專利名稱：產(chǎn)生3－甲基氨基－1－(噻吩－2－基)丙－1－醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備式I 的3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的方法，特別涉及制備S-對映體I-S的方法。
式I-S 的氨基丙醇I的S對映體是用于合成式II的抗抑郁劑度洛西汀(duloxetine)的重要前體 其中，B是帶n個負電荷的無機或有機酸性基團，HnB是可藥用的酸。
現(xiàn)有技術(shù)用于制備度洛西汀或其相應(yīng)堿的方法是復雜的并必須使用手性試劑或手性起始化合物。
因而，EP-B-0273658描述了制備度洛西汀的相應(yīng)堿的方法，將2-乙?；绶酝ㄟ^Mannich反應(yīng)與甲醛和二甲基胺反應(yīng)，還原所得Mannich堿的酮基產(chǎn)生外消旋的(S)-3-N，N-二甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇，用氟化萘將醇官能團醚化并最終將二甲基氨基基團轉(zhuǎn)化為甲基氨基官能團進行所述制備。萘醚的目標對映體可通過使用手性起始材料獲得或通過在終產(chǎn)物步驟進行外消旋物拆分，如通過與旋光酸形成鹽的方法或通過在手性固定相上層析獲得。
US-5,362,886描述了類似的方法，其中將S-扁桃酸加至在還原酮基后獲得的外消旋丙醇中。將這方面獲得的該醇的S對映體用于隨后的反應(yīng)步驟。
EP-A-0457559也描述了與EP-B-0273658中描述的方法相類似的方法。在該方法中，用不對稱還原體系LAH-Icb(氫化鋁鋰-[(2R，2S)-(-)-4-二甲基氨基-1，2-二苯基-3-甲基-2-丁醇])還原Mannich堿的酮基產(chǎn)生S對映體形式的醇。除了成本，本發(fā)明的缺點還在于還原體系LAH-Icb的不穩(wěn)定性，LAH-Icb僅能穩(wěn)定幾分鐘。
在Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals，XXXVI卷，3號，213-223頁中，W.J.Wheeler和F.kuo也描述了制備度洛西汀的方法。在該方法中，將噻吩-2-甲酰氯于Stille偶合中與乙烯基三-正丁基錫烷在存在催化量的苯甲基(氯)-雙(三苯基膦)鈀(II)時在DMPU(二甲基丙烯脲)中反應(yīng)產(chǎn)生式II的1-(噻吩-2-基)丙烯酮， 隨后通過用氯化氫處理將其轉(zhuǎn)化為式III.1的3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮 隨后用手性唑硼烷和BH3將用該方法獲得的氯化丙酮III.1還原，產(chǎn)生式IV.1-S的(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇
可將以這種方式獲得的醇IV.1-S通過接連與碘化鈉并隨后與甲胺反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇1-S。通過隨后接連與氫化鈉、1-氟代萘以及氯化氫反應(yīng)，可獲得鹽酸鹽形式的度洛西汀。就此而論是不利的，首先，制備氯丙酮中間產(chǎn)物III.1需要許多步驟和昂貴的試劑。其次，將氯丙酮III.1轉(zhuǎn)化為氨基醇時分離氯丙醇IV.1-S。然而申請人進行的研究已經(jīng)表明這種氯丙醇不穩(wěn)定并非常容易通過強烈的放熱反應(yīng)分解，這樣不僅導致氨基醇的產(chǎn)量損失而且使得在工業(yè)規(guī)模上更難控制該反應(yīng)。
