專利名稱：：方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種個(gè)人化的癌癥治療方法和所述方法中使用的一種試劑盒，該方法采用一組標(biāo)記基因組以預(yù)測患者是否對化學(xué)治療劑產(chǎn)生應(yīng)答。具體地說，該方法預(yù)測患者對erbB受體酪氨酸激酶抑制劑的應(yīng)答。更為具體的是，該方法利用在erbB受體酪氨酸激酶抑制劑的應(yīng)答者和非應(yīng)答者之間具有差異表達(dá)的一組標(biāo)記基因的水平，關(guān)系到那些患有單獨(dú)或部分受erbB受體酪氨酸激酶調(diào)控的癌癥的患者，尤其是患有晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)例如腺癌的患者。
背景技術(shù)：
：肺癌是癌癥死亡的最主要原因，因此也是一個(gè)主要的全球性的健康問題。在治療這種疾病中，主要依靠化學(xué)療法，因?yàn)榇蠖鄶?shù)在診斷時(shí)已經(jīng)患有局部晚期3(44％)或是轉(zhuǎn)移性階段4(32％)的疾病[1]。然而，大規(guī)模的轉(zhuǎn)移分析的結(jié)果揭示了與最佳的輔助護(hù)理相比，基于鉑的化學(xué)療法只將晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的生存期中位數(shù)延長了約6個(gè)星期[2]。在最近的十年，已經(jīng)研發(fā)出許多新的細(xì)胞毒素劑，包括紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、吉西他濱(gemcitabine)和長春瑞濱(vinorelbine)，并且給肺癌晚期患者提供了多種選擇。然而，與基于順氯氨鉑的治療相比，每種療法只提供了適中的存活效果[3][4]。最近，研發(fā)出了致力于克服常規(guī)細(xì)胞毒性劑的局限的新的治療方法，該方法包括許多分子靶向劑[5][6]。最近幾年來，發(fā)現(xiàn)某些生長因子酪氨酸激酶在起始細(xì)胞復(fù)制的生物化學(xué)信號的傳遞中非常重要。它們是跨越細(xì)胞膜的大蛋白，并具有一個(gè)用于結(jié)合生長因子如表皮生長因子(EGF)的胞外結(jié)構(gòu)域和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)部分，該細(xì)胞內(nèi)部分起著激酶的作用，使蛋白質(zhì)中的酪氨酸氨基酸磷酸化從而影響細(xì)胞增殖。已知的各種受體酪氨酸激酶分類基于結(jié)合不同受體酪氨酸激酶的生長因子家族(Wilks，AdvancesinCancerResearch，1993，60，43-73)。這些分類包括I類受體酪氨酸激酶，其包括受體酪氨酸激酶的EGF家族。這包括配體EGF的受體、TGFα(也稱為TGFA)、雙調(diào)蛋白(也稱為AREG)、β-動物纖維素、結(jié)合EGF的肝素、表調(diào)節(jié)蛋白(epiregulin)和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuregulins)(包括NRG-1、NRG-2、NRG-3和NRG-4)的受體。更為具體的是，這些受體包括那些具有功能性激酶結(jié)構(gòu)域的被稱為erbB1(EGFR)、erbB2(Neu、Her2)和erbB4(Her4)以及不具有功能性結(jié)構(gòu)域的erbB3(her3)的受體、II類受體酪氨酸激酶和III類受體酪氨酸激酶，其中II類受體酪氨酸激酶包括受體酪氨酸激酶的胰島素家族例如胰島素和IGFI受體和胰島素相關(guān)受體，III類受體酪氨酸激酶包括受體酪氨酸激酶的源于血小板的生長因子(PDGF)家族如PDGFα、PDGFβ和集落刺激因子1(CSF1)受體。已知包括EGFR、erbB2、erbB3和erbB4在內(nèi)的受體酪氨酸激酶的erbB家族常常參與驅(qū)動腫瘤細(xì)胞的增殖和存活(評述見于Olayioye等，EMBOJ.，2000，19，3159)。其可發(fā)生的一種機(jī)制是所述受體在蛋白水平上的過度表達(dá)，這通常是基因擴(kuò)增的結(jié)果。在許多普通的人類癌癥，例如包括腺癌在內(nèi)的晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)(Cerny等.，Brit.J.Cancer，1986，54，265；Reubi等.，Int.J.Cancer，1990，45，269；Rusch等.，CancerResearch，1993，53，2379；Brabenderetal，Clin.CancerRes.，2001，7，1850)和其它的肺癌(Hendler等，CancerCells，1989，7，347)中都觀察到了這一點(diǎn)(評述見于Klapper等，Adv.CancerRes.，2000，77，25)。對一種或多種上述受體錯(cuò)誤調(diào)節(jié)的結(jié)果是，普遍認(rèn)為許多腫瘤在臨床上變得更為迅速地蔓延因而導(dǎo)致更難對病人進(jìn)行預(yù)后診斷(Brabender等，Clin.CancerRes.，2001，7，1850；Ross等，CancerInvestigation，2001，19，554，Yu等.，Bioessays，2000，22.7，673)。除了這些臨床發(fā)現(xiàn)之外，很多臨床前信息表明受體酪氨酸激酶的erbB家族參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。除此之外，許多臨床前研究已經(jīng)證實(shí)了可以通過用小分子抑制劑、顯性負(fù)性或抑制性抗體敲除一個(gè)或多個(gè)erbB活性來誘導(dǎo)抗增殖作用(評述見于Mendelsohn等，Oncogene，2000，19，6550)。因此，現(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識到這些受體酪氨酸激酶的抑制劑應(yīng)當(dāng)可用作哺乳動物癌癥細(xì)胞的增殖的一種選擇性抑制劑(Yaish等.Science，1988，242，933，Kolibaba等，BiochimicaetBiophysicaActa，1997，133，F(xiàn)217-F248；Al-Obeidi等，2000，Oncogene，19，5690-5701；Mendelsohn等，2000，Oncogene.19.6550-6565)。除了這些預(yù)先的臨床數(shù)據(jù)，采用抗EGFR和erbB2的抑制性抗體(依次為c-225和曲妥珠單抗(trastuzumab))的研究結(jié)果證明其對于所選實(shí)體瘤的治療在臨床上有效(評述見Mendelsohn等，2000，Oncogene，19，6550-6565)。受體酪氨酸激酶的erbB家族的許多小分子抑制劑是已知的，尤其是EGFR和erbB2受體酪氨酸激酶的抑制劑。例如，歐洲專利申請?zhí)?566226和國際專利申請WO96/33980和WO97/30034公開了某些在4-位有一個(gè)苯胺基取代基的喹唑啉衍生物具有EGFR受體酪氨酸激酶活性，并且它們是包括前列腺癌在內(nèi)的癌癥組織增殖的抑制劑。JRWoodburn等在Proc.Amer.Assoc.CancerResearch，1997，38，633和Pharmacol.Ther.，1999，82，241-250中已經(jīng)公開了化合物N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺是一種有效的EGFR酪氨酸激酶抑制劑。利用代碼號ZD1839和化學(xué)文摘登記號184475-35-2，該化合物還被稱作易瑞沙(注冊商標(biāo))、吉非替尼(美國采用的名字)。下文中，將該化合物稱為吉非替尼。近來吉非替尼在日本已經(jīng)獲得批準(zhǔn)用于治療無法用手術(shù)進(jìn)行治療的或復(fù)發(fā)的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，并且在美國被批準(zhǔn)在鉑和多烯紫杉醇(docetaxel)化學(xué)治療失敗后作為用于治療患有局部晚期轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的單治療。此外從國際專利申請WO96/30347中已知某些在4-位有一個(gè)苯胺基取代基的結(jié)構(gòu)相關(guān)的喹唑啉衍生物也有EGFR酪氨酸激酶抑制活性。WO99/55683公開了化合物N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺或者其藥學(xué)上可接受的鹽(與代碼號CP358774和OSI-774相聯(lián)系，下文用代碼號OSI-774表示)是一種EGFRTKI。從國際專利申請WO97/38983中進(jìn)一步可知某些其它的在4-位有一個(gè)苯胺基取代基的結(jié)構(gòu)相關(guān)的喹唑啉衍生物也有EGFR酪氨酸激酶抑制活性。在J.Med.Chem.，1999，42，1803-1815和WO00/31048中公開了化合物6-丙烯酰胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(與代碼號PD183805和CI1033相聯(lián)系，下文用代碼號CI1033表示)是一種EGFRTKI。從國際專利申請WO97/02266中進(jìn)一步可知某些在4-位有一個(gè)苯胺基取代基的結(jié)構(gòu)相關(guān)的雜環(huán)衍生物也有EGFR酪氨酸激酶抑制活性。例如化合物4-[(1R)-1-苯乙基氨基]-6-(4-羥基苯基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(與代碼號PKI-166、CGP75166和CGP59326相聯(lián)系，下文用代碼號PKI-166表示)是一種EGFRTKI。從歐洲專利申請?zhí)?787722和國際專利申請WO98/50038、WO99/09016和WO99/24037中進(jìn)一步可知某些其它在4-位有一個(gè)苯胺基取代基的結(jié)構(gòu)相關(guān)的喹唑啉衍生物也有EGFR酪氨酸激酶抑制活性。例如化合物N-[4-(3-溴代苯胺基)喹唑啉-4-基]丁-2-炔酰胺(與代碼號CL-387785和EKB-785相聯(lián)系，下文用代碼號CL-387785表示)是一種EGFRTKI。從NatureMedicine，2000，6，1024-1028和美國專利號6,002,008中進(jìn)一步可知某些其它在4-位有一個(gè)苯胺基取代基的結(jié)構(gòu)相關(guān)的喹唑啉衍生物也有EGFR酪氨酸激酶抑制活性。例如化合物4-(3-氯-4-氟苯胺基)-3-氰基-6-(4-二甲基氨基丁-2(E)-烯酰胺基)-7-乙氧基喹啉(下文用代碼號EKB-569表示)是一種EGFRTKI。從WO99/35146和WO01/04111中還可得知的是，某些喹唑啉衍生物是一種或多種erbB受體酪氨酸激酶的抑制劑。例如，化合物N-f3-氯-4-[(3-氟代芐基)氧]苯基}-6-[5-({[2-(甲磺?；?乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]喹唑啉-4-胺(也表示為lapatinib或下文中以代碼號GW2016表示)就被認(rèn)為是EGF和erbB2受體酪氨酸激酶的抑制劑。NovartisAE788是另一種合適的抑制劑化合物。還可以用適當(dāng)?shù)目筫rbB受體的抗體抑制胞外配體結(jié)合到受體上從而抑制erbB受體酪氨酸激酶。例如利用抗erbB2的抗體曲妥珠單抗(trastuzumab)[HerceptinTM]和抗erbbl抗體西妥昔單抗(cetuximab)[C225]。已經(jīng)證明在臨床中使用這種抑制性抗體有利于治療所選擇的實(shí)體瘤(評述見于Mendelsohn等，2000，Oncogene，19，6550-6565)。如上所述，吉非替尼是一種表皮生長因子受體-酪氨酸激酶(EGFR-TK)的口服活性抑制劑，其阻斷了負(fù)責(zé)驅(qū)動增殖、侵襲和癌細(xì)胞生存的信號傳導(dǎo)通路[7]。在對基于鉑的化學(xué)治療不應(yīng)答的患有晚期NSCLC的登記患者的臨床研究中觀察到了有效的抗腫瘤作用和NSCLC相關(guān)癥狀和生活質(zhì)量的快速改善。在隨機(jī)的雙盲II期單藥治療試驗(yàn)(IDEAL1試驗(yàn))中，將吉非替尼用作對晚期NSCLC的化學(xué)治療的第2或第3條線所獲得的腫瘤反應(yīng)率為18.4％(95％CI11.0-25.9％)，在IDEAL2試驗(yàn)中，將其用作對晚期NSCLC的化學(xué)治療的第3或第4線所獲得的腫瘤反應(yīng)率為11.8％(95％CI6.2-19.7％)[8]、[27]、[28]。