專利名稱：使用粒酶b蛋白酶切割融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是通過使用粒酶B(Granzyme B)蛋白酶對重組產(chǎn)生的融合蛋白進(jìn)行酶切制備呈真實形式的目標(biāo)多肽的方法。而且本發(fā)明涉及包含粒酶B切割位點的融合蛋白以及人粒酶B變異體。
本發(fā)明的背景和先有技術(shù)一般在蛋白質(zhì)工程，特別是在制藥領(lǐng)域中，以高度純化和經(jīng)過充分研究的形式制備和純化重組多肽例如藥物蛋白，已經(jīng)成為一項主要任務(wù)。
制備這種重組多肽常常依賴的技術(shù)涉及以融合或者雜合蛋白形式生產(chǎn)多肽，其中目標(biāo)蛋白質(zhì)或者多肽與載體或者融合伴侶(如多肽或者蛋白質(zhì))相融合。
與目標(biāo)多肽融合的融合伴侶或者載體的存在具有以下優(yōu)勢它可以使融合蛋白具有更高的抗蛋白酶降解能力；可以促進(jìn)表達(dá)和分泌；可以提高溶解度并使融合蛋白能夠進(jìn)行隨后的親和純化。而且，通過融合蛋白表達(dá)，可能具有生物危害的物質(zhì)例如肽類激素，可以以無活性的形式產(chǎn)生，然后在體外通過切除融合伴侶使其激活。
但是這種融合蛋白自身通常并不適宜作為最終產(chǎn)物，原因有融合伴侶可能影響目標(biāo)多肽的生物活性或者穩(wěn)定性，并且如果將要在臨床使用該蛋白，可能會產(chǎn)生抗原性問題。因此有必要切除融合蛋白以釋放目標(biāo)多肽。
原則上這可以通過化學(xué)方法或者生化方法例如酶切來實現(xiàn)。但是重要的是切割是高度特異的，且只發(fā)生在目標(biāo)多肽和融合伴侶之間的切割序列處，即連接區(qū)，但優(yōu)選地不在目標(biāo)多肽自身的內(nèi)部，因為這可能會例如嚴(yán)重影響目標(biāo)多肽的生物活性。這種方法使用的試劑通過肽鍵的水解發(fā)生作用，且切割試劑的特異性決定于位于或者靠近被切割肽鍵的氨基酸殘基的特性。
切割融合蛋白的生化方法是以蛋白酶(蛋白水解酶)的使用為基礎(chǔ)的。但是如果切割位點特異的氨基酸同時出現(xiàn)在目標(biāo)多肽自身的內(nèi)部，則融合蛋白的酶切就受到限制。因此，為了達(dá)到切割的目的，酶不僅僅識別氨基酸，而是識別氨基酸序列，這才是特別適宜的，因為識別和切割切割序列所需的氨基酸數(shù)目越多，該氨基酸序列除了在目標(biāo)多肽和融合伴侶之間存在以外還能夠再次出現(xiàn)在目標(biāo)多肽內(nèi)部的概率就越低。
迄今為止已有數(shù)個蛋白酶用于融合蛋白的酶切，切割方法是使融合蛋白與蛋白酶在適當(dāng)條件下接觸。
WO 03/010204涉及的是使用泛素切割酶從融合蛋白上分離多肽，根據(jù)此發(fā)明，泛素切割酶切割與在蛋白質(zhì)(例如泛素)C端RGG氨基酸序列相鄰的肽鍵。
US 6,010,883公開了一種方法，其中使用凝血因子Xa(EC3.4.21.6；通過對酶原因子X進(jìn)行有限蛋白酶解形成的S1絲氨酸型肽酶)將融合伴侶從融合蛋白上切除。該蛋白酶在氨基酸序列X-Y-Gly-Arg之后進(jìn)行特異切割，其中X是Ile，Leu，Pro或Ala，Y是Glu，Asp，Gln或Asn。Xa因子優(yōu)選地在切割序列Ile-Glu-Gly-Arg之后切割。
在特異切割融合蛋白的方法中建議和使用的其它先有技術(shù)中的酶包括煙草蝕紋病毒NIa蛋白酶、膠原酶、腸激酶、枯草桿菌蛋白酶和凝血酶。
但是，在融合蛋白系統(tǒng)中使用蛋白酶切割可能會遇到許多問題。一個主要的問題是對融合蛋白的非特異蛋白水解，這會導(dǎo)致在幾個不同位置的切割，結(jié)果使產(chǎn)物丟失，產(chǎn)生污染性的片段。而且目前已知的酶經(jīng)常會出現(xiàn)使融合蛋白不充分或者不完全切割。這種不充分切割使產(chǎn)量下降，并且可能在純化的蛋白中引入異質(zhì)性，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白只有一小部分被回收。
另一個與許多目前在融合蛋白切割上應(yīng)用的酶相關(guān)的問題是切割后的多肽產(chǎn)物(目標(biāo)多肽)上經(jīng)常連有假的或外來的氨基酸。當(dāng)銜接物被切掉時通常會存在這些氨基酸，無關(guān)的氨基酸殘基可能對產(chǎn)生的目標(biāo)多肽的性質(zhì)有所影響。這對于用于為治療人類疾病生產(chǎn)的蛋白來說可能是至關(guān)重要的。因此，非常需要產(chǎn)生沒有外來氨基酸短序列或者殘基的真實的純多肽。
目標(biāo)多肽在切割后仍然殘留外來氨基酸的問題在美國專利4,543,329中予以闡釋，該專利描述了使用膠原酶對融合蛋白進(jìn)行選擇性切割的過程。但是，使用這種酶在目標(biāo)多肽的N端引入了外來氨基酸序列Gly-Pro。為了獲得真實形式的目標(biāo)多肽，隨后必須通過使用一種或者更多不同的氨肽酶(例如氨酰色氨酸氨肽酶和色氨酸氨肽酶)在另一個反應(yīng)步驟中除去這些外來氨基酸(Gly和Pro)。
這一問題還在美國專利5,427,927中予以闡釋，該專利描述了使用IgA蛋白酶對融合蛋白進(jìn)行序列特異切割的過程，其中IgA蛋白酶的識別位點被插入到融合蛋白的連接區(qū)，隨后用IgA蛋白酶切割融合蛋白。IgA蛋白酶的識別位點是氨基酸序列Y-Pro↓X-Pro，其中X可以是任何氨基酸，Y可以是一個或者幾個任意的氨基酸，↓指明了切割位點。但是在使用IgA蛋白酶切割后形成的目標(biāo)蛋白在其N端具有X-Pro外來氨基酸序列，即產(chǎn)生的目標(biāo)多肽并不以其本來或者真實的形式存在。
目前用于融合蛋白切割的最廣泛使用的蛋白酶是絲氨酸蛋白酶因子Xa和凝血酶。但是，已知這兩種酶對融合蛋白都有非特異性切割。此外，因子Xa需要從牛血清中分離，所以在治療性應(yīng)用中用Xa因子切割蛋白之后需要進(jìn)行大量的純化和分析以檢測可能存在的病原性因子如病毒和朊病毒(例如導(dǎo)致牛海綿狀腦病的朊病毒)。而且，這些酶相當(dāng)昂貴。
考慮到先有技術(shù)的缺點和不足之處，因此本發(fā)明的目的是提供一種改進(jìn)的方法用于切割融合蛋白。
本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)可以通過使用粒酶B蛋白酶(EC 3.4.21.79)用于切割融合蛋白從而克服上述技術(shù)問題。因此，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)粒酶B蛋白酶可以對具有粒酶B蛋白酶切割位點的融合蛋白進(jìn)行高效的切割，并且具有高度的切割特異性。特別是已經(jīng)證明粒酶B蛋白酶與目前廣泛使用的蛋白酶因子Xa相比對融合蛋白具有更高的特異性切割。而且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)粒酶B在切割具有粒酶B識別序列的融合蛋白(粒酶B識別序列的位置位于N端融合伴侶和C端目標(biāo)多肽之間，其中切割位點緊鄰目標(biāo)多肽)時產(chǎn)生的目標(biāo)多肽沒有來自切割位點的外來氨基酸，即產(chǎn)生的是真實形式的多肽。這樣可以通過粒酶B切割融合蛋白產(chǎn)生具有本來氨基酸序列的重組目標(biāo)蛋白。而且，粒酶B蛋白酶還可以通過重組制備，這也是它的優(yōu)勢。最后還發(fā)現(xiàn)將人粒酶B中的第228號氨基酸(胰凝乳蛋白酶原編號)半胱氨酸替換為苯丙氨酸，在制備重組人粒酶B時可以得到更高的最終蛋白質(zhì)回收。
發(fā)明概述因此本發(fā)明涉及的首先是制備真實形式目標(biāo)多肽的方法。該方法包含以下步驟(i)提供融合蛋白，其按N端到其C端的順序包含(a)融合伴侶，(b)包含粒酶B蛋白酶切割位點的粒酶B蛋白酶識別位點以及(c)目標(biāo)多肽，其中所述的切割位點緊鄰目標(biāo)多肽；和(ii)使所述融合蛋白與粒酶B蛋白酶(EC 3.4.21.79)接觸以在所述切割位點處切割產(chǎn)生真實形式的所述目標(biāo)多肽。
另一方面提供了融合蛋白，其按N端到其C端的順序包含(a)融合伴侶，(b)包含粒酶B蛋白酶切割位點的粒酶B蛋白酶識別位點以及(c)目標(biāo)多肽，其中所述的切割位點緊鄰目標(biāo)多肽。
還提供了一個人粒酶B蛋白酶變異體，其中第228號的氨基酸(胰凝乳蛋白酶原編號)半胱氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?br> 另一些方面本發(fā)明提供了編碼這樣的融合蛋白或者人粒酶B蛋白酶變異體的分離的核酸序列，包含該分離的核酸序列的重組載體，使用這種載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及制備融合蛋白或者人粒酶B蛋白酶變異體的方法，該方法包含以下步驟(i)提供有效連接于啟動子的重組載體；(ii)使用該重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(iii)在表達(dá)融合蛋白的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；以及(iv)選擇地分離融合蛋白或者人粒酶B蛋白酶變異體。
發(fā)明詳述一方面本發(fā)明涉及的是通過酶切融合蛋白制備真實形式目標(biāo)多肽的方法。因此，根據(jù)上面提及的，該方法包含提供融合蛋白的步驟，該融合蛋白按照從其N端到其C端的順序包含融合伴侶、包含粒酶B蛋白酶切割位點的粒酶B蛋白酶識別位點以及目標(biāo)多肽，其中切割位點的位置緊鄰目標(biāo)多肽。隨后使融合蛋白與粒酶B蛋白酶接觸，以在粒酶B蛋白酶接切割位點處切割產(chǎn)生真實形式的目標(biāo)多肽。在此使用的術(shù)語“融合蛋白”指包含來自至少兩個不同蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)域的多肽。
根據(jù)本發(fā)明，提供一種制備真實形式目標(biāo)多肽的方法。根據(jù)這里所使用的，術(shù)語“真實形式”指的是包含多肽自身氨基酸序列的多肽而沒有任何額外的氨基酸殘基。正如上面所述，與許多目前在融合蛋白切割上應(yīng)用的酶相關(guān)的問題是切割后的多肽產(chǎn)物上經(jīng)常連有假的或外來的氨基酸，即產(chǎn)生的多肽并不以其“真實形式”存在。因此，在此上下文中，真實形式的目標(biāo)多肽所指的多肽，其氨基酸一級序列與編碼目標(biāo)多肽的本來基因序列所編碼的氨基酸序列相同，即該多肽不含有任何非本來排列的氨基酸。術(shù)語“本來基因序列”不一定是天然存在的基因序列，它也可以是部分或者全部人工的序列。類似地應(yīng)當(dāng)理解真實形式的目標(biāo)多肽不一定是天然存在的多肽，它也可以是部分或者全部人工的。相反，“非真實”的多肽含有的氨基酸中至少有一個不是編碼目標(biāo)多肽的本來基因序列所編碼的。
根據(jù)本發(fā)明，目標(biāo)多肽和融合伴侶之間的連接區(qū)包含粒酶B蛋白酶識別位點，它具有粒酶B蛋白酶切割位點。這樣的識別位點指的是確定的氨基酸序列，它能夠被粒酶B的識別并且在融合伴侶和目標(biāo)多肽之間的連接區(qū)被切割。因此切割位點應(yīng)當(dāng)被理解為氨基酸序列的兩個氨基酸之間、發(fā)生融合蛋白切割的位點。連接區(qū)的形式可以是任何適宜長度的不屬于目標(biāo)多肽的銜接物序列。但是為了得到真實形式的目標(biāo)多肽，粒酶B切割位點的位置緊鄰目標(biāo)多肽的N端，目的是使融合蛋白在N端被特異切割而不會導(dǎo)致假的或者外來的氨基酸仍然附著在產(chǎn)生的目標(biāo)多肽上。因此，術(shù)語“緊鄰”暗示粒酶B識別序列(在一些實施方案中識別序列前面是一個銜接物序列或者識別序列自身是銜接物序列的一部分)所處的位置使粒酶B切割位點在目標(biāo)多肽N端的側(cè)旁。
粒酶是儲存于顆粒中的絲氨酸蛋白酶，它們參與靶細(xì)胞識別后T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性防御反應(yīng)。粒酶的主要功能是誘導(dǎo)病毒侵染的細(xì)胞和其他有潛在危害的細(xì)胞的死亡。粒酶B是粒酶的一種類型，在與靶細(xì)胞接觸后它被定向地分泌到細(xì)胞外，并在穿孔素(一種由細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞表達(dá)的溶細(xì)胞蛋白)的協(xié)助下進(jìn)入靶細(xì)胞。粒酶B處理和激活各種不同的半胱天冬酶原，這樣誘導(dǎo)靶細(xì)胞程序性死亡。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“粒酶B蛋白酶”(這里也被稱為GrB)包括屬于或者可能屬于酶命名數(shù)據(jù)庫第34期，2004年2月(http//www.expasy.org/enzyme)中酶學(xué)委員會編號EC 3.4.21.79的酶。因此根據(jù)本發(fā)明任何適宜的粒酶B蛋白酶都可以使用，包括人粒酶B蛋白酶，小鼠粒酶B蛋白酶和大鼠粒酶B蛋白酶。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法用于制備人治療性蛋白產(chǎn)物時，一般優(yōu)選使用人粒酶B蛋白酶。人粒酶B蛋白酶在大多數(shù)人組織中都存在，在那里它們的生物學(xué)功能是眾所周知的。因此在最終的治療性蛋白產(chǎn)物中存在痕量的殘留粒酶B蛋白酶對施用該治療性蛋白產(chǎn)物的病人表現(xiàn)為最小的風(fēng)險。因此已知如果有活性的粒酶B蛋白酶注射到人血流中，它會迅速地被α-2-巨球蛋白所捕獲，然后該復(fù)合體通過LRP清除受體被清除。粒酶B蛋白酶還有另外一個名字是“細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞蛋白酶2”。
已知粒酶B蛋白酶優(yōu)先選擇在天冬氨酸(D)殘基之后切割，且粒酶B是已知的哺乳動物絲氨酸蛋白酶中唯一具有這種P1蛋白水解特異性的酶。因此根據(jù)本發(fā)明設(shè)想在有用的實施方案中的粒酶B切割位點在切割位點N端的P1位置至少包含一個天冬氨酸殘基。一些目前已知的粒酶B蛋白酶識別位點在Harris等人(1998)中予以公開。因此在有用的實施方案中，識別位點的氨基酸序列具有以下的通式切割位點的N端為P4P3P2P1↓，其中P4優(yōu)選的氨基酸為I或V，P3優(yōu)選的氨基酸為E，Q或M，P2是X，X代表任何氨基酸，P1優(yōu)選的氨基酸是D，↓是粒酶B蛋白酶的切割位點。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)粒酶B蛋白酶能夠從融合蛋白上切掉目標(biāo)多肽而不會在目標(biāo)多肽上留下任何非本來氨基酸。特別是令人驚奇地發(fā)現(xiàn)粒酶B蛋白酶能夠從融合蛋白上的P1位置之后識別和切掉多肽，而對P1′-P4′位置，即切割位點后的氨基酸位置的特異氨基酸殘基沒有任何嚴(yán)格限制。這與先前技術(shù)中的發(fā)現(xiàn)相反。在例如Sun等人(2001)中，結(jié)論是粒酶B底物的P1′-P4′殘基對于底物結(jié)合是重要的，當(dāng)存在酸性P4′殘基(即天冬氨酸或者谷氨酸)時，可以觀察到最高的底物親和性。此外，Harris等人(1998)的結(jié)論是粒酶B對P2′位置上的甘氨酸殘基具有強(qiáng)的優(yōu)選選擇。雖然有這些先前技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，但現(xiàn)在已經(jīng)確定粒酶B蛋白酶一般可以用于從融合蛋白上切除目標(biāo)多肽，而不需要在P1′-P4′位置上有特異的氨基酸殘基。
正如上面提及的，本發(fā)明另一個特別的優(yōu)勢是發(fā)現(xiàn)粒酶B蛋白酶使具有位于目標(biāo)多肽N端的粒酶B蛋白酶切割位點的融合蛋白被高效切割，并且具有高度的切割特異性。特別是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)粒酶B蛋白酶與目前廣泛使用的用于融合蛋白切割的蛋白酶，即Xa相比對融合蛋白具有更高的特異性切割。因此發(fā)現(xiàn)當(dāng)五個以前作為可被Xa因子切割而制備的不同融合蛋白在使用粒酶B蛋白酶切割時，得到的切割結(jié)果與因子Xa切割的特異性相當(dāng)或者更高，正如從以下實施例中可以清楚地看到的那樣。這可以從例如實施例8以及相伴隨的

圖11中看到，實施例8和圖11對使用因子Xa和粒酶B分別消化融合蛋白H6-IEGR-RAP和H6-IEPD-RAP，不同時間取樣進(jìn)行PAGE分析。從該實驗可以清楚地看到，30分鐘以后使用兩種蛋白酶融合蛋白都基本上被完全切割。但是使用Xa因子比使用粒酶B產(chǎn)生了更多的降解產(chǎn)物。這明顯說明粒酶B是高度特異的，特異性甚至高于廣泛使用的蛋白酶因子Xa。發(fā)現(xiàn)粒酶B既能夠從目標(biāo)多肽上切除相當(dāng)短的N端標(biāo)簽例如六聚組氨酸尾，又能夠在被一個短銜接物序列非常緊密連接的融合伴侶和目標(biāo)多肽之間產(chǎn)生切割，這里進(jìn)一步證明了粒酶B高度的多能性和巨大的靈活性。