可從文獻中獲知用于制備3-氯-1-(噻吩-2-基)丙基-1-酮的方法，3-氯-1-(噻吩-2-基)丙基-1-酮由W.J.Wheeler等描述并在合成度洛西汀期間作為中間產(chǎn)物產(chǎn)生。然而，現(xiàn)有技術(shù)的已知方法的缺點是形成的氯丙酮III.1的產(chǎn)量低或者必須使用難以處理的試劑。因而，在CR Acad.Sci.，Ser.，Ser.C，1979，288(1)，49-52中，A.Etienne等描述了通過將噻吩和3-氯丙酰氯在硝基甲烷溶劑中在存在三氯化鋁作為路易斯酸催化劑時進行Friedel-Crafts反應(yīng)制備氯丙酮III.1。氯丙酮III.1僅以7％的產(chǎn)量獲得。如由Liu等在Chirality，12，26-29(2000)中描述的相應(yīng)反應(yīng)，在存在四氯化錫作為路易斯酸催化劑以及苯作為溶劑時，也得到不令人滿意的產(chǎn)量。在Acta Chem.Scand.B 20(6)，1577-1587(1966)中，Meth-Cohn等描述在存在三氯化鐵或三氯化鋁時在噻吩上進行相應(yīng)的Friedel-Crafts?；饔?，形成的氯丙酮III.1具有中等到良好的產(chǎn)量。該方法的缺點在于必須使用二硫化碳作為溶劑。
在Tetradron Lett.44,2003,4783-4787中，Kamal，G.B.R.Khanna、R.Ramu和T.Krishnaji描述度洛西汀前體(S)-3-羥基-3-(噻吩-2-基)丙腈的制備，該方法通過用氯代乙酰氯乙酰化噻吩、用硼氫化鈉還原酮產(chǎn)生外消旋醇、用氰化物取代氯基并將外消旋腈醇與乙酸乙烯酯在存在洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶(在硅藻土上固定)時反應(yīng)，該脂肪酶選擇性催化R對映體的酯化作用，從而保持未被酯化的目標S對映體可以以純化的形式分離。關(guān)于該方法的缺點在于，一方面需要多個反應(yīng)步驟，另一方面，由于酯化的R部分不再進一步反應(yīng)產(chǎn)生度洛西汀，造成了一半腈醇的損失。
因此本發(fā)明的一個目的是提供用于制備3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的方法，所述方法克服了上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點。而且，本方法將以好的總體產(chǎn)量提供式I化合物，特別是也使得對映體選擇性地制備S對映體I-S成為可能。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過首先用Friedel-Crafts反應(yīng)將噻吩與β-鹵代丙?；u或丙烯酰鹵在存在路易斯酸時進行反應(yīng)，且在分離反應(yīng)產(chǎn)物前通入鹵化氫來達到這一目標。此后，將得到的式III的3-鹵代-1-(噻吩-2-基)-丙-1-酮 Hal＝鹵素還原并將式IV的還原產(chǎn)物 與甲胺反應(yīng)。
因此本發(fā)明涉及用于制備式I 的3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的方法，其中a)噻吩在存在路易斯酸時與β-鹵代丙?；u或丙烯酰基鹵反應(yīng)得到3-鹵代-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮，在反應(yīng)發(fā)生同時或之后但是在分離反應(yīng)產(chǎn)物之前通入鹵化氫，和b)將在a)步驟中獲得的丙酮還原并然后，優(yōu)選地不分離反應(yīng)產(chǎn)物，與甲胺反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明的方法以好的總產(chǎn)量提供了目標化合物I。而且，鹵代丙酮中間產(chǎn)物III的制備沒有使用昂貴的有機錫試劑。不需要分離難以操作的鹵代丙醇IV。而且，該方法使得可能以簡單的方式通過在存在手性催化劑或手性還原劑時還原鹵代丙酮中間產(chǎn)物III來對映體選擇性地制備S對映體I-S，其中所述手性催化劑或手性還原劑表現(xiàn)出關(guān)于(S)-3-鹵代-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇I-S形成的選擇性。