而且，在這些試驗(yàn)中，該藥的治療獲得了高疾病控制率(IDEAL1中為54.4％，IDEAL2中為42.2％)及一般的總體癥狀改善率(IDEAL1中為40.3％，IDEAL2中為43.1％)。當(dāng)與對于常規(guī)的細(xì)胞毒性劑的反應(yīng)相比時(shí)，這些結(jié)果是有希望的，但是事實(shí)仍然是該研究中的登記患者中約有半數(shù)并未獲得有效治療，病癥沒有得到改善。而且，這種藥物治療易對無應(yīng)答者產(chǎn)生副作用，包括威脅生命的副作用如間質(zhì)性肺炎[11]?；颊邔Σ煌瘜W(xué)療法的反應(yīng)各不相同，因此就需要發(fā)現(xiàn)能夠預(yù)測哪一種治療方式最適合某個(gè)具體的患者的方法。越來越多的證據(jù)提示患者對多種藥物產(chǎn)生的應(yīng)答可能與患者的遺傳圖譜有關(guān)，影響例如對某種藥物的應(yīng)答的遺傳因子的確定可用于給患者提供個(gè)人化的治療方案。這種個(gè)人化的治療方案為患者提供了使治療效果最佳的可能性，同時(shí)減少了例如與可選擇的治療方法或效果更差的治療方法有關(guān)的副作用。因此需要一種能夠預(yù)測患者對藥物的反應(yīng)的方法。發(fā)明概述實(shí)驗(yàn)證明，某些癌癥對化學(xué)治療劑的敏感性可以通過基因表達(dá)預(yù)測到，因此可以通過測定患者組織中某些基因的相關(guān)水平來確定用這些化學(xué)治療劑治療癌癥患者的適合性。因此，本發(fā)明提供了一組分離的標(biāo)記基因，包括至少一個(gè)鑒定為在患者間具有差異表達(dá)的基因，所述患者是對一種erbB受體酪氨酸激酶抑制劑的應(yīng)答者和非應(yīng)答者；所述分離的基因組包括一個(gè)或多個(gè)選自至少由包括衍生于所述基因的特異性寡核苷酸在內(nèi)的表4中所列的51個(gè)基因構(gòu)成的組中的基因。表4中，給出了這些基因在GeneBank數(shù)據(jù)庫中的登錄號。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，在所給登錄號中的序列代表的僅僅是該表格中所涉及的基因序列的例子；包括含有序列糾錯(cuò)的序列在內(nèi)的可選擇的序列、等位基因或其它變異，剪接突變等也包括在用這些名字所表示的基因的定義中。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，所涉及的序列是登錄號中所列序列以及表4a中詳細(xì)列出和陳述的具體序列。另一方面，本發(fā)明還提供了一組分離的標(biāo)記基因，包括至少一個(gè)鑒定為在患者間具有差異表達(dá)的基因，所述患者是對一種erbB受體酪氨酸激酶抑制劑的應(yīng)答者和非應(yīng)答者；所述分離的基因組包括一個(gè)或多個(gè)選自于至少由包括衍生于所述基因的特異性寡核苷酸在內(nèi)的表4中所列的51個(gè)基因構(gòu)成的組中的基因。本發(fā)明通過使治療與每個(gè)患者相適應(yīng)從而發(fā)揮各種現(xiàn)有藥物更為有效的用途，使得改良預(yù)測以及由此產(chǎn)生的癌癥患者的生活質(zhì)量的提高成為可能。優(yōu)選的組是表4中所列前40個(gè)基因中的至少一個(gè)或多個(gè)。更為優(yōu)選的組是表4中所列前20個(gè)基因中的至少一個(gè)或多個(gè)。更為優(yōu)選的組是表4中所列前12個(gè)基因中的至少一個(gè)或多個(gè)。更為優(yōu)選的組是表4中所列前5個(gè)基因中的至少一個(gè)或多個(gè)。特別優(yōu)選的組是表4a中所列前12個(gè)基因，也就是FLJ22622(例如GenBankNM024829)、AREG(例如GenBankBC009799)、COR01C(例如GenBankNM-014325)、AVEN(例如GenBankBC010488)、DUSP3(例如GenBankNM004090、DJ473B4(例如GenBankAI026836)、PHLDA2(例如GenBankBU500509)、RBM7(例如GenBankNM0106090)、EST(GenBankBX0952512)、OSMR(例如GenBankAI436027)、GCLC(例如GenBankAI971137)、COL4A3BP(例如GenBankBQ024877)。優(yōu)選的是，所述抑制劑選自吉非替尼、OSI-774、PKI-166、EKB-569、GW2016、CI-1033和一種抗erbB抗體如曲妥珠單抗(trastuzumab)和西妥昔單抗(cetuximab)。最優(yōu)選的是，所述抑制劑是吉非替尼。本發(fā)明尤其適用于預(yù)測在那些患有單獨(dú)或部分受erbB受體酪氨酸激酶調(diào)控的癌癥的患者或患者群中對前述化學(xué)治療劑的應(yīng)答。這些癌癥包括，例如非實(shí)體瘤如白血病、多發(fā)性骨髓瘤或淋巴瘤，和實(shí)體瘤如膽管、骨、膀胱、腦/CNS、乳腺、結(jié)腸直腸、子宮頸、子宮內(nèi)膜、胃、頭和頸、肺、肝、肌肉、神經(jīng)元、食道、卵巢、胰腺、胸膜/腹膜、前列腺、腎臟、皮膚、睪丸、甲狀腺、子宮和陰門腫瘤。本發(fā)明尤其適用于鑒定對例如如上定義的erbB受體酪氨酸激酶抑制劑這樣的化學(xué)治療劑產(chǎn)生應(yīng)答的患有NSCLC，尤其是包括晚期腺癌在內(nèi)的晚期NSCLC的患者。本發(fā)明通過鑒定NSCLC的“個(gè)體的癌癥圖譜”從而確定哪種腫瘤會對吉非替尼產(chǎn)生應(yīng)答，在例如NSCLC尤其是晚期NSCLC這樣的癌癥治療方面提供了相當(dāng)大的優(yōu)勢。這包括無法用第一條治療線和例如化學(xué)療法這樣的其它任何治療方法治療的患者。本發(fā)明對于治療以前無法用化學(xué)療法如基于鉑的化學(xué)療法治療的NSCLC的患者特別有效。本發(fā)明對于治療以前接受過化學(xué)療法如基于鉑的化學(xué)療法治療的局部晚期(IIIB階段)或轉(zhuǎn)移性NSCLC(IV階段)的患者也特別有效。本發(fā)明還提供了一種預(yù)測患有癌癥例如肺癌患者或患者群中對使用化學(xué)治療劑尤其是erbB受體酪氨酸激酶抑制劑進(jìn)行治療的應(yīng)答性，包括比較選自如上定義的基因組中的一組標(biāo)記基因的差異表達(dá)。優(yōu)選通過基因表達(dá)圖譜進(jìn)行表達(dá)的評價(jià)，所述基因表達(dá)圖譜采用的是基于寡核苷酸的陣列或任何形式的基于cDNA的陣列的RT-PCR(反向轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))；實(shí)時(shí)PCR、原位雜交、RNA印跡法、基因表達(dá)的連續(xù)分析(SAGE)例如Velculescu等在Science270(5235)484-487中描述的，或差別表達(dá)。這些和其它方法的細(xì)節(jié)都可以在例如Sambrook等，1989，MolecularCloningALaboratoryManual)中找到。這種評價(jià)優(yōu)選使用微陣列分析。作為選擇，或另外，所述評價(jià)還使用免疫組化分析。另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)測患有癌癥患者或患者群對使用化學(xué)治療劑尤其是erbB受體酪氨酸激酶抑制劑治療的應(yīng)答性的試劑盒，包括合適的支持介質(zhì)上的如上定義的標(biāo)記基因組。優(yōu)選的是，標(biāo)記基因連接在載體材料上或者像硝酸纖維素這樣的膜上，或尼龍或塑料膜或載玻片上。該試劑盒優(yōu)選含有一種微陣列。包括優(yōu)選實(shí)施方式的發(fā)明詳述通過下面的實(shí)施例將對本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的說明和闡述，所述實(shí)施例用于幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，但無論如何都不是要限制本發(fā)明的范圍。下面對本發(fā)明的一些要素進(jìn)行更詳細(xì)的描述。根據(jù)這里所述的實(shí)施方式的內(nèi)容，“分離的標(biāo)記基因組”在這里是指一組可用于對根據(jù)本發(fā)明的患者的應(yīng)答分類或歸類的基因?！安町惐磉_(dá)”基因是在應(yīng)答者或非應(yīng)答者組間以更高水平或更低水平表達(dá)的基因。“應(yīng)答者/非應(yīng)答者”按照國際抗癌聯(lián)盟/世界衛(wèi)生組織(UICC/WHO)標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)腫瘤應(yīng)答按如下方式分類完全性應(yīng)答(CR)在所有可評價(jià)的損傷中沒有殘留腫瘤；部分應(yīng)答(PR)在可測量的損傷的總量中有殘留的腫瘤，表現(xiàn)為由于化學(xué)療法的誘導(dǎo)，與基線相比減少了50％或更多并且沒有新的損傷；穩(wěn)定的疾病(SD)有殘留的腫瘤，不符合CR的要求；和進(jìn)行性疾病(PD)在可測量的損傷的總量中殘留的腫瘤表現(xiàn)為與基線相比增加了25％或更多或者出現(xiàn)新的損傷。本發(fā)明對于確定患者是CR還是PR尤為有效?！癊rbB受體抑制劑包括但不僅限于erbB受體酪氨酸激酶抑制劑”該家族包括如本發(fā)明發(fā)明背景部分描述的EGF、erbB2(HER)、erbB3(注意erbB3沒有功能型激酶區(qū)域)和erbB4?！盎蛱禺愋怨押塑账帷币馑际沁@些寡核苷酸對于各個(gè)基因而言是特有的，以便例如所述基因的片段唯一識別該基因。有利的是，一個(gè)基因特異性寡核苷酸長度在5至50個(gè)核苷酸之間，優(yōu)選為約15至30個(gè)寡核苷酸，最優(yōu)選為約23個(gè)寡核苷酸?！瓣嚵谢蛭㈥嚵小痹谠S多教科書和文獻(xiàn)中一般性地描述了陣列技術(shù)和各種與之相關(guān)的技術(shù)和應(yīng)用?；蜿嚵屑夹g(shù)尤其適于實(shí)施本發(fā)明。制備微陣列的方法是本領(lǐng)域中所公知的。這些方法包括Lemieux等，(1998)，MolecularBreeding4，277-289，Schena和Davis.ParallelAnalysiswithBiologicalChips.inPCRMethodsManual(eds.M.Innis，D.Gelfand，J.Sninsky)，Schena和Davis，(1999)，Genes，GenomesandChips。在DNA微陣列中APracticalApproach(ed.M.Schena)，OxfordUniversityPress，Oxford，UK，1999)，TheChippingForecast(NatureGeneticsspecialissue；January1999Supplement)，MarkSchena(Ed.)，MicroarrayBiochipTechnology，(EatonPublishingCompany)，Cortes，2000，TheScientist14[17]25，GwynneandPage，微陣列分析thenextrevolutioninmolecularbiology，Science，1999August6；和EakinsandChu，1999，TrendsinBiotechnology，17，217-218。所述技術(shù)在PCT/US01/10063和US2002090979及其參考文獻(xiàn)中有描述。供應(yīng)商包括Affymetrix(California)和ClontechLaboratories(California)。陣列技術(shù)的主要應(yīng)用包括序列的鑒定(核苷酸序列/核苷酸序列突變)和測定核苷酸序列的表達(dá)水平(豐度)。基因表達(dá)圖譜可利用陣列技術(shù)，也可結(jié)合利用蛋白組學(xué)技術(shù)(Celis等，2000，F(xiàn)EBSLett，480(1)2-16；Lockhart和Winzeler，2000，Nature405(6788)827-836；Khan等，1999，20(2)223-9)。陣列技術(shù)的其它應(yīng)用也是本領(lǐng)域中已知的；例如，核苷酸序列的發(fā)現(xiàn)、癌癥研究(Marx，2000，Science2891670-1672；Scherf，等，2000，NatGenet；24(3)236-44；Ross等，2000，NatGenet.2000Mar；24(3)227-35)，SNP分析(Wang等，1998，Science，280(5366)1077-82)、藥物發(fā)現(xiàn)、藥理基因組學(xué)(pharmacogenomics)、疾病診斷(例如，利用微觀流體裝置Chemical&EngineeringNews，F(xiàn)ebruary22，1999，77(8)27-36)、毒理學(xué)(RockettandDix(2000)，Xenobiotica，30(2)155-77；Afshari等.