盡管不是必需的，但是在某些實施方案中最好對目標(biāo)多肽進(jìn)行選擇，這樣如果目標(biāo)多肽是融合蛋白的一部分時，目標(biāo)多肽的N端包含氨基酸P1′和P2′，產(chǎn)生粒酶B識別位點的通式P4P3P2P1↓P1′P2′，其中P1′是X，X表示任何氨基酸，而P2′是G。盡管粒酶B蛋白酶對于P1′位置的氨基酸沒有嚴(yán)格的限制，但是在此位置一般優(yōu)選選擇大的疏水性氨基酸，包括Trp(T)，Leu(L)，Phe(F)和Ile(I)。這樣，在一個有用的實施方案中，P1′位置的氨基酸選自T，L，F(xiàn)和I。在某些實施方案中在P2′位置不包括Pro(P)可能是有利的。本發(fā)明的另一個方面對目標(biāo)多肽進(jìn)行選擇可能是有利的，這樣如果目標(biāo)多肽是融合蛋白的一部分時，目標(biāo)多肽的N端P4′位置包含酸性氨基酸例如D或E。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“氨基酸”和“氨基酸殘基”指的是全部天然存在的L-α-氨基酸。這個定義意味著包括正亮氨酸、鳥氨酸和高半胱氨酸。氨基酸通過三字母或者單字母名稱進(jìn)行確定Asp，D天冬氨酸Ile，I異亮氨酸Thr，T蘇氨酸 Leu，L亮氨酸Ser，S絲氨酸 Tyr，Y酪氨酸Glu，E谷氨酸 Phe，F(xiàn)苯丙氨酸Pro，P脯氨酸 His，H組氨酸Gly，G甘氨酸 Lys，K賴氨酸Ala，A丙氨酸 Arg，R精氨酸Cys，C半胱氨酸Trp，W色氨酸Val，V纈氨酸 Gln，Q谷氨酰胺Met，M甲硫氨酸Asn，N天冬酰胺Nle，J正亮氨酸Orn，O鳥氨酸Hcy，U高半胱氨酸 Xxx，X任何L-α-氨基酸。
在另外的有用實施方案中，粒酶B蛋白酶的識別位點具有的氨基酸序列選自ICPD↓，IEAD↓，IEPD↓，IETD↓，IQAD↓，ISAD↓，ISSD↓，ITPD↓，VAPD↓，VATD↓，VCTD↓，VDPD↓，VDSD↓，VEKD↓，VEQD↓，VGPD↓，VEID↓，VRPD↓，VTPD↓，LEED↓，LEID↓，LGND↓，LGPD↓，AQPD↓，其中↓是粒酶B的切割位點。這些識別和切割位點以前被Casciola-Rosen等人(1999)有所描述。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“目標(biāo)多肽”或者“所需的多肽”指的是在融合蛋白內(nèi)需要表達(dá)出來的多肽。正如在這里所使用的，術(shù)語“多肽”不一定對所需目標(biāo)多肽的大小提出限制，因此，這個術(shù)語應(yīng)按照其最廣義來理解，這樣就包括直至50或者更多氨基酸的多肽，包括寡肽如二、三、五和六肽，多肽和蛋白質(zhì)。目標(biāo)多肽可以是中間產(chǎn)物或者最終產(chǎn)物，例如可以用于醫(yī)藥領(lǐng)域、研究領(lǐng)域、環(huán)保領(lǐng)域或者在工業(yè)過程或產(chǎn)物中。正如前面所描述的，在融合蛋白中目標(biāo)多肽與另外一個蛋白或者蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域即融合伴侶相連或者融合，目的是例如提高目標(biāo)多肽的穩(wěn)定性以及便于融合蛋白的純化。在有用的實施方案中目標(biāo)多肽是蛋白例如分泌蛋白。分泌蛋白具有各種不同的工業(yè)應(yīng)用，包括藥物和診斷學(xué)。目前可以獲得的多數(shù)蛋白質(zhì)藥物例如溶栓藥劑、干擾素、白介素、紅細(xì)胞生成素、集落促生長因子以及多種不同的其他細(xì)胞因子都是分泌型蛋白。在有用的實施方案中，目標(biāo)多肽是多肽激素例如生長激素、胰高血糖素、胰島素或者干擾素、單鏈抗體可變區(qū)片段(scfv)，或者載脂蛋白如載脂蛋白a-i(apoA-I)，載脂蛋白A-II，或載脂蛋白A-IV。
在本發(fā)明的另一方面中，目標(biāo)多肽是一種酶，例如粒酶B。這樣，通過提供根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白并且選擇粒酶B蛋白酶作為目標(biāo)多肽，就提供了自我激活的粒酶B蛋白酶，它提供了這樣一種可能性，即提供無活性的粒酶B原，隨后原則上只要加入一分子的活性粒酶B蛋白酶就可以使粒酶B酶原被激活。這樣就可以提供不需要依賴外加例如外源激活劑生物物質(zhì)來激活的粒酶B原。正如下面的實施例中可以清楚看到的那樣，發(fā)現(xiàn)粒酶B自我激活是定量進(jìn)行直至完成的，且自我激活的粒酶B蛋白酶樣品繼續(xù)孵育幾天后發(fā)現(xiàn)仍然保持穩(wěn)定的活性水平并且只產(chǎn)生微量的自體分解產(chǎn)物。這清楚地證明了粒酶B蛋白酶自我激活的優(yōu)勢是對自體分解(cannibalism)具有高度穩(wěn)定性，如實施例5和圖3所示。
根據(jù)本發(fā)明，融合伴侶可以是任何適宜的類型，只要它是一種肽、寡肽、多肽或者蛋白質(zhì)即可，包括四肽、五肽以及六肽。可以對其進(jìn)行選擇使融合蛋白對蛋白降解具有更高的抵抗力、有助于表達(dá)的提高以及融合蛋白的分泌、提高可溶性并且使融合蛋白隨后用于親和純化。
本發(fā)明的融合蛋白在有用的實施方案中可能包含融合伴侶，它是一種親和標(biāo)簽。這種親和標(biāo)簽可能是例如一個親和結(jié)構(gòu)域，它可以使融合蛋白的純化在親和樹脂上進(jìn)行。親和標(biāo)簽還可以是多聚組氨酸標(biāo)簽包括六聚組氨酸標(biāo)簽、多聚精氨酸標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、Strep標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、S-標(biāo)簽、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽、纖維素結(jié)合肽、幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽或者麥芽糖結(jié)合蛋白。
正如上面提到的可以根據(jù)本發(fā)明使用任何適宜的粒酶B蛋白酶，包括人粒酶B蛋白酶、小鼠粒酶B蛋白酶和大鼠粒酶B蛋白酶。但是從以下的實施例中可以看出，發(fā)現(xiàn)將人粒酶B中的第228號氨基酸(胰凝乳蛋白酶原編號)半胱氨酸替換為苯丙氨酸，得到人粒酶B蛋白酶變異體，在制備人粒酶B時可以得到更高的最終蛋白質(zhì)收率，而卻沒有對切割特異性或者產(chǎn)生的粒酶B的活性有任何可觀察到的程度的影響。這一發(fā)現(xiàn)與以前的預(yù)期相左，因為苯丙氨酸(芳香氨基酸)與半胱氨酸(親水性氨基酸)在化學(xué)上相差很大，所以一般不考慮用它來替代半胱氨酸。這樣在現(xiàn)在的優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的粒酶B蛋白酶是人粒酶B蛋白酶變異體，其中第228號氨基酸(胰凝乳蛋白酶原編號)半胱氨酸突變?yōu)楸奖彼?。?yīng)當(dāng)理解術(shù)語“人粒酶B蛋白酶變異體”還包括在第228號氨基酸(胰凝乳蛋白酶原編號)半胱氨酸突變以外的變異體，在天然人粒酶B蛋白酶全長序列或者不同結(jié)構(gòu)域中具有進(jìn)一步變異的變異體，例如粒酶B蛋白酶變異體，其中在全長的天然粒酶B氨基酸序列的N或C端加入或者刪除了一個或者更多氨基酸殘基。例如使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何保守和非保守突變的技術(shù)和指導(dǎo)方針可以進(jìn)行這樣的進(jìn)一步的變體。變體可以是編碼人粒酶B蛋白酶的一個或者更多密碼子的替換、刪除或者插入，其結(jié)果是與天然的人粒酶B蛋白酶序列相比人粒酶B蛋白酶的氨基酸序列發(fā)生改變，優(yōu)選地，改變對人粒酶B蛋白酶特異性和/或活性沒有負(fù)面的影響。而且“人粒酶B蛋白酶變異體”的含義中也包括了全長的天然粒酶B氨基酸序列(例如激活的具有第228號半胱氨酸殘基突變的形式)的片段。在一個有用的實施方案中，粒酶B蛋白酶變異體是序列編號57顯示的變異體。
一般地，融合伴侶的選擇通常依據(jù)的是使分離簡化的性質(zhì)，最合意的是那些由產(chǎn)生融合蛋白的微生物容易地分泌出來的融合伴侶。例如多聚組氨酸序列、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶以及麥芽糖結(jié)合蛋白一般是優(yōu)選的，因為有現(xiàn)成的結(jié)合它們并且進(jìn)行洗脫的親和層析柱。
根據(jù)本發(fā)明的方法在有用的實施方案中可以包括一個隨后的分離步驟，用于分離通過融合蛋白酶切產(chǎn)生的目標(biāo)多肽。這一分離步驟可以通過任何本領(lǐng)域內(nèi)已知用于蛋白質(zhì)分離的適宜方法進(jìn)行，包括使用離子交換、按照大小進(jìn)行分級和親和純化，層析的選擇取決于目標(biāo)多肽的性質(zhì)。因此為了用于親和純化的目的，目標(biāo)多肽還可以例如包括一個C端連接的親和標(biāo)簽，目的是使用上述提及的親和標(biāo)簽系統(tǒng)分離產(chǎn)生的目標(biāo)多肽。
根據(jù)本發(fā)明，融合蛋白與粒酶B蛋白酶相接觸，以在緊鄰目標(biāo)多肽的粒酶B蛋白酶切割位點處切割融合蛋白，產(chǎn)生真實形式的目標(biāo)多肽。這一反應(yīng)可以使用游離的粒酶B分批進(jìn)行，或者使用固定化形式例如通過吸附、共價結(jié)合、截留或者膜限制固定的粒酶B蛋白酶。用于固定粒酶B蛋白酶的適宜載體包括常規(guī)載體例如聚丙烯酰胺、幾丁質(zhì)、葡聚糖、κ角叉膠、硅藻土和纖維素。通過共價偶聯(lián)到不溶性的基質(zhì)上對酶進(jìn)行固定化是廣泛使用的技術(shù)。在使酶共價結(jié)合到不溶性支持物方面，賴氨酸殘基是最常使用的基團(tuán)，原因是廣泛暴露的表面和高度的反應(yīng)性。因此在有用的實施方案中，粒酶B蛋白酶通過賴氨酸殘基被固定化。另一方面，粒酶B蛋白酶通過其C端被固定化，例如通過多聚組氨酸標(biāo)簽(包括六聚組氨酸標(biāo)簽)。該反應(yīng)還可以通過游離的粒酶B蛋白酶與膜類型的生物反應(yīng)器聯(lián)合使用來進(jìn)行，或者使用連續(xù)類型的生物反應(yīng)器以及固定化的粒酶B蛋白酶。
正如從以下實施例中可以清楚看到的那樣，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)如果包含一個多聚組氨酸融合伴侶(例如六聚組氨酸)的游離的融合蛋白(即非固定的)在Ni2+離子和氨三乙酸(NTA)的存在下與粒酶B蛋白酶接觸，則其切割所需的時間會顯著減少。考慮這一切割速度的顯著提高主要原因是鎳離子與融合蛋白的N端的多聚組氨酸融合伴侶結(jié)合并且有助于粒酶B蛋白酶接觸到切割位點。此外還考慮到加入NTA會在溶液中包圍在鎳離子之外，正如在Ni2+-NTA瓊脂糖層析柱上的方式一樣，這樣就避免融合蛋白以及產(chǎn)生的蛋白出現(xiàn)沉淀。當(dāng)進(jìn)行這樣的切割過程時，一般優(yōu)選的鎳離子濃度范圍是1-20mM，NTA的濃度范圍是1-20mM。此外，優(yōu)選的溫度范圍是15-50℃，包括20-45℃的范圍。在一個優(yōu)選的實施方案中，溫度范圍是20-30℃，例如大約23℃。在另一個略不優(yōu)選的實施方案中，溫度范圍是30-45℃，例如大約37℃。最佳的溫度范圍可以對每一個融合蛋白分別確定，因為這部分地取決于在不同溫度下融合蛋白的穩(wěn)定性。
根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)如上面有所描述的，還提供了融合蛋白，其按N端到其C端的順序包含(a)融合伴侶(b)包含粒酶B蛋白酶切割位點的粒酶B蛋白酶識別位點以及(c)目標(biāo)多肽，其中所述的切割位點緊鄰目標(biāo)多肽。在有用的實施方案中，目標(biāo)多肽是粒酶B，這樣就提供了自體激活的粒酶B蛋白酶。特別地，提供了自體激活的人粒酶B酶原融合蛋白，從其N端到其C端的順序包含具有粒酶B識別位點和切割位點的七氨基酸殘基的原序列，之后是激活的人粒酶B氨基酸序列，最后是與粒酶B的C端融合的六聚組氨酸標(biāo)簽(H6)。因此粒酶B切割位點緊鄰激活的粒酶B氨基酸序列的Ile16(胰凝乳蛋白酶原編號)。更為特別的是，提供了人自體激活粒酶B融合蛋白pro-IEPD-GrB-H6(序列編號2)和pro-IEAD-GrB-H6(序列編號3)。而且還如前面描述的，發(fā)現(xiàn)將第228號殘基半胱氨酸(胰凝乳蛋白酶原編號)通過定點突變替換為丙氨酸(A)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)或者苯丙氨酸(F)是有益的。在其他有用的實施方案中提供的自體激活融合蛋白選自以下各項組成的組pro-IEPD-GrB-H6 C228A(序列編號5)，pro-IEPD-GrB-H6 C228T(序列編號6)，pro-IEPD-GrB-H6 C228V(序列編號7)，和pro-IEPD-GrB-H6 C228F(序列編號8)。
融合蛋白或者本發(fā)明的粒酶B蛋白酶變異體可以在任意適宜的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中通過培養(yǎng)用編碼融合蛋白的載體轉(zhuǎn)化的宿主(培養(yǎng)條件是融合蛋白被表達(dá))進(jìn)行表達(dá)。優(yōu)選地，表達(dá)系統(tǒng)是使目標(biāo)融合蛋白能夠在體外容易地分離和重折疊的表達(dá)系統(tǒng)。一般來講，優(yōu)選原核表達(dá)系統(tǒng)，因為可以得到高產(chǎn)量的蛋白，并且有有效的純化和重折疊策略。但是，可以選擇許多宿主細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化和表達(dá)所描述融合蛋白的適宜宿主，包括特別適宜的哺乳動物、昆蟲、真菌和細(xì)菌宿主細(xì)胞。通常使用的細(xì)菌菌株包括芽孢桿菌和埃希氏菌，包括大腸桿菌。這樣，選擇適宜的或者中意的宿主和表達(dá)系統(tǒng)，完全是在具有技術(shù)從業(yè)人員的能力和判斷力之內(nèi)，而不需要過度的實驗。類似地，一旦選定了本發(fā)明融合蛋白的一級氨基酸序列，本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員可以很容易地設(shè)計出編碼本發(fā)明融合蛋白或者粒酶B蛋白酶變異體的適當(dāng)?shù)闹亟M核酸序列或者DNA構(gòu)建體，同時考慮到的因素包括所選宿主中的密碼子偏好、宿主中對分泌信號序列的需要、信號序列中蛋白酶切割位點的引入等等。這些重組DNA構(gòu)建體可以按照閱讀框插入到眾多適宜于所選宿主的載體的任何一個中。適宜和中意的表達(dá)載體的選擇也完全在具有技術(shù)從業(yè)人員的能力和判斷力之內(nèi)。優(yōu)選地，表達(dá)載體包括強(qiáng)啟動子，以引導(dǎo)重組構(gòu)建體的表達(dá)。
最后，提供了一種生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白或者粒酶B蛋白酶變異體的方法，包括如下步驟(i)提供重組載體，該載體包含有效連接于啟動子的編碼本發(fā)明的融合蛋白或者粒酶B蛋白酶變異體的分離的核酸序列；(ii)使用該重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(iii)在表達(dá)融合蛋白的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；以及(iv)選擇性地分離融合蛋白或者粒酶B蛋白酶變異體。
現(xiàn)在通過在以下非限制性的實施例和圖片進(jìn)行舉例說明來描述本發(fā)明。
附圖描述圖1顯示了GrB-H6與FXa孵育幾天的活性，使用以下的顯色試驗500μl緩沖液(100mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0)，4μl 100mMAc-IEPD-pNA和5μl GrB-H6。100μl GrB-H6(大約10μg)和1μl FXa(1mg/ml)的混合物置于4℃孵育，在0小時、2小時、5小時、19小時、2天和5天后測定活性。
圖2顯示GrB-H6和GrB-H6 C228F對幾個顯色底物的活性Ac-IEPD-pNA，Ac-LEED-pNA，Ac-VEID-pNA，Ac-YVAD-pNA，和Ac-DEVD-pNA?；钚栽囼炘?00μl 100mM HEPES pH 7.75中進(jìn)行，底物濃度為400μM，每一次測定加入1μg蛋白酶。所有測定在23℃下進(jìn)行，且測定3次，通過設(shè)置Ac-IEPD-pNA測得的活性為100％，對所有得到的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖3(A)顯示在100mM HEPES pH 7.4下，于4℃，23℃，和37℃孵育的GrB-H6 C228F樣品的SDS PAGE結(jié)果。