在本發(fā)明的上下文中，“對映體選擇性”表示S對映體的對映體過量值ee(％)，該值通過已知的方式，根據(jù)下式ee(％)＝[S對映體-R對映體/(S對映體-R對映體)]×100計算，至少為50％，優(yōu)選至少80％，特別地至少為90％，尤其至少為95％。
作為在?；^程中，或優(yōu)選在酰基化進行后但是在反應(yīng)產(chǎn)物分離前通入鹵化氫的結(jié)果，基本上沒有獲得1-噻吩-2-基-丙酮II作為步驟a)的終產(chǎn)物，該化合物在現(xiàn)有技術(shù)的方法中總作為副產(chǎn)物出現(xiàn)并減少了目標?；a(chǎn)物III的產(chǎn)量。
具有電子對空位的共價金屬鹵化物或半金屬鹵化物適合用作路易斯酸。通常，它們選自鈦、錫、鋁、釩、鐵或硼的鹵素化合物。優(yōu)選氯化物；然而，當使用鋁時，二氯化單烷基鋁和氯化二烷基鋁也是合適的。使用硼時，氟化物也是合適的。合適的路易斯酸的實例是四氯化鈦、三氯化硼、三氟化硼、四氯化錫、五氯化釩、三氯化鐵、三氯化鋁、二氯化烷基鋁和氯化二烷基鋁。特別優(yōu)選使用三氯化鋁。
合適的β-鹵代丙酰鹵是3-氯丙酰氯和3-溴丙酰溴或者3-溴丙酰氯。優(yōu)選使用3-氯丙酰氯。
優(yōu)選將丙烯酰氯作為丙烯酰鹵使用。
β-鹵代丙酰鹵優(yōu)選在步驟a)中用作?；瘎?。
氯化氫和溴化氫是合適的鹵化氫。優(yōu)選使用鹵化氫，其中鹵素原子對應(yīng)于所用的β-鹵代丙酰鹵中β-鹵素基團。因此，當使用3-氯代丙酰氯時，優(yōu)選使用氯化氫。
在Friedel-Crafts?；磻?yīng)中通常使用的所有溶劑都適合用作步驟a)中用來反應(yīng)的溶劑。原則上，合適的溶劑是質(zhì)子惰性溶劑，其不降低所用的試劑，特別是路易斯酸的反應(yīng)性，或不在給定反應(yīng)條件下進入與路易斯酸的任何競爭反應(yīng)。這些溶劑的實例是自身?；姆枷阕逶噭?即噻吩)、比噻吩明顯更難?；姆紵N，如苯、硝基苯和鹵代芳烴，如氯苯和二氯苯以及鹵代脂族烴，特別是鹵代烷如氯甲烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、氯乙烷、二氯乙烷和三氯乙烷。上述溶劑和混合物也是合適的。優(yōu)選使用如硝基苯或鹵代烴的溶劑，其中Friedel-Crafts?；苫揪嗟剡M行。特別是優(yōu)選鹵代芳烴或脂族烴，特別優(yōu)選鹵代烷。特別使用二氯乙烷或氯苯。
路易斯酸必須基于理論上要獲得的?；绶缘牧恳灾辽俚饶柫渴褂茫驗槁芬姿顾崤c在?；陂g形成的酮形成絡(luò)合物，該絡(luò)合物在Friedel-Crafts反應(yīng)的常規(guī)條件下保持穩(wěn)定。基于以更小比例使用的1摩爾的?；M分(噻吩或β-鹵代丙酰鹵)，路易斯酸優(yōu)選以1∶1-1∶2、特別優(yōu)選1∶1-1∶1.5，特別是1∶1.1-1∶1.5的摩爾比使用。
噻吩和β-鹵代丙酰鹵以優(yōu)選1∶0.5-1∶2、特別優(yōu)選1∶0.7-1∶1.5，特別是1∶0.8-1∶1.2的摩爾比使用。
與Friedel-Crafts酰化有關(guān)，將試劑一起加入的順序是次要的。因而，可能例如最初將路易斯酸導入溶劑中并首先加入β-鹵代丙酰鹵并然后加入噻吩。備選地，可能最初引入噻吩和路易斯酸并將β-鹵代丙酰鹵加入它們。
通常，當加入β-鹵代丙酰鹵時進行冷卻是有利的，因為路易斯酸和?；u的反應(yīng)通常是強烈放熱的。尤其依賴溶劑選擇反應(yīng)溫度。溫度通常在10℃-40℃的范圍內(nèi)。當使用鹵代烴，尤其是鹵代烷時，反應(yīng)溫度適宜地最高為50℃，因為否則，溶劑將自身反應(yīng)。反應(yīng)溫度優(yōu)選為-20℃-40℃，特別優(yōu)選為0-30℃。
原則上，反應(yīng)壓力不是關(guān)鍵的。通常，反應(yīng)在常壓下進行；然而也可以在正壓或負壓下進行。例如，當溶劑在通常條件下高度揮發(fā)或不是液體，如當使用氯甲烷時，使用正壓。
優(yōu)選在?；l(fā)生后通入鹵化氫?，F(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法如氣相層析法、薄層層析法或NMR波譜法可用來確定?；磻?yīng)的完成。在每種情況下，通入發(fā)生的時間尤其取決于批大小并可通過技術(shù)人員確定。通常，通入鹵化氫至少直到不再可能檢測到任何1-噻吩-2基丙酮。