，1999，CancerResl；59(19)4759-60)和毒理基因組學(xué)(toxicogenomics)(功能性基因組學(xué)與分子毒理學(xué)的雜合體)。毒理基因組學(xué)的目標(biāo)是查明對有毒物的毒性反應(yīng)與暴露于這種有毒物的對象的核苷酸序列圖譜的改變之間的相關(guān)性(Nuwaysir，等(1999)，MolecularCarcinonucleotidesequencesis，24153-159)。一般而言，通過在空間上隔開文庫中的成員，任何文庫都可以以整齊的方式排列成一種陣列。適于用作排成陣列的文庫的例子包括核酸文庫、肽、多肽和蛋白質(zhì)文庫，以及其中包括任意分子的文庫例如配體文庫。因此，提到“文庫”之處，其包括陣列形式的文庫。文庫的成員通常被固定到或固定化在固相上，優(yōu)選固定在一種固體基底上，以限制試樣的擴(kuò)散和混合。尤其是，這些文庫可以被固定化在結(jié)實(shí)的平面固相上，其包括膜和無孔的基質(zhì)例如塑料和玻璃。此外，以便于標(biāo)定(也就是參考或通向某一特定標(biāo)本)的方式排列試樣。典型的是，在格子形成中將這些試樣點(diǎn)樣成斑點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)該目的，可以對一般的檢測系統(tǒng)進(jìn)行修改。例如，可將陣列固定在微板的表面上，既可以是多份試樣在一個(gè)孔中，也可以是每個(gè)孔中一種試樣。此外，固體基底可以是膜，例如硝基纖維素或尼龍膜(例如，用于印跡實(shí)驗(yàn)的膜)?？晒┻x擇的基底包括玻璃或基于二氧化硅的基底。因此，通過任意合適的本領(lǐng)域公知方法，例如通過電荷相互作用或通過化學(xué)偶聯(lián)將試樣固定到孔壁或孔的底部或者固定到膜表面上。還可以使用其它排列和固定手段，例如移液操作、滴落-接觸、壓電方式、墨水噴射和泡沫噴射技術(shù)、靜電作用等。就基于硅的芯片來說，可利用光刻法將試樣排列和固定在芯片上?？梢酝ㄟ^形成″斑點(diǎn)″排列在固體基底上；這可通過手動或利用機(jī)器人技術(shù)來固定試樣。一般而言，陣列可被稱為巨陣列或微陣列，區(qū)別在于試樣斑的尺寸。巨陣列通常含有尺寸約為300微米或更大的試樣斑，通過現(xiàn)有的凝膠和印跡掃描儀就可簡便地成像。微陣列中的試樣斑尺寸直徑通常小于200微米，這種陣列通常含有數(shù)千個(gè)斑點(diǎn)。因此，微陣列可能需要專業(yè)化的機(jī)器人技術(shù)和成像設(shè)備，這可能需要定做。由Cortese，2000，TlaeScientist14[11]26做的評述中概括地描述了使用儀器的方法。用于生產(chǎn)DNA分子的固定化文庫的技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中已有描述。一般而言，最早的技術(shù)方法描述了如何制備單鏈核酸分子文庫，采用例如分色涂蓋技術(shù)在固體基底上的多個(gè)不連續(xù)的位點(diǎn)建立序列的各種排列。US5,837,832描述了一種用于生產(chǎn)固定在硅質(zhì)基底上的DNA陣列的改良方法，其基于超大規(guī)模集成化技術(shù)。尤其是，US5,837,832描述了一種用于制備位于基底上的空間確定的位點(diǎn)上特異性的探針組合的被稱之為“貼瓷磚”的策略，其可用于生產(chǎn)本發(fā)明的固定化DNA文庫。US5,837,832也提供了可以使用的早期技術(shù)的參考文獻(xiàn)。為了幫助檢測，可以用像熒光、生物發(fā)光、磷光、放射性報(bào)道分子這樣的任意可簡單檢測的報(bào)道分子來標(biāo)記目標(biāo)和探針。在Shalon等，1996，GenomeRes6(7)639-45中公開了探針和目標(biāo)的標(biāo)記。本發(fā)明方法中所采用的材料理想地是適于制備試劑盒的材料。一般包括一套說明書。常規(guī)的重組DNA方法技術(shù)除非另有說明，本發(fā)明采用了常規(guī)的化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫技術(shù)，這些技術(shù)在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有說明。參見例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，MolecularCloningALaboratoryManual，SecondEdition，Books1-3，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel，F(xiàn).M.等(1995andperiodicsupplements；CurrentProtocolsinMolecularBiology，ch.9，13，and16，JohnWiley&Sons，NewYork，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，andA.Kahn，1996，DNAIsolationandSequencingEssentialTechniques，JohnWiley&Sons；M.J.Gait(Editor)，1984，OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach，IrlPress；以及D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，MethodsofEnzymologyDNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology，AcademicPress。這些常規(guī)文件都并入本文作為參考。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，采用一種表示27,648個(gè)基因的cDNA微陣列系統(tǒng)篩選能夠?yàn)橥砥贜SCLC預(yù)測對吉非替尼的應(yīng)答性的一組基因。對表達(dá)圖譜的統(tǒng)計(jì)分析鑒定出了12個(gè)在對吉非替尼的應(yīng)答者和非應(yīng)答者之間差異表達(dá)的基因。一種基于這些基因表達(dá)的藥物應(yīng)答評分系統(tǒng)成功地預(yù)測了對吉非替尼治療的應(yīng)答。圖1圖解說明四種典型的肺腺癌的激光-微光束顯微解剖的圖。上行顯示的是解剖之前的樣品；下行表示的是經(jīng)解剖的癌癥細(xì)胞(H.E.菌株X100)。TBB顯示的是轉(zhuǎn)支氣管活組織檢查；LN表示的是淋巴結(jié)。圖2建立一種用于預(yù)測吉非替尼治療效率的評分系統(tǒng)。A.當(dāng)區(qū)分基因的數(shù)量改變時(shí)出現(xiàn)了不同的預(yù)測分。區(qū)分基因組的編號(從5到51)對應(yīng)于從表4的按等級排序列表的頂部選擇出的基因的編號。分類評分(CS)的值越大表明兩組分離得越好。B.采用了用于吉非替尼-敏感性(左)的51個(gè)候選基因和12個(gè)最終為了GRS而選出的預(yù)測基因的17個(gè)“學(xué)習(xí)”病例的等級群聚。樹狀圖代表的是單個(gè)的病例之間表達(dá)模式的形似性；分枝越長表示差異越大。這兩組被12-基因組最為清楚地分開。C.非應(yīng)答者和應(yīng)答者的差異的示意圖，和基于GRS檢驗(yàn)的“檢驗(yàn)病例”。紅色菱形表示學(xué)習(xí)PR病例的預(yù)測分，藍(lán)色菱形表示學(xué)習(xí)PD病例。粉色三角形表示未用于建立GRS的檢驗(yàn)PR病例，藍(lán)色三角形表示檢驗(yàn)PD病例。黃色三角形表示在整個(gè)4個(gè)月的觀察期間保持SD狀態(tài)的檢驗(yàn)SD病例，綠色三角形表示曾經(jīng)在該研究中的某一時(shí)間點(diǎn)被鑒定為SD而在治療開始后三至四個(gè)月內(nèi)顯示出進(jìn)行性的檢驗(yàn)病例。圖3用半定量RT-PCR和免疫組織化學(xué)分析對GRS的確認(rèn)。A.對PR和PD組的RNA的半定量RT-PCR分析的代表性圖象。OSMR和GCLC基因在非應(yīng)答者中過表達(dá)(PD)。通過ACTB的擴(kuò)增來控制每一cDNA模板的完整性。B.用抗AREG抗體(X200)對從同一PD患者(No.LC21)獲得的纖維鏡經(jīng)支氣管(肺)活組織檢查(TBB)和淋巴結(jié)(LN)活組織檢查的代表性樣品進(jìn)行組織免疫化學(xué)染色。C.用抗其它四個(gè)預(yù)測標(biāo)記(TGFA，ADAM9，CD9和OSMR)的抗體(X200)對來自PD患者(No.LC21)的代表性樣品進(jìn)行組織免疫化學(xué)染色。圖4由ELISA測定的5個(gè)PR、10個(gè)SD和20個(gè)PD腺癌病例中的TGFA血清濃度。TGFA的平均血清水平由黑條紋表示在PD患者中為19.0±2.8pg/ml(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)，在SD患者中為13.9±1.9pg/ml，在PR患者中為12.8±1.4pg/ml。圖5.分泌的AREG對吉非替尼-敏感性PC-9細(xì)胞的抗細(xì)胞凋亡作用。A.通過半定量RT-PCR檢查的AREG轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞系PC-9、NCI-H358和-H522中的表達(dá)。B.在從NCI-H358或-H522細(xì)胞的培養(yǎng)物獲得的補(bǔ)充有10％FCS的培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基或無血清條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的PC-9細(xì)胞。每一種培養(yǎng)基都曾經(jīng)在48小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)替換成同一種培養(yǎng)基；在加入濃度為0.5或1.0μM的吉非替尼后72小時(shí)，通過MTT檢測測量細(xì)胞生存能力。對該試驗(yàn)做了三次。Y軸表示培養(yǎng)在不同培養(yǎng)基中的細(xì)胞的相對MTT值(存在0.5或1.0μM的吉非替尼的MTT/不存在吉非替尼的MTT)。C.以自分泌形式分泌的AREG對NSCLC細(xì)胞對吉非替尼的抗性的影響。在培養(yǎng)開始時(shí)，將PC-9細(xì)胞接種在含有1.0μM的吉非替尼和重組的AREG蛋白(終濃度為1-100ng/ml)的培養(yǎng)基中；72小時(shí)后，用通過三次重復(fù)的MTT測定來檢測細(xì)胞的生存能力(藍(lán)條)。Y軸表示細(xì)胞的相對MTT值(在各濃度的AREG下的MTT/沒有AREG的MTT)。還研究了在沒有1.0μM的吉非替尼存在條件下AREG對NSCLC細(xì)胞的生存能力的影響。將單個(gè)的PC-9細(xì)胞加入到含有重組AREG蛋白但沒有吉非替尼的培養(yǎng)基中；72小時(shí)后，用通過三次重復(fù)的MTT測定來檢測細(xì)胞的生存能力(紅條)。圖6對PD和PR患者的切片中的雙調(diào)節(jié)素表達(dá)進(jìn)行的免疫組織化學(xué)分析。材料和方法患者和組織樣本進(jìn)行包括多中心試驗(yàn)的II期臨床研究，以探究產(chǎn)生臨床抗腫瘤效果的主要生物學(xué)因子以及研究在以前接受化學(xué)治療沒有成功的患有非小細(xì)胞肺癌患者中以每日250mg劑量的ZD1839的不利的藥物反應(yīng)(ADR)和藥代動力學(xué)。主要的目的就是闡明能夠預(yù)先確定吉非替尼可能的抗腫瘤效果的基因表達(dá)圖譜。研究初始，采用至今為止作為基礎(chǔ)原理的研究測定了樣本尺寸12，13。由于在患有肺癌的患者中對吉非替尼的應(yīng)答率已經(jīng)低于20％8-10，為了獲得上述檢測的學(xué)習(xí)病例，檢測了約50位患者。那些局部晚期患者(IIIB階段)或轉(zhuǎn)移性NSCLCs對一種或多種常規(guī)的化療方案產(chǎn)生抵抗的患者都被收錄到該試驗(yàn)中。收錄的標(biāo)準(zhǔn)是(1)年齡大于20歲(2)體力狀態(tài)(PS)0-2，(3)足夠的肝和腎機(jī)能試驗(yàn)。所有患者都在日本的德島大學(xué)或KinkiUniversity醫(yī)院接受治療，每天口服一次250mg的吉非替尼。該治療一直持續(xù)到患者由于(1)疾病的進(jìn)行，(2)無法忍受的毒力或(3)撤回允諾而脫離該研究。