A-N泳道的樣品描述A分子量標(biāo)記BGrB-H6 C228F，孵育前CGrB-H6 C228F 4℃孵育1天DGrB-H6 C228F 4℃孵育3天EGrB-H6 C228F 4℃孵育6天FGrB-H6 C228F 4℃孵育15天GGrB-H6 C228F 23℃孵育1天HGrB-H6 C228F 23℃孵育3天IGrB-H6 C228F 23℃孵育6天JGrB-H6 C228F 23℃孵育15天KGrB-H6 C228F 37℃孵育1天LGrB-H6 C228F 37℃孵育3天MGrB-H6 C228F 37℃孵育6天NGrB-H6 C228F 37℃孵育15天泳道B顯示了完好的GrB-H6 C228F。完好蛋白酶的條帶在所有的泳道中都可以見到(1)，I-N泳道中出現(xiàn)另外一個條帶(2)，該條帶必定是蛋白酶降解的產(chǎn)物，很可能是由于在序列IQDD↓FV的Asp50和Phe51之間進(jìn)行自體切割造成的。
圖3(B)顯示了在100mM HEPES pH 7.4下，于4℃，23℃，和37℃孵育的GrB-H6 C228F樣品，孵育0、6、(10)和15天后活性測定的結(jié)果?；钚詼y定在500μl 100mM HEPES pH 7.4中進(jìn)行，每次測定加入具有從孵育樣品中取出的0.2μg GrB-H6 C228F的400μM Ac-IEPD-pNA。
圖4顯示H6-TripUB IEPD↓SP和H6-IEPD-TN123與GrB-H6一同孵育12小時后樣品的SDS PAGE。
泳道A-J的描述A分子量標(biāo)記BH6-TripUB IEPD↓SP自身于12小時孵育之后C200μl H6-TripUB IEPD↓SP+1μl GrB-H6于12小時孵育之后D200μl H6-TripUB IEPD↓SP+10μl GrB-H6于12小時孵育之后EH6-FX-TripUB與FXa孵育FH6-IEPD-TN123自身于12小時孵育之后G200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6于12小時孵育之后H200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6于12小時孵育之后I與泳道D和H中相同濃度的GrB-H6自身J使用FXa切割小鼠H6-FX-TN123泳道B顯示了未切割的H6-TripUB IEPD↓SP(1)，其中沒有加入GrB-H6，而泳道C和D顯示兩次孵育，分別加入1和10微升的GrB-H6。在這兩個泳道中，除了未切割的融合蛋白外，還可以看到切割反應(yīng)的產(chǎn)物，即正確切割的H6-TripUB IEPD↓SP(2)。泳道E中含有FXa識別位點IQGR而不是GrB識別位點IEPD的構(gòu)建體H6-FX-TripUB用FXa切割，產(chǎn)生的產(chǎn)物與GrB-H6切割的H6-TripUB IEPD↓SP具有相同的大小。
泳道F-J顯示GrB-H6+H6-IEPD-TN123孵育12小時后的結(jié)果。F泳道顯示未切割的H6-IEPD-TN123(3)。泳道G和H顯示在沒有鈣離子存在的條件下，H6-IEPD-TN123是如何被GrB-H6切割的(4)。電泳的帶型在圖12中給予解釋。泳道J中小鼠H6-FX-TN123構(gòu)建體使用FXa切割顯示了正確切割產(chǎn)物的大小。圖中標(biāo)記為(5)的是GrB-H6的位置，與加入10μl GrB-H6的樣品中GrB-H6的濃度相同。
圖5顯示了GrB-H6+H6-TripUB IEPD↓SP孵育12、19和24小時后樣品的SDS PAGE結(jié)果，以及GrB-H6+H6-IEPD-TN123孵育的樣品的SDS PAGE結(jié)果。
泳道A-K描述A分子量標(biāo)記BH6-TripUB IEPD↓SP自身于12小時孵育后C200μl H6-TripUB IEPD↓SP+1μl GrB-H6于12小時孵育后D200μl H6-TripUB IEPD↓SP+1μl GrB-H6于19小時孵育后E200μl H6-TripUB IEPD↓SP+1μl GrB-H6于24小時孵育后F200μl H6-TripUB IEPD↓SP+10μl GrB-H6于19小時孵育后G200μl H6-TripUB IEPD↓SP+10μl GrB-H6于24小時孵育后HGrB-H6于自身如F和G中一樣稀釋IH6-IEPD-TN123自身于12小時孵育后J200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6于12小時孵育后K200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6于12小時孵育后泳道B顯示了未切割的H6-TripUB IEPD↓SP(1)。泳道C-E中正確切割的產(chǎn)物在所有的泳道中都有出現(xiàn)，在圖中用(2)標(biāo)記。加入的GrB-H6越多，孵育時間越長，在泳道中出現(xiàn)更多的切割產(chǎn)物。
圖3中的I、J和K泳道與圖2中具有H6-IEPD-TN123+GrB-H6孵育物的F，G，和H泳道相同，盡管在圖3的凝膠上上樣量更大。因此條帶比圖2中的條帶更清楚。標(biāo)記為(3)的條帶是未切割的H6-IEPD-TN123，標(biāo)記為(4)，(5)，(6)和(7)的帶型在圖12中予以解釋。
圖6解釋了圖2和3中觀察到的簡單帶型。當(dāng)沒有GrB-H6加入時，沒有出現(xiàn)切割，在凝膠上只看到未切割的融合蛋白。在GrB-H6加入時，小的N端序列被切掉，在凝膠上除了剩余的未切割的融合蛋白以外還有正確切割的產(chǎn)物出現(xiàn)。被GrB-H6切掉的小N端序列由于太小，不能在SDS凝膠上觀察到。
圖7、8和9顯示H6-TripUB IEPD↓SP+GrB-H6在23℃(圖5)，37℃(圖6)和42℃(圖7)下孵育樣品的SDS PAGE結(jié)果，無添加物(1)，加入4.2mM Ni2+(2)以及加入4.2mM Ni2++5mM NTA(3)。A-K泳道的描述(對所有的溫度相同)A分子量標(biāo)記B未切割的H6-TripUB IEPD↓SPC200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，無添加物D200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，無添加物E200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，無添加物F200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，4.2mM Ni2+G200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，4.2mM Ni2+H200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，4.2mM Ni2+I200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，4.2mM Ni2++5mMNTAJ200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，4.2mM Ni2++5mMNTAK200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，4.2mM Ni2++5mMNTA所有三個圖的泳道C-E(1)中沒有加入Ni2+或NTA時，H6-TripUBIEPD↓SP融合蛋白的切割在不同溫度下進(jìn)行的速率不同。23℃下22小時后，大約40％的融合蛋白被切割。22小時后，于37℃和42℃下比23℃下有更多的融合蛋白被切割，大約是于37℃為60％，于42℃為50％。
由于在37℃和42℃下加入4.2mM Ni2+時觀察到蛋白的沉淀，2小時孵育后在凝膠上沒有再觀察到融合蛋白的進(jìn)一步切割。因此在圖6(37℃)和圖7(42℃)的泳道F-H(2)中看到的蛋白少于圖5(23℃)的泳道F-H(2)中看到的蛋白。在圖5的泳道F-H(2)中，大約50％的融合蛋白在22小時的孵育后被切割為產(chǎn)物，這比沒有加入Ni2+時要多。
孵育時加入4.2mM Ni2++5mM NTA，沒有觀察到沉淀。在圖5的I-K泳道中(3)，比泳道C-E(1)和F-H(2)觀察到更多的產(chǎn)物，所以在Ni2+和NTA存在的條件下于23℃孵育22小時后，大約60％的融合蛋白被切割，而沒有添加物時切割率是40％，只加入Ni2+時切割率是50％。
進(jìn)一步提高溫度至37℃(圖6泳道I-K(3))和42℃(圖7泳道I-K(3))，觀察到切割率有更大的提高。于37℃孵育22小時后幾乎所有的融合蛋白都被切割為正確的產(chǎn)物。于42℃孵育22小時后，與37℃相比只有少量的融合蛋白沒有被切割。
圖10顯示H6-IEPD-RAP與1或10μl GrB-H6的共同孵育后樣品的SDS PAGE結(jié)果。泳道(A-L)描述如下A分子量標(biāo)記BH6-IEPD-RAP自身于5小時孵育后C200μl H6-IEPD-RAP+1μl GrB-H6于5小時孵育后D200μl H6-IEPD-RAP+10μl GrB-H6于5小時孵育后EH6-IEPD-RAP自身于23小時孵育后F200μl H6-IEPD-RAP+1μl GrB-H6于23小時孵育后G200μl H6-IEPD-RAP+10μl GrB-H6于23小時孵育后HH6-IEGR-RAP被FXa部分切割，純化的IH6-IEGR-RAP幾乎被FXa完全切割，純化的JH6-IEPD-RAP自身于26小時孵育后K200μl H6-IEPD-RAP+1μl GrB-H6于26小時孵育后L200μl H6-IEPD-RAP+10μl GrB-H6于26小時孵育后未切割的H6-IEPD-RAP(1)在泳道B，E，和J中顯示。泳道C和D中清楚顯示在根據(jù)上面描述與1或10μl GrB-H6的共同孵育僅5小時后所有的H6-IEPD-RAP都被切割產(chǎn)生最終產(chǎn)物(2)。還清楚地顯示在RAP中至少有一個內(nèi)部切割位點，在這些泳道中產(chǎn)生兩個低分子量的條帶，即最終的產(chǎn)物被切割呈兩段，在凝膠上都可見(3)。泳道F和G以及泳道K和L與泳道C和D基本相同，盡管取樣時間靠后，與GrB-H6共同孵育23和26小時后在RAP的顯著內(nèi)部位點中產(chǎn)生更多的切割。
泳道H和I中顯示經(jīng)過FXa部分切割(泳道H)或者完全切割(泳道I)的H6-IEGR-RAP產(chǎn)生最終的RAP產(chǎn)物的純化樣品。在這些泳道中，已經(jīng)通過純化除去來自任何由FXa在內(nèi)部切割產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。
圖11顯示H6-IEPD-RAP+GrB-H6和H6-IEGR-RAP+FXa孵育樣品的SDS PAGE結(jié)果。泳道(A-O)的描述A分子量標(biāo)記BH6-IEGR-RAP自身于27小時孵育后C400μl H6-IEGR-RAP+1μl FXa于1/2小時孵育后D400μl H6-IEGR-RAP+1μl FXa于1小時孵育后E400μl H6-IEGR-RAP+1μl FXa于3小時孵育后F400μl H6-IEGR-RAP+1μl FXa于5小時孵育后G400μl H6-IEGR-RAP+1μl FXa于7小時孵育后H400μl H6-IEGR-RAP+1μl FXa于27小時孵育后IH6-IEPD-RAP自身于27小時孵育后J400μl H6-IEPD-RAP+2μl GrB-H6于1/2小時孵育后K400μl H6-IEPD-RAP+2μl GrB-H6于1小時孵育后L400μl H6-IEPD-RAP+2μl GrB-H6于3小時孵育后M400μl H6-IEPD-RAP+2μl GrB-H6于5小時孵育后N400μl H6-IEPD-RAP+2μl GrB-H6于7小時孵育后O400μl H6-IEPD-RAP+2μl GrB-H6于27小時孵育后在泳道B-H中是H6-IEGR-RAP孵育后的樣品(1)，其中泳道B顯示未切割的H6-IEGR-RAP。泳道C-H顯示在僅僅半小時后幾乎所有的融合蛋白都已經(jīng)被FXa切割產(chǎn)生正確的產(chǎn)物。泳道D-G中出現(xiàn)了一些降解產(chǎn)物，在泳道H中27小時的孵育后，所有的融合蛋白都已經(jīng)被降解，產(chǎn)生不同的小片段，沒有剩下正確切割的產(chǎn)物。
泳道I-O顯示了H6-IEPD-RAP孵育后的樣品(2)。泳道I顯示了未切割的H6-IEPD-RAP，與H6-IEGR-RAP相同，在僅僅半小時后幾乎所有的H6-IEPD-RAP都已經(jīng)被GrB-H6切割產(chǎn)生正確的產(chǎn)物，如泳道J中所示。在泳道K-N中，出現(xiàn)了降解產(chǎn)物，但是與H6-IEGR-RAP孵育的結(jié)果相比要少。在泳道O中，27小時孵育后仍然有相當(dāng)多的正確切割的產(chǎn)物剩余。
圖12顯示H6Ubi-IEPD-ApoA1+GrB-H6 C228F和H6Ubi-IEGR-ApoA1+FXa孵育樣品的SDS PAGE結(jié)果。泳道(A-M)的描述A分子量標(biāo)記BH6Ubi-IEPD-ApoA1自身，0小時孵育C400μg H6Ubi-IEPD-ApoA1+0.4μg GrB-H6 C228F，1小時孵育D400μg H6Ubi-IEPD-ApoA1+0.4μg GrB-H6 C228F，3小時孵育E400μg H6Ubi-IEPD-ApoA1+0.4μg GrB-H6 C228F，6小時孵育F400μg H6Ubi-IEPD-ApoA1+0.4μg GrB-H6 C228F，24小時孵育G400μg H6Ubi-IEPD-ApoA1+0.4μg GrB-H6 C228F，48小時孵育HH6Ubi-IEGR-ApoA1自身，0小時孵育I350μg H6Ubi-IEGR-ApoA1+0.35μg FXa，1小時孵育J350μg H6Ubi-IEGR-ApoA1+0.35μg FXa，3小時孵育K350μg H6Ubi-IEGR-ApoA1+0.35μg FXa，6小時孵育L350μg H6Ubi-IEGR-ApoA1+0.35μg FXa，24小時孵育M350μg H6Ubi-IEGR-ApoA1+0.35μg FXa，48小時孵育在泳道B-G中是H6Ubi-IEPD-ApoA1孵育后的樣品(1)，其中泳道B顯示未切割的H6Ubi-IEPD-ApoA1制備物。泳道H-M顯示H6Ubi-IEGR-ApoA1孵育后的樣品(2)，其中泳道H顯示未切割的H6Ubi-IEGR-ApoA1制備物。完好的、未經(jīng)切割的融合蛋白由(3)指示。(4)標(biāo)記的條帶是正確切割的ApoA1產(chǎn)物，而(5)標(biāo)記的條帶是H6Ubi融合伴侶。
圖13顯示H6-IEPD-TN123+GrB-H6在沒有加入Ca2+的情況下孵育12小時和5天后的樣品的SDS PAGE結(jié)果。一些樣品經(jīng)過還原處理。泳道(A-N)的描述A分子量標(biāo)記B200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6 5天孵育后，樣品被還原處理C200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6 5天孵育后，樣品被還原處理D+EH6-IEPD-TN123自身于5天孵育后F200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6于5天孵育后G200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6于5天孵育后HGrB-H6自身如在C和G中一樣稀釋IH6-IEPD-TN123自身于12小時孵育后J200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6于12小時孵育后K200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6于12小時孵育后LH6-IEPD-TN123自身于12小時孵育后，樣品被還原處理M200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6于12小時孵育后，樣品被還原處理N200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6于12小時孵育后，樣品被還原處理泳道I-K與圖2中的泳道F-H和圖3中的泳道I-K相同，即與0，0.2或2μg GrB-H6孵育12小時后的樣品。這里的帶型(1)表明H6-IEPD-TN123的TN123部分存在一個內(nèi)部切割位點，該帶型在圖12中有進(jìn)一步的解釋。泳道D-G顯示5天孵育后的結(jié)果，這里大部分的融合蛋白已被切割。泳道G(加入了10μl GrB-H6)中幾乎所有的融合蛋白都被切割了兩次(2)；在IEPD↓序列處以及在TN123中具有AQPD↓序列的內(nèi)部位點。
泳道L-N以及泳道B-D分別是相同樣品12小時后和5天后的結(jié)果，但是這里樣品經(jīng)過還原處理。帶型(3)在圖12中也有解釋，同樣幾乎所有的融合蛋白在與10μl GrB-H6孵育5天后都被切割了兩次，泳道C(4).
