種，更優(yōu)選至少三種或三種以上生長因子。細(xì)胞培養(yǎng)基適當(dāng)?shù)匕ㄟx自下組的至少一種非動(dòng)物二級(jí)來源的外源生長因子EGF，F(xiàn)GF，三-碘-L tyronine和氫化可的松和非動(dòng)物二級(jí)來源的IGF-1和/或胰島素中的至少一種。所述培養(yǎng)基適當(dāng)?shù)匕‥GF，F(xiàn)GF，三-碘-L tyroninc和非動(dòng)物二級(jí)來源的氫化可的松和非動(dòng)物二級(jí)來源的IGF-1和/或胰島素中的至少一種的組合。術(shù)語″生長因子″表示蛋白，肽，或多肽，或多肽的復(fù)合物，包括細(xì)胞因子，它們是細(xì)胞生長所必需的，可以在培養(yǎng)過程中由細(xì)胞產(chǎn)生，并且可以影響它自身和/或多種其他相鄰的或遠(yuǎn)處的細(xì)胞，例如，促進(jìn)細(xì)胞附著和生長。某些，而不是全部生長因子是激素。示例的生長因子是胰島素，胰島素樣生長因子(IGF)，包括IGF-1，表皮生長因子(EGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，包括堿性FGF(bFGF)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα)，血小板衍生的生長因子(PDGFs)，神經(jīng)生長因子(NGF)，角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)，VEGF，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)，白介素-8(IL-8)，白介素6(IL-6)，三-碘-L tyronine和氫化可的松。優(yōu)選的生長因子包括，例如EGF，F(xiàn)GF(優(yōu)選bFGF)，IGF-1或胰島素，三-碘-L tyronine和氫化可的松，并且可以單獨(dú)使用或者優(yōu)選組合使用。優(yōu)選的培養(yǎng)基包括非動(dòng)物來源的EGF，F(xiàn)GFb，IGF-1或胰島素，三-碘-L tyronine和氫化可的松。更優(yōu)選的是本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的所有成分，如在表3中所列舉的成分都是非動(dòng)物一級(jí)和二級(jí)來源的。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基還包括非動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，優(yōu)選植物或酵母來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物?！宓鞍踪|(zhì)水解產(chǎn)物″或″蛋白胨″表示正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的純化制劑或它的粗制級(jí)份，因此它是不含蛋白的。術(shù)語不含蛋白意在表示不含任何有功能活性的蛋白，不過，不排除非功能性肽，因?yàn)檫@些肽可能精確地由蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物產(chǎn)生。特別合適的水解產(chǎn)物級(jí)份包括小麥蛋白胨蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，例如由分子量最高為10000道爾頓的肽組成的酶促消化物，所述肽的80％的大部分為300-1000道爾頓。在使用時(shí)，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物在培養(yǎng)基中的濃度為0-10g/L，在使用時(shí)優(yōu)選為1-5g/L，特別優(yōu)選2.5g/L。具體地講，所述蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物來自植物(例如，水稻，玉米，小麥，大豆，豌豆，棉花，馬鈴薯)或酵母。本發(fā)明優(yōu)選的植物蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物是小麥蛋白胨蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。
或者，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基表示″新鮮培養(yǎng)基″，″條件培養(yǎng)基″，或這兩種培養(yǎng)基的混合物。″新鮮培養(yǎng)基″表示通過商業(yè)渠道獲得的或用各種成分制備的任何細(xì)胞培養(yǎng)基，業(yè)已將它用于培養(yǎng)任何細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，新鮮培養(yǎng)基表示通過商業(yè)渠道獲得的培養(yǎng)基或用上述各種成分制備的培養(yǎng)基。就是說，根據(jù)本發(fā)明，它缺少一級(jí)來源的動(dòng)物成分并且業(yè)已補(bǔ)充了上文所述的至少一種非動(dòng)物二級(jí)來源的外源生長因子，并且任選地，但是優(yōu)選地補(bǔ)充了非動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，如小麥蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。
″條件培養(yǎng)基″用于表示業(yè)已被一種細(xì)胞培養(yǎng)物利用的培養(yǎng)基，并且被另一種培養(yǎng)物再利用。該條件培養(yǎng)基包括第一種培養(yǎng)物對(duì)內(nèi)源生長刺激物質(zhì)，內(nèi)源附著因子和特殊內(nèi)源營養(yǎng)物的釋放。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種生產(chǎn)條件培養(yǎng)基的方法，包括將本發(fā)明的新鮮培養(yǎng)基與動(dòng)物或優(yōu)選人類貼壁依賴性細(xì)胞組合，以便制備條件培養(yǎng)基。
除非另有說明，新鮮培養(yǎng)基，條件培養(yǎng)基，以及這兩者的混合物被稱作″培養(yǎng)基″。
表2表示添加到新鮮培養(yǎng)基中的生長因子和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的濃度范圍和優(yōu)選濃度。因此，添加到本發(fā)明的合適培養(yǎng)基中的生長因子的濃度由下面的表2所限定。
表2

可以理解的是，根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞類型和要獲得的性能，本發(fā)明的新鮮培養(yǎng)基可任選地進(jìn)一步補(bǔ)充常見于培養(yǎng)基中的并且是非動(dòng)物來源的成分。例如，合適的成分有氨基酸(包括非必需氨基酸)，維生素，核苷酸/核苷，脂肪酸，抗生素和氧化穩(wěn)定劑，它們都是非動(dòng)物來源的。
合適的新鮮培養(yǎng)基是無動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，如基于DMEM的培養(yǎng)基(高葡萄糖Dulbecco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基)，MEM(極限必需培養(yǎng)基Eagle)，培養(yǎng)基199，RPM-I 1640，所有這些培養(yǎng)基都可以從以下等公司獲得Life-technologies-Gibco-BRL，BioWittaker，Sigma-Aldrich，并且用生長因子進(jìn)一步適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充，并且任選用上述非動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物補(bǔ)充。技術(shù)人員可以理解的是，起始培養(yǎng)基需要根據(jù)所培養(yǎng)的細(xì)胞類型選擇。優(yōu)選的商業(yè)渠道獲得的新鮮培養(yǎng)基是Ultra-MEM，可以從BioWhittaker(目錄號(hào)12-745F)獲得。另外，根據(jù)要培養(yǎng)的細(xì)胞類型，所述新鮮培養(yǎng)基是用每一種成分制備的無動(dòng)物培養(yǎng)基，并且包括(并且窮舉)糖類來源，無機(jī)鹽成分，微量元素，氨基酸(包括非必需氨基酸)，維生素，核苷酸/核苷，脂肪酸，抗生素，氧化穩(wěn)定劑和水，適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充了非動(dòng)物來源的外源生長因子，并且任選地，但是優(yōu)選補(bǔ)充了上文所述的非動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。所述培養(yǎng)物的基本組成的例子在實(shí)施例I和表3中提供。