為了檢查?；a(chǎn)物，通常最初將反應(yīng)混合物進行水解處理以斷裂已經(jīng)形成的酮-路易斯酸絡(luò)合物。將水或經(jīng)稀釋的含水無機酸，如稀鹽酸用于水解。用已知的方法，如在Organikum[Practical course in organicchemistry]，VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften，第17版，1988年，323頁以及以下等等中描述的方法實現(xiàn)進一步純化和分離。
根據(jù)本發(fā)明的方法在步驟a)中產(chǎn)生高產(chǎn)量的3-鹵代-(噻吩-2-基)-1-丙酮III。在?；磻?yīng)過程中可以形成的任何1-噻吩-2-基丙酮II基本上完全轉(zhuǎn)化為3-鹵代-(噻吩-2-基)-1-丙酮III，這樣基于3-鹵代-(噻吩-2-基)-1-丙酮III的產(chǎn)量，反應(yīng)混合物含有至多1mol％，特別優(yōu)選至多0.5mol％的丙酮II。
例如通過使用金屬氫化物或半金屬氫化物或使用氫在存在合適的過渡金屬催化劑時完成步驟b)中的丙酮III的還原。
合適的金屬氫化物或半金屬氫化物既是中性的又分別是金屬和半金屬的配位氫化物。可有利地使用已經(jīng)證明在將酮還原為醇中具有價值的金屬氫化物或半金屬氫化物。氫化物優(yōu)選為硼或鋁的氫化物。
合適的中性氫化物的實例是硼烷(BH3；B2H6)、鋁烷(AlH3)、硅烷(SiH4)、單硼烷和二烷基硼烷，如雙(3-甲基丁-2-基)硼烷、(二唾液酸基硼烷)或9-硼雙環(huán)[3.3.1]壬烷(9-BBN)、單烷基鋁和二烷基鋁化合物，如二異丁基氫化鋁(DIBAL-H)和三烷基硅烷，如三甲基硅烷或三乙基硅烷。
合適的配位氫化物的實例是配位硼氫化物如硼氫化鈉(NaBH4)、硼氫化鋰(LiBH4)、或硼氫化鈣Ca[BH4]2，配位氫化鋁，如氫化鋰鋁(LiAlH4)、配位烷基硼氫化物或烷氧基硼氫化物，如三乙基硼氫化鋰或三異丙氧基硼氫化鉀(KB(OCH(CH3)2)3H)，或配位烷基氫化鋁或烷氧基氫化鋁，如二乙基氫化鋁鈉、雙(2-甲氧基乙氧基)氫化鋁鋰(LiAl[OC2H4OCH3]2H2)、雙(2-甲氧基乙氧基)氫化鋁鈉(NaAl[OC2H4OCH3]2H2；“紅Al”)或三(叔丁氧基)氫化鋰鋁(LiAl[OC(CH3)3]3H)等。
適合用于用金屬氫化物或半金屬氫化物還原的溶劑特別取決于所使用的還原劑并應(yīng)該本身不含有任何在反應(yīng)條件下也能還原的基團。因此，使用上述氫化物的還原優(yōu)選地在質(zhì)子惰性溶劑中進行，所述質(zhì)子惰性溶劑不含在給定反應(yīng)條件下能被還原的官能團。這些溶劑的實例是芳烴和脂族烴，例如C5-C8-烷和C5-C8-環(huán)烷，如戊烷、己烷、庚烷、環(huán)戊烷、環(huán)己烷和環(huán)辛烷，芳族化合物，如苯、甲苯、硝基苯、氯苯和二氯苯，以及，具有4-8個碳原子的開鏈和環(huán)醚，如二乙醚、甲基叔丁醚、四氫呋喃或二烷，以及氯化烴類，特別是鹵代烷如氯甲烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或三氯乙烷。上述溶劑的混合物也是合適的。優(yōu)選使用上述芳烴、醚或鹵代烴。
用上述的一些配位氫化物，特別是用反應(yīng)性較小的氫化物如硼氫化鈉進行的還原反應(yīng)可以在存在質(zhì)子溶劑例如C1-C3-醇類，如甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇時或甚至在水溶液中也可以實現(xiàn)。在這種情況下，優(yōu)選使用由至少一種先前提到的質(zhì)子惰性溶劑和至少一種醇組成的混合物。因為氫化物在堿性質(zhì)子溶液中更穩(wěn)定，當使用質(zhì)子溶劑時，反應(yīng)優(yōu)選地在存在合適的堿時進行。合適的堿的實例是堿金屬氫氧化物，如氫氧化鈉或氫氧化鉀，或堿金屬