圖14顯示了H6-IEPD-TN123+GrB-H6在加入Ca2+的情況下孵育12小時和兩天后樣品的SDS PAGE結(jié)果。一些樣品經(jīng)過還原處理。泳道(A-K)的描述A分子量標(biāo)記B200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6以及5mM CaCl2，樣品經(jīng)過還原處理C200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6以及5mM CaCl2，樣品經(jīng)過還原處理DH6-IEPD-TN123自身E200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6以及5mM CaCl2F200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6沒有CaCl2G200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6以及5mM CaCl2H200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6沒有CaCl2IGrB-H6自身如在G和H中一樣稀釋J200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6沒有CaCl2孵育兩天后K200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6沒有CaCl2孵育兩天后泳道B-H和J-K顯示H6-IEPD-TN123與GrB-H6分別孵育12小時和兩天的結(jié)果。
泳道D顯示未切割的H6-IEPD-TN123。比較泳道E和G(+5mM Ca2+)與泳道F和H(沒有Ca2+)，在5mM Ca2+存在時只出現(xiàn)兩個條帶(1)，而在沒有Ca2+時有4個條帶(2)，如圖2、3、10和12的描述。在Ca2+存在時，與10μl GrB-H6孵育12小時后大約40％的融合蛋白已經(jīng)被正確切割(泳道G)，而在沒有Ca2+存在時，兩個位點發(fā)生的切割更快一些(泳道H，12小時后；泳道K，2天后)。在泳道K中幾乎所有的融合蛋白都被切割了兩次(3)。
泳道B和C中的樣品經(jīng)過還原處理且仍然只有兩個條帶出現(xiàn)(4)；未切割的H6-IEPD-TN123和除去H6后的正確切割產(chǎn)物。
圖15顯示了在圖2、3、10和11中的SDS PAGE凝膠上觀察到的帶型的示意圖。
(A)當(dāng)沒有Ca2+存在時，H6-IEPD-TN123構(gòu)建體在兩個不同的位置切割，用“GrB-H6→”表示。被切除的小的N端部分太小，所以不能在凝膠上觀察到。產(chǎn)生的分子由兩條多肽鏈組成，它們之間由一個二硫鍵維系。
(1)和(2)在非還原性凝膠上，(2)中的帶型是在切割不完全時得到的。(1)是未切割的H6-IEPD-TN123，在(2)中剩余未切割的融合蛋白是從上數(shù)第二條帶。(2)中最上方的帶是在內(nèi)部位點AQPD↓切割后的H6-IEPD-TN123，產(chǎn)生的分子與未切割的H6-IEPD-TN123大小相同，但是較不緊密。在底部的帶是正確切割的融合蛋白，而從上數(shù)第三條帶是切割了兩次的融合蛋白，即在正確的IEPD↓位點和內(nèi)部AQPD↓位點的切割。在內(nèi)部位點切割后，分子的緊密程度降低，因此在凝膠中比正確切割的融合蛋白遷移得要短。
(3)和(4)如果將樣品還原處理，則觀察到(4)中的帶型。這里任何的二硫鍵都被打斷，所以在凝膠上只能看到單個多肽鏈。(3)顯示了未切割的還原的H6-IEPD-TN123的位置。(4)中最上方的條帶是剩余的未切割的H6-IEPD-TN123，而從上數(shù)第二條帶是正確切割的還原的H6-IEPD-TN123。在還原條件下在內(nèi)部被切割的分子不再被任何的二硫鍵所維系，所以在內(nèi)部切割后兩個多肽中只有稍大的多肽才能在凝膠上看到。因此從上數(shù)第三條帶是融合蛋白內(nèi)部切割后產(chǎn)生的稍大部分，而底部的條帶是在正確的IEPD↓位點和內(nèi)部位點切割后產(chǎn)生的稍大部分。
(B)在孵育中加入5mM Ca2+后，觀察不到內(nèi)部的切割。Ca2+離子與H6-IEPD-TN123分子結(jié)合的方式阻止了GrB-H6在內(nèi)部的AQPD↓位點切割融合蛋白。隨著AQPD↓不能被切割，切割只在正確的IEPD↓位點發(fā)生。
(5)和(6)當(dāng)只在正確的位點IEPD↓位點處切割時就看到了(6)中的帶型。未切割的H6-IEPD-TN123的位置在(5)中所示，所以(6)中上方的條帶是剩余的未切割的H6-IEPD-TN123。底部的條帶是只在正確位點切割了僅一次的融合蛋白。小的N端肽太小，所以不能在凝膠上觀察到。
圖16顯示了五個H6-TripUB變異體中的三個與GrB-H6孵育的樣品。該三個變異體分別是H6-TripUB IEPD↓SP，H6-TripUB IQAD↓SP和H6-TripUB IQAD↓SG。泳道(A-P)的描述A分子量標(biāo)記BH6-TripUB IEPD↓SP自身于24小時孵育后C200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6于2小時孵育后D200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6于6小時孵育后E200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6于24小時孵育后F200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6于48小時孵育后
GH6-TripUB IQAD↓SP自身于24小時孵育后H200μl H6-TripUB IQAD↓SP+5μl GrB-H6于2小時孵育后I200μl H6-TripUB IQAD↓SP+5μl GrB-H6于6小時孵育后J200μl H6-TripUB IQAD↓SP+5μl GrB-H6于24小時孵育后K200μl H6-TripUB IQAD↓SP+5μl GrB-H6于48小時孵育后LH6-TripUB IQAD↓SG自身于24小時孵育后M200μl H6-TripUB IQAD↓SG+5μl GrB-H6于2小時孵育后N200μl H6-TripUB IQAD↓SG+5μl GrB-H6于6小時孵育后O200μl H6-TripUB IQAD↓SG+5μl GrB-H6于24小時孵育后P200μl H6-TripUB IQAD↓SG+5μl GrB-H6于48小時孵育后泳道B中顯示了未切割的H6-TripUB IEPD↓SP，在與GrB-H6共同孵育后，在泳道C-F中出現(xiàn)越來越多的正確切割的產(chǎn)物。在泳道F中，48小時孵育后大約2/3起始量的未切割的H6-TripUB IEPD↓SP已經(jīng)被正確切割。在泳道G-K中，顯示的是H6-TripUB IQAD↓SP樣品，與H6-TripUB IEPD↓SP的結(jié)果大致相同，未切割的H6-TripUB IQAD↓SP在泳道G中，而在泳道H-K中出現(xiàn)越來越多的正確切割的產(chǎn)物。但是切割比對IEPD↓SP序列的切割要慢得多，且在48小時的孵育后只有一小部分被切割。對于泳道L-P中的H6-TripUB IQAD↓SG樣品，顯然切割的速率要比H6-TripUB IEPD↓SP和H6-TripUB IQAD↓SP都快得多。泳道L顯示未切割的H6-TripUB IQAD↓SG在僅僅兩小時孵育后大部分的融合蛋白都已經(jīng)被切割產(chǎn)生正確的產(chǎn)物了。
圖17顯示五個H6-TripUB變異體中的兩個與GrB-H6孵育的樣品。該兩個剩余的變異體是H6-TripUB VGPD↓SP和H6-TripUB VGPD↓FG。泳道(A-K)的描述AH6-TripUB VGPD↓SP自身于24小時孵育后B200μl H6-TripUB VGPD↓SP+5μl GrB-H6于2小時孵育后C200μl H6-TripUB VGPD↓SP+5μl GrB-H6于6小時孵育后D200μl H6-TripUB VGPD↓SP+5μl GrB-H6于24小時孵育后
E200μl H6-TripUB VGPD↓SP+5μl GrB-H6于48小時孵育后FH6-TripUB VGPD↓FG自身24小時孵育后G200μl H6-TripUB VGPD↓FG+5μl GrB-H6于2小時孵育后H200μl H6-TripUB VGPD↓FG+5μl GrB-H6于6小時孵育后I200μl H6-TripUB VGPD↓FG+5μl GrB-H6于24小時孵育后J200μl H6-TripUB VGPD↓FG+5μl GrB-H6于48小時孵育后K分子量標(biāo)記泳道A中是未切割的H6-TripUB VGPD↓SP，泳道B-E中出現(xiàn)越來越多正確切割的產(chǎn)物，如在H6-TripUB IEPD↓SP中所見到的一樣(泳道B-F，圖16)。48小時后大約一半量的融合蛋白都已經(jīng)被切割。在泳道F中顯示了未切割的H6-TripUB VGPD↓FG，在泳道G-J中出現(xiàn)H6-TripUB VGPD↓FG的正確切割產(chǎn)物。僅僅2小時孵育后，所有的融合蛋白都已經(jīng)被正確切割。
圖18顯示H6-TripUB IEPD↓SP，H6-TripUB IEPD↓TQ和H6-TripUB IEPD↓IV與GrB-H6 C228F在23℃孵育的樣品，蛋白酶和融合蛋白的比例是1∶500。
泳道A-M的描述A分子量標(biāo)記BH6-TripUB IEPD↓SP，0小時孵育C250μl H6-TripUB IEPD↓SP+1μl GrB-H6 C228F，4小時孵育D250μl H6-TripUB IEPD↓SP+1μl GrB-H6 C228F，24小時孵育E250μl H6-TripUB IEPD↓SP+1μl GrB-H6 C228F，96小時孵育FH6-TripUB IEPD↓TQ，0小時孵育G250μl H6-TripUB IEPD↓TQ+1μl GrB-H6 C228F，4小時孵育
H250μl H6-TripUB IEPD↓TQ+1μl GrB-H6 C228F，24小時孵育I250μl H6-TripUB IEPD↓TQ+1μl GrB-H6 C228F，96小時孵育JH6-TripUB IEPD↓IV，0小時孵育K250μl H6-TripUB IEPD↓IV+1μl GrB-H6 C228F，4小時孵育L250μl H6-TripUB IEPD↓IV+1μl GrB-H6 C228F，24小時孵育M250μl H6-TripUB IEPD↓IV+1μl GrB-H6 C228F，96小時孵育在泳道B-E中顯示了H6-TripUB IEPD↓SP的切割(1)，其中的切割在96小時后幾乎是100％的完全。泳道F-I是H6-TripUB IEPD↓TQ的切割(2)，僅在24小時后切割幾乎是100％完全了。對于泳道J-M顯示的H6-TripUB IEPD↓IV(3)的切割也是相同的情況。完好的和切割的H6-TripUB IEPD↓TQ在凝膠上都位于比H6-TripUB IEPD↓SP的條帶略偏下的位置，原因是H6-TripUB IEPD↓TQ是H6-TripUB IEPD↓SP的一個刪除突變體。另一個刪除突變體H6-TripUB IEPD↓IV的條帶位置更靠下，因為刪除的片段比H6-TripUB IEPD↓TQ中的刪除片段要大。
圖19，A顯示H6-TripUB IEPD↓SP和H6-TripUB IEPD↓EP與GrB-H6 C228F在21℃和37℃孵育的樣品，蛋白酶和融合蛋白的比例是1∶500，總體積是200微升。
泳道A-O的描述A分子量標(biāo)記BH6-TripUB IEPD↓SP，0小時孵育C24μg H6-TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB-H6 C228F，21℃，4小時
D24μg H6-TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB-H6 C228F，21℃，24小時E24μg H6-TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB-H6 C228F，21℃，48小時F24μg H6-TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB-H6 C228F，37℃，4小時G24μg H6-TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB-H6 C228F，37℃，24小時H24μg H6-TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB-H6 C228F，37℃，48小時IH6-TripUB IEPD↓EP，0小時孵育J36μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB-H6 C228F，21℃，4小時K36μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB-H6 C228F，21℃，24小時L36μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB-H6 C228F，21℃，48小時M36μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB-H6 C228F，37℃，4小時N36μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB-H6 C228F，37℃，24小時O36μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB-H6 C228F，37℃，48小時完好的未切割的H6-TripUB IEPD↓SP在泳道B中顯示(1)，而在21℃和37℃的切割分別在泳道C-E(2)和泳道F-H(3)中顯示。在兩個溫度下幾乎沒有差異。21℃下48小時后大約40％已經(jīng)被切割。未切割的H6-TripUB IEPD↓EP在泳道I(4)中顯示，而在21℃和37℃的切割反應(yīng)分別在泳道J-L(5)和泳道M-O(6)中顯示。同樣兩個溫度間幾乎沒有差異，21℃下48小時后大約35-40％已經(jīng)被切割，即GrB-H6 C228F對兩個底物切割得都很好。
圖19，B顯示H6-TripUB IEPD↓EG和H6-TripUB IEPD↓EP與GrB-H6 C228F在22℃和37℃孵育的樣品，蛋白酶和融合蛋白的比例是1∶500，總體積是200微升。
泳道A-O的描述A分子量標(biāo)記BH6-TripUB IEPD↓EG，0小時孵育C40μg H6-TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB-H6 C228F，23℃，6小時D40μg H6-TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB-H6 C228F，23℃，24小時E40μg H6-TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB-H6 C228F，23℃，50小時F40μg H6-TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB-H6 C228F，37℃，6小時G40μg H6-TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB-H6 C228F，37℃，24小時H40μg H6-TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB-H6 C228F，37℃，50小時IH6-TripUB IEPD↓EP，0小時孵育J38μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB-H6 C228F，23℃，6小時K38μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB-H6 C228F，23℃，24小時L38μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB-H6 C228F，23℃，50小時M38μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB-H6 C228F，37℃，6小時
N38μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB-H6 C228F，37℃，24小時O38μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB-H6 C228F，37℃，50小時完好的未切割的H6-TripUB IEPD↓EG在泳道B中顯示(1)，而在21℃和37℃的切割分別在泳道C-E(2)和泳道F-H(3)中顯示。在兩個溫度下幾乎沒有差異，僅僅6小時后切割就已經(jīng)完全。未切割的H6-TripUB IEPD↓EP在泳道I(4)中顯示，而在21℃和37℃的切割反應(yīng)分別在泳道J-L(5)和泳道M-O(6)中顯示。同圖19A中一樣，21℃切割50小時后大約40％已經(jīng)被切割。令人驚奇的是GrB-H6 C228F對IEPD↓EG底物的切割比對IEPD↓SP和IEPD↓EP的切割要好得多。
圖20顯示H6-TripUB IQAD↓SP或H6-TripUB IQAD↓SG與六個不同的固定化GrB-H6 C228F制備物孵育的樣品，實驗A-F，在實施例9中描述。
泳道A-M的描述AH6-TripUB IQAD↓SP+固定化的GrB-H6 C228F，實驗ABH6-TripUB IQAD↓SP+固定化的GrB-H6 C228F，實驗BCH6-TripUB IQAD↓SP+固定化的GrB-H6 C228F，實驗CDH6-TripUB IQAD↓SP+固定化的GrB-H6 C228F，實驗DEH6-TripUB IQAD↓SP+固定化的GrB-H6 C228F，實驗EFH6-TripUB IQAD↓SP+固定化的GrB-H6 C228F，實驗FGH6-TripUB IQAD↓SG+固定化的GrB-H6 C228F，實驗AHH6-TripUB IQAD↓SG+固定化的GrB-H6 C228F，實驗BIH6-TripUB IQAD↓SG+固定化的GrB-H6 C228F，實驗CJH6-TripUB IQAD↓SG+固定化的GrB-H6 C228F，實驗DKH6-TripUB IQAD↓SG+固定化的GrB-H6 C228F，實驗ELH6-TripUB IQAD↓SG+固定化的GrB-H6 C228F，實驗FM分子量標(biāo)記
H6-TripUB IQAD↓SP的孵育在泳道A-F中顯示(1)，而H6-TripUBIQAD↓SG的孵育在泳道G-L中顯示(2)，代表未切割的融合蛋白(H6-TripUB IQAD↓SP或H6-TripUB IQAD↓SG)的條帶由(3)標(biāo)記，正確切割的產(chǎn)物的條帶的位置由(4)標(biāo)記。