所述培養(yǎng)基適合培養(yǎng)動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物或優(yōu)選人類細(xì)胞，具體地講，貼壁依賴性動(dòng)物細(xì)胞。如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或優(yōu)選人類細(xì)胞，優(yōu)選貼壁依賴性二倍體細(xì)胞，它構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。
在本發(fā)明的優(yōu)選方面，還提供了用于在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生產(chǎn)動(dòng)物或優(yōu)選人類貼壁依賴性細(xì)胞，優(yōu)選二倍體細(xì)胞的方法，所述方法包括a)將細(xì)胞接種在所述培養(yǎng)基中，并且讓所述細(xì)胞附著在基質(zhì)上；b)收獲來自步驟a)的條件培養(yǎng)基，并且從該基質(zhì)上分離所述細(xì)胞層，并且用非動(dòng)物來源的蛋白酶解離細(xì)胞，以便形成細(xì)胞懸浮液；c)將步驟b)的細(xì)胞懸浮液接種到裝在包括附著支持物的裝置中的培養(yǎng)基中，使得允許細(xì)胞結(jié)合；d)在相同的培養(yǎng)基中生長所述細(xì)胞；e)任選重復(fù)步驟b)-d)。
所述方法可任選包括冷凍從步驟b)中收獲的細(xì)胞的步驟，以便產(chǎn)生細(xì)胞庫。
用于步驟b)的蛋白酶在處理之后任選被滅活。
根據(jù)細(xì)胞類型，以及要獲得的所述細(xì)胞培養(yǎng)方法的性能，技術(shù)人員可以理解的是，所使用的培養(yǎng)基，特別是在步驟a)和c)中所使用的培養(yǎng)基還可以是新鮮培養(yǎng)基，或來自前面的培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基或新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的混合物。在所述混合物中，新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的比例為1∶0(100％新鮮培養(yǎng)基)-0∶1(100％條件培養(yǎng)基)。所述條件培養(yǎng)基優(yōu)選占培養(yǎng)基總體積的0-大約75％。新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的優(yōu)選比例為1∶1(50％新鮮培養(yǎng)基/50％條件培養(yǎng)基)，更優(yōu)選的比例為大約7∶1(87.5％新鮮培養(yǎng)基/12.5％條件培養(yǎng)基)-1∶7，更優(yōu)選的比例為大約3∶1(75％新鮮培養(yǎng)基/25％條件培養(yǎng)基)-1∶3，最優(yōu)選的比例為3∶1(75％新鮮培養(yǎng)基/25％條件培養(yǎng)基)。所述優(yōu)選比例優(yōu)選在整個(gè)培養(yǎng)過程中在每次更換培養(yǎng)基時(shí)保持。
所述蛋白酶是非動(dòng)物來源的，就是說所述蛋白酶不是從動(dòng)物來源中純化的。所述蛋白酶可以來自重組來源，不過，優(yōu)選來自細(xì)菌，酵母，或植物來源，合適的是來自非動(dòng)物二級(jí)來源。來自重組來源的蛋白酶意在表示通過DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的任何蛋白酶，并且涉及將微生物，例如細(xì)菌，病毒，酵母，植物等用于其生產(chǎn)。優(yōu)選的蛋白酶包括半胱氨酸內(nèi)肽酶；中性真菌蛋白酶(來自A.oryzae)；中性細(xì)菌蛋白酶(來自枯草芽孢桿菌)(參見Brocklehurst，K.等，Cysteineproteinases.In New Comprehensive Biochemistry Vol.16，Hyd rolyticEnzymes；Neuberger，A.& Brocklehurst；K.，eds，pp.39-158(1987)Elsevier，Amsterdam)；絲氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶樣蛋白酶(如r蛋白酶，購自Invitrogen，3175 Staley Road，Grand Island，NY 14072.供應(yīng)商目錄號(hào)02-106)或重組胰蛋白酶(如Trypzean，在玉米中生產(chǎn)的重組胰蛋白酶，Prodigen，101 Gateway Blvd，Suite 100 CollegeStation，Texas 77845.生產(chǎn)商代碼TRY)。來自胰蛋白酶樣蛋白酶家族的蛋白酶通常出現(xiàn)在原核生物，動(dòng)物和病毒中，令人吃驚的是，迄今為止沒有在植物中發(fā)現(xiàn)。這些酶參與了多種生理學(xué)過程，其中最熟知的是消化，受精，血液凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)和發(fā)育過程。它們被認(rèn)為偏離了共同的祖先蛋白。在文獻(xiàn)中業(yè)已對(duì)這些酶進(jìn)行了充分的披露(A.J.Greer，″Comparative modelling methods-application to the family ofmammalian serine protease″Proteins，Vol.7，p 317-334，1990)并且可以根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)劃分成不同的家族(A.Sali & T.Blundell，″definition of general topological equivalence in protein structures″J.Mol.Biol.，212，p 403-428，1990)。合適的蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，如重組胰蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶是中性真菌蛋白酶或中性細(xì)菌蛋白酶。本發(fā)明的更優(yōu)選的蛋白酶是半胱氨酸內(nèi)肽酶。特別優(yōu)選的半胱氨酸蛋白酶來自植物來源。來自植物的優(yōu)選的半胱氨酸內(nèi)肽酶選自下組無花果蛋白酶(無花果乳膠的主要蛋白水解成分)(Liener，I.E.& Friedenson，B.Methods Enzymol，1970，19，261-273)，莖菠蘿蛋白酶(從菠蘿植物的莖中提取的)，獼猴桃堿(從獼猴桃果實(shí)或獼猴桃中提取)和木瓜蛋白酶(從木瓜的乳膠中提取的)。在所述半胱氨酸蛋白酶中，無花果蛋白酶是特別優(yōu)選的。
所述蛋白酶能夠以任何合適的濃度使用，以便確保在合理的分離時(shí)間內(nèi)進(jìn)行有效的細(xì)胞解離(單一化的細(xì)胞)。
通過閱讀實(shí)施例II所示的步驟能夠更好地理解生產(chǎn)二倍體貼壁依賴性細(xì)胞的過程。簡單地講，所述細(xì)胞層來自解凍并且接種用于細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞或來自本發(fā)明的培養(yǎng)基中的以前的繼代培養(yǎng)物。然后，在用于細(xì)胞分離的第一個(gè)步驟中，取出貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基，并且保持以便用作接種步驟的條件培養(yǎng)基。所述細(xì)胞層優(yōu)選是洗滌過的，是分離的，并且通過使用蛋白酶溶液和搖晃燒瓶解離成單個(gè)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞分離并且單一化時(shí)，收集細(xì)胞懸浮液，并且可用于細(xì)胞接種或細(xì)胞存庫。當(dāng)?shù)鞍酌傅幕钚詫?duì)所述細(xì)胞系的培養(yǎng)物有毒時(shí)，任選用合適的蛋白酶抑制劑對(duì)它進(jìn)行抑制。在用于細(xì)胞接種的第二個(gè)步驟中，以用于產(chǎn)生的細(xì)胞系的常見細(xì)胞密度將細(xì)胞接種在新的燒瓶中。然后，將培養(yǎng)基，優(yōu)選新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的混合物添加到新的燒瓶中。在用于細(xì)胞生長的第三個(gè)步驟中，在與用于細(xì)胞系生產(chǎn)的常用方法中的相同的溫度和相同的氣氛中培養(yǎng)新的細(xì)胞培養(yǎng)物。在步驟1(細(xì)胞分離)之后可以將任選的第四個(gè)步驟用于細(xì)胞存庫并且取代步驟2(細(xì)胞接種)和3(細(xì)胞生長)。該步驟是通過在不含動(dòng)物來源的成分的，補(bǔ)充了常用于細(xì)胞系冷凍的常用無動(dòng)物來源的防凍劑(通常是DMSO和甲基纖維素)的培養(yǎng)基中冷凍細(xì)胞進(jìn)行的。