在開始治療后每隔4星期就按照國際抗癌聯(lián)盟/世界衛(wèi)生組織(UICC/WHO)概述的標(biāo)準(zhǔn)對目標(biāo)腫瘤應(yīng)答進(jìn)行評定。應(yīng)答的分類如下完全應(yīng)答(CR)，在所有可評價(jià)的損傷中沒有殘留腫瘤；部分應(yīng)答(PR)在可測量的損傷的總量中有殘留的腫瘤，表現(xiàn)為由于化學(xué)療法的誘導(dǎo)，與基線相比減少了50％或更多并且沒有新的損傷；穩(wěn)定的疾病(SD)有殘留的腫瘤，不符合CR的要求；和進(jìn)行性疾病(PD)在可測量的損傷的總量中殘留的腫瘤表現(xiàn)為與基線相比增加了25％或更多或者出現(xiàn)新的損傷。所有可評價(jià)的損傷都是采用與基線相同的技術(shù)如普通X-射線、CT或MRI以二維方式測量的(可測量的損傷的最大直徑與其最長的垂線的乘積之和)。在4個(gè)月治療結(jié)束(或停止服藥)時(shí)，根據(jù)下列定義評定每位患者的最佳總應(yīng)答CR，在兩個(gè)連續(xù)的檢測時(shí)間點(diǎn)之間的間隔為至少28天的符合CR要求的患者；PR，在兩個(gè)連續(xù)的檢測時(shí)間點(diǎn)之間的間隔為至少28天的被判定為PR或更好的患者；SD，在兩個(gè)連續(xù)的檢測時(shí)間點(diǎn)之間的間隔為至少28天的被判定為SD或更好但不符合CR或PR的患者。SD病例的第一次判斷應(yīng)該在第一次腫瘤檢測時(shí)間點(diǎn)或這之后(隨機(jī)取樣28天后)；PD，在第一次腫瘤檢測時(shí)間點(diǎn)或這之前被確定為PD的患者(隨機(jī)取樣28天后)；未知，不符合對加重的疾病最佳應(yīng)答的患者，在基線之后(隨機(jī)取樣之前)和在進(jìn)行之前所有的目標(biāo)狀態(tài)都是未知的。在吉非替尼治療前，經(jīng)書面同意經(jīng)支氣管(肺)(TBB)、皮膚或淋巴結(jié)活組織檢查取出腫瘤樣本。從各個(gè)研究所的倫理委員會已經(jīng)獲得論理學(xué)的允許。立刻冰凍活組織檢查樣本，包埋在TissueTekOCT培養(yǎng)基中(Sakura，Tokyo，Japan)，在80℃下儲存。對所有的樣本都進(jìn)行了顯微鏡檢驗(yàn)，一開始就選擇了來自于28名患者(17個(gè)學(xué)習(xí)病例和11個(gè)檢驗(yàn)病例)的樣本以進(jìn)行進(jìn)一步分析，這些樣本都含有足夠的癌癥細(xì)胞以用于表達(dá)圖譜分析。為了驗(yàn)證該預(yù)測系統(tǒng)，來自于5個(gè)新登記的病例(4PD和1SD)的樣本的隨機(jī)組合(blindedset)也被加入到11個(gè)檢驗(yàn)病例中。這些患者的臨床和組織學(xué)信息被總結(jié)在表1-3中。顯微解剖考慮到癌癥細(xì)胞和各種從一種腫瘤到遞呈到另一種上的實(shí)質(zhì)細(xì)胞在比例上的差異，顯微解剖是一種在cDNA陣列上獲得精確的基因表達(dá)圖譜的必要手段。因此，我們用蘇木精和曙紅對8μm厚的冰凍切片染色，使用μCUT激光微光束顯微解剖系統(tǒng)(MolecularMachines&IndustriesAG，Glattbrugg，Switzerland)14選擇性地收集癌癥細(xì)胞。在該系統(tǒng)中，組織切片被安置在一種薄的支撐性聚乙烯膜上，該膜將會與該靶組織一起被切下；脈沖-紫外線(UV)狹窄光束聚焦激光沿著可在顯示屏觀察到的預(yù)先選擇的路線切下癌癥細(xì)胞。這種要提取的材料決不直接暴露于激光下而是僅僅被激光包圍；不像其它LMM系統(tǒng)，這使得切下的細(xì)胞在沒有輻射的條件下得以恢復(fù)從而繼續(xù)存活。采用這種系統(tǒng)，我們能夠快速分離組織的小片區(qū)域，并從組織切片中分離出單細(xì)胞(圖1)。RNA提取和基于T7的RNA擴(kuò)增用RNeasy迷你試劑盒和不含RNA酶的DNA酶試劑盒(QIAGEN，Hilden，Germany)按照生產(chǎn)商提供的方案從癌癥細(xì)胞的各顯微解剖群中提取總RNA。如上所述，對總RNAs進(jìn)行基于T7的RNA擴(kuò)增15。從每份樣本中進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增獲得40-200μg的aRNA(經(jīng)擴(kuò)增的RNA)(＞100,000倍)。作為對照探針，以同樣方式擴(kuò)增出正常人肺poly(A)+RNA(BDBiosciencesClontech，PaloAlto，CAandBIOCHAIN，Hayward，CA，USA)。在Cy5-dCTP和Cy3-dCTP存在下分別將各樣本和對照組中的aRNA等分樣品(2-5μg)反轉(zhuǎn)錄。cDNA微陣列我們的“廣及基因組-范圍的”cDNA微陣列系統(tǒng)含有從國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的UniGene數(shù)據(jù)庫中選出的27,648個(gè)cDNAs15。所述微陣列的制作、雜交、清洗和信號強(qiáng)度的檢測以前都被描述過15。為了使腫瘤和對照組中的mRNA量標(biāo)準(zhǔn)化，將每種基因表達(dá)的Cy5/Cy3比率調(diào)整到使得52個(gè)管家基因的平均Cy5/Cy3比率等于1。我們利用方差分析將截止值分配給每一個(gè)微陣列玻片以如下方式計(jì)算基因的Cy5/Cy3比率(1)如果Cy5(癌癥樣本)低于截止水平，那么該基因的Cy5/Cy3比率就被替換為其Cy5和Cy3高于切斷水平的其它基因的Cy5/Cy3比率中的2.5％；(2)如果Cy3(對照樣本)低于截止水平，那么該基因的Cy5/Cy3比率就被替換為其Cy5和Cy3高于切斷水平的其它基因的Cy5/Cy3比率中的97.5％；(3)如果Cy5和Cy3都低于截止水平，那么該基因的Cy5/Cy3比率就空著。用于預(yù)測對吉非替尼應(yīng)答的基因的提取為了發(fā)現(xiàn)可能與對吉非替尼的敏感性相關(guān)的基因，比較了兩組患者間約27,648個(gè)基因的各種測量結(jié)果，這兩組中其中一組被分類為對吉非替尼應(yīng)答者(PR)，另一組分為非應(yīng)答者(PD)。為了減小可能在兩類間存在差異的有效基因的數(shù)目的維數(shù)，我們僅提取了滿足以下兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的基因1)在各組的至少60％中的信號強(qiáng)度高于截止水平，和2)|MEDPR-MEDPD|□1，其中MED指示在每組中從對函數(shù)變換的相對表達(dá)比率計(jì)算而獲得的中位數(shù)。然后應(yīng)用隨機(jī)置換測試來測定各個(gè)基因區(qū)分兩類(PR和PD)的能力；從經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換的兩組中每種基因的相對表達(dá)比率計(jì)算出平均值(μ)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ)。每種基因的辨別分值定義如下DS＝(μPR-μPD)/(σPR+σPD)。對于各組中的每一對都將樣本隨機(jī)置換1000次。由于每種基因的DS數(shù)據(jù)組都顯示出正常的分布，因此我們計(jì)算出一種用于使用者定義分組的p值。藥物反應(yīng)分值的計(jì)算我們按照前述方法計(jì)算出反映候選預(yù)測基因表達(dá)水平的吉非替尼應(yīng)答評分(GRS)16-18。每一種基因(gi)是投票贊成應(yīng)答者(PR)還是非應(yīng)答者(PD)依賴于樣本中表達(dá)水平(xi)是否接近于標(biāo)準(zhǔn)樣本中的一組或另一組的平均表達(dá)水平。票數(shù)的數(shù)量(vi)反映了樣本中的表達(dá)水平與兩個(gè)分類的平均值的偏差Vi＝|xi-(μPR+μPD)/2|。我們統(tǒng)計(jì)了票數(shù)而獲得了支持應(yīng)答者(VPR)和非應(yīng)答者(VPD)的總票數(shù)，并且以如下方式計(jì)算出GRS值GRS＝((VPR-VPD)/(VPR+VPD))×100，其中GRS值反映了在應(yīng)答者或非應(yīng)答者的方向中的勝利的界限。GRS值的范圍在-100至100；GRS的絕對值越高，預(yù)測的可靠性越強(qiáng)。評分的交互證實(shí)以及對預(yù)測系統(tǒng)的評價(jià)通過末位淘汰方法獲得所有樣本的預(yù)測得分，在該方法中，每一次從樣本組中移除一種樣本；使用剩下的樣本計(jì)算每種基因的兩個(gè)分類的置換p值和平均值。通過計(jì)算預(yù)測得分來預(yù)測留下的樣本的藥物反應(yīng)。對于每份樣本都要重復(fù)一遍上述步驟16-17。為了評價(jià)預(yù)測系統(tǒng)的可靠性，我們采用每個(gè)基因組合中的應(yīng)答者和非應(yīng)答者的GRS值以如下方式計(jì)算出“分類得分”(CS)CS＝(μGRSpr-μGRSpd)/(σGRSpr+σGRSpd)17。CS值越大說明由預(yù)測系統(tǒng)將兩組分開得越好。分級群聚我們利用可從網(wǎng)上獲得的M.Eisen(http//genome-www5.stanford.edu/MicroArray/SMD/restech.html)編寫的軟件(″Cluster″and″TreeView″)制作出微陣列序列數(shù)據(jù)的圖示并制作出分級群聚的樹狀圖。在應(yīng)用聚類算法之前，將每個(gè)斑點(diǎn)的熒光比率首先進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，然后對于每種樣本的數(shù)據(jù)，以中位數(shù)為中心排除掉實(shí)驗(yàn)誤差。半定量RT-PCR分析使用寡(dT)12-18引物和SuperScriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)逆轉(zhuǎn)錄雜交到微陣列玻片上的來自于各個(gè)樣本和正常對照肺的相同aRNA的等分樣品(5.0μg)。使用下組特異于用于建立GRS的前12個(gè)基因的合成引物或者使用β-肌動蛋白(ACTB)特異性引物作為一種內(nèi)部對照來進(jìn)行半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)FLJ22662，5’-GCCATAAGTGGTCCCACAGT-3’和5’-GTCTTCTAGTCCGTCATCTCCCT-3’；雙調(diào)蛋白(AREG)5’-CCATAGCTGCCTTTATGTCTGC-3’和5’-CTTTTTACCTTCGTGCACCTTT-3’；冠蛋白、肌動蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)、1C(CORO1C)、5’-TAATCTGCTGAGGACCTTTTGTC-3’和5’-TAATTCACTGTCCTCTTCTGGGA-3’；細(xì)胞凋亡、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活性抑制因子(AVEN)、5’-GCTCACAGCAGTAAATGCCTA-3’和5’-TGCTATGCTGTAAACACTGGCTA-3’；雙特異性磷酸酶3(DUSP)、5’-GGATCCTTTATTGGTGGTAGAGC-3’和5’-CCAGAGTGACCCTGAAGATAAAT-3’；DJ473B4、5’-ACCTGATTCTCTAGGTGCAGTTT-3’和5’-GTCGTTTCAACCAGGTAGTTTTG-3’；血小板白細(xì)胞C激酶底物同源性樣區(qū)域、家族A、成員2(PHLDA2)，5’-GGGCGCCTTAAGTTATTGGA-3’和5’-GGATGGTAGAAAAGCAAACTGG-3’；RNA結(jié)合基序蛋白7(RBM7)，5’-TGTAAATGGAGATTGTACAGGTTG-3’和5’-AGGAACAGTACAAATGCTGTGGT-3’；BX092512(EST)、5’-GCACTCCTTGAAGGTACACTAAC-3’和5’-ATTTGTATTCACTCAGCCATGC-3’；制瘤素M受體(OSMR)、5′-ACCCAACTTCAAAACTAGGACTC-3′和S′-ACAGCTTGATGTCCTTTCTATGC-3′；谷氨酸-半胱氨酸連接酶、催化亞基(GCLC)、5′-TCATGAAAGGCACTGAGTTTTG-3′和5′-GTTAGCTGAAGCAGCTITATTGC-3′；膠原、IV型、α3結(jié)合蛋白(COL4A3BP)，5′-ATATGCACAATCCTGGAAGTGA-3′和5′-TGCCTTACTAGCATTACCACCAT-3′；ACTB、5′-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3′和5′-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGG3′。