實施例實施例1人粒酶B表達(dá)載體的設(shè)計和構(gòu)建為了制備無活性的粒酶B酶原構(gòu)建體，將編碼活化的人粒酶B(E.C.3.4.21.79)的序列，即從Ile21(胰凝乳蛋白酶原編號Ile16)到Tyr246的序列克隆到含有C端六聚His標(biāo)簽(H6)的pT7克隆載體中(pT7 C-term H6)，得到表達(dá)載體pT7-IEGR-GrB-H6。含有凝血因子Xa(FXa)識別序列IEGR的序列MGSIEGR置于粒酶B中Ile21的N端，在Arg(R)和Ile21之間提供了一個FXa切割位點。產(chǎn)生的融合蛋白粒酶B酶原含有FXa識別序列和C端的六聚His標(biāo)簽，在下面稱為pro-IEGR-GrB-H6，在序列編號1中示出。
為了形成自我激活的粒酶B酶原蛋白，構(gòu)建表達(dá)載體pT7-IEPD-GrB-H6和pT7-IEAD-GrB-H6，其中的FXa識別序列IEGR被分別替換為粒酶B的識別序列IEPD或IEAD。產(chǎn)生的自我激活GrB蛋白在下面分別稱為pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6，并在序列編號2和序列編號3中示出。在下面的部分中概述了載體的設(shè)計和克隆。
在人粒酶B中特別是上面描述的粒酶B蛋白pro-IEGR-GrB-H6、pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6中于氨基酸228位(使用現(xiàn)成的標(biāo)準(zhǔn)胰凝乳蛋白酶原氨基酸編號系統(tǒng))存在的游離的半胱氨酸，在實施例2中描述的重折疊過程中可能產(chǎn)生問題，降低了活化的酶的穩(wěn)定性，對含有二硫鍵的底物產(chǎn)生更高的非酶反應(yīng)性。因此制備了一些基于pro-IEPD-GrB-H6的重組突變蛋白，其中Cys228氨基酸殘基(胰凝乳蛋白酶原氨基酸編號)通過使構(gòu)建體pT7-IEPD-GrB-H6定點突變，被替換為絲氨酸(S)，丙氨酸(A)，蘇氨酸(T)，纈氨酸(V)，或苯丙氨酸(F)，分別得到表達(dá)載體pT7-IEPD-GrB-H6 C228S，pT7-IEPD-GrB-H6C228A，pT7-IEPD-GrB-H6 C228T，pT7-IEPD-GrB-H6 C228V和pT7-IEPD-GrB-H6 C228F。產(chǎn)生的突變體蛋白在下面分別稱為Pro-IEPD-GrB-H6 C228S(序列編號4)，pro-IEPD-GrB-H6 C228A(序列編號5)，pro-IEPD-GrB-H6 C228T(序列編號6)，pro-IEPD-GrB-H6C228V(序列編號7)，和pro-IEPD-GrB-H6 C228F(序列編號8)，它們被一起稱為pro-IEPD-GrB-H6 C228X突變體。所有這些突變體都構(gòu)建為自我激活的粒酶B蛋白酶。
pT7 C-term H6克隆載體的構(gòu)建從寡聚核苷酸引物H6 C-term fw(序列編號9)和H6 C-termrev(序列編號10)得到的DNA片段使用標(biāo)準(zhǔn)的步驟連接到NcoI和EcoRI切割的載體pT7(Christensen JH等人，1991)中構(gòu)建為克隆載體pT7 C-term H6。
將人粒酶B克隆到克隆載體pT7 C-term H6中從人骨髓、人白細(xì)胞、人淋巴結(jié)和淋巴瘤(Raji)細(xì)胞(ClontechLaboratories，Inc目錄號7181-1，7182-1，7164-1，7167-1)中分離得到的cDNA混合物，用寡聚核苷酸引物GrBfw(序列編號11)和GrBrev EcoRI(序列編號12)擴(kuò)增后產(chǎn)生的DNA片段GrB EcoRI，經(jīng)BamHI和EcoRI酶切，然后用標(biāo)準(zhǔn)的步驟插入到BamHI和EcoRI切割的pT7C-term H6載體中，構(gòu)建得到表達(dá)載體pT7-IEGR-GrB-H6。得到的核苷酸序列GrB EcoRI在序列編號13中示出。
自我激活的人粒酶B表達(dá)載體pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6的構(gòu)建根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用QuikChangeTM定點突變試劑盒(STRATAGENE，目錄編號#200518)構(gòu)建編碼自我激活粒酶B酶原蛋白的表達(dá)載體pT7-IEPD-GrB-H6和pT7-IEAD-GrB-H6。用表達(dá)載體pT7-IEGR-GrB-H6作為模板。寡聚核苷酸引物GrB GR-PD fw和GrBGR-PD rev(序列編號14和15)用于構(gòu)建pT7-IEPD-GrB-H6；寡聚核苷酸引物GrB GR-AD fw和GrB GR-AD rev(序列編號16和17)用于構(gòu)建pT7-IEAD-GrB-H6。
自我激活的pro-IEPD-GrB-H6 C228X突變體表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用QuikChangeTM定點突變試劑盒(STRATAGENE，目錄編號#200518)構(gòu)建編碼自我激活pro-GrB-H6 C228X突變體的表達(dá)載體pT7-IEPD-GrB-H6 C228X。使用表達(dá)載體pT7-IEPD-GrB-H6作為模板。經(jīng)簡并的核苷酸引物GrB SAT fw和GrBSAT rev(序列編號18和19)用于構(gòu)建pT7-IEPD-GrB-H6 C228S，pT7-IEPD-GrB-H6 C228A，和pT7-IEPD-GrB-H6 C228S，在表1中所示的GrB SAT fw和GrB SAT rev引物序列中，D＝A，G，或T和H＝T，C，或A。簡并核苷酸引物GrB VF fw和GrB VF rev(序列編號20和21)用于構(gòu)建pT7-IEPD-GrB-H6 C228V和pT7-IEPD-GrB-H6 C228F，在表1中所示的GrB VF fw和GrB VF rev引物序列中，K＝G或T和M＝A或C。
表1寡聚核苷酸引物
實施例2自我激活的人粒酶B的表達(dá)和重折疊可被FXa激活的重組pro-IEGR-GrB-H6可被FXa激活的重組粒酶B酶原融合蛋白pro-IEGR-GrB-H6(序列編號1)制備如下根據(jù)Studier FW等人(1990)中的描述，實施例1中制備的表達(dá)載體pT7-IEGR-GrB-H6在E.coli BL21細(xì)胞中進(jìn)行中等規(guī)模(3×1升)的生長和表達(dá)。于37℃以對數(shù)生長的培養(yǎng)物在OD600＝0.8時用噬菌體λCE6感染，感染復(fù)數(shù)約為5。培養(yǎng)物繼續(xù)在37℃培養(yǎng)，感染后50分鐘加入0.1g/L利福平(溶解于甲醇中制成0.1g/mL)。于37℃繼續(xù)培養(yǎng)3小時，離心收獲細(xì)胞。通過滲透休克和超聲波裂解細(xì)胞，將總細(xì)胞蛋白抽提到苯酚(用Trisma堿調(diào)節(jié)pH至8)中。加入2.5倍體積的乙醇離心沉淀酚相中的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)沉淀溶于含6M鹽酸胍、50mM Tris-HCl pH 8，和100mM二硫蘇糖醇的緩沖液中。使用SephadexTMG-25 Fine(Amersham Biosciences)凝膠過濾將蛋白洗脫到8M尿素，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl pH 8，和5mM 2-巰基乙醇中。粗加工蛋白制備物上樣于Ni2+-活化的NTA-瓊脂糖層析柱(Ni2+-NTA-agarose，Quiagen)上。
粗蛋白提取物上樣于Ni2+-NTA-瓊脂糖層析柱后，用1柱體積的上樣緩沖液；而后1柱體積的8M尿素，0.5M NaCl，50mM磷酸鈉pH6.3和5mM 2-巰基乙醇；_柱體積的6M鹽酸胍，50mM Tris-HCl pH8，和5mM 2-巰基乙醇；最后用_柱體積的8M尿素，0.5M NaCl，50mMTris-HCl pH 8和3mM還原型谷胱甘肽分別洗柱，將融合蛋白pro-IEGR-GrB-H6從大量E.coli和λ噬菌體蛋白中純化出來。
使用Th_gersen等人描述的循環(huán)重折疊步驟(國際專利申請?zhí)朩O9418227)，使融合蛋白pro-IEGR-GrB-H6在Ni2+-NTA-瓊脂糖層析柱上重折疊。梯度操作概覽在下面的表2中描述，其中緩沖液A是0.5MNaCl，50mM Tris-HCl pH 8，2mM還原型谷胱甘肽，和0.2mM氧化型谷胱甘肽；緩沖液B是6M尿素，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl pH 8和3mM還原型谷胱甘肽。
表2
循環(huán)重折疊步驟完成后，使用含有0.5M NaCl，50mM Tris-HCl pH8和10mM EDTA pH 8的緩沖液將pro-IEGR-GrB-H6融合蛋白從Ni2+-NTA-瓊脂糖層析柱上洗脫下來。
從Ni2+-NTA-瓊脂糖層析柱上洗脫下來之后，用1體積的50mMTris-HCl pH 8.0稀釋pro-IEGR-GrB-H6蛋白，然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7。然后蛋白質(zhì)上樣于SP SepharoseTMFast Flow(AmershamBiosciences)離子交換層析柱上。使用10柱體積以上的250mM NaCl、50mM Tris-HCl pH 7.0到1M NaCl、50mM Tris-HCl pH 7.0的線性梯度洗脫蛋白。洗脫過程中取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析可見一條顯著的條帶，其為預(yù)計分子量27.4kDa的單體pro-IEGR-GrB-H6的遷移。
自我激活的pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6自我激活的重組粒酶B融合蛋白pro-IEPD-GrB-H6(序列編號2)和pro-IEAD-GrB-H6(序列編號3)通過實施例1中制備的載體pT7-IEPD-GrB-H6和pT7-IEAD-GrB-H6的表達(dá)產(chǎn)生，其中的表達(dá)、重折疊和純化基本上與上面描述的pro-IEGR-GrB-H6按同樣方法進(jìn)行。
兩個酶pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6的自我激活按照以下實施例3中描述的方法進(jìn)行。
自我激活的pro-IEPD-GrB-H6 C228X突變體所有的pro-IEPD-GrB-H6 C228X突變體(序列編號4、5、6、7和8)用表達(dá)載體pT7-IEPD-GrB-H6 C228X進(jìn)行表達(dá)，基本上與上面描述的pro-IEGR-GrB-H6按同樣方法進(jìn)行。pro-IEPD-GrB-H6 C228X突變體的重折疊也基本上與上面描述的pro-IEGR-GrB-H6按同樣方法進(jìn)行。在陽離子交換層析柱上的激活按照上面描述的用于pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6的方法進(jìn)行。
在酶原形式的重折疊蛋白上樣于陽離子交換層析柱SPSepharoseTMFast Flow(Amersham Biosciences)后僅4小時就完成了自我激活的pro-IEPD-GrB-H6 C228X突變體的純化和完全激活，用250mM NaCl，50mM TrisHCl，pH 7.0洗柱4小時，最后用750mM NaCl，50mM TrisHCl，pH 7.0洗脫激活的蛋白。洗脫后被激活的突變體稱為GrB-H6 C228S，GrB-H6 C228A，GrB-H6 C228T，GrB-H6 C228V，和GrB-H6C228F。
pro-IEPD-GrB-H6 C228X突變體的表達(dá)水平與pro-IEPD-GrB-H6的表達(dá)水平相似。但是重折疊效率與pro-IEPD-GrB-H6相比最高相差90％。一個突變體pro-IEPD-GrB-H6 C228S的重折疊效率非常低，因此沒有進(jìn)一步進(jìn)行分析。這與預(yù)期的相反，即預(yù)期替換半胱氨酸殘基最明顯的保守選擇是絲氨酸，因為絲氨酸在蛋白質(zhì)中天然存在的所有氨基酸中與半胱氨酸在大小、親水性和化學(xué)性質(zhì)上最為相似。
其他突變體中的三個pro-IEPD-GrB-H6 C228A，pro-IEPD-GrB-H6C228T，和pro-IEPD-GrB-H6 C228V的重折疊效率與pro-IEPD-GrB-H6的重折疊效率相似。
非常有趣的發(fā)現(xiàn)是pro-IEPD-GrB-H6 C228F突變體，比未突變的含有Cys228氨基酸殘基的pro-IEPD-GrB-H6在重折疊和純化后得到了更高的蛋白質(zhì)回收率，而其中的半胱氨酸替換為苯丙氨酸。因此當(dāng)70毫克(用Bradford法(Coomassie _PlusProtein Assay ReagentKit，Pierce Biotechnology)定量，使用牛血清白蛋白作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn))的pro-IEPD-GrB-H6 C228F或未突變的pro-IEPD-GrB-H6進(jìn)行上面描述的重折疊和純化步驟以后，最終產(chǎn)率(蛋白質(zhì)回收率)分別為1.5％和0.5％。這清楚地說明突變的pro-IEPD-GrB-H6 C228F提供了提高的最終蛋白質(zhì)回收率。未突變的Pro-IEPD-GrB-H6的低回收率的原因是當(dāng)?shù)鞍淄ㄟ^陽離子交換層析純化和激活時，蛋白明顯傾向于沉淀這樣就降低了活性酶的最終產(chǎn)率(回收率)。pro-IEPD-GrB-H6 C228F沒有觀察到明顯的沉淀。因此，用苯丙氨酸替換半胱氨酸228看來對粒酶B是有利的，特別是對于自我激活的粒酶B。這是非常令人驚奇的，因為苯丙氨酸在化學(xué)上與半胱氨酸相差很大，一般不選作半胱氨酸的替代物。
因此在以下的實施例中我們重點研究C228F突變體pro-IEPD-GrB-H6 C228F，與pro-IEGR-GrB-H6進(jìn)行比較。
實施例3使用純化的牛因子Xa激活pro-IEGR-GrB-H6融合蛋白，以及pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6的自我激活因子Xa激活pro-IEGR-GrB-H6根據(jù)實施例2中的描述制備單體未激活的pro-IEGR-GrB-H6，直接從SP Sepharose離子交換的洗脫物中取樣。向1毫克pro-IEGR-GrB-H6(大約10毫升)被如此激活，即加入50μg FXa(50μl的1mg/ml儲液)，室溫孵育幾天。pro-IEGR-GrB-H6被FXa切割/激活產(chǎn)生GrB-H6的程度，通過SDS PAGE進(jìn)行分析。
此外，pro-IEGR-GrB-H6和FXa孵育的過程中使用以下的顯色反應(yīng)體系對粒酶B活性監(jiān)測幾天500μl緩沖液(100mM NaCl，50mM Tris-HClpH 8.0)，4μl 100mM Ac-IEPD-pNA，和5μl孵育混合物。將100μlPro-IEGR-GrB-H6(大約10μg)與1μl FXa(1mg/ml)混和制備孵育混合物，孵育時維持在4℃。結(jié)果總結(jié)在表3和圖1中。
表3
為了除去加入的FXa，將孵育混合物上樣于SP SepharoseTM FastFlow(Amersham Biosciences)離子交換層析柱上，用250mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 7.0洗柱。FXa不與層析介質(zhì)結(jié)合，而產(chǎn)生的GrB-H6用750mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 7.0從層析柱上洗脫。
呈色活性測定為了測定加入的FXa是否被正確地從孵育混合物中除去，在FXa加入和除去的前后對GrB-H6和FXa的活性進(jìn)行測定，使用底物S2222(N-苯甲酰-L-異亮氨酰-L-谷氨酰-甘氨酰-L-精氨酰-p-硝基苯胺，Chromogenix，意大利，目錄編號S2222)和Ac-IEPD-pNA(N-乙酰-L-異亮氨酰-L-谷氨酰-L-脯氨酰-L-天冬氨酰-p-硝基苯胺，Calbiochem，La Jolla，美國，目錄編號368067)，吸收在405nm測量大約3分鐘，計算ΔOD405/min。使用以下的混合物測定FXa活性500μl緩沖液，25μl3mM S2222，和5μl FXa。使用以下的混合物測定GrB-H6活性500μl緩沖液，2μl 100mM Ac-IEPD-pNA，和5μl GrB-H6。
使用的緩沖液是100mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0或100mMHEPES pH 7.4。使用100mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0緩沖液的實例在下面的表3中示出，其中使用了除去FXa后SP Sepharose洗脫物中的頂層級分(the top fraction)。
表4
可以從上面的表4中看出，通過SP SepharoseTMFast Flow離子交換層析，加入的FXa完全從激活混合物中除去。使用包含100mMHEPES pH 7.4的緩沖液得到相同的結(jié)果。
pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6的自我激活根據(jù)實施例2中的描述，使用實施例1中描述的表達(dá)載體pT7-IEPD-GrB-H6和pT7-IEAD-GrB-H6制備重組的自我激活人粒酶B衍生物IEPD-GrB-H6和IEAD-GrB-H6。從SP Sepharose層析柱上洗脫IEAD-GrB-H6和IEPD-GrB-H6蛋白，在4℃保存2天，然后使用呈色檢測對各自洗脫物的頂層級分進(jìn)行活性測定。對于這一目的使用以下的混合物500μl緩沖液(100mM HEPES pH 7.5)，2μl 100mMAc-IEPD-pNA，和5μl蛋白質(zhì)溶液。吸收的改變在405nm測量3分鐘。在4℃繼續(xù)孵育1天和2天后再次測定活性。結(jié)果總結(jié)于表5中。
表5
可以從表5中看到，自我激活衍生物pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6不需要加入任何事先活化的粒酶B即可被激活，且自我激活過程在4℃下至少三或四天后才能完成。
實施例4用小的呈色肽底物測定粒酶B的活性激活和純化的GrB-H6的活性在不同的緩沖液中使用底物Ac-IEPD-pNA進(jìn)行測量500μl緩沖液，2μl 100mM Ac-IEPD-pNA，和5μl GrB-H6。除非特別說明，從第一個0.75分鐘開始計算ΔOD405/min。
表6