通常，細(xì)胞必須適應(yīng)在不含外源動(dòng)物來源的成分的培養(yǎng)基中生長，采用包括具有逐漸降低的所述成分的濃度的若干種培養(yǎng)物的預(yù)定策略，然后將它們的培養(yǎng)物放在完全不含外源動(dòng)物來源的成分的培養(yǎng)基中(Chandler JP.，Am Biotechnol Lab 1990，8，18-28)。該適應(yīng)步驟是確保正常細(xì)胞生長和典型的細(xì)胞形態(tài)學(xué)所必須的。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，用于生產(chǎn)本發(fā)明的細(xì)胞的方法在不含外源動(dòng)物來源的成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞之前不需要任何適應(yīng)步驟，并且所述細(xì)胞的衰老不受該適應(yīng)步驟的缺乏的影響。這是本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。實(shí)際上，通常的細(xì)胞生長和典型的細(xì)胞形態(tài)學(xué)保持了達(dá)到群體加倍水平(PDL)所需要的多個(gè)世代(群體加倍)，相當(dāng)于觀察到所述細(xì)胞衰老時(shí)的PDL的2/3。通常的細(xì)胞生長和典型的細(xì)胞形態(tài)學(xué)優(yōu)選需要保持多個(gè)世代(群體加倍)，以便達(dá)到觀察到所述細(xì)胞衰老時(shí)的群體加倍水平(PDL)。觀察到所述細(xì)胞衰老時(shí)的PDL相當(dāng)于在含有動(dòng)物來源的成分的通常的過程中所觀察到的PDL。例如，對(duì)于來自主細(xì)胞庫(PDL13)并且在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MRC-5細(xì)胞來說，在觀察到細(xì)胞衰老之后，通常的細(xì)胞生長和典型的細(xì)胞形態(tài)學(xué)保持了超過50代(群體加倍)。
因此本發(fā)明還提供了適合在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞系，優(yōu)選動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人二倍體貼壁依賴性細(xì)胞系?！暹m應(yīng)的″表示典型的細(xì)胞生長和細(xì)胞形態(tài)學(xué)保持了多個(gè)世代，類似于用含有動(dòng)物來源的成分的典型培養(yǎng)基觀察到的那些，或者衰老的出現(xiàn)并不比使用傳統(tǒng)培養(yǎng)基時(shí)出現(xiàn)的明顯更快。另外，本發(fā)明還提供了適合在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生產(chǎn)生物學(xué)活性產(chǎn)物，優(yōu)選病毒的細(xì)胞系，優(yōu)選動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人二倍體貼壁依賴性細(xì)胞系。
因此，在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明相應(yīng)地還提供了在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生產(chǎn)動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物或優(yōu)選人二倍體貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)重組蛋白或病毒的方法，所述方法包括用上述蛋白酶使所述細(xì)胞培養(yǎng)物傳代。具體地講，以低密度將貼壁依賴性細(xì)胞，通常是二倍體細(xì)胞接種在基本上不含動(dòng)物來源的外源成分的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，并且在它們業(yè)已擴(kuò)增以便形成匯合層或多層之后，使它們分離，以便形成懸浮液，并且再次以低密度接種。用于分離和傳代所述細(xì)胞的蛋白酶優(yōu)選是非動(dòng)物來源的，或來自重組來源，選自下組半胱氨酸內(nèi)肽酶，中性真菌蛋白酶，中性細(xì)菌蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。合適的蛋白酶是胰蛋白酶樣蛋白酶，如Trypzean或重組胰蛋白酶，如r蛋白酶或半胱氨酸內(nèi)肽酶，更優(yōu)選無花果蛋白酶，莖菠蘿蛋白酶和獼猴桃堿。在所述半胱氨酸蛋白酶，無花果蛋白酶是特別優(yōu)選的。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中，在動(dòng)物如哺乳動(dòng)物或優(yōu)選人類貼壁依賴性細(xì)胞，優(yōu)選二倍體細(xì)胞中生產(chǎn)病毒的方法a)用所述病毒感染所述細(xì)胞b)繁殖所述病毒，和c)收獲所述病毒。
任選對(duì)收獲的病毒進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)純化步驟，本發(fā)明的另一方面是提供按本發(fā)明的描述所生產(chǎn)的病毒并且配制成免疫原性組合物，如疫苗，與可以藥用的載體，賦形劑和/或佐劑混合。
根據(jù)細(xì)胞類型，以及要獲得的病毒生產(chǎn)方法的性能，技術(shù)人員可以理解的是，用于在步驟a)中接種細(xì)胞的培養(yǎng)基還可以是新鮮培養(yǎng)基或來自前面的培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基或新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的混合物。優(yōu)選的是，為了優(yōu)化病毒生產(chǎn)，新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的比例為1∶0(100％新鮮培養(yǎng)基)-0∶1(100％條件培養(yǎng)基)。所述條件培養(yǎng)基優(yōu)選占培養(yǎng)基總體積的0-大約75％。新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的優(yōu)選比例為1∶1(50％新鮮培養(yǎng)基/50％條件培養(yǎng)基)，更優(yōu)選大約7∶1(87.5％新鮮培養(yǎng)基/12.5％條件培養(yǎng)基)，最優(yōu)選大約3∶1(75％新鮮培養(yǎng)基/25％條件培養(yǎng)基)。新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的比例為1∶0(100％新鮮培養(yǎng)基)是特別優(yōu)選的。用于感染細(xì)胞和繁殖病毒的培養(yǎng)基可以與生長培養(yǎng)基相同，更優(yōu)選它包括25％w/vEGF，25％w/vbFGF和25％w/vT3，并且任選還補(bǔ)充了20％w/v蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，優(yōu)選小麥蛋白胨E1(Organotechnie SA，F(xiàn)rance)。最優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)基不含任何蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。
通過閱讀在實(shí)施例III中所披露的步驟可以更好地理解病毒生產(chǎn)方法。
簡單地講，在用于病毒感染的第一個(gè)步驟中，按照所述方法在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的貼壁依賴性細(xì)胞用合適的病毒感染，感染復(fù)數(shù)與用于病毒生產(chǎn)的常規(guī)方法的感染復(fù)數(shù)相同。在用于病毒繁殖的第二個(gè)步驟中，在與常用于病毒生產(chǎn)的方法中的相同的溫度和相同的氣氛下培養(yǎng)受感染的細(xì)胞。在第三個(gè)步驟中，在經(jīng)歷與常用于病毒生產(chǎn)的相同的繁殖時(shí)間之后收獲病毒。所述病毒收獲方法是按照常用于病毒收獲的方法進(jìn)行的。有關(guān)用于病毒生產(chǎn)的一般培養(yǎng)條件參見甲型肝炎病毒培養(yǎng)方法(WO 95/24468)，甲型肝炎病毒疫苗(WO 94/06446；A.Hagen J.，2000，Bioprocess Engineering 23，439-449)。