已針對循環(huán)數(shù)對PCR反應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化以確保產(chǎn)物濃度在擴(kuò)增的對數(shù)生長期內(nèi)。我們進(jìn)行了磷光成像定量分析(MolecularImagerFXBio-RadLaboratories，Hercules，CA，USA)，并且將RT-PCR的譜帶強(qiáng)度與微陣列數(shù)據(jù)中的標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)的Cy5/Cy3比率進(jìn)行了定量比較。進(jìn)行RT-PCR以篩選出最近報(bào)道的作為一種突變熱點(diǎn)的EGFR的第709-870位密碼子的完整區(qū)域(從p-環(huán)至活化環(huán))中的突變，其中采用了三組引物片段1，5’-TCTTACACCCAGTGGAGAAGC-3′和5′-GTCTTTGTGTTCCCGGACAT-3’；片段2，5′-ACTATGTCCGGGAACACAAA-3′和5′-TTCCGTCATATGGCTTGG-3′；片段3，5′-CGTCGCTATCAAGGAATTAAGAG-3′和5′-GTAGCTCCAGACATCACTCTGGT-3′。通過直接測序分析了經(jīng)吉非替尼治療的19名患者的RT-PCR產(chǎn)物。免疫組織化學(xué)分析為了證實(shí)編碼EGFR和其它ERBB成員的配體的AREG和轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGFA)蛋白和其它3個(gè)公知的與EGFR信號傳遞相關(guān)的用于預(yù)測對于吉非替尼的應(yīng)答者和對非應(yīng)答者的候選標(biāo)記(一種解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶區(qū)域9(ADAM9)、CD9抗原(p24)和OSMR)的差異表達(dá)，我們用ENVISION+試劑盒/HRP(DakoCytomation，GlostrupDenmark)對由纖維鏡經(jīng)支氣管(肺)活組織檢查(TBB)和淋巴結(jié)活組織檢驗(yàn)獲得的臨床組織切片進(jìn)行染色。在內(nèi)源性過氧化物酶和蛋白質(zhì)封閉反應(yīng)后，迅速加入抗人AREG多克隆抗體(NeoMarkers，F(xiàn)remont，CA，USA)、抗人TGFA單克隆抗體(Calbiochem，Darmstadt，Germany)、抗人ADAM9單克隆抗體(R&DSystemsInc.Minneapolis，MN，USA)、抗人CD9單克隆抗體(NovocastraLaboratoriesLtd，NewcastleuponTyne，UK)或抗人OSMR單克隆抗體(SantaCruzBiotechnology，Inc.，SantaCruz，CA，USA)，然后以經(jīng)HRP標(biāo)記的抗兔或抗小鼠IgG作為第二抗體。然后加入基質(zhì)-色原體，使用蘇木精將樣本復(fù)染色。選出來自于11名患者的病毒組織樣本用于免疫組織化學(xué)分析。由沒有臨床重復(fù)數(shù)據(jù)的預(yù)先知識的三名獨(dú)立的研究人員通過評分強(qiáng)度將免疫染色的陽性半定量地評估為缺乏或陽性的。只有當(dāng)評論者獨(dú)立地定義為陽性時(shí)才認(rèn)為這些案例是陽性的。ELISA從由35名接受了根據(jù)與日本的廣島大學(xué)醫(yī)院的該項(xiàng)臨床研究同樣的方案以吉非替尼治療的肺-ADC患者(5名PR、10名SD和20名PD)組成的獨(dú)立的組中獲得血清。所有患者血清都是在診斷時(shí)征得患者同意下于開始治療后每隔4周獲得的，并且儲存于-80℃。通過采用一種可商購的酶檢測試劑盒(TGF-alphaELISA試劑盒OncogeneRsearchProducts，SanDiego，CA，USA)的ELISA檢測血清的TGFA水平。體外吉非替尼治療和AREG-自分泌測定人NSCLC(腺癌)細(xì)胞系PC-9、NCI-H358和NCI-H522是從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；Rockville，MD，USA)購買的。為了檢測AREG在這些NSCLC(腺癌)細(xì)胞中的表達(dá)，用寡(dT)12-18引物和SuperscriptII(Invitrogen)將各個(gè)細(xì)胞系的總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。按以前描述的方式進(jìn)行半定量反轉(zhuǎn)錄酶-PCR(RT-PCR)14。吉非替尼(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲基-6-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉ZD1839，易瑞沙)是由AstraZenecaPharmaceuticals(Macclesfield，UK)提供的，它是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶的抑制劑。以10mM的濃度將該藥溶解于DMSO，并保存在-20℃。我們進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)以確定肺腺癌細(xì)胞系對吉非替尼治療的敏感性。以5×105細(xì)胞/100-mm培養(yǎng)皿的濃度將細(xì)胞平鋪，并且在合適的無血清培養(yǎng)基中用1.0μM的吉非替尼進(jìn)行處理。在處理后將細(xì)胞胰蛋白酶消化72小時(shí)，收集于PBS中，在70％冷乙醇中固定30分鐘。用100μg/ml核糖核酸酶(Sigma-AldrichCo.，St.Louis，MO，USA)處理后，用50μg/ml的PBS中的碘化丙錠(Sigma-AldrichCo.)對細(xì)胞染色。在BectonDickinsonFACScan上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)，用ModFit軟件(VeritySoftwareHouse，Inc.，Topsham，ME，USA)分析。從至少20,000個(gè)無門控的細(xì)胞中確定了細(xì)胞周期的G0/G1、S和G2/M期的細(xì)胞核的百分?jǐn)?shù)以及G1亞期的總數(shù)。為了研究AREG的作用是否是在吉非替尼處理的肺腺癌細(xì)胞中發(fā)揮自分泌抗細(xì)胞凋亡因子的作用，我們進(jìn)行了以下測定。首先在吉非替尼處理前，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)不表達(dá)AREG的吉非替尼敏感性PC-9細(xì)胞至少8小時(shí)。然后將這些細(xì)胞與0.5或1.0μM吉非替尼一起在無血清培養(yǎng)基或補(bǔ)充有10％FCS的培養(yǎng)基或者是從表達(dá)AREG的細(xì)胞(NCI-H358或NCI-H522)的72小時(shí)培養(yǎng)物中收集的無血清條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時(shí)。在48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)用含有吉非替尼的相同培養(yǎng)基將每種培養(yǎng)基都更換一次。為了檢測每個(gè)細(xì)胞系對吉非替尼的反應(yīng)，通過采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CellCountingKits)(WAKO，Osaka，Japan)的MTT檢測評價(jià)生存能力。為了證實(shí)AREG對吉非替尼抗性NSCLC細(xì)胞的自分泌的影響，我們在含有1.0μM吉非替尼和終濃度為1-100ng/ml的重組AREG蛋白(Genzyme-Techne，Minneapolis，MN，USA)的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)PC-9細(xì)胞72小時(shí)。用MTT檢測評價(jià)細(xì)胞的生存能力。還通過在無血清無吉非替尼僅含重組AREG蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)PC-9細(xì)胞而評價(jià)了AREG自身對NSCLC細(xì)胞的的生存能力的影響。以上述方式進(jìn)行MTT檢測。結(jié)果對吉非替尼治療的應(yīng)答在53名參加本試驗(yàn)的患者中，46名的腫瘤被診斷為腺癌(86.8％)；5名為扁平細(xì)胞癌(9.4％)；兩名為大細(xì)胞癌(3.8％)。15名患者實(shí)現(xiàn)了PR并且沒有人顯示出CR；17名患者被分類為SD，19名被分類為PD。有2名患者的臨床應(yīng)答數(shù)據(jù)無法獲得。該治療的腫瘤應(yīng)答率(CR+PR/CR+PR+SD+PD)為29.4％，疾病控制率為(CR+PR+SD/CR+PR+SD+PD)62.8％(表1)。腫瘤樣本是從43名患者中收集的。來自于這43名患者的樣本含有足夠的腫瘤細(xì)胞數(shù)量以用于分析我們的cDNA微陣列上的表達(dá)圖譜。所認(rèn)定的適于進(jìn)行進(jìn)一步微陣列分析的樣本的數(shù)量為8個(gè)PR、7個(gè)SD、13個(gè)PD(表2)。以28個(gè)樣本中的17個(gè)作為學(xué)習(xí)病例(7個(gè)PR、10個(gè)PD)進(jìn)行分析，以11個(gè)樣本作為檢驗(yàn)病例(1個(gè)PR、3個(gè)PD、7個(gè)SD)以建立一種預(yù)測吉非替尼治療效果的預(yù)測評分系統(tǒng)。為了進(jìn)一步確認(rèn)該預(yù)測系統(tǒng)的有效性，獲得了另外一組來自于5名新加入的檢測病例(4個(gè)PD和1個(gè)SD)的樣本的隨機(jī)組合(blindedset)，最后將其加入到上述起初的11個(gè)檢驗(yàn)病例中。與對吉非替尼的敏感性相關(guān)的基因的鑒定我們通過比較27,648個(gè)基因的表達(dá)水平試圖提取在PR組(定義為應(yīng)答者)中的7名患者的腫瘤和PD組(定義為非應(yīng)答者)的10名患者的腫瘤之間差異表達(dá)的基因。(表2，3)我們進(jìn)行隨機(jī)置換檢驗(yàn)以區(qū)分由腫瘤應(yīng)答定義的兩種亞類，鑒定出置換p值低于0.001的51個(gè)基因(表4)。在非應(yīng)答者中，40個(gè)基因的表達(dá)水平更高一些，其它11個(gè)基因的表達(dá)水平更低一些。一種預(yù)測吉非替尼治療效果的預(yù)測評分系統(tǒng)的建立基于上述51個(gè)選出的基因的表達(dá)圖譜，我們試圖建立一種預(yù)測吉非替尼治療效果的預(yù)測評分系統(tǒng)。預(yù)測得分，稱之為吉非替尼應(yīng)答得分(GRS)，是按照前述方法計(jì)算的(參見方法部分)。為了確定用于提供兩組的最佳區(qū)分的候選基因的數(shù)量，我們基于它們的置換p值的顯著性對這51個(gè)基因進(jìn)行了按序排列并且通過末位淘汰檢驗(yàn)法(leave-one-outtest)從按序排列的列表的底部開始遞減1個(gè)(51、50、49、48等等)計(jì)算了預(yù)測得分。我們計(jì)算出一種分類得分(CS)，這是我們以前定義的用于評價(jià)每組基因區(qū)分兩種類別的能力的一種標(biāo)準(zhǔn)17。如圖2A中所示，在差別基因的數(shù)量改變時(shí)我們獲得了不同的預(yù)測得分。當(dāng)我們采用我們的候選基因列表中的頭12個(gè)基因計(jì)算得分時(shí)，我們獲得了最佳CS，這意味著應(yīng)答者與非應(yīng)答者得以最佳區(qū)分。采用所有51個(gè)基因或僅僅頭12個(gè)基因的分級群聚分析，根據(jù)對吉非替尼的應(yīng)答將所有17個(gè)病例分至兩組中的其中一組(圖2，B)。當(dāng)我們使用這頭12個(gè)基因進(jìn)行簇分析時(shí)，這兩組能夠最清楚地被區(qū)分。最后，我們建立了一種數(shù)值的藥物-應(yīng)答-評分算法，其基于所選出的這12個(gè)基因的表達(dá)水平可臨床上用于預(yù)測個(gè)體的NSCLC對吉非替尼的敏感性。為了證實(shí)該預(yù)測系統(tǒng)的有效性，我們研究了與這17個(gè)用于建立所述系統(tǒng)的“學(xué)習(xí)病例”完全無關(guān)的另外8個(gè)(″檢驗(yàn)″)NSCLC病例(1個(gè)PR，7個(gè)PD)。