TN＝100mM NaCl，50mM Tris-HCl可以從上面的表6中看到，在所有研究的緩沖液中，100mM HEPESpH 7.4-7.5對于GrB-H6的活性是最佳的。
在隨后用GrB-H6 C228F進(jìn)行的pH篩選實驗中，對底物Ac-IBPD-pNA的活性最佳的pH是100mM HEPES，pH范圍7.5-7.8。
為了測定穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)KM和kcat，使用與上面描述相同的呈色檢測，檢測比色皿中的總體積是500微升。檢測緩沖液是100mM HBPESpH 7.75，在每一次測定中使用的GrB-H6或GrB-H6 C228F濃度都是20nM。使用以下的底物濃度作Lineweaver-Burk曲線5，40，150，300，和600μM。得到的結(jié)果在下面的表7中示出表7
在上面的表7中示出的GrB-H6和GrB-H6 C228F的KM、kcat和kcat/KM測定數(shù)值與重組大鼠GrB的數(shù)值(Harris J.L.等人，1998)非常相近。
實施例5GrB-H6和GrB-H6 C228F特異性以及GrB-H6 C228F穩(wěn)定性的測定GrB-H6和GrB-H6 C228F的特異性除了實施例4中應(yīng)用的Ac-IEPD-pNA底物以外，使用呈色底物Ac-LEED-pNA、Ac-VEID-pNA、Ac-YVAD-pNA和Ac-DEVD-pNA檢測GrB-H6和GrB-H6 C228F蛋白酶的特異性。同樣在500μl 100mM HEPES pH 7.75中進(jìn)行活性檢測，底物濃度為400μM。每一次測定時在檢測比色皿中加入1微克蛋白酶。所有的檢測重復(fù)三次，設(shè)定在Ac-IEPD-pNA上的活性測量為100％對獲得的活性數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果在圖2中示出，可以看到GrB-H6蛋白酶的特異性至少與GrB-H6 C228F蛋白酶的特異性相同。
GrB-H6 C228F的穩(wěn)定性為了測定GrB-H6 C228F蛋白酶的穩(wěn)定性，GrB-H6 C228F樣品在100mM HEPES pH 7.4中于4℃、23℃和37℃下分別孵育15天。選擇100mM HEPES緩沖液的目的是檢查任何自體切割和降解，但是沒有從SDS PAGE觀察到明顯的“自體裂解”(參見圖3A)。在孵育期間還測定了對顯色底物Ac-IEPD-pNA的水解活性，參見圖3B。
GrB-H6 C228F蛋白酶在4℃和23℃非常穩(wěn)定。于23℃孵育15天，活性只輕度下降了大約10％，在凝膠中幾乎看不見降解的片段。即使于37℃在15天后仍剩余大約20％的活性，在凝膠中只有很少的降解片段。
還發(fā)現(xiàn)GrB-H6 C228F蛋白酶在10分鐘的短時間內(nèi)直至50℃都是穩(wěn)定的(這里沒有顯示)。在該實驗中蛋白酶的樣品在給定的溫度下孵育10分鐘然后放回室溫，于23℃孵育10分鐘。在23℃測定對Ac-IEPD-pNA的活性。蛋白酶的孵育溫度在50℃以下，在返回室溫(23℃)孵育后活性幾乎100％的恢復(fù)，但是在50℃以上的溫度下孵育，蛋白酶就不能再恢復(fù)為活性形式了，只能檢測到很少的活性。
實施例6含有可被GrB-H6和GrB-H6 C228F切割的識別序列的融合蛋白表達(dá)載體的設(shè)計和構(gòu)建為了制備適宜的融合蛋白作為GrB-H6和GrB-H6 C228F的底物，將可以被FXa切割的融合蛋白H6-FX-TripBUB，H6-IEGR-RAP，H6Ubi-IEGR-ApoA1，和H6-FX-TN123(分別由pT7H6-FX-TripBUB，pT7H6-FX-RAP，pT7H6Ubi-FX-ApoA1，和pT7H6-FX-TN123編碼)中的FXa識別序列IEGR或IQGR改為IEPD，得到構(gòu)建體H6-TripUB IEPD↓SP(序列編號22)，H6-IEPD-RAP(序列編號23)，H6Ubi-IEPD-ApoA1(序列編號24)，和H6-IEPD-TN123(序列編號25)。
在構(gòu)建體H6-TripUB IEPD↓SP中，粒酶B的識別序列是IEPD↓SP，其中↓表示了切割位點。這個識別序列位于構(gòu)建體中H6和TripUB部分之間，其中位于可被切割的肽鍵C端的兩個氨基酸殘基S和P是TripUB的N端部分。
在以下H6-TripUB融合蛋白(稱為H6-TripUB變異體)中的識別序列作為它們名稱的最后部分，如XXXX↓YY，其中XXXX是位于六聚His和TripUB之間的粒酶B識別序列的一部分，而YY是TripUB的一部分。
H6-TripUB IEPD↓SP構(gòu)建體中的IEPD↓SP切割位點改變?yōu)榱硗獾?個切割位點，得到以下的變異體H6-TripUB IQAD↓SP(序列編號26)，H6-TripUB IQAD↓SG(序列編號27)，H6-TripUB VGPD↓SP(序列編號28)，H6-TripUB VGPD↓FG(序列編號29)，H6-TripUB IEPD↓TQ(序列編號30)，H6-TripUB IEPD↓IV(序列編號31)，H6-TripUB IEPD↓EP(序列編號32)，和H6-TripUB IEPD↓EG(序列編號33)，其中↓表示切割位點。在這8個構(gòu)建體的6個中，融合蛋白的P1′和P2′位點(都是TripUB的一部分)被改變，即H6-TripUB IQAD↓SG，H6-TripUB VGPD↓FG，H6-TripUB IEPD↓TQ，H6-TripUB IEPD↓IV，H6-TripUB IEPD↓EP，和H6-TripUB IEPD↓EG。
融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用QuikChangeTM定點突變試劑盒(STRATAGENE，目錄編號200518)構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6-TripUB IEPD↓SP，載體pT7H6-FX-TripBUB(國際專利申請WO 9856906)作為模板，寡聚核苷酸引物為TripUB GrB fw(序列編號34)和TripUB GrBrev(序列編號35)。
使用載體pT7H6-FX-RAP(Nykj_r等人，1992)作為模板以及寡聚核苷酸引物RAP GrB fw(序列編號36)和RAP GrB rev(序列編號37)根據(jù)上面的描述通過定點突變構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6-IEPD-RAP。
使用載體pT7H6Ubi-FX-ApoA1(國際專利申請WO0238609)作為模板以及寡聚核苷酸引物Mut-GrB fw(序列編號38)和Mut-GrBrev(序列編號39)根據(jù)上面的描述通過定點突變構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6Ubi-IEPD-ApoA1。
使用載體pT7H6-FX-TN123(Holtet等人，1997)作為模板以及寡聚核苷酸引物TN GrB fw(序列編號40)和TN GrB rev(序列編號41)根據(jù)上面的描述通過定點突變構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6-IEPD-TN123。
使用載體pT7H6-FX-TripBUB(WO 9856906)作為模板以及寡聚核苷酸引物PC7TripUB GR-AD fw(序列編號42)和PC7TripUB GR-AD rev(序列編號43)根據(jù)上面的描述通過定點突變構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6-TripUB IQAD↓SP。
使用載體pT7H6-TripUB IQAD↓SP作為模板以及寡聚核苷酸引物PC7TripUB P-G fw(序列編號44)和PC7TripUB P-G rev(序列編號45)根據(jù)上面的描述通過定點突變構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6-TripUB IQAD↓SG。
使用載體pT7H6-TripUB IEPD↓SP作為模板和寡聚核苷酸引物DNATrip IE-VG fw(序列編號46)和DNATrip IE-VG rev(序列編號47)根據(jù)上面的描述通過定點突變構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6-TripUB VGPD↓SP。
使用載體pT7H6-TripUB VGPD↓SP作為模板以及寡聚核苷酸引物DNATrip SP-FG fw(序列編號48)和DNATrip SP-FG rev(序列編號49)根據(jù)上面的描述通過定點突變構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6-TripUB VGPD↓FG。
使用載體pT7H6-TripUB IEPD↓SP作為模板以及寡聚核苷酸引物Trip IEPD-TQ(序列編號50)和UB3(序列編號52)通過PCR反應(yīng)構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6-TripUB IEPD↓TQ。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用BamHI和HindIII酶切然后連接到BamHI-HindII酶切的pT7H6(GS)3載體(Christensen J.H等人，1991)中。
使用載體pT7H6-TripUB IEPD↓SP作為模板以及寡聚核苷酸引物Trip IEPD-IV(序列編號51)和UB3(序列編號52)通過PCR反應(yīng)構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6-TripUB IEPD↓IV。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用BamHI和HindIII酶切然后連接到BamHI-HindII酶切的pT7H6(GS)3載體(Christensen J.H等人，1991)中。
使用載體pT7H6-TripUB IEPD↓SP作為模板和寡聚核苷酸引物TripUB EP fw(序列編號53)和TripUB EP rev(序列編號54)根據(jù)上面的描述通過定點突變構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6-TripUB IEPD↓EP。
使用載體pT7H6-TripUB IEPD↓EP作為模板以及寡聚核苷酸引物TripUB EG fw(序列編號55)和TripUB EG rev(序列編號56)根據(jù)上面的描述通過定點突變構(gòu)建表達(dá)載體pT7H6-TripUB IEPD↓EG。
表8寡聚核苷酸引物
實施例7含有可被GrB-H6和GrB-H6 C228F切割的識別序列的融合蛋白的表達(dá)、純化和重折疊融合蛋白的表達(dá)為了制備嵌合融合蛋白H6-TripUB IEPD↓SP，H6-IEPD-RAP，H6-IEGR-RAP，H6Ubi-IEPD-ApoA1，H6Ubi-IEGR-ApoA1，H6-IEPD-TN123和H6-TripUB變異體，對表達(dá)載體pT7H6-TripUB IEPD↓SP，pT7H6-IEPD-RAP，pT7H6-FX-RAP，pT7H6Ubi-IEPD-ApoA1，pT7H6Ubi-IEGR-ApoA1，pT7H6-IEPD-TN123，pT7H6-TripUB IQAD↓SP，pT7H6-TripUB IQAD↓SG，pT7H6-TripUB VGPD↓SP，pT7H6-TripUB VGPD↓FG，pT7H6-TripUB IEPD↓TQ，pT7H6-TripUB IEPD↓IV，pT7H6-TripUB IEPD↓EP，和pT7H6-TripUB IEPD↓EG(后面8個是H6-TripUB變異體)在大腸桿菌BL21中進(jìn)行中等規(guī)模的培養(yǎng)(3升；2xTY培養(yǎng)基，5mM MgSO4和0.1mg/ml氨芐青霉素)，根據(jù)Studier FW等人(1990)的描述。在37℃生長呈對數(shù)生長的培養(yǎng)物于OD600＝0.8時用噬菌體λCE6感染，感染復(fù)數(shù)約為5。于37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時，離心收獲細(xì)胞。將細(xì)胞重懸于100毫升750mM NaCl，100mM Tris-HClpH 8，1mM EDTA pH 8中。加入苯酚(150毫升，用Trima堿調(diào)節(jié)pH至8)，超聲波處理混合物以提取總蛋白。離心(25分鐘，10.000g)澄清后，向苯酚相中加入2.5倍體積的96％乙醇離心沉淀粗蛋白質(zhì)級分。蛋白質(zhì)沉淀溶于75毫升6M鹽酸胍、50mM Tris-HCl pH 8，和100mM二硫蘇糖醇(DTT)的緩沖液中。
H6-TripUB IEPD↓SP，H6-IEPD-RAP，H6-IEGR-RAP，H6Ubi-IEPD-ApoA1，H6Ubi-IEPD-ApoA1以及H6-TripUB變異體的純化使用SephadexTMG-25Fine(Amersham Biosciences)凝膠過濾將蛋白洗脫到8M尿素，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl pH 8，和10mM 2-巰基乙醇的緩沖液中后，將H6-IEPD-TripUB和H6-IEPD-RAP融合蛋白的粗蛋白制備物分批上樣吸附于Ni2+活化的NTA-瓊脂糖層析柱(Ni2+-NTA-agarose，Quiagen)上(柱體積通常為50-75毫升)進(jìn)行純化(Hochuli E等人，1988)。層析柱按照以下洗滌1.2×柱體積8M尿素，500mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8，和10mM 2-巰基乙醇2.1×柱體積8M尿素，500mM NaCl，50mM磷酸鈉pH 6.3，和10mM 2-巰基乙醇3.1×柱體積6M鹽酸胍，50mM Tris-HCl pH 8，和10mM 2-巰基乙醇4.2×柱體積500mM NaCl，和50mM Tris-HCl pH 8用500mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8，和10mM EDTA洗脫純化的融合蛋白。
H6-IEPD-TN123融合蛋白的純化和重折疊使用SephadexTMG-25 Fine(Amersham Biosciences)凝膠過濾將蛋白洗脫到8M尿素，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl pH 8，和10mM 2-巰基乙醇的緩沖液中后，將H6-IEPD-TN123融合蛋白的粗蛋白制備物分批上樣吸附于Ni2+活化的NTA-瓊脂糖層析柱(Ni2+-NTA-agarose，Quiagen)上(柱體積通常為50-75毫升)進(jìn)行純化和體外重折疊。層析柱按照以下洗滌1.2×柱體積8M尿素，500mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8，和10mM 2-巰基乙醇2.1×柱體積8M尿素，500mM NaCl，50mM磷酸鈉pH 6.3，和10mM 2-巰基乙醇3.1×柱體積6M鹽酸胍，50mM Tris-HCl pH 8，和10mM 2-巰基乙醇然后使用Th_gersen等人用于纖溶酶原kringle 4的循環(huán)重折疊步驟(國際專利申請WO 9418227)對每一個融合蛋白進(jìn)行重折疊。重折疊步驟完成之后用500mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8，10mM EDTA將每一個重折疊的蛋白從Ni2+-NTA-瓊脂糖層析柱上洗脫。
每一個重折疊蛋白的各個級分通過凝膠過濾洗脫到50mM NaCl，25mM乙酸鈉pH 5.0和1mM CaCl2中，然后進(jìn)一步使用SP SepharoseTMFast Flow(Amersham Biosciences，1.6厘米直徑(i.d.)20厘米長層析柱)離子交換層析進(jìn)行純化，使用鹽梯度從50mM NaCl，25mM乙酸鈉pH 5.0，1mM CaCl2到1M NaCl，25mM乙酸鈉pH 5.0，1mM CaCl2進(jìn)行洗脫。
每一個正確折疊蛋白產(chǎn)物的最后純化是通過凝膠過濾將其洗脫到25mM NaCl，10mM Tris-HCl pH 8，和1mM CaCl2中，然后進(jìn)一步使用Q SepharoseTMFast Flow(Amersham Biosciences，1.6厘米直徑(i.d.)20厘米長層析柱)離子交換層析進(jìn)行純化，使用鹽梯度從25mMNaCl，10mM Tris-HCl pH 8，和1mM CaCl2到500mM NaCl，10mM Tris-HClpH 8，和1mM CaCl2進(jìn)行洗脫。
實施例8使用GrB-H6，GrB-H6 C228F和FXa對制備的融合蛋白進(jìn)行切割用GrB-H6切割H6-TripUB IEPD↓SPNi2+-NTA-瓊脂糖層析柱上洗脫的融合蛋白H6-TripUB IEPD↓SP(根據(jù)實施例7中的描述制備)通過凝膠過濾洗脫到100mM HEPES pH7.5中，取200微升頂層級分樣品分別與0、1或10μl激活的GrB-H6(大約0，0.2和2μgGrB-H6)共同在室溫下孵育。
12，19，和24小時孵育后取樣，進(jìn)行SDS PAGE，凝膠示于圖4和5中。
只有正確切割的產(chǎn)物在圖4的C-D泳道和圖5的C-G泳道中出現(xiàn)，孵育時間越長，泳道中出現(xiàn)的切割產(chǎn)物越多，對于加入1和10μlGrB-H6的結(jié)果是相同的。觀察到的單一帶型在圖6中予以解釋。從這里就很清楚GrB-H6對H6-TripUB IEPD↓SP上的單一位點進(jìn)行特異性切割。在IEPD序列后的正確位點進(jìn)行切割在圖4的E泳道中得到確證，此處含有FXa識別位點IQGR而不是GrB識別位點IEPD的構(gòu)建體H6-FX-TripUB被FXa切割產(chǎn)生與被GrB-H6切割的H6-TripUB IEPD↓SP同樣大小的產(chǎn)物。
溫度以及添加Ni2+和NTA對H6-TripUB IEPD↓SP被GrB-H6切割的影響用H6-TripUB IEPD↓SP融合蛋白建立以下9個孵育(表9)，每一個孵育使用200μl H6-TripUB IEPD↓SP和5μl GrB-H6(大約1μgGrB-H6)。
表9
2，7和22小時孵育后取樣進(jìn)行SDS PAGE，參見圖7、8和9。
預(yù)期Ni2+離子會結(jié)合融合蛋白的N端六聚His尾巴(H6)，使GrB-H6更容易接近被其識別的切割位點。此外，Ni2+離子還結(jié)合GrB-H6構(gòu)建體的C端六聚His尾巴。加入NTA罩住了溶液中的Ni2+離子，與在Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠珠上出現(xiàn)的情況相同，即模擬了Ni2+-NTA瓊脂糖層析柱上的環(huán)境。