可以使用本發(fā)明的培養(yǎng)基和方法生產(chǎn)的病毒和人病毒疫苗的例子包括活的，減毒的，滅活的，重組修飾的病毒。具體地講，用作疫苗的可以在貼壁依賴性細(xì)胞上繁殖的減毒病毒包括，但不局限于腺病毒科(即腺病毒1-49)，皰疹病毒科(即皰疹病毒HSV，巨細(xì)胞病毒CMV，水痘帶狀皰疹病毒VZV，EB病毒EBV)，黃病毒科(即登革熱病毒，丙型肝炎病毒，日本腦炎病毒，黃熱病病毒)，痘病毒科(即牛痘病毒，猴痘病毒，痘苗病毒，天花病毒)，小核糖核酸病毒科(即艾柯病毒，科薩奇病毒，甲型肝炎病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒，鼻病毒)，呼腸孤病毒科(即輪狀病毒，科羅拉多蜱熱病毒)，披膜病毒科(即東方馬腦炎病毒，風(fēng)疹病毒)，肝DNA病毒科(即乙型肝炎病毒)，逆轉(zhuǎn)錄病毒科(即免疫缺陷病毒HIV/SIV)，副粘病毒科(即麻疹病毒，腮腺炎病毒，副流感病毒，呼吸道合胞病毒RSV)，棒狀病毒科(即狂犬病病毒，水泡性口炎病毒)，正粘病毒科(即流感病毒)，未分類的病毒(即戊型肝炎病毒，δ肝炎病毒)，星狀病毒科(即星狀病毒)，冠狀病毒科(即冠狀病毒)，沙粒病毒科(即Junin virus)，Bunyaviridae(立夫特山谷熱病毒)。在另一種實(shí)施方案中，用本發(fā)明的方法進(jìn)行的病毒疫苗的生產(chǎn)包括生產(chǎn)在粘附細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白。優(yōu)選的貼壁依賴性細(xì)胞包括，例如AGMK，VERO，MDCK(犬上皮腎臟細(xì)胞)，CEF(雞，胚胎成纖維細(xì)胞)和CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞，更優(yōu)選的細(xì)胞是貼壁依賴性二倍體細(xì)胞，例如MRC-5，WI-38，TIG-1，TIG-7，F(xiàn)RhL-2，MRC-9，IMR-90和IMR 91。MRC-5是特別優(yōu)選的細(xì)胞系。業(yè)已證實(shí)本發(fā)明的方法能成功地生產(chǎn)甲型肝炎病毒，腮腺炎病毒和VZV。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，用下列任何病毒感染的細(xì)胞是優(yōu)選的肝炎，特別是HAV，脊髓灰質(zhì)炎病毒，HSV，特別是HSV-1和HSV-2，CMV，EBV，風(fēng)疹病毒，副粘病毒科(即麻疹病毒，腮腺炎病毒，副流感病毒，呼吸道合胞病毒RSV)，VZV。
一般來說，啟動(dòng)主細(xì)胞庫需要15代，并且為了生產(chǎn)工作細(xì)胞庫需要10代。為了以400L的規(guī)模進(jìn)行平均批量培養(yǎng)需要至少大約15代。從貼壁依賴性細(xì)胞系開始，并且使用本發(fā)明的培養(yǎng)基，可以按照相同的方案用大約15代制備主細(xì)胞庫(MCB)，并且用大約10代制備工作細(xì)胞庫(WCB)，因此，在不含外源動(dòng)物來源的成分的培養(yǎng)基開發(fā)的條件下，用大約15代制備培養(yǎng)物。
本發(fā)明還涉及將上文所披露的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選二倍體貼壁依賴性細(xì)胞，更優(yōu)選真核細(xì)胞，最優(yōu)選動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，或優(yōu)選人類細(xì)胞的用途。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供細(xì)胞培養(yǎng)物，它包括本發(fā)明的培養(yǎng)基和細(xì)胞，優(yōu)選二倍體貼壁依賴性細(xì)胞，更優(yōu)選真核細(xì)胞，最優(yōu)選動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物或優(yōu)選人類細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及可以通過本文所限定的方法獲得的病毒群體。它還涉及一種生產(chǎn)病毒疫苗的方法，包括將所述病毒群體與可以藥用的載體，賦形劑或佐劑混合。


圖1.在使用用于細(xì)胞分離的無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶和使用實(shí)施例1.1確定的培養(yǎng)基進(jìn)行MRC-5細(xì)胞衰老試驗(yàn)期間的細(xì)胞密度。
圖2.在將無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶用于細(xì)胞分離和使用實(shí)施例1.1確定的培養(yǎng)基進(jìn)行MRC-5細(xì)胞衰老試驗(yàn)期間的細(xì)胞存活力。
圖3.在將無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶用于細(xì)胞分離和使用實(shí)施例1.1確定的培養(yǎng)基進(jìn)行MRC-5細(xì)胞衰老試驗(yàn)期間的細(xì)胞生長。
圖4.在MRC-5細(xì)胞衰老試驗(yàn)期間使用實(shí)施例I.1(單一成分)和實(shí)施例I.2(補(bǔ)充過的超-MEM培養(yǎng)基)確定的培養(yǎng)基獲得的細(xì)胞密度的比較。
圖5.在MRC-5細(xì)胞衰老試驗(yàn)期間使用實(shí)施例I.1(單一成分)和實(shí)施例I.2(補(bǔ)充過的超-MEM培養(yǎng)基)確定的培養(yǎng)基獲得的細(xì)胞存活力。
圖6.在MRC-5細(xì)胞衰老試驗(yàn)期間使用實(shí)施例I.1(單一成分)和實(shí)施例I.2(補(bǔ)充過的超-MEM培養(yǎng)基)確定的培養(yǎng)基獲得的細(xì)胞生長。
圖7.通過將無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶用于細(xì)胞分離在MRC-5細(xì)胞上生產(chǎn)HAV。
圖8.通過將無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶用于細(xì)胞分離而擴(kuò)增的MRC-5細(xì)胞的細(xì)胞存庫期間的細(xì)胞密度。
圖9.通過將無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶用于細(xì)胞分離而擴(kuò)增的MRC-5細(xì)胞的細(xì)胞存庫期間的細(xì)胞存活力。
圖10.通過將無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶用于細(xì)胞分離而擴(kuò)增的MRC-5細(xì)胞的細(xì)胞存庫期間的細(xì)胞生長。
圖11.通過將Trypzean(Prodigen)或r蛋白酶(Invitrogen)用于細(xì)胞分離而擴(kuò)增的MRC-5細(xì)胞的細(xì)胞存庫期間的細(xì)胞密度。
圖12.通過將Trypzean(Prodigen)或r蛋白酶(Invitrogen)用于細(xì)胞分離而擴(kuò)增的MRC-5細(xì)胞的細(xì)胞存庫期間的細(xì)胞存活力。
圖13.將Trypzean(Prodigen)或r蛋白酶(Invitrogen)用于細(xì)胞分離而擴(kuò)增的MRC-5細(xì)胞的細(xì)胞存庫期間的細(xì)胞生長。
將通過以下非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例II.1.用各成分制備新鮮培養(yǎng)基典型的優(yōu)選新鮮培養(yǎng)基包括表3中所列舉的常用成分的全部或大部分。根據(jù)本發(fā)明，可以用表2所列舉的生長因子和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物適當(dāng)補(bǔ)充該培養(yǎng)基。
表3-不含動(dòng)物來源的成分的培養(yǎng)基





*在上面的表3中，還將鐵復(fù)合物(果糖鐵)用作鐵的來源，作為無機(jī)鐵的補(bǔ)充。
I.2.用適當(dāng)補(bǔ)充過的商業(yè)化培養(yǎng)基制備新鮮培養(yǎng)基商業(yè)化培養(yǎng)基Ultra-MEM目錄號(hào)12-745F(還原的血清培養(yǎng)基，無蛋白基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不含L-谷氨酰胺)可以從BioWhittaker獲得。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方不含動(dòng)物來源的成分，但是，是按照生產(chǎn)商的說明進(jìn)行經(jīng)典設(shè)計(jì)的，以便補(bǔ)充少量的血清(如低于10％)和其他添加劑(ITES＝胰島素(動(dòng)物來源)+轉(zhuǎn)鐵蛋白(動(dòng)物來源)+乙醇胺+硒)。業(yè)已在缺少推薦的來自動(dòng)物來源的補(bǔ)充物(血清和ITES)的條件下使用了所述培養(yǎng)基。
業(yè)已用以下成分補(bǔ)充了該培養(yǎng)基，都不含來自一級(jí)和二級(jí)動(dòng)物來源的成分1.IGF-10.1mg/L2.EGF0.005mg/L3.bFGF0.003mg/L4.三碘-L-tyronine(T3)0.066mg/L5.小麥蛋白胨E12.5g/L還含有6.果糖鐵0.1667ml/L7.丙酮酸鈉0.055g/L業(yè)已添加了以下成分，以便優(yōu)化在沒有動(dòng)物來源的成分的條件下進(jìn)行的培養(yǎng)過程-谷氨酰胺0.2922g/L-葡萄糖0.33g/L