我們對這些樣本中的每一個(gè)樣本中的基因表達(dá)圖譜進(jìn)行了檢驗(yàn)，然后根據(jù)這12個(gè)差別基因的表達(dá)水平計(jì)算出GRS。如圖2C中所示，在所有8個(gè)″檢驗(yàn)″病例中由GRS系統(tǒng)獲得的得分與對吉非替尼的臨床應(yīng)答相一致。患有SD的患者在腫瘤應(yīng)答中的GRS值根據(jù)上面建立的預(yù)測評分系統(tǒng)，計(jì)算出8名檢測-SD患者的GRS值。雖然這些值廣泛地分布在-83.0(預(yù)測為非應(yīng)答者)至61.6(應(yīng)答者)，整個(gè)觀察期間維持在SD狀態(tài)的患者的得分可能高于在該研究中的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)被認(rèn)定為SD但在治療開始后3或4個(gè)月內(nèi)顯示出疾病進(jìn)行性的患者的得分(圖2，C)。盡管GRS系統(tǒng)是基于區(qū)分于腫瘤應(yīng)答中患有PR的患者和患有PD(沒有SD)的患者之間的基因表達(dá)圖譜建立的，這些結(jié)果顯示GRS適于按患者對吉非替尼的應(yīng)答將SD患者分成各個(gè)小組。用半定量RT-PCR對GRS有效性進(jìn)行的驗(yàn)證為了證實(shí)前12個(gè)預(yù)測基因在PR和PD病例間的差異表達(dá)，把從微陣列獲得的表達(dá)值與從相同患者中獲得的RNA的半定量RT-PCR所得的值聯(lián)系起來(5個(gè)PR和7個(gè)PD)(圖3A、表5A)。所有這12個(gè)基因的Spearman等級相關(guān)性是正相關(guān)，并且這12基因中有7個(gè)是顯著正相關(guān)的。GRS有效性的免疫組織化學(xué)驗(yàn)證為了驗(yàn)證預(yù)測蛋白標(biāo)記在PR和PD病例間的差異表達(dá)，我們用五種不同的抗AREG、TGFA、ADAM9、CD9和OSMR抗體進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色，已知的是AREG、TGFA、ADAM9、CD9和OSMR與配體-EGFR信號傳遞有關(guān)，它們的置換p-值都小于0.01。首先我們用這5種抗體對由經(jīng)支氣管(肺)活組織檢查和淋巴結(jié)活組織檢查從相同患者中獲得的配對的腫瘤組織切片進(jìn)行染色。在3名不同患者中沒有觀察到這5個(gè)標(biāo)記的蛋白表達(dá)存在患者間的差異(圖3，B)。我們還在11個(gè)NSCLC樣本中(5個(gè)PR和6個(gè)PD)用5種標(biāo)記對微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行了驗(yàn)證。其結(jié)果與微陣列數(shù)據(jù)相一致(圖3C、表5B)。TGFA的血清水平為了進(jìn)一步評價(jià)該預(yù)測系統(tǒng)在常規(guī)臨床情況中的可行性，我們用ELISA在單獨(dú)采集用于血清學(xué)檢驗(yàn)并未加入到微陣列分析的由5名PR、10名SD和20名PD患者中獲得的血清樣本中對TGFA蛋白進(jìn)行了檢測。在PD患者中，TGFA的血清水平為19.0±2.8pg/ml(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)，在SD患者中為13.9±1.9pg/m，在PR患者中為12.8±1.4pg/ml(圖4)。當(dāng)以16.0pg/ml作為截止值時(shí)，從PD患者獲得的20份血清樣本中有12份呈現(xiàn)為TGFA陽性，所有從PD患者獲得的血清樣本為陰性。體外吉非替尼處理和AREG自分泌檢測在非應(yīng)答者中，EGFR和其它ERBB成員的一種配體AREG在非應(yīng)答者中得到了顯著的過表達(dá)而在應(yīng)答者中卻無法(幾乎沒有)檢測到。為了研究AREG蛋白在以自分泌形式分泌時(shí)是否導(dǎo)致了NSCLC對吉非替尼治療的抗性，我們進(jìn)行了以下生物學(xué)分析。我們一開始通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)鑒定出了AREGmRNA在肺-腺癌細(xì)胞系NCI-H358和-H522中的表達(dá)，而在PC-9中沒有表達(dá)(圖5，A)。接著，我們在以1.0μM的吉非替尼處理PC-9細(xì)胞72小時(shí)后進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析，并發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)處理的細(xì)胞(6％)相比吉非替尼提高了G1期細(xì)胞核的百分率(24％)(數(shù)據(jù)未顯示)。該結(jié)果表明吉非替尼在PC-9細(xì)胞中可能誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。然后在無血清培養(yǎng)基或從在存在或缺少0.5或1.0μM吉非替尼條件下生長的NCI-H358或-H522細(xì)胞獲得的無血清條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)之后，我們分析了PC-9細(xì)胞的生存能力，其中PC-9細(xì)胞對吉非替尼敏感并且不表達(dá)AREG。如圖5B所示，培養(yǎng)于無血清的含有吉非替尼的條件培養(yǎng)基中的PC-9細(xì)胞的生存能力比生長在具有相同吉非替尼濃度的無血清培養(yǎng)基中的PC-9細(xì)胞要強(qiáng)。由于以前已經(jīng)報(bào)道過吉非替尼的提供者，吉非替尼的抗腫瘤效果在10％FCS存在下降低，這表明該檢測應(yīng)該適于吉非替尼劑量和活性的定量測量。為了研究以自分泌形式分泌的AREG是否抑制了經(jīng)吉非替尼治療的NSCLC細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，我們在含有終濃度為1-100ng/ml的重組AREG蛋白并且含有或不含1.0μM吉非替尼的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)PC-9細(xì)胞。與僅和1.0μM吉非替尼一起培養(yǎng)的PC-9細(xì)胞相比，與AREG蛋白和1.0μM吉非替尼一起培養(yǎng)的PC-9細(xì)胞的生存能力以AREG-劑量-依賴性的方式得以提高(圖5，C)。另一方面，重組AREG單獨(dú)對PC-9細(xì)胞的生存能力不產(chǎn)生影響(圖5，C)。該觀察結(jié)果顯然表明了AREG抑制由吉非替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但是其自身并不影響細(xì)胞的生存能力。對AREG的免疫染色顯示在圖6中。討論大量的證據(jù)支持了以下觀點(diǎn)，即EGFR的自分泌途徑中的分子與一些對于癌癥的形成和進(jìn)行至關(guān)重要的過程有關(guān)，這些過程包括細(xì)胞增殖、血管發(fā)生和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散5。因此，對特定的信號傳遞的治療性阻斷可能是一種有前途的癌癥治療策略。吉非替尼，一種合成的苯胺基喹唑啉，其通過與三磷酸腺苷競爭酪氨酸激酶受體的胞內(nèi)區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)而抑制了酪氨酸激酶活性。在第II期試驗(yàn)中，將吉非替尼用作晚期NSCLC的第2、第3或第4條線單藥治療，腫瘤應(yīng)答率達(dá)到了近20％8-10，優(yōu)于常規(guī)的細(xì)胞毒性劑所獲的應(yīng)答率。在IDEAL1中對患者的多變量分析提示女性中的應(yīng)答率可能要高于男性，腺癌患者中的應(yīng)答率高于扁平細(xì)胞癌患者(差異比分別為2.7和3.5)9。最近的研究提示吉非替尼有效的個(gè)體更可能患細(xì)支氣管肺泡亞型的腺癌，且決不會是吸煙者(差異比分別為13.5和4.2)19。這里所報(bào)道的臨床試驗(yàn)中記載的更高的應(yīng)答率(29.4％)可能反映了腺癌患者的比例(46名腺癌、5名扁平細(xì)胞癌和2名大細(xì)胞癌)比其它研究中的病例的比例更高。包括細(xì)支氣管肺泡癌(BAC)特征在內(nèi)的吉非替尼敏感性的臨床病理學(xué)決定因素在一定程度上有預(yù)測性9，10，19，20。然而，以往的報(bào)道和我們的觀察顯然顯示出沒有因子能夠完美地預(yù)測NSCLC對吉非替尼治療的應(yīng)答。因此用于預(yù)先從非應(yīng)答者中區(qū)分出應(yīng)答者的方法可以使吉非替尼在臨床背景中的應(yīng)用得到更多關(guān)注。通過從微陣列數(shù)據(jù)上獲得的晚期NSCLC的基因表達(dá)圖譜的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，我們鑒定出12個(gè)與對吉非替尼的敏感性相關(guān)的基因。我們介紹了一種基于在應(yīng)答組和非應(yīng)答組中顯示出最顯著的表達(dá)水平差異的12個(gè)基因的表達(dá)的預(yù)測評分系統(tǒng)。這組基因是從肺腺癌的表達(dá)圖譜中選出來的；然而，GRS系統(tǒng)成功地將我們的8個(gè)″檢驗(yàn)″PR和PD病例根據(jù)它們對吉非替尼的臨床應(yīng)答進(jìn)行了分類，其中的一個(gè)是扁平細(xì)胞癌。此外，該系統(tǒng)可能將中間的腫瘤應(yīng)答(SD)分成兩組，一組代表在很長時(shí)間成功維持在腫瘤-靜態(tài)效果的患者，另一組代表未能達(dá)到這種效果的患者。實(shí)際上，我們需要使用各醫(yī)院通用的最低限度入侵性技術(shù)來預(yù)測各個(gè)腫瘤的化學(xué)敏感性，因?yàn)楹苌儆型砥贜SCLC患者適于作為手術(shù)切除腫瘤的候選者。因此我們嘗試建立一種預(yù)測系統(tǒng)，其只是需要一定數(shù)量的能夠通過例如柔性(光導(dǎo))纖維支氣管鏡檢查獲得的癌癥組織。通過驗(yàn)證該方法的各個(gè)步驟，我們能將小至1mm的活檢標(biāo)本中的基因表達(dá)精確地繪制。通過12個(gè)顯示出最顯著差異的基因的半定量RT-PCR證實(shí)了相應(yīng)的微陣列結(jié)果，從而建立了GRS系統(tǒng)。而且，我們在TBB和淋巴結(jié)活組織檢查樣本中驗(yàn)證了針對5種不同的用于將可能的應(yīng)答者與非應(yīng)答者區(qū)分開的生物標(biāo)記(AREG、TGFA、ADAM9、CD9和OSMR)的抗體的有效性，這五種生物標(biāo)記都與配體-EGFR信號傳遞有關(guān)。此外，我們通過ELISA能夠在肺-ADC患者中檢測血清TGFA蛋白。對這些用于臨床的標(biāo)記的進(jìn)一步評估是必要的，預(yù)測所需的基因的有限數(shù)目應(yīng)當(dāng)最終使得實(shí)驗(yàn)室能夠通過利用像血液的血清學(xué)檢驗(yàn)、PCR實(shí)驗(yàn)或活檢標(biāo)本的免疫組織化學(xué)分析這樣的常規(guī)方法預(yù)先診斷出吉非替尼治療對于一名NSCLC患者的有效性。根據(jù)我們的了解，這是首次關(guān)于無法切除的“晚期”肺癌的基因表達(dá)圖譜的報(bào)道，盡管已經(jīng)報(bào)道了“早期”肺癌的手術(shù)切除樣本的圖譜。然而，經(jīng)診斷患有NSCLC的患者中約有70％的腫瘤已經(jīng)是局部晚期或遷移性的，這使得它們對常規(guī)的治療方式產(chǎn)生抗性。因此本文所列基因應(yīng)當(dāng)有助于揭示肺癌進(jìn)展的分子機(jī)理，并且可能是藥物發(fā)展?jié)撛诘哪繕?biāo)。吉非替尼是作為EGFR-TK的一種“選擇性”抑制劑而被研制出來的；然而無論是在體內(nèi)還是在體外都沒有發(fā)現(xiàn)EGFR活化水平與對吉非替尼的應(yīng)答之間有清楚的聯(lián)系7，23。在臨床試驗(yàn)中，吉非替尼對腺癌比對扁平細(xì)胞癌更有效9，10，盡管EGFR的過表達(dá)在腺癌中的頻率更低24。因此，鑒定出哪種腫瘤是該治療的合適的目標(biāo)非常重要。在我們的使用臨床樣本的分析中，在應(yīng)答者與非應(yīng)答者間的EGFR蛋白表達(dá)的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是不顯著的。另一方面，兩種都編碼EGFR以及其它ERBB成員的配體的雙向調(diào)節(jié)因子(AREG)和轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFA)在非應(yīng)答者中得到了顯著過表達(dá)而在應(yīng)答中卻無法(幾乎沒有)檢測到(分別為p＝0.0000000000093和0.0095；表4)。