圖7顯示了于23℃的孵育，圖8顯示了于37℃的孵育，圖9顯示了于42℃的孵育。當(dāng)沒有添加Ni2+或NTA時，H6-TripUB IEPD↓SP融合蛋白的切割與在圖4和5中觀察到的相似，盡管22小時后似乎于37℃的孵育是所檢測的三個溫度下最佳的孵育溫度。
加入4.2mM Ni2+后一些蛋白在較高的溫度37℃和42℃下沉淀，但是在23℃下沒有看到沉淀。因此在這兩個溫度下2小時孵育后在凝膠中看不到融合蛋白被進(jìn)一步切割，似乎一些H6-TripUB IEPD↓SP和GrB-H6都沉淀了。與沒有添加Ni2+相比，于23℃下更多的融合蛋白在22小時后被切割。
向孵育混合物中加入5mM NTA消除了觀察到的沉淀問題。于23℃下孵育22小時后，與沒有添加Ni2+或NTA相比，更多的融合蛋白被切割，所以添加Ni2+和NTA似乎加速了切割反應(yīng)。通過進(jìn)一步提高溫度至37℃和42℃，觀察到切割速率有更大的提高。于37℃下孵育22小時后，幾乎所有的融合蛋白都被切割為正確的產(chǎn)物。于42℃孵育22小時后，與37℃相比只有少量的融合蛋白沒有被切割。
將在圖4和5中顯示的實驗中最初估計的切割速率與這里觀察到的切割速率相比，顯然添加Ni2+和NTA以及在37℃孵育極大地加速了GrB-H6對H6-TripUB IEPD↓SP的特異切割。
GrB-H6對H6-IEPD-RAP的切割Ni2+-NTA-瓊脂糖層析柱上洗脫的融合蛋白H6-IEPD-RAP(根據(jù)實施例7中的描述制備)通過凝膠過濾洗脫到100mM HEPES pH 7.4中，取200微升頂層級分樣品分別與0，1或10μl激活的GrB-H6(大約0，0.2和2μg GrB-H6)共同在室溫下孵育。5，23和26小時孵育后取樣進(jìn)行SDS PAGE，參見圖10。
根據(jù)上面的描述，與1或10μl GrB-H6共同孵育僅5小時后，所有的H6-IEPD-RAP都被切割產(chǎn)生正確的最終產(chǎn)物。還很清楚在RAP中至少有一個內(nèi)部切割位點，但是該內(nèi)部位點的切割卻比IEPD序列的切割慢得多。通過比較純化的H6-FX-RAP樣品被FXa部分切割的產(chǎn)物(泳道H)或者完全切割給出最終的RAP產(chǎn)物(泳道I)的大小，可以看到GrB-H6在IEPD序列處將H6正確地切掉了。在這些泳道中，任何由FXa進(jìn)行內(nèi)部切割產(chǎn)生的降解產(chǎn)物都被純化除去。
GrB-H6切割H6-IEPD-RAP和FXa切割H6-IEGR-RAP的比較將GrB-H6切割H6-IEPD-RAP與FXa切割H6-IEGR-RAP進(jìn)行比較。H6-IEPD-RAP和H6-IEGR-RAP都溶于100mM HEPES pH 7.4中，在室溫23℃下進(jìn)行以下的孵育，蛋白酶和融合蛋白的比例是1∶1000。
1.400μl(約500μg)H6-IEGR-RAP+0.5μl FXa(1mg/ml)(約0.5μg)2.400μl(約400μg)H6-GrB-RAP+2μl GrB-H6(約0.4μg)0，_，1，3，5，7和27小時孵育后取樣進(jìn)行SDS PAGE，參見圖11。
顯然兩種情況下，融合蛋白都被它們相應(yīng)的蛋白酶迅速地切割。兩種孵育中，僅僅半小時后幾乎所有的融合蛋白都已經(jīng)被切割產(chǎn)生正確的產(chǎn)物。
但是27小時后，在H6-IEGR-RAP+FXa的孵育中，所有的融合蛋白都已經(jīng)被降解產(chǎn)生不同的小片段，而沒有剩余的正確切割的產(chǎn)物。
在H6-IEPD-RAP+GrB-H6的孵育中也看到了降解的片段，但是沒有在H6-IEGR-RAP+FXa的孵育中那么多。在RAP中的19個可能位點(RAP產(chǎn)物中有19個Asp殘基)中似乎只有一個GrB-敏感的位點，而有幾個FXa敏感位點(26個可能的位點，26個Arg殘基)。這減緩了H6-IEPD-RAP被GrB-H6的降解，所以在27小時孵育后仍然存在相當(dāng)多的正確切割的產(chǎn)物(大約25％)。
總之，GrB-H6對RAP融合蛋白的正確切割與FXa對RAP融合蛋白的切割一樣迅速，但是GrB-H6對RAP融合蛋白的降解要比FXa對RAP融合蛋白的降解慢得多。因此在這個實施例中GrB-H6優(yōu)于FXa，而且也顯示GrB-H6是一個非常特異的蛋白酶。
GrB-H6 C228F切割H6Ubi-IEPD-ApoA1和FXa切割H6Ubi-IEGR-ADoA1的比較對于H6Ubi-IEPD-ApoA1+GrB-H6 C228F以及H6Ubi-IEGR-ApoA1+FXa的切割反應(yīng)，蛋白酶和底物的比例是1∶1000，切割在100mM HEPESpH 7.75中，室溫23℃下進(jìn)行。
1.250μl(約400μg)H6Ubi-IEPD-ApoA1+0.4μg GrB-H6 C228F2.250μl(約350μg)H6Ubi-IEGR-ApoA1+0.35μg FXa0，1，3，6，24和48小時在23℃孵育后取樣進(jìn)行SDS PAGE，參見圖12。
GrB的底物H6Ubi-IEPD-ApoA1在23℃孵育僅6小時后約100％被切割，而6小時后只有一小部分的FXa的底物H6Ubi-IEGR-ApoA1被切割。還看到FXa需要48小時以上的時間以完全切割FXa底物。
在以上的兩個實施例中GrB-H6和GrB-H6 C228F蛋白酶，如所提及的，都優(yōu)于FXa，因為它們比純化的牛FXa切割時要迅速得多(對H6Ubi-X-ApoA1而言)，或者要特異得多(對于H6-X-RAP而言)(其中的X指的是識別位點IEPD或IEGR)。這兩個實施例證明GrB-H6和GrB-H6 C228F可以既切除短的N端標(biāo)簽例如六聚His尾巴(H6-IEPD-RAP中的H6)，又可以在由一個短的銜接物序列(銜接物序列包含緊鄰目標(biāo)多肽的GrB切割位點)非常緊密連接的兩個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間切割(在這里如H6Ubi-IEPD-ApoA1中的ApoA1，銜接物序列是GGSIEPD，其中IEPD是GrB的識別位點)。在以上兩種情況中通過N端測序證實GrB-H6和GrB-H6 C228F產(chǎn)生正確切割的產(chǎn)物。
GrB-H6對H6-IEPD-TN123的切割Q Sepharose上洗脫的融合蛋白H6-IEPD-TN123(根據(jù)實施例7中的描述制備)通過最終純化經(jīng)凝膠過濾洗脫到100mM HEPES pH 7.5中，取200微升頂層級分樣品分別與0，1或10μl激活的GrB-H6(大約0，0.2和2μg GrB-H6)在沒有鈣存在或者5mM CaCl2存在的條件下共同在室溫下孵育。沒有CaCl2存在時孵育的樣品在12、19、24小時以及5天孵育后取樣進(jìn)行SDS PAGE，參見圖4、5和13。有和沒有CaCl2存在時孵育的樣品在大約20和48小時的孵育后取樣進(jìn)行SDS PAGE，參見圖14。
無Ca2+當(dāng)沒有Ca2+存在時，H6-IEPD-TN123被GrB-H6切割顯示了獨特的帶型，如圖4、5和13所示。H6-IEPD-TN123在IEPD序列處被正確切割，而且與在內(nèi)部位點AQPD序列處的切割同樣迅速。這一帶型在圖15中予以解釋。H6-IEPD-TN123在IEPD↓位點被正確切割可以從圖4的泳道J中觀察到，圖4中小鼠H6-FX-TN123被FXa切割產(chǎn)生的產(chǎn)物的大小與GrB-H6在沒有內(nèi)部切割時切割H6-IEPD-TN123產(chǎn)生的產(chǎn)物大小相同，即帶型中四條帶中最靠下的條帶。
當(dāng)對樣品進(jìn)行還原處理如圖13中的泳道B-D和L-N所示，出現(xiàn)了不同的帶型。該帶型也在圖15中予以解釋，并且支持了特異內(nèi)部切割位點AQPD的觀點。
有Ca2+存在圖11顯示了H6-IEPD-TN123與GrB-H6的孵育，其中在某些孵育中加入了5mM CaCl2。這里在鈣存在時只出現(xiàn)兩個條帶(泳道E和G)，而沒有鈣存在時有四個條帶，如圖4、5、13和15中描述的。這表明在孵育中加入Ca2+，使GrB-H6不能接觸到Tetranectin(TN123)中的內(nèi)部切割位點AQPD。這是由于在Tetranectin中AQPD序列位于一個環(huán)內(nèi)，其中Q和D殘基參與與鈣離子的結(jié)合。這樣就只出現(xiàn)融合蛋白中的特異位點IEPD處被正確切割而TN123中的內(nèi)部切割位點由于Ca2+的加入而被“關(guān)閉”。
H6-TripUB變異體的切割每一個Ni2+-NTA-瓊脂糖層析柱上洗脫的融合蛋白經(jīng)凝膠過濾洗脫到100mM HEPES pH 7.4中，使用五個不同變異體濃度大致相同的級分。五個變異體是H6-TripUB IEPD↓SP，H6-TripUB IQAD↓SP，H6-TripUB IQAD↓SG，H6-TripUB VGPD↓SP和H6-TripUB VGPD↓FG。每一種融合蛋白各取200微升，分別與5μl激活的GrB-H6(大約1μgGrB-H6)共同在室溫23℃下孵育。蛋白酶和融合蛋白的比例是1∶500。在2，6，24和48小時孵育后取樣進(jìn)行SDS PAGE，凝膠在圖16和17中示出。
在圖16中顯示了H6-TripUB IEPD↓SP，H6-TripUB IQAD↓SP和H6-TripUB IQAD↓SG的樣品。在48小時孵育后，大約2/3原來未切割的H6-TripUB IEPD↓SP已經(jīng)被正確切割。與此相比，序列IQAD↓SP的切割要比H6-TripUB IEPD↓SP中序列IEPD↓SP的切割慢得多。2小時孵育后不能觀察到產(chǎn)物，48小時孵育后只有少量被切割。從H6-TripUB IQAD↓SG樣品來看，顯然切割與H6-TripUB IEPD↓SP和H6-TripUB IQAD↓SP二者相比要快得多。2小時孵育后融合蛋白的大部分已經(jīng)被切割產(chǎn)生正確的產(chǎn)物。識別序列中P2′位點上的Pro(P)到Gly(G)的單突變已經(jīng)足以使切割速率發(fā)生如此巨大的改變。
在圖17中顯示了H6-TripUB VGPD↓SP和H6-TripUB VGPD↓FG孵育后的樣品。對VGPD↓SP序列的切割幾乎與圖16中H6-TripUB IEPD↓SP的切割一樣迅速。2小時后形成少量的產(chǎn)物而在48小時后大約一半量的融合蛋白已經(jīng)被切割。在H6-TripUB VGPD↓SP中當(dāng)P1′和P2′位點從SP改變?yōu)镕G時，反應(yīng)速率出現(xiàn)巨大的改變。僅僅2小時孵育后所有的融合蛋白都已經(jīng)被正確切割。
圖18顯示了H6-TripUB IEPD↓TQ和H6-TripUB IEPD↓IV切割的樣品與H6-TripUB IEPD↓SP切割的比較。兩個構(gòu)建體H6-TripUBIEPD↓TQ和H6-TripUB IEPD↓IV是H6-TripUB IEPD↓SP的Trip部分的刪除突變體，其中在H6-TripUB IEPD↓TQ中刪除了前7個殘基而在H6-TripUB IEPD↓IV中刪除了前13個殘基。
這里蛋白酶和融合蛋白的比例也是1∶500，反應(yīng)在23℃下進(jìn)行。4，24，和96小時孵育后取樣進(jìn)行SDS PAGE。
從圖18所示的凝膠可以清楚看到對H6-TripUB IEPD↓TQ和H6-TripUB IEPD↓IV二者的切割都比H6-TripUB IEPD↓SP的切割要快得多。如以下得圖19所示，這可能是由于H6-TripUB IEPD↓SP中P2′位置上的Pro所致。
圖19，A顯示了H6-TripUB IEPD↓SP和H6-TripUB IEPD↓EP的切割，而B顯示了H6-TripUB IEPD↓EP和H6-TripUB IEPD↓EG的切割。這里蛋白酶與融合蛋白的比例還是1∶500，切割反應(yīng)混合物在23℃和37℃下孵育。對于A圖中的凝膠，在0，4，24和48小時后取樣進(jìn)行SDS PAGE；對于B圖中的凝膠，在0，6，24和50小時后取樣進(jìn)行SDS PAGE。
從這些凝膠中可以清楚看出P2′位置上的Pro對于使用GrB-H6C228F進(jìn)行切割的速率是非常不利的。一個意外是GrB-H6 C228F能夠切割含有IEPD↓EP位點的底物。它切割這個位點與切割I(lǐng)EPD↓SP具有相同的低效率，但是P1′位置上的一個酸性殘基如Glu(E)是很不好的，因為這使大多數(shù)絲氨酸蛋白酶(如純化的牛FXa)都不能切割。
如果我們現(xiàn)在考慮IEPD↓SP，IQAD↓SP，IQAD↓SG，IEPD↓EP，和IEPD↓EG的P1′P2′位置，P2′位置從色氨酸改變?yōu)楦拾彼犸@著增強(qiáng)了切割。Harris JL等人，1998使用噬菌體顆粒上展示的肽底物研究野生型大鼠GrB時也觀察到P2′位置對G的偏好。同樣GrB-H6 C228F在IEPD↓EG位點處表現(xiàn)出不可思議的有效切割，盡管P1′位置是E，如上所述，E在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的阻礙大多數(shù)絲氨酸蛋白酶切割的殘基。在蛋白酶與底物的比例為1∶500時，只需要不到5小時，GrB-H6C228F就能完成對H6-TripUbi IEPD↓EG的切割。在這方面GrB-H6C228F再次優(yōu)于FXa。
除了這些觀察之外，還有重要的一點是注意到即使與GrB-H6或GrB-H6 C228F共同孵育48小時以上，在任何H6-TripUB變異體中也沒有發(fā)生內(nèi)部切割，表明GrB-H6和GrB-H6 C228F非常特異地在工程化的識別位點處切割，盡管TripUB序列含有7個另外的Asp(D)殘基。
實施例9粒酶B的固定化為了能夠容易地從切割混合物中除去粒酶B酶，在以下描述的6個實驗中使用GrB-H6 C228F變異體固定在凝膠基質(zhì)上。
使用二乙烯砜活化的基質(zhì)Mini-Leak(Kem-En-Tec)在0.3MNaHCO3/NaOH，pH 8.6中進(jìn)行固定化。使用兩個水平的活化每升沉降的小珠分別使用2-5毫摩爾和10-50毫摩爾的乙烯基團(tuán)，對于每個活化水平，使用不同蛋白質(zhì)濃度以及存在或者不存在PEG 20000的條件下進(jìn)行三次實驗。六次實驗的結(jié)果總結(jié)在表10中。為了進(jìn)行固定化，GrB-H6 C228F在0.3M NaHCO3/NaOH pH 8.6中于蛋白質(zhì)濃度根據(jù)Bradford檢測使用牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品測定為4mg/ml。GrB-H6C228F溶液的酶活性根據(jù)實施例4中的描述進(jìn)行測定，使用0.3MNaHCO3/NaOH、pH 8.6緩沖液和30％PEG 20000、0.3M NaHCO3緩沖液作為檢測緩沖液。將控干水的凝膠、蛋白質(zhì)溶液和緩沖液混和起來以提供表10中列出的體積和濃度，隨后在室溫下混和48小時，進(jìn)行固定化。
表10
在通過離心控干凝膠并且除去上清后通過加入600μl 0.2M乙醇胺，pH為9.0阻斷多余的活性基團(tuán)，隨后在室溫下混和過夜。通過用1M NaCl漂洗凝膠三次除去未結(jié)合的蛋白(離心后除去上清)，最后凝膠用250mM NaCl；50mM Tris-HCl，pH 8.0漂洗。固定化的GrB-H6C228F的酶活性測定如下稱取控干的凝膠基質(zhì)與300μl含有100mMHEPES，pH 7.75；400μM Ac-IEPD-pNA(Calbiochem)的底物溶液混和，孵育一定時間后測量上清的OD405nm，確定每毫升底物溶液每克干膠的ΔOD405nm/min。使用固定化的GrB-H6 C228F的酶活性確定偶聯(lián)效率，表達(dá)為計算出的酶活性(如果所有上樣的酶都被偶聯(lián)并且具有活性)的百分比。
偶聯(lián)效率也在表10中列出，兩個活化水平的偶聯(lián)效率沒有顯著差異，對于兩個蛋白濃度，偶聯(lián)效率也處于相同的范圍內(nèi)，所以在固定化混合物中使用高蛋白質(zhì)濃度則得到最高的偶聯(lián)水平。還不能推斷在偶聯(lián)混合物中加入PEG 20000是否有利于固定化，對于高蛋白質(zhì)濃度也沒有對其進(jìn)行測定。
對使用高蛋白濃度的兩個固定化實驗(實驗C和F)測定了固定化的GrB-H6 C228F對使用尿素和鹽酸胍(GdmCl)變性的穩(wěn)定性。實驗C和F的凝膠基質(zhì)分成三小份，置于旋轉(zhuǎn)小層析柱內(nèi)，分別與8M尿素；0.5M NaCl；50mM Tris-HCl，pH 8.0(尿素)、6M鹽酸胍；50mM Tris-HCl，pH 8.0(GdmCl)、或者100mM HEPES，pH 7.75(HEPES)在室溫下共同孵育30分鐘，然后用100mM HEPES，pH 7.75漂洗并平衡。然后根據(jù)上面的描述測定固定化GrB-H6 C228F的酶活性。
得到的酶活性在下面的表11中示出。使用尿素變性似乎有利于固定化的GrB-H6 C228F，因為孵育之后的酶活性與使用無變性能力的HEPES緩沖液孵育后的酶活性相比有所增加，而使用鹽酸胍變性似乎使酶活性略微下降。
表11
通過切割按照實施例6中制備的融合蛋白H6-TripUB IQAD↓SP和H6-TripUB IQAD↓SG證明了固定化的GrB-H6 C228F具有功能。來自六個固定化實驗中的50μl凝膠基質(zhì)進(jìn)行切割實驗。凝膠基質(zhì)用200μl含有100mM HEPES，pH 7.75的緩沖液重懸，并與100μl所述兩種融合蛋白的每一種分別在室溫下振蕩孵育過夜。取出上清通過非還原SDS-PAGE進(jìn)行分析，參見圖20。
對于所有12個切割實驗，融合蛋白都被切割產(chǎn)生對應(yīng)于TripUbi部分的單一產(chǎn)物，H6融合伴侶已經(jīng)從TripUbi部分上被切掉。正如預(yù)期，來自實驗C和F的應(yīng)該具有最高偶聯(lián)水平的凝膠基質(zhì)切割了略多的融合蛋白。沒有測定切割效率。
參考文獻(xiàn)Christensen J.H.等人(1991)，F(xiàn)EBS Letters，281(1-2)181-184.
Nykj_r A.等人(1992)，Journal of Biological Chemistry，267(21)14543-14548.
Holtet T.L.等人(1997)，Protein Science，61511-1515Studier F.W.等人(1990)，Methods in Enzymology，18560-89Hochuli E.等人(1988)，Biotechnology，1321-1325Harris等人(1998)，Journal of Biological Chemistry 273(42)27364-27373.
Casciola-Rosen等人(1999)，Journal of Experimental Medicine 190(6)815-825.
Th_gersen等人(1994)，InternationalPatent Application WO 9418227Sun J.等人(2001)，Journal of Biological Chemistry 276(18)15177-15184.