-硒(Na2SeO3)0.01mg/L-乙醇胺0.0006μl/L對(duì)來自無動(dòng)物的細(xì)胞庫(PDL21)的MRC-5細(xì)胞進(jìn)行解凍，并且按照在實(shí)施例II和IV中披露的方法培養(yǎng)，使用上述培養(yǎng)基，和以下繼代培養(yǎng)方案·D7以1/8的比例將細(xì)胞接種在100ml由12.5％的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中·D12以1/4的比例將細(xì)胞接種在100ml由25％的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中·D16以1/8的比例將細(xì)胞接種在100ml由12.5％的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中·D21重復(fù)從D7開始的方案在±三個(gè)月的時(shí)間(例如80天)內(nèi)，在175cm2T-燒瓶中培養(yǎng)細(xì)胞，直到衰老(±PDL65)。在該方法中，細(xì)胞接種物并不固定于目標(biāo)細(xì)胞密度上。作為對(duì)照進(jìn)行的細(xì)胞計(jì)數(shù)，證實(shí)在出現(xiàn)衰老之前觀察到的細(xì)胞接種物密度為9000細(xì)胞/cm2-40000細(xì)胞/cm2。在培養(yǎng)81天之后，MRC-5細(xì)胞達(dá)到了PDL66，細(xì)胞生長速度為0.57PDL/天，此后觀察到了衰老。在圖4，5和6中所示出的結(jié)果與用在1.2部分所述的各成分制備的培養(yǎng)基觀察到的結(jié)果相當(dāng)，它在81天之后導(dǎo)致了大約PDL65的衰老，并且細(xì)胞生長速度為大約0.56PDL。
與此同時(shí)，將來自該培養(yǎng)物的細(xì)胞用于按照在實(shí)施例III中披露的方法生產(chǎn)HAV，使用與上文所述相同的培養(yǎng)基，所不同的是，EGF，bFGF和T3濃度降低到在細(xì)胞生長培養(yǎng)基中的濃度的25％，并且，所不同的是，小麥蛋白胨濃度降低到0.5g/L。病毒的收獲是在培養(yǎng)開始之后2個(gè)月進(jìn)行的。
實(shí)施例II用于在基本上不含任何來自動(dòng)物來源的成分的培養(yǎng)基中生產(chǎn)動(dòng)物或人貼壁依賴性細(xì)胞的方法。
步驟1細(xì)胞分離取出在細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中生長的貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基，并且保持在無菌容器中。這種回收的培養(yǎng)基被視為條件培養(yǎng)基，并且被用于接種細(xì)胞。用補(bǔ)充了EDTA的磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)洗滌所述細(xì)胞層2次，每升PBS大約0.04克-大約1克EDTA，優(yōu)選大約0.2克/L的目標(biāo)濃度是理想的。
一旦洗滌了所述細(xì)胞層，添加足夠體積的蛋白酶溶液，以便覆蓋整個(gè)細(xì)胞層。大約0.01ml/cm2-2ml/cm2，更優(yōu)選0.0333ml/cm2的目標(biāo)體積是理想的。該蛋白酶溶液是通過將所述酶溶解在補(bǔ)充了EDTA的PBS中制備的。每升PBS大約0.02克-大約0.5克的EDTA，優(yōu)選大約0.1克的目標(biāo)是理想的。添加到PBS/EDTA中的蛋白酶的量是制備具有足夠蛋白質(zhì)水解活性的溶液，以便獲得有效細(xì)胞分離所需要的用量。在以下情況下認(rèn)為細(xì)胞分離是有效的大部分細(xì)胞從燒瓶上分離下來，并且細(xì)胞聚集物在大約5分鐘-大約30分鐘，優(yōu)選大約12分鐘的預(yù)期目標(biāo)時(shí)間之后解離成單個(gè)細(xì)胞。在下面列舉了可用在貼壁依賴性細(xì)胞上的某些蛋白酶的酶活性，例如，但不局限于-對(duì)于無花果蛋白酶來說，目標(biāo)酶活性為大約5.5μUPABA/ml-大約550μUPABA/ml，優(yōu)選大約55μUPABA/ml是理想的(一個(gè)單位的PABA是在37℃下水解1μmole的Na-苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基苯胺/分鐘的酶的活性(Methods in Enzymology Vol XIX Proteolyticenzymes p261-284)。
-對(duì)于菠蘿蛋白酶來說，目標(biāo)酶活性為大約0.001明膠消化的單位(GDU)/ml-大約0.1GDU/ml，優(yōu)選大約0.01GDU/ml是理想的，(一個(gè)單位的GDU活性是在分析條件下從確定的明膠底物中釋放1mg氨基酸的酶的活性9-(參考文獻(xiàn)同上)。
-對(duì)于來自A.oryzae的中性真菌蛋白酶來說，目標(biāo)酶活性相當(dāng)于大約12.5μg/ml的蛋白量(1.25μg/ml-大約125μg/ml，優(yōu)選大約12.5μg/ml是理想的(按照生產(chǎn)商的說明，Lyven Zac Normandial，11avenue du Pays de Caen 14460 Colom belles，F(xiàn)rance)。
-對(duì)于來自枯草芽孢桿菌的中性細(xì)菌蛋白酶來說，目標(biāo)酶活性相當(dāng)于大約150μg/ml(15μg/ml-大約1.5mg/ml，優(yōu)選大約150μg/ml)的蛋白量是理想的(按照生產(chǎn)商的說明，Lyven Zac Normandial，11avenue du Pays de Caen 14460 Colom belles，F(xiàn)rance)。
-對(duì)于Trypzean來說，目標(biāo)酶活性為大約100USP/ml-0.1USP/ml，優(yōu)選1USP/ml是理想的(按照生產(chǎn)商Prodigen的說明，101Gateway Blvd，Suite 100 College Station，Texas 77845.生產(chǎn)商編碼TRY)。
-對(duì)于r蛋白酶來說，對(duì)母液的大約3倍-大約300倍，優(yōu)選30倍的目標(biāo)稀釋倍數(shù)是理想的(按照生產(chǎn)商Invitrogen的說明，3175Staley Road，Grand Island，NY 14072.供應(yīng)商目錄號(hào)02-106)。
在觀察到細(xì)胞分離時(shí)，輕柔搖晃燒瓶，并且將細(xì)胞懸浮液收集到無菌容器中。為了回收最多的細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基漂洗所述燒瓶，以相同的方式將漂洗的培養(yǎng)基收集到無菌容器中，然后細(xì)胞懸浮液就可用于細(xì)胞接種步驟或細(xì)胞存庫步驟。
步驟2細(xì)胞接種在步驟1所述的細(xì)胞分離之后獲得的貼壁依賴性細(xì)胞可以按照以下說明接種到新的燒瓶中-接種細(xì)胞的密度與接種使用動(dòng)物來源的成分的貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物的常用方法的密度相同。例如，MRC-5細(xì)胞是以大約5000細(xì)胞/cm2-大約40000細(xì)胞/cm2，優(yōu)選7500細(xì)胞/cm2-25000細(xì)胞/cm2的目標(biāo)細(xì)胞密度接種的。
-在細(xì)胞接種之后添加到所述燒瓶中的生長培養(yǎng)基的體積與在使用動(dòng)物來源的成分的貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物的常規(guī)方法中添加的體積相同。所述生長培養(yǎng)基由新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的混合物組成。所述條件培養(yǎng)基是在所述細(xì)胞分離步驟開始時(shí)回收的細(xì)胞培養(yǎng)基(參見步驟1)。添加到所述新鮮培養(yǎng)基中的條件培養(yǎng)基的量取決于接種的細(xì)胞系。一般0％-大約75％的條件培養(yǎng)基的目標(biāo)是理想的。舉例來說，對(duì)于MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)物來說，大約10％-大約35％的條件培養(yǎng)基的目標(biāo)是優(yōu)選的，并且大約0.025ml/cm2-大約3ml/cm2的培養(yǎng)基添加到所述燒瓶中是優(yōu)選的。
步驟3細(xì)胞生長接種到細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中的貼壁依賴性細(xì)胞是在用于使用動(dòng)物來源的成分的貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物的常規(guī)方法的相同溫度培養(yǎng)的。例如，對(duì)于MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)來說，大約30℃-大約40℃，優(yōu)選大約37℃的目標(biāo)溫度是優(yōu)選的。
接種到細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中的貼壁依賴性細(xì)胞是在與用于使用動(dòng)物來源的成分的貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物的常用方法相同的氣氛中培養(yǎng)的。例如，MRC-5細(xì)胞可以在有或沒有CO2對(duì)照，以及有或沒有相對(duì)濕度對(duì)照的條件下接種的。