這些配體和EGFR自分泌環(huán)對于肺癌細(xì)胞的生長和生存的重要性是無可爭辯的24-26，但是對AREG在癌癥的形成和進(jìn)行中的作用卻還了解得很少。然而，一些證據(jù)線提示AREG的過表達(dá)與NSCLC患者的壽命縮短有關(guān)24。而且，最近報(bào)道了AREG在人肺癌細(xì)胞中的抗細(xì)胞凋亡活性25。為了研究AREG的抗細(xì)胞凋亡活性是否誘導(dǎo)了NSCLC細(xì)胞對吉非替尼治療的抗性，我們采用對吉非替尼敏感性的但是不表達(dá)AREG的NSCLC細(xì)胞系PC-9進(jìn)行了生物檢測。我們發(fā)現(xiàn)吉非替尼對PC-9的抗腫瘤活性顯著地被AREG的自分泌降低了。該證據(jù)強(qiáng)烈地表露出盡管由于配體、二聚配偶體、效應(yīng)物和下游路徑的復(fù)雜性由EGFR介導(dǎo)的生長因子信號傳遞在每一步都被顯著地復(fù)雜化了26，但是AREG可能是導(dǎo)致癌癥進(jìn)展和對吉非替尼的抗性的配體-受體自分泌生長路徑的一種重要活化劑。幾種與EGFR-TK路徑相關(guān)的要素存在于我們的差異表達(dá)基因的列表中。例如，編碼雙特異性磷酸酶3(DUSP3)、ADAM9、CD9和OSMR的基因在非應(yīng)答者中被顯著表達(dá)了(分別為p＝0.0000000000094、0.01、0.000022和0.0000011)。DUSP3基因通過對促細(xì)胞分裂劑激活的蛋白激酶(MAPK)的脫去磷酸作用而調(diào)節(jié)EGFR信號傳遞，脫去磷酸的促細(xì)胞分裂劑激活性蛋白激酶是一種重要的信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子，ADAM9通過脫落proHB-EGF(pro肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子)的胞外區(qū)(ectodomain)而參與了EGFR信號傳遞的激活28。CD9與跨膜的TGFA發(fā)生物理性的相互作用。CD9的表達(dá)強(qiáng)烈地減少了由生長因子和PMA誘導(dǎo)的跨膜向可溶性TGFA的蛋白水解轉(zhuǎn)化，并極大地增強(qiáng)了TGFA誘導(dǎo)的EGFR激活29。據(jù)報(bào)道在乳腺癌細(xì)胞中OSMR與ERBB2在結(jié)構(gòu)上相關(guān)。盡管已經(jīng)提出過吉非替尼的其它靶分子，我們的研究結(jié)果提示EGFR信號傳遞至少是與對該藥的應(yīng)答相關(guān)的重要過程中之一。由于吉非替尼能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)一些腫瘤細(xì)胞的凋亡，其它像AREG這樣的具有抗細(xì)胞凋亡活性的分子可能有助于腫瘤對該藥的抗性。已知的是AVEN(細(xì)胞凋亡、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑)增強(qiáng)了Bcl-xL的抗細(xì)胞凋亡活性，抑制Apaf-1調(diào)節(jié)的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活性31，其在我們的非應(yīng)答者中特異性地表達(dá)(p＝0.00000000042)。另一方面，調(diào)節(jié)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制也應(yīng)該影響藥物的抗性。GCLC(谷氨酸-半胱氨酸連接酶，催化性的亞基)在像順氯氨鉑、依托泊苷和阿霉素這樣的抗癌藥的細(xì)胞解毒中具有重要作用32，其在我們的非應(yīng)答者組中過表達(dá)(p＝0.00000012)。由于這些基因在我們的腫瘤實(shí)驗(yàn)組(panel)中與對化學(xué)治療的應(yīng)答負(fù)相關(guān)(也就是這些基因的表達(dá)越高，對吉非替尼的抗性就越強(qiáng))，它們可能與導(dǎo)致抗性產(chǎn)生的機(jī)制有關(guān)。還應(yīng)該注意的是我們的候選預(yù)測基因中有幾乎一半的功能是未知的。因此需要進(jìn)一步研究以更清楚地揭示作為NSCLC對吉非替尼的應(yīng)答的基礎(chǔ)的生物學(xué)事件。總之，我們在人肺癌中鑒定出了51個(gè)在對吉非替尼的應(yīng)答者和非應(yīng)答者間顯著地差異表達(dá)的基因，并基于其中12個(gè)基因的表達(dá)模式建立了一種評分系統(tǒng)，用于預(yù)測各種腫瘤對該藥的應(yīng)答。盡管采用更大組的臨床病例進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證是必要的，但是本發(fā)明所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)可以產(chǎn)生對于作為信號抑制策略基礎(chǔ)的分子事件的有價(jià)值的了解，并且通過檢測一組具有高預(yù)測價(jià)值的基因而提供了關(guān)于對各個(gè)NSCLC患者的吉非替尼治療的重要信息。參考文獻(xiàn)1.Fossella，F(xiàn).V.，等，RandomizedphaseIIItrialofdocetaxelversusvinorelbineorifosfamideinpatientswithadvancednon-small-celllungcancerpreviouslytreatedwithplatinum-containingchemotherapyregimens.TheTAX320Non-SmallCellLungCancerStudyGroup.JClinOncol，2000.18(12)p.2354-62.2.Non-smallCellLungCancerCollaborativeGroup.Chemotherapyinnon-smallcelllungcancerameta-analysisusingupdateddataonindividualpatientsfrom52randomisedclinicaltrials.Bmj，1995.311(7010)p.899-909.3.Schiller，J.H.，等，Comparisonoffourchemotherapyregimensforadvancednon-small-celllungcancer.NEnglJMed，2002.346(2)p.92-8.4.Kelly，K.，等，RartdomizedphaseIIItrialofpaclitaxelpluscarboplatinversusvinorelbinepluscisplatininthetreatmentofpatientswithadvancednon--small-celllungcanceraSouthwestOncologyGrouptrialJClinOncol，2001.19(13)p.3210-8.5.Baselga，J.，Whytheepidermalgromthfactorreceptor？Sherationaleforcancertherapy.Oncologist，2002.7Suppl4p.2-8.6.Traxler，P.，Tyrosinekinasesastargetsincancertherapy-successesandfailures.ExpertOpinTherTargets，2003.7(2)p.215-34.7.Wakeling，A.E.，等，ZD1839(易瑞沙)anorallyactiveinhibitorofepidermalgrowthfactorsignali7lgwithpotentialforcancertherapy.CancerRes，2002.62(20)p.5749-54.8.Herbst，R.S.，Dose-comparativemonotherapytrialsofZD1839inpreviouslytreatednon-smallcelllungcancerpatients.SeminOncol，2003.30(1Suppl1)p.30-8.9.Fukuoka，M.，等，F(xiàn)inalresultsfromaphase#trialofZD1839(′易瑞沙′)forpatientswithadvancednon-smallcelllungcancer(IDEAL1J.ProAmSocClin.Oncol2002.21；298a(A1188).10.Kris，MG.，等，AphaseIItrialofZD1839(′易瑞沙′Jinadvancednon-smallcell11.Inoue，A.，等，Severeacuteintersitialpneumoniaand吉非替尼.Lancet，2003.361(9352)p.137-9.12.Bohm，M.，等，MicrobeamMOMeNT.hon-contactlasermicrodissectionofmembrane-mountednativetissue.AmJPathol，1997.151(1)p.63-7.13.Okabe，H.，等，Genome-wideanalysisofgeneexpressioninhumanhepatocellularcarcinomasusingcDNAmicroarray.identificationofgenesinvolvedinviralcarcinogenesisandtumorprogression.CancerRes，2001.61(5)p.2129-37.14.Kitahara，O.，etal.，AlterationsofgeiieexpressionduringcolorectatcarcinogenesisrevealedbycDNAmicroarraysafterlaser-capturemicrodissectionoftumortissuesandnormalepithelia.CancerRes，2001.61(9)p.3544-9.15.Golub，T.R.，等，Molecularclassificationofcancerclassdiscoveryandclasspredictionbygeneexpressionmonitoring.Science，1999.286(5439)p.531-7.16.MacDonald，T.J.，等，Expressionprofilingofmedulloblastoma.PDGFRAandtheRAS/MAPKpathwayastherapeutictargetsformetastaticdisease.NatGenet，2001.29(2)p.143-52.17.Kaneta.Y.，等，PredictionofsensitivitytoSTI571amongchronicmyeloidleukemiapatientsbygenome-widecDNAmicroarrayanalysis.JpnJCancerRes2002.93，p.849-856.18.Pavelic，K.，等，EvidenceforaroleofEGFreceptorintheprogressionofhumanlungcarcinoma.AnticancerRes，1993.13(4)p.1133-7.19.Kikuchi，T.，等，Expressionprofilesofnon-smallcelllungcancersoncDNAmicroarraysIdentifi8cationofgenesforpredictionoflymph-nodemetastasisandsensitivitytoanti-cancerdrugs.Oncogene，2003.22(14)p.2192-205.20.Heighway，J.，等，Expressionproflingofprimarynon-smallcelllungcancerfortargetidentification.Oncogene，2002.21(50)p.7749-63.21.Beer，D.G.，等，Gene-expressionprofilespredictsurvivalofpatientswithlungadenocarcinoma.NatMed，2002.8(8)p.816-24.22.Miura，K.，等，Lasercapturemicrodissectionandmicroarrayexpressionanalysisoflungadenocarcinomarevealstobaccosmoking-andprognosis-relatedmolecularprofiles.CancerRes，2002.62(11)p.3244-50.23.Moasser，M.M.，等，ThetyrosinekinaseinhibitorZD1839(″易瑞沙)inhibitsHER2-drivensignalingandsuppressesthegrowthofHER2-overexpressingtumorcells.CancerRes，2001.61(19)p.7184-8.24.Rusch，V.