序列表<110>Borean Pharma A/S<120>使用粒酶B蛋白酶切割融合蛋白<130>3106<160>57<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>243<212>PRT<213>人工<220>
<223>pro-IEGR-GrB-H6<400>1Met Gly Ser Ile Glu Gly Arg Ile Ile Gly Gly His Glu Ala Lys Pro1 5 10 15His Ser Arg Pro Tyr Met Ala Tyr Leu Met Ile Trp Asp Gln Lys Ser20 25 30Leu Lys Arg Cys Gly Gly Phe Leu Ile Gln Asp Asp Phe Val Leu Thr35 40 45Ala Ala His Cys Trp Gly Ser Ser Ile Asn Val Thr Leu Gly Ala His50 55 60Asn Ile Lys Glu Gln Glu Pro Thr Gln Gln Phe Ile Pro Val Lys Arg65 70 75 80Pro Ile Pro His Pro Ala Tyr Asn Pro Lys Asn Phe Ser Asn Asp Ile85 90 95
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<223>GrB GR-PD rev<400>15ccccgatgat atccggctcg atggatccca tatg 34<210>16<211>33<212>DNA<213>人工<220>
<223>GrB GR-AD fw<400>16tccatcgagg ctgatatcat cgggggacat gag 33<210>17<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>GrB GR-AD rev<400>17ccccgatgat atcagcctcg atggatccca tatg 34<210>18<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>GrB SAT fw<400>18tccacgagca dccaccaaag tctcaag 27<210>19<211>26
<212>DNA<213>人工<220>
<223>GrB SAT rev<400>19agactttggt gghggctcgt ggaggc 26<210>20<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>GrB VF fw<400>20tccacgagcc ktcaccaaag tctcaag 27<210>21<211>26<212>DNA<213>人工<220>
<223>GrB VF rev<400>21agactttggt gamggctcgt ggaggc 26<210>22<211>150<212>PRT<213>人工<220>
<223>H6-TripUB IEPD！SP<400>22
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<220>
<223>H6-IEPD-RAP<400>23Met Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ile Glu Pro Asp Tyr1 5 10 15Ser Arg Glu Lys Asn Gln Pro Lys Pro Ser Pro Lys Arg Glu Ser Gly20 25 30Glu Glu Phe Arg Met Glu Lys Leu Asn Gln Leu Trp Glu Lys Ala Gln35 40 45Arg Leu His Leu Pro Pro Val Arg Leu Ala Glu Leu His Ala Asp Leu50 55 60Lys Ile Gln Glu Arg Asp Glu Leu Ala Trp Lys Lys Leu Lys Leu Asp65 70 75 80Gly Leu Asp Glu Asp Gly Glu Lys Glu Ala Arg Leu Ile Arg Asn Leu85 90 95Asn Val Ile Leu Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Gly Lys Lys Asp Ala Arg100 105 110Gln Val Thr Ser Asn Ser Leu Ser Gly Thr Gln Glu Asp Gly Leu Asp115 120 125Asp Pro Arg Leu Glu Lys Leu Trp His Lys Ala Lys Thr Ser Gly Lys130 135 140Phe Ser Gly Glu Glu Leu Asp Lys Leu Trp Arg Glu Phe Leu His His145 150 155 160
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Glu Leu<210>24<211>336<212>PRT<213>人工<220>
<223>H6Ubi-IEPD-ApoA1<400>24Met Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gln Ile Phe Val Lys1 5 10 15Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr20 25 30Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro35 40 45Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg50 55 60Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val65 70 75 80Leu Arg Leu Arg Gly Gly Ser Ile Glu Pro Asp Gly Gly Asp Glu Pro85 90 95Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val100 105 110
Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly115 120 125Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp130 135 140Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val145 150 155 160Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg165 170 175Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro180 185 190Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr195 200 205Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg210 215 220Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu225 230 235 240Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu245 250 255Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu260 265 270Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys275 280 285
Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu290 295 300Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val305 310 315 320Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln325 330 335<210>25<211>197<212>PRT<213>人工<220>
<223>H6-IEPD-TN123<400>25Met Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ile Glu Pro Asp Gly1 5 10 15Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp20 25 30Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr35 40 45Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr50 55 60Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys Phe Leu Ala Phe65 70 75 80Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp Cys Ile Ser Arg85 90 95
Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu Asn Asp Ala Leu100 105 110Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala Glu Ile Trp Leu115 120 125Gly Leu Asn Asp Met Ala Ala Glu Gly Thr Trp Val Asp Met Thr Gly130 135 140Ala Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Thr Glu Ile Thr Ala Gln Pro145 150 155 160Asp Gly Gly Lys Thr Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser Gly Ala Ala Asn165 170 175Gly Lys Trp Phe Asp Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu Pro Tyr Ile Cys180 185 190Gln Phe Gly Ile Val195<210>26<211>150<212>PRT<213>人工<220>
<223>H6-TripUB IQAD！SP<400>26Met Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ile1 5 10 15
Gln Ala Asp Ser Pro Gly Thr Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys20 25 30Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu35 40 45Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys50 55 60Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Gly Ser Gln Ile Phe Val Lys Thr65 70 75 80Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile85 90 95Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp100 105 110Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr115 120 125Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu130 135 140Arg Leu Arg Gly Gly Ser145 150<210>27<211>150<212>PRT<213>人工<220>
<223>H6-TripUB IQAD！SG
<400>27Met Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ile1 5 10 15Gln Ala Asp Ser Gly Gly Thr Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys20 25 30Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu35 40 45Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys50 55 60Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Gly Ser Gln Ile Phe Val Lys Thr65 70 75 80Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile85 90 95Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp100 105 110Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr115 120 125Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu130 135 140Arg Leu Arg Gly Gly Ser145 150<210>28<211>150
<212>PRT<213>人工<220>
<223>H6-TripUB VGPD！SP<400>28Met Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Ser Gly Ser Val1 5 10 15Gly Pro Asp Ser Pro Gly Thr Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys20 25 30Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu35 40 45Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys50 55 60Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Gly Ser Gln Ile Phe Val Lys Thr65 70 75 80Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile85 90 95Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp100 105 110Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr115 120 125Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu130 135 140
Arg Leu Arg Gly Gly Ser145 150<210>29<211>150<212>PRT<213>人工<220>
<223>H6-TripUB VGPD！FG<400>29Met Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Ser Gly Ser Val1 5 10 15Gly Pro Asp Phe Gly Gly Thr Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys20 25 30Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu35 40 45Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys50 55 60Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Gly Ser Gln Ile Phe Val Lys Thr65 70 75 80Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile85 90 95Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp100 105 110Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr115 120 125
Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu130 135 140Arg Leu Arg Gly Gly Ser145 150<210>30<211>143<212>PRT<213>人工<220>
<223>H6-TripUB IEPD！TQ<400>30Met Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ile1 5 10 15Glu Pro Asp Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp20 25 30Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr35 40 45Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr50 55 60Val Gly Ser Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr65 70 75 80Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile85 90 95
Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala100 105 110Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln115 120 125Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Ser130 135 140<210>31<211>137<212>PRT<213>人工<220>
<223>H6-TripUB IEPD！IV<400>31Met Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ile1 5 10 15Glu Pro Asp Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met20 25 30Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala35 40 45Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Gly Ser Gln Ile Phe50 55 60Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser65 70 75 80Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile85 90 95
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp100 105 110Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His115 120 125Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Ser130 135<210>32<211>150<212>PRT<213>人工<220>
<223>H6-TripUB IEPD！EP<400>32Met Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ile1 5 10 15Glu Pro Asp Glu Pro Gly Thr Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys20 25 30Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu35 40 45Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys50 55 60Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Gly Ser Gln Ile Phe Val Lys Thr65 70 75 80
Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile85 90 95Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp100 105 110Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr115 120 125Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu130 135 140Arg Leu Arg Gly Gly Ser145 150<210>33<211>150<212>PRT<213>人工<220>
<223>H6-TripUB IEPD！EG<400>33Met Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ile1 5 10 15Glu Pro Asp Glu Gly Gly Thr Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys20 25 30Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu35 40 45Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys50 55 60
Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Gly Ser Gln Ile Phe Val Lys Thr65 70 75 80Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile85 90 95Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp100 105 110Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr115 120 125Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu130 135 140Arg Leu Arg Gly Gly Ser145 150<210>34<211>37<212>DNA<213>人工<220>
<223>TripUB GrB fw引物<400>34gtggatccat cgagcctgac tctcctggta ccgagcc 37<210>35<211>38<212>DNA<213>人工<220>
<223>TripUB GrB rev引物<400>35ggtaccagga gagtcaggct cgatggatcc actaccac 38<210>36<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>RAP GrB fw引物<400>36cggatccatc gagcctgact actcgcggga gaag 34<210>37<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>RAP GrB rev引物<400>37cccgcgagta gtcaggctcg atggatccgt gatg 34<210>38<211>42<212>DNA<213>人工<220>
<223>Mut-GrB fw<400>38cgtggtggat ccatcgagcc ggacggtgga gatgaacccc cc42<210>39<211>42
<212>DNA<213>人工<220>
<223>Mut-GrB rw<400>39ggggggttca tctccaccgt ccggctcgat ggatccacca cg42<210>40<211>33<212>DNA<213>人工<220>
<223>TN GrB fw引物<400>40ggatccatcg agcctgacgg cgagccacca acc 33<210>41<211>33<212>DNA<213>人工<220>
<223>TN GrB rev引物<400>41ggctcgccgt caggctcgat ggatccgtga tgg 33<210>42<211>33<212>DNA<213>人工<220>
<223>PC7TripUB GR-AD fw<400>42ggatccatcc aggcagactc tcctggtacc gag 33
<210>43<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>PC7TripUB GR-AD rev<400>43gtaccaggag agtctgcctg gatggatcca ctac34<210>44<211>37<212>DNA<213>人工<220>
<223>PC7TripUB P-G fw<400>44ggatccatcc aggcagactc tggtggtacc gagccac 37<210>45<211>38<212>DNA<213>人工<220>
<223>PC7TripUB P-G rev<400>45ctcggtacca ccagagtctg cctggatgga tccactac38<210>46<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>DNATrip IE-VG fw<400>46gtagtggatc agtcgggcct gactctcctg gtac 34<210>47<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>DNATrip IE-VG rev<400>47gagagtcagg cccgactgat ccactaccac tacc 34<210>48<211>31<212>DNA<213>人工<220>
<223>DNATrip SP-FG fw<400>48ggcctgactt tggtggtacc gagccaccaa c31<210>49<211>31<212>DNA<213>人工<220>
<223>DNATrip SP-FG rev<400>49ggctcggtac caccaaagtc aggcccgact g31<210>50<211>52
<212>DNA<213>人工<220>
<223>Trip IEPD-TQ<400>50gggaaaggat ccatcgagcc tgacacccag aagcccaaga agattgtaaa tg 52<210>51<211>54<212>DNA<213>人工<220>
<223>Trip IEPD-IV<400>51gggaaaggat ccatcgagcc tgacattgta aatgccaaga aagatgttgt gaac 54<210>52<211>39<212>DNA<213>人工<220>
<223>UB3<400>52cgcaagcttg catgcttagg atccaccacg aagtctcaa39<210>53<211>29<212>DNA<213>人工<220>
<223>TripUB EP fw<400>53cgagcctgac gagcctggta ccgagccac 29
<210>54<211>30<212>DNA<213>人工<220>
<223>TripUB EP rev<400>54cggtaccagg ctcgtcaggc tcgatggatc 30<210>55<211>29<212>DNA<213>人工<220>
<223>TripUB EG fw<400>55cctgacgagg gtggtaccga gccaccaac 29<210>56<211>29<212>DNA<213>人工<220>
<223>TripUB EG rev<400>56gctcggtacc accctcgtca ggctcgatg 29<210>57<211>227<212>PRT<213>人工<220>
<223>GrB variant C228F<400>57Ile Ile Gly Gly His Glu Ala Lys Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala1 5 10 15Tyr Leu Met Ile Trp Asp Gln Lys Ser Leu Lys Arg Cys Gly Gly Phe20 25 30Leu Ile Gln Asp Asp Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Gly Ser35 40 45Ser Ile Asn Val Thr Leu Gly Ala His Asn Ile Lys Glu Gln Glu Pro50 55 60Thr Gln Gln Phe Ile Pro Val Lys Arg Pro Ile Pro His Pro Ala Tyr65 70 75 80Asn Pro Lys Asn Phe Ser Asn Asp Ile Met Leu Leu Gln Leu Glu Arg85 90 95Lys Ala Lys Arg Thr Arg Ala Val Gln Pro Leu Arg Leu Pro Ser Asn100 105 110Lys Ala Gln Val Lys Pro Gly Gln Thr Cys Ser Val Ala Gly Trp Gly115 120 125Gln Thr Ala Pro Leu Gly Lys His Ser His Thr Leu Gln Glu Val Lys130 135 140Met Thr Val Gln Glu Asp Arg Lys Cys Glu Ser Asp Leu Arg His Tyr145 150 155 160
Tyr Asp Ser Thr Ile Glu Leu Cys Val Gly Asp Pro Glu Ile Lys Lys165 170 175Thr Ser Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Lys Val180 185 190Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Gly Arg Asn Asn Gly Met Pro Pro Arg195 200 205Ala Phe Thr Lys Val Ser Ser Phe Val His Trp Ile Lys Lys Thr Met210 215 220Lys Arg Tyr22權(quán)利要求
1.制備呈真實形式的目標(biāo)多肽的方法，所述的方法包含以下步驟(i)提供融合蛋白，其按N端到其C端的順序包含(a)融合伴侶，(b)包含粒酶B蛋白酶切割位點的粒酶B蛋白酶識別位點，(c)目標(biāo)多肽，其中所述的切割位點緊鄰目標(biāo)多肽；以及(ii)使所述融合蛋白與粒酶B蛋白酶接觸以在所述切割位點處切割產(chǎn)生呈真實形式的所述目標(biāo)多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的粒酶B蛋白酶識別位點具有以下的通式的氨基酸序列P4P3P2P1↓其中P4是氨基酸I或VP3是氨基酸E，Q或MP2是X，X代表任何氨基酸，P1是氨基酸D，以及↓是所述的粒酶B蛋白酶的切割位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的粒酶B蛋白酶識別位點具有的氨基酸序列選自由以下各項組成的組ICPD↓，IEAD↓，IEPD↓，IETD↓，IQAD↓，ISAD↓，ISSD↓，ITPD↓，VAPD↓，VATD↓，VCTD↓，VDPD↓，VDSD↓，VEKD↓，VEQD↓，VGPD↓，VEID↓，VRPD↓，VTPD↓，LEED↓，LEID↓，LGND↓，LGPD↓，AQPD↓，其中↓是所述的粒酶B蛋白酶的切割位點。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述通式還包含氨基酸P1′和P2′，產(chǎn)生以下的通式P4P3P2P1↓P1′P2′，其中P1′是X，X代表了任何氨基酸，P2′是G，且其中P1′和P2′是目標(biāo)多肽的一部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述通式還包含氨基酸P1′，P2′，P3′和P4′，得到通式P4P3P2P1↓P1′P2′P3′P4′，其中P4′是D或E，且其中P1′，P2′，P3′和P4′是目標(biāo)多肽的一部分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的目標(biāo)多肽選自以下各項組成的組酶、多肽激素、單鏈抗體可變區(qū)片段以及載脂蛋白A。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中的多肽激素選自由生長激素、胰高血糖素、胰島素和干擾素組成的組。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中的酶是粒酶B。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的融合伴侶是親和標(biāo)簽。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中的親和標(biāo)簽選自以下各項組成的組多聚組氨酸標(biāo)簽、多聚精氨酸標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、Strep標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、S-標(biāo)簽、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽、纖維素結(jié)合肽、幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽以及麥芽糖結(jié)合蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的粒酶B蛋白酶選自由人粒酶B蛋白酶、小鼠粒酶B蛋白酶和大鼠粒酶B蛋白酶組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中的粒酶B蛋白酶是如序列編號57所示的人粒酶B蛋白酶變異體，其中第228號(胰凝乳蛋白酶原編號)的半胱氨酸殘基突變?yōu)楸奖彼帷?br> 13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的粒酶B蛋白酶以固定化的形式出現(xiàn)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中的粒酶B蛋白酶通過C端被固定化。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中的粒酶B蛋白酶通過一個賴氨酸殘基被固定化。
16.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中的親和標(biāo)簽是多聚組氨酸標(biāo)簽，其中的融合蛋白在Ni2+離子和氨三乙酸(NTA)存在下與粒酶B蛋白酶接觸。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中Ni2+的濃度范圍是1-20mM，NTA的濃度范圍是1-20mM。
18.融合蛋白，其按N端到其C端的順序包含(a)融合伴侶，(b)包含粒酶B蛋白酶切割位點的粒酶B蛋白酶識別位點，以及(c)目標(biāo)多肽，其中所述的切割位點緊鄰目標(biāo)多肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的融合蛋白，其中的粒酶B蛋白酶識別位點的氨基酸序列具有以下的通式P4P3P2P1↓其中P4是氨基酸I或VP3是氨基酸E，Q或MP2是X，X代表任何氨基酸，P1是氨基酸D，以及↓是所述的粒酶B蛋白酶的切割位點。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的融合蛋白，其中的粒酶B蛋白酶識別位點具有的氨基酸序列選自由以下各項組成的組ICPD↓，IEAD↓，IEPD↓，IETD↓，IQAD↓，ISAD↓，ISSD↓，ITPD↓，VAPD↓，VATD↓，VCTD↓，VDPD↓，VDSD↓，VEKD↓，VEQD↓，VGPD↓，VEID↓，VRPD↓，VTPD↓，LEED↓，LEID↓，LGND↓，LGPD↓，AQPD↓，其中↓是所述的粒酶B蛋白酶的切割位點。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的融合蛋白，其中的通式還包含氨基酸P1′和P2′，產(chǎn)生以下的通式P4P3P2P1↓P1′P2′，其中P1′是X，X代表了任何氨基酸，P2′是G，且其中P1′和P2′是目標(biāo)多肽的一部分。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的融合蛋白，其中的通式還包含氨基酸P1′，P2′，P3′和P4′，得到通式P4P3P2P1↓P1′P2′P3′P4′，其中P4′是D或E，且其中P1′，P2′，P3′和P4′是目標(biāo)多肽的一部分。
23.根據(jù)權(quán)利要求18的融合蛋白，其中的目標(biāo)多肽選自以下各項組成的組酶、多肽激素、單鏈抗體可變區(qū)片段以及載脂蛋白A。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的融合蛋白，其中的多肽激素選自由生長激素、胰高血糖素、胰島素和干擾素組成的組。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的融合蛋白，其中的酶是粒酶B。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的融合蛋白，其中的粒酶B包含一個C端多聚組氨酸標(biāo)簽。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的融合蛋白，選自pro-IEPD-GrB-H6(序列編號2)和pro-IEAD-GrB-H6(序列編號3)。
28.根據(jù)權(quán)利要求25的融合蛋白，選自由pro-IEPD-GrB-H6C228A(序列編號5)，pro-IEPD-GrB-H6C228T(序列編號6)，pro-IEPD-GrB-H6C228V(序列編號7)，和pro-IEPD-GrB-H6C228F(序列編號8)組成的組。
29.根據(jù)權(quán)利要求25的融合蛋白，其中所述酶粒酶B是人粒酶B蛋白酶變異體，其中第228號的(胰凝乳蛋白酶原編號)半胱氨酸殘基突變?yōu)楸奖彼帷?br> 30.根據(jù)權(quán)利要求25的融合蛋白，其中的人粒酶B蛋白酶變異體如序列編號57所示。
31.根據(jù)權(quán)利要求18的融合蛋白，其中的融合伴侶是一個親和標(biāo)簽。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的融合蛋白，其中的親和標(biāo)簽選自以下各項組成的組多聚組氨酸標(biāo)簽、多聚精氨酸標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、Strep標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、S-標(biāo)簽、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽、纖維素結(jié)合肽、幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽以及麥芽糖結(jié)合蛋白。
33.人粒酶B蛋白酶變異體，其中的其中第228號的(胰凝乳蛋白酶原編號)半胱氨酸殘基突變?yōu)楸奖彼帷?br> 34.根據(jù)權(quán)利要求33的人粒酶B蛋白酶變異體，如序列編號57所示。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34的人粒酶B蛋白酶變異體的用途。
36.編碼根據(jù)權(quán)利要求19-32中任何一個融合蛋白的分離的核酸序列或者編碼根據(jù)權(quán)利要求33或34中人粒酶B蛋白酶變異體的分離的核酸序列。
37.包含根據(jù)權(quán)利要求36的分離的核酸序列的重組載體。
38.被根據(jù)權(quán)利要求37的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
39.制備根據(jù)權(quán)利要求18的融合蛋白或者根據(jù)權(quán)利要求33或34的人粒酶B蛋白酶變異體的方法，該方法包含以下步驟(i)提供包含有效連接于啟動子的根據(jù)權(quán)利要求36的分離的核酸序列的重組載體；(ii)使用所述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(iii)在表達(dá)所述融合蛋白或者人粒酶B蛋白酶變異體的條件下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；以及(iv)選擇地分離所述融合蛋白或者人粒酶B蛋白酶變異體。
全文摘要
通過使用粒酶B蛋白酶(EC 3.4.21.79)對融合蛋白進(jìn)行酶切制備呈真實形式的目標(biāo)多肽的方法。還提供了包含目標(biāo)多肽和融合伴侶的融合蛋白，其中在目標(biāo)多肽和融合伴侶之間的連接區(qū)包含緊鄰目標(biāo)多肽的粒酶B蛋白酶切割位點；還提供了人粒酶B蛋白酶變異體，其中第228號的(胰凝乳蛋白酶原編號)半胱氨酸殘基突變?yōu)楸奖彼帷?br> 文檔編號C12N9/64GK1795209SQ200480014688
公開日2006年6月28日 申請日期2004年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月23日
發(fā)明者R·H·勞倫森, C·H·芬波 申請人:伯瑞恩藥物公司