步驟4細(xì)胞存庫對(duì)在步驟1所述的細(xì)胞分離之后獲得的貼壁依賴性細(xì)胞進(jìn)行冷凍，為了獲得細(xì)胞存庫，所采用的方法與用于使用動(dòng)物來源的成分的貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物的常用方法相同，不同之處在于以下各點(diǎn)細(xì)胞必須在不含動(dòng)物來源的成分的培養(yǎng)基中冷凍，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了相同的不含動(dòng)物來源的防凍劑添加劑，與用于使用動(dòng)物來源的成分的貼壁依賴性細(xì)胞冷凍的常用方法中的添加劑相同。例如，MRC-5細(xì)胞是在不含動(dòng)物來源的成分的培養(yǎng)基中冷凍的，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充了理想目標(biāo)濃度的大約2.5％-大約12.5％的DMSO，和理想的目標(biāo)濃度的大約0.01％-大約1％的甲基纖維素。
實(shí)施例III在培養(yǎng)基中在動(dòng)物或人貼壁依賴性細(xì)胞中生產(chǎn)病毒的方法步驟5病毒感染以用于使用動(dòng)物來源的成分的貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物的常規(guī)方法相同的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染貼壁依賴性細(xì)胞。例如，對(duì)于用甲型肝炎病毒(HAV)感染的MARC-5細(xì)胞來說，大約0.005-大約1的MOI目標(biāo)是理想的。在本文所披露的不含動(dòng)物來源的成分并且補(bǔ)充了表2所示成分的培養(yǎng)基中感染細(xì)胞，為了進(jìn)行病毒生產(chǎn)，任選使用蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。
步驟6病毒繁殖在與用于使用動(dòng)物來源的成分在貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物上繁殖病毒的常用方法相同的溫度下培養(yǎng)感染的貼壁依賴性細(xì)胞。例如，對(duì)于在MRC-5細(xì)胞上繁殖的HAV來說，大約31℃-大約33℃，優(yōu)選32℃的目標(biāo)溫度是理想的。在與用于使用動(dòng)物來源的成分在貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物上進(jìn)行繁殖的常規(guī)方法中使用的相同的氣氛下培養(yǎng)感染過的貼壁依賴性細(xì)胞。例如，用HAV感染過的MRC-5細(xì)胞可以在有或沒有CO2對(duì)照以及有或沒有相對(duì)濕度對(duì)照的條件下培養(yǎng)。
步驟7病毒收獲貼壁依賴性細(xì)胞的病毒感染和病毒收獲之間的病毒繁殖時(shí)間與用于使用動(dòng)物來源的成分在貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物上進(jìn)行病毒繁殖的常規(guī)方法的繁殖時(shí)間相同。例如，在MRC-5細(xì)胞上進(jìn)行的HAV繁殖是在病毒感染之后大約21-29天時(shí)間完成的。
病毒收獲方法與使用動(dòng)物來源的成分的在貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行病毒收獲的常規(guī)方法相同。例如，在MRC-5細(xì)胞上生產(chǎn)的HAV的收獲始于用PBS對(duì)細(xì)胞層進(jìn)行兩次洗滌，然后，通過細(xì)胞分離回收病毒，使用補(bǔ)充了0.1-1g/L的EDTA的PBS，然后通過冷凍進(jìn)行細(xì)胞裂解。
實(shí)施例IV培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞，直到衰老，將無花果蛋白酶用于細(xì)胞分離(參見圖1，2和3)用于MRC-5細(xì)胞衰老試驗(yàn)的小規(guī)模方法需要用在步驟1-3中披露的不含動(dòng)物來源的成分的方法重復(fù)所述細(xì)胞生產(chǎn)方法，直到出現(xiàn)衰老。來自細(xì)胞庫PDL21的MRC-5細(xì)胞不含動(dòng)物來源的成分，對(duì)它進(jìn)行解凍，接種到裝有100ml新鮮培養(yǎng)基的Nunc T175cm2燒瓶中，培養(yǎng)基按表2所述進(jìn)行了適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充，并且在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。在7天之后，在Nunc T-175cm2燒瓶中，在37℃下進(jìn)行繼代培養(yǎng)(參見步驟1-3)，將4.2ml的酶活性為45μUPABA/ml的無花果蛋白酶溶液用于細(xì)胞分離。繼代培養(yǎng)是按照以下方法進(jìn)行的·D7以1/8的比例將細(xì)胞接種在100ml由12.5％的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中·D12以1/8的比例將細(xì)胞接種在100ml由12.5％的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中·D17以1/4的比例將細(xì)胞接種在100ml由25％的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中·D21重復(fù)從D7開始的方案在該方法中，細(xì)胞接種物并不固定于目標(biāo)細(xì)胞密度。作為對(duì)照進(jìn)行的細(xì)胞計(jì)數(shù)，證實(shí)細(xì)胞接種物密度為8000細(xì)胞/cm2-33000細(xì)胞/cm2范圍內(nèi)。在培養(yǎng)90天之后，MRC-5細(xì)胞達(dá)到了群體加倍水平71，細(xì)胞生長速度為0.56 PDL/天，此后觀察到衰老。在圖1，2和3中所示出的上述結(jié)果與將豬胰蛋白酶用于細(xì)胞分離和使用牛血清的方法觀察到的結(jié)果相當(dāng)(在83天之后出現(xiàn)了出現(xiàn)了大約PDL65的衰老，并且細(xì)胞生長速度為大約0.55PDL/天(Wistrom C，Villeponteau.B.Exp.Gerontol，1990；25(2)97-105))。
實(shí)施例V培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞直到衰老，將菠蘿蛋白酶用于細(xì)胞分離(參見圖1，2和3)該方法與實(shí)施例III所披露的方法相似，不同之處在于以下各點(diǎn)-將酶活性為0.01105明膠消化的單位(GDU)/ml的菠蘿蛋白酶溶液用于細(xì)胞分離，以取代無花果蛋白酶溶液。
-繼代培養(yǎng)是按照以下方法進(jìn)行的·D7以1/8的比例將細(xì)胞接種在100ml由12.5％的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中·D12以1/8的比例將細(xì)胞接種在100ml由12.5％的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中·D17以1/4的比例將細(xì)胞接種在100ml由12.5％的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中·D21重復(fù)從D7開始的方案作為對(duì)照進(jìn)行的細(xì)胞計(jì)數(shù)，證實(shí)細(xì)胞接種物密度為8000細(xì)胞/cm2-33000細(xì)胞/cm2范圍內(nèi)。MRC-5細(xì)胞在培養(yǎng)82天之后達(dá)到了群體加倍水平67，細(xì)胞生長速度為0.56PDL/天，此后觀察到了衰老。在圖1，2和3中所示出的結(jié)果與將豬胰蛋白酶用于細(xì)胞分離和使用牛血清的方法觀察到的結(jié)果相當(dāng)(83天之后的衰老為PDL65，細(xì)胞生長速度＝0.55PDL/天(Wistrom C，Villeponteau.B.Exp.Gerontol，1990；25(2)97-105))。
實(shí)施例VI通過將無花果蛋白酶用于細(xì)胞分離而擴(kuò)增的MRC-5細(xì)胞上的HAV生產(chǎn)(參見圖7)通過將無花果蛋白酶用于細(xì)胞分離，用培養(yǎng)的MRC-5細(xì)胞在Nunc細(xì)胞工廠(CF)中進(jìn)行的HAV生產(chǎn)需要執(zhí)行在實(shí)施例II中的步驟5-7所披露的方法。在Nunc T175cm2燒瓶中，擴(kuò)增來自細(xì)胞庫(PDL21)的不含動(dòng)物來源的成分的MRC-5細(xì)胞，然后在CF中擴(kuò)增，直到群體加倍水平達(dá)到36，該過程使用實(shí)施例I的步驟1-3所披露的方法(圖7)。用HAV母液接種物感染MRC-5細(xì)胞。所述接種物是在表2所示的培養(yǎng)基中制備的，目標(biāo)MOI為0.01。在感染之后，在32℃下培養(yǎng)細(xì)胞27天，在7，14和21天之后更新培養(yǎng)基三次(圖7)。HAV收獲是在感染之后27天進(jìn)行的，首先用PBS洗滌細(xì)胞層兩次，然后用補(bǔ)充了大約0.2g/L的EDTA的PBS分離細(xì)胞，并最終冷凍細(xì)胞。使用該方法獲得的HAV總體的抗原效價(jià)為250-350 E.L.I.S.單位(ELU)/0.1ml。以上結(jié)果與將豬胰蛋白酶用于細(xì)胞分離和使用牛血清的方法觀察到的結(jié)果相當(dāng)(HAV總體抗原效價(jià)＝250ELU/0.1ml)。