，等，Overexpressionoftheepidermalgrowthfactorreceptoranditsligandtransforminggrowthfactoralphaisfrequentinresectablenon-smallcelllungcancerbutdoesnotpredicttumorprogression.ClinCancerRes，1997.3(4)p.515-22.25.Fontanini，G.，等，Evaluationofepidermalgrowthfactor-relatedgrowthfactorsandreceptorsandofneoangiogenesisincompletelyresectedstageI-IIIAnoiz-small-celllungcanceramphiregulinandmicrovesselcountareindependentprognosticindicatorsofsurvival.ClinCancerRes，1998.4(1)p.241-9.26.Brundage，M.D.，D.Davies，andW.J.Mackillop，Prognosticfactorsinnon-smallcelllungcanceradecadeofprogress.Chest，2002.122(3)p.1037-57.27.Hurbin，A.，等，Inhibitionofapoptosisbyamphiregulinviaaninsulin-likegrowthfactor-1receptor-dependentpathwayinnon-smallcelllungcancercelllines.JBiolChem，2002.277(51)p.49127-33.28.Yarden，Y.andM.X.Sliwkowski，UntanglingtheErbBsignallingnetwork.NatRevMolCellBiol，2001.2(2)p.127-37.29.Prenzel，N.，等，EGFreceptortransactivationbyG-protein-coupledreceptorsrequiresmetalloproteinasecleavageofproHB-EGF.Nature1999.402(6764)884-830.Nelson，Chau，等，Aven，anovelinhibitorofcaspaseactivation，bindsBcl-xLandApaf-l.MolecCell2000.6p.31-41.31.Tipnis，SR.，等，Overexpressionoftheregulatorysubunitofr-glutamylcysteinesynthetaseinHelacellsincreasesr-glutamylcysteinesynthetaseactivityandconfersdrugresistance.BiochemJ1999.337，p.559-566.表1基線患者的特征和應(yīng)答的匯總表表2適于分析的案例的數(shù)量以及它們最佳的總體應(yīng)答(1)學(xué)習(xí)病例是用于研制GRS的，而檢測病例是用于驗(yàn)證的(2)之后從5個(gè)新收錄的病例中獲得另一個(gè)樣本的隨機(jī)組合(blindedset)(4PD和1SD)也加入到這11個(gè)檢測病例中。表3患者的臨床病例學(xué)特征(1)ADC，腺癌；SCC，扁平細(xì)胞癌。(2)TNM臨床分類和階段分組是基于UICC/WHO分類評定的。(3)EGFR的密碼子第709-870位(從p環(huán)到活化環(huán))的突變(GenBank登錄號NM005228)。(4)對吉非替尼的客觀腫瘤應(yīng)答是在治療開始后每隔四周用UICC/WHO標(biāo)準(zhǔn)評定的。PR，部分應(yīng)答；SD，穩(wěn)定的疾??；PD，進(jìn)行性疾病(5)總體最佳反應(yīng)是基于如材料和方法部分提到的定義評定的。(6)學(xué)習(xí)例，用于研制GRS的樣品；檢測例，用于驗(yàn)證GRS的樣品。(7)GRS由于測系統(tǒng)確定的吉非替尼應(yīng)答得分(*)為進(jìn)一步驗(yàn)證GRS，而后從5個(gè)新加入的病例中獲得另一樣本的隨機(jī)組合(4PD和1SD)也加入到這28個(gè)檢測病例中。表4用于將吉非替尼的應(yīng)答者(PR)與非應(yīng)答者(PD)區(qū)分開的51個(gè)候選基因(*)(*)12個(gè)基因和51基因的組按不低于0.001的置換p值的等級次序列出。表4A用于將吉非替尼的應(yīng)答者(PR)與非應(yīng)答者(PD)區(qū)分開的132個(gè)基因的列表表5AcDNA微陣列數(shù)據(jù)與半定量RT-PCR的相關(guān)性所有12個(gè)基因的相關(guān)性都是正的，其中12個(gè)基因中的7個(gè)是顯著正相關(guān)的。表5B免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果權(quán)利要求1.一組分離的標(biāo)記基因，包括至少一個(gè)鑒定為在患者間具有差異表達(dá)的基因，所述患者是對一種erbB受體酪氨酸激酶抑制劑的應(yīng)答者和非應(yīng)答者；所述基因組包括一個(gè)或多個(gè)選自至少由包括衍生于所述基因的特異性寡核苷酸在內(nèi)的本發(fā)明表4中所列的51個(gè)基因構(gòu)成的組中的基因。2.根據(jù)權(quán)利要求1的基因組，它包括一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明表4中所列的前40個(gè)基因中的基因。3.根據(jù)權(quán)利要求1的基因組，它包括一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明表4中所列的前20個(gè)基因中的基因。4.根據(jù)權(quán)利要求1的基因組，它包括一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明表4中所列的前12個(gè)基因中的基因。5.根據(jù)權(quán)利要求1的基因組，它包括一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明表4中所列的前5個(gè)基因中的基因。6.根據(jù)權(quán)利要求1的基因組，其是本發(fā)明表4中所列的前12個(gè)基因，也就是基因FLJ22622(例如GenBankNM024829)、AREG(例如GenBankBC009799)、COR01C(例如GenBankNM014325)、AVEN(例如GenBankBC010488)、DUSP3(例如GenBankNM004090)、DJ473B4(例如GenBankAI026836)、PHLDA2(例GenBankBU500509)、RBM7(例如GenBankNM0106090)、EST(GenBankBX0952512)、OSMR(例如GenBankAI436027)、GCLC(例如GenBankAI971137)、COL4A3BP(例如GenBankBQ024877)。7.根據(jù)權(quán)利要求6的基因組，其中所述基因包括在表4a中列出的序列。8.根據(jù)權(quán)利要求6的基因組，其中所述基因組包括基因特異性寡核苷酸，所述寡核苷酸包括表4中所列序列的5至50個(gè)寡核苷酸。9.根據(jù)前一項(xiàng)權(quán)利要求的基因組，其中所述抑制劑選自吉非替尼、OSI-774、PKI-166、EKB-569、GW2016和CI-1033。10.根據(jù)權(quán)利要求9的基因組，其中所述抑制劑是吉非替尼。11.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的基因組，其中所述抑制劑是一種抗erbB抗體。12.根據(jù)權(quán)利要求11的基因組，其中所述抗體是曲妥珠單抗(trastuzumab)或西妥昔單抗(cetuximab)。13.一種預(yù)測癌癥患者或患者群中對使用erbB受體酪氨酸激酶抑制劑進(jìn)行的治療的應(yīng)答性的方法，或者用于選擇會對erbB受體酪氨酸激酶抑制劑產(chǎn)生應(yīng)答的患者或患者群的方法，包括比較一種或多種選自權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)定義的基因組中的標(biāo)記基因的差異表達(dá)。14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中患者的應(yīng)答性是由藥物應(yīng)答評分的產(chǎn)生來體現(xiàn)的。15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中所述比較是通過微陣列檢測進(jìn)行的。16.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中所述比較是通過免疫組織化學(xué)進(jìn)行的。17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，所述方法包括檢測雙向調(diào)節(jié)因子的差異表達(dá)。18.根據(jù)權(quán)利要求13至17中任一項(xiàng)的方法，其中所述抑制劑如權(quán)利要求9至12任一項(xiàng)中所定義。19.一種在權(quán)利要求13至18的方法中使用的診斷試劑盒，其包括一種位于合適的支持介質(zhì)上的標(biāo)記基因組，該組合選自如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所定義的組。20.根據(jù)權(quán)利要求19的試劑盒，其包括一種微陣列。21.一種治療癌癥患者的方法，其包括以權(quán)利要求9至12中任一項(xiàng)的抑制劑給藥，檢測一種標(biāo)記基因組合的差異表達(dá)，所述組合選自如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所定義的組。22.選自由本發(fā)明表4中所列的51個(gè)基因構(gòu)成的組中的分離基因序列在測量所述基因在從NSCLC患者獲得的組織樣本中的表達(dá)水平的用途，所述的基因包括衍生于所述基因的基因特異性寡核苷酸在內(nèi)的。23.一種診斷試劑盒，包括用于確定選自的本發(fā)明表4中所列的51個(gè)基因構(gòu)成的組中的一個(gè)或多個(gè)基因在從NSCLC患者獲得的組織樣本中的表達(dá)水平的工具，所述的基因包括衍生于所述基因的基因特異性寡核苷酸在內(nèi)，該試劑盒包括一種包括權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所定義的分離的標(biāo)記基因組合的支持材料、至少一種連結(jié)在上面的基因。24.一種如權(quán)利要求9至12中任一項(xiàng)定義的抑制劑在治療根據(jù)權(quán)利要求13的方法鑒定的NSCLC患者中的用途。25.一種治療根據(jù)權(quán)利要求13至17中任一項(xiàng)的方法鑒定的NSCLC患者或患者群的方法，包括對所述患者以erbB受體酪氨酸激酶抑制劑給藥。26.erbB受體酪氨酸激酶抑制劑在生產(chǎn)用于治療根據(jù)權(quán)利要求13至17中任一項(xiàng)的方法鑒定的NSCLC患者或患者群的藥物的用途。27.一種檢測或用于檢測erbB受體酪氨酸激酶抑制劑的方法，包括治療患者并且評估相對于相關(guān)對照，該化合物是否調(diào)節(jié)來自根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的標(biāo)記基因組的至少一個(gè)基因的表達(dá)。28.一種進(jìn)行臨床試驗(yàn)以測量erbB受體酪氨酸激酶的抑制作用或抑制劑的效果的方法，包括在患者或患者群中測量如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)中定義的基因組的表達(dá)的相對水平。全文摘要本發(fā)明涉及一組分離的標(biāo)記基因，包括至少一個(gè)鑒定為在患者間具有差異表達(dá)的基因，所述患者是對一種erbB受體酪氨酸激酶抑制劑的應(yīng)答者和非應(yīng)答者；所述分離的基因組包括一個(gè)或多個(gè)選自至少由(51)本文所列的基因構(gòu)成的組中的基因，所述基因包括衍生于所述基因的特異性寡核苷酸在內(nèi)；以及該sauch基因組在診斷中的應(yīng)用。文檔編號C12Q1/68GK1829793SQ200480015047公開日2006年9月6日申請日期2004年6月1日優(yōu)先權(quán)日2003年5月30日發(fā)明者T·楚若,Y·納卡穆拉,S·宋,M·福擴(kuò)卡申請人:阿斯利康(英國)有限公司,國立大學(xué)法人東京大學(xué)