實(shí)施例VII通過將菠蘿蛋白酶用于細(xì)胞分離而擴(kuò)增的MRC-5細(xì)胞上的HAV生產(chǎn)(參見圖7)該方法與實(shí)施例V所披露的方法類似，所不同的是，將酶活性為0.01105明膠消化的單位(GDU)/ml的菠蘿蛋白酶溶液用于細(xì)胞分離，以取代無花果蛋白酶溶液。
用該方法獲得的HAV的總體抗原滴度為250-350 E.L.I.S.單位/0.1ml。該結(jié)果與將豬胰蛋白酶用于細(xì)胞分離和使用牛血清的方法觀察到的結(jié)果相當(dāng)(HAV總體抗原滴度＝250ELU/0.1ml)。
實(shí)施例VIII通過將無花果蛋白酶用于細(xì)胞分離而擴(kuò)增的MRC-5細(xì)胞的細(xì)胞存庫(參見圖8，9和10)
用于通過無花果蛋白酶擴(kuò)增的MRC-5細(xì)胞的細(xì)胞存庫方法，需要重復(fù)所述細(xì)胞生產(chǎn)方法，使用實(shí)施例I的步驟1-3所披露的不含動(dòng)物來源的成分的程序，直到達(dá)到選定的PDL(PDL21)。在該P(yáng)DL下，按照實(shí)施例I的步驟4所披露的方法冷凍細(xì)胞。對(duì)來自細(xì)胞庫(PDL14)的含有血清的MRC-5細(xì)胞進(jìn)行解凍，接種到裝有100ml在表2中所示出的Nunc T175cm2燒瓶中，并且在37℃下培養(yǎng)。7天之后，在Nunc T-175cm2燒瓶中，在37℃下繼代培養(yǎng)(參見步驟1-3)，將4.2ml酶活性為45UPABA/ml的無花果蛋白酶溶液用于細(xì)胞分離。繼代培養(yǎng)是按照以下方法進(jìn)行的·D7以1/8的比例將細(xì)胞接種在100ml由12.5％的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中·D12以1/4的比例將細(xì)胞接種在100ml由25％的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中·D16用1/4的比例進(jìn)行細(xì)胞存庫在該方法中，細(xì)胞接種物并不固定于目標(biāo)細(xì)胞密度。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果如圖8，9和10所示。16天之后，MRC-5細(xì)胞達(dá)到了PDL21。在該P(yáng)DL下，在不含動(dòng)物來源的成分的，補(bǔ)充了7.5％DMSO和0.1％甲基纖維素的培養(yǎng)基中冷凍MRC-5細(xì)胞。在解凍之后，所述MRC-5細(xì)胞表現(xiàn)出的存活力和細(xì)胞生長與在冷凍之前所觀察到的結(jié)果相當(dāng)(存活力大約為90-95％，細(xì)胞生長速度＞0.55PDL/天)(參見圖1，2和3)。以上結(jié)果與將豬胰蛋白酶用于細(xì)胞分離和使用牛血清的方法觀察到的結(jié)果相當(dāng)(存活力大約為90-95％，細(xì)胞生長速度＝0.55PDL/天(Wistrom C，Villeponteau.B.Exp.Gerontol，1990；25(2)97-105))。
實(shí)施例IX通過將菠蘿蛋白酶用于細(xì)胞分離而擴(kuò)增的MRC-5細(xì)胞的細(xì)胞存庫(參見圖8，9和10)該方法與實(shí)施例VII披露的方法類似，不同之處在于以下各點(diǎn)-將酶活性為0.01105明膠消化的單位(GDU)/ml的菠蘿蛋白酶溶液用于細(xì)胞分離，以取代無花果蛋白酶溶液。
-繼代培養(yǎng)是按照以下方法進(jìn)行的·D7以1/4的比例將細(xì)胞接種在100ml由25％的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中·D11以1/8的比例將細(xì)胞接種在100ml由12.5％的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中·D16用1/4的比例進(jìn)行細(xì)胞存庫細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果如圖8，9和10所示。在16天之后所述MRC-5細(xì)胞達(dá)到了群體加倍水平為21。在解凍之后，所述MRC-5細(xì)胞表現(xiàn)出的存活力和細(xì)胞生長與在解凍之前觀察到的結(jié)果相當(dāng)(存活力大約為90-95％，細(xì)胞生長速度＞0.55PDL/天)(參見圖1，2和3)。以上結(jié)果與將豬胰蛋白酶用于細(xì)胞分離并且使用牛血清觀察到的結(jié)果相當(dāng)(存活力大約為90-95％，細(xì)胞生長速度＝0.55PDL/天(WistromC，Villeponteau.B.Exp.Gerontol，1990；25(2)97-105))。
實(shí)施例X將Trypzean(Prodigen)或r蛋白酶(Invitrogen)用于細(xì)胞分離，培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞直到衰老進(jìn)行MRC-5細(xì)胞衰老試驗(yàn)的小規(guī)模方法，涉及重復(fù)所述細(xì)胞生產(chǎn)方法，采用在實(shí)施例II的步驟1-3中所披露的不含動(dòng)物來源的成分的程序，直到觀察到衰老。來自不含動(dòng)物來源的成分的大約PDL27的細(xì)胞培養(yǎng)物的MRC-5細(xì)胞在Nunc T175cm2中進(jìn)行繁殖，使用活性為1USP/ml的Trypzean溶液或r蛋白酶(InVitrogen)溶液(用補(bǔ)充了EDTA的PBS稀釋母液30倍，與用于細(xì)胞分離的溶液相同，參見步驟實(shí)施例II的步驟1)，按照以下方法進(jìn)行·D0以1/8的比例將細(xì)胞接種在100ml由12.5％的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中·D5以1/4的比例將細(xì)胞接種在100ml由25％的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中·D9以1/8的比例將細(xì)胞接種在100ml由12.5％的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中·D14重復(fù)從D0開始的方案在該方法中，細(xì)胞接種物并不固定于目標(biāo)細(xì)胞密度。作為對(duì)照樣品進(jìn)行的細(xì)胞計(jì)數(shù)，證實(shí)細(xì)胞接種物密度為8000細(xì)胞/cm2-30000細(xì)胞/cm2。在培養(yǎng)61天之后MRC-5細(xì)胞達(dá)到了超過60的PDL，細(xì)胞生長速度為大約0.56PDL/天，此后觀察到了衰老。在圖11，12和13中所示出的結(jié)果與將豬胰蛋白酶用于細(xì)胞分離和使用牛血清的方法觀察到的結(jié)果相當(dāng)(在培養(yǎng)83天之后的衰老為大約PDL65，細(xì)胞生長速度為大約0.55PDL/天(Wistrom C，Villeponteau.B.Exp.Gerontol，1990；25(2)97-105))。
權(quán)利要求
1.缺少一級(jí)動(dòng)物來源的外源成分的細(xì)胞培養(yǎng)基，包括i)選自下組的至少一種非動(dòng)物二級(jí)來源的外源生長因子EGF，F(xiàn)GF，三-碘-L tyronine和氫化可的松，和；ii)非動(dòng)物二級(jí)來源的IGF-1和/或胰島素中的至少一種。
2.如權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基包括兩種或兩種以上選自下組的非動(dòng)物二級(jí)來源的外源生長因子EGF，F(xiàn)GF，三-碘-L tyronine和氫化可的松，以及非動(dòng)物二級(jí)來源的IGF-1和/或胰島素中的至少一種的組合。
3.如權(quán)利要求2的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基包括非動(dòng)物二級(jí)來源的EGF，F(xiàn)GF，三-碘-L tyronine和氫化可的松以及非動(dòng)物二級(jí)來源的IGF-1和/或胰島素中的至少一種的組合。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所有成分都是非動(dòng)物一級(jí)和二級(jí)來源的。
5.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，還包括非動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。
6.如權(quán)利要求5的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物來自小麥。
7.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基適合培養(yǎng)動(dòng)物，優(yōu)選人二倍體貼壁依賴性細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，當(dāng)EGF存在時(shí)，其濃度大約為0.00001-0.3mg/l；當(dāng)FGF存在時(shí)，其是bFGF形式的，濃度大約為0.00001-0.1mg/l；當(dāng)三-碘-L tyronine存在時(shí)，其濃度大約為0-1mg/l；當(dāng)氫化可的松存在時(shí)，其濃度大約為0-10mg/l；當(dāng)IGF-1存在時(shí)，其濃度大約為0.00001-5mg/l；當(dāng)胰島素存在時(shí)，其濃度大約為0.1-1000mg/l。
9.如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基是新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的混合物。
10.一種動(dòng)物，優(yōu)選人類二倍體貼壁依賴性細(xì)胞系，適合在權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)的培養(yǎng)基中生長。
11.一種動(dòng)物，優(yōu)選人類二倍體貼壁依賴性細(xì)胞系，適合在權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)的培養(yǎng)基中生產(chǎn)生物學(xué)產(chǎn)物。
12.如權(quán)利要求1的細(xì)胞系，其中，所述生物學(xué)產(chǎn)物是病毒。
13.如權(quán)利要求10-12中任意一項(xiàng)的細(xì)胞系，選自下組MRC-5，WI-38，TIG-1，TIG-7，F(xiàn)RhL-2，MRC-9，IMR-90和IMR 91。
14.一種生產(chǎn)條件培養(yǎng)基的方法，包括將權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的新鮮培養(yǎng)基與動(dòng)物或優(yōu)選人類二倍體貼壁依賴性細(xì)胞組合，以便產(chǎn)生條件培養(yǎng)基。
15.一種生產(chǎn)動(dòng)物或優(yōu)選人類二倍體貼壁依賴性細(xì)胞的方法，包括a)將所述細(xì)胞接種在權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中，并且讓所述細(xì)胞附著在基質(zhì)上；b)收獲從步驟a)得到的條件培養(yǎng)基，并且從所述基質(zhì)上分離所述細(xì)胞層，并且用非動(dòng)物來源的蛋白酶解離細(xì)胞，以便形成細(xì)胞懸浮液；c)將步驟b)的細(xì)胞懸浮液接種到裝在包括附著支持物的培養(yǎng)裝置中的所述培養(yǎng)基中，使得細(xì)胞附著；和d)在相同的培養(yǎng)基中生長所述細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求15的方法，還包括冷凍在步驟b)中收獲的細(xì)胞，以便產(chǎn)生細(xì)胞庫。
17.如權(quán)利要求15或16的方法，其中，用于步驟a)和c)中的任意一個(gè)步驟的所述細(xì)胞培養(yǎng)基是i)條件培養(yǎng)基或ii)新鮮培養(yǎng)基或iii)條件培養(yǎng)基和新鮮培養(yǎng)基的混合物。
18.如權(quán)利要求17的方法，其中，所述條件培養(yǎng)基是按1∶0-0∶1的比例(新鮮∶條件)用新鮮培養(yǎng)基稀釋。
19.如權(quán)利要求17的方法，其中，所述條件培養(yǎng)基是按7∶1-1∶7的比例(新鮮∶條件)用新鮮培養(yǎng)基稀釋。
20.如權(quán)利要求17的方法，其中，所述條件培養(yǎng)基是按3∶1-1∶3的比例(新鮮∶條件)用新鮮培養(yǎng)基稀釋。
21.如權(quán)利要求17的方法，其中，所述條件培養(yǎng)基是按3∶1的比例(新鮮∶條件)用新鮮培養(yǎng)基稀釋。
22.如權(quán)利要求15-21中任意一項(xiàng)的方法，其中所述用于步驟b)的非動(dòng)物來源的蛋白酶選自下組半胱氨酸內(nèi)肽酶，中性真菌蛋白酶，中性細(xì)菌蛋白酶或絲氨酸蛋白酶。
23.如權(quán)利要求22的方法，其中，所述絲氨酸蛋白酶是重組胰蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。
24.如權(quán)利要求22的方法，其中，所述半胱氨酸內(nèi)肽酶選自下組無花果蛋白酶，莖菠蘿蛋白酶，和獼猴桃堿。
25.一種在權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)的培養(yǎng)基中生產(chǎn)動(dòng)物或優(yōu)選人類貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，所述方法包括用非動(dòng)物來源的蛋白酶對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行傳代的步驟。
26.如權(quán)利要求25的方法，其中，所述非動(dòng)物來源的蛋白酶選自下組半胱氨酸內(nèi)肽酶，中性真菌蛋白酶，中性細(xì)菌蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。
27.如權(quán)利要求26中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述半胱氨酸內(nèi)肽酶選自下組無花果蛋白酶，莖菠蘿蛋白酶，和獼猴桃堿。
28.如權(quán)利要求14-27中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物是MRC-5，WI-38，TIG-1，TIG-7，F(xiàn)RhL-2，MRC-9，IMR-90和IMR 91細(xì)胞的培養(yǎng)物。
29.一種在權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中，在動(dòng)物或優(yōu)選人類二倍體貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)病毒的方法，所述方法包括a)用病毒感染所述細(xì)胞b)繁殖所述病毒，和c)收獲所述病毒。
30.如權(quán)利要求29的方法，其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基是如在權(quán)利要求17-21的任意一項(xiàng)中進(jìn)一步限定的。
31.如權(quán)利要求29或30的方法，還包括對(duì)收獲的病毒進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)純化步驟。
32.如權(quán)利要求29-31中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述病毒是由MRC-5，WI-38，TIG-1，TIG-7，F(xiàn)RhL-2，MRC-9，IMR-90和IMR91細(xì)胞生產(chǎn)的。
33.如權(quán)利要求29-32中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述病毒選自下組HAV，脊髓灰質(zhì)炎病毒，HSV，CMV，EBV，風(fēng)疹病毒，副粘病毒科，如腮腺炎病毒，VZV。
34.一種生產(chǎn)病毒疫苗的方法，包括將權(quán)利要求29-33的病毒與可以藥用的載體，賦形劑或佐劑混合。
35.可以通過權(quán)利要求29-33中任意一項(xiàng)的方法獲得的病毒群體。
36.一種生產(chǎn)病毒疫苗的方法，包括將權(quán)利要求34的病毒群體與可以藥用的載體，賦形劑或佐劑混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及在沒有一級(jí)動(dòng)物來源的外源成分的條件下培養(yǎng)動(dòng)物，優(yōu)選人二倍體貼壁依賴性細(xì)胞的方法，并且涉及基本上不含一級(jí)動(dòng)物來源的外源成分的、適合執(zhí)行所述方法的細(xì)胞培養(yǎng)基。具體地講，本發(fā)明涉及包括至少一種，更優(yōu)選若干種，無外源動(dòng)物的生長因子的細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明還涉及在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)動(dòng)物，優(yōu)選人二倍體貼壁依賴性細(xì)胞的方法，包括將非動(dòng)物來源的胰蛋白酶代用品用于使細(xì)胞傳代。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)病毒和人病毒疫苗等的方法。
文檔編號(hào)C12N7/02GK1756837SQ200480005848
公開日2006年4月5日 申請(qǐng)日期2004年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月3日
發(fā)明者B·G·L·埃爾茨, Y·J·M·希斯萊因, M·-M·J·貢澤, I·S·L·克諾特, C·馬格托 申請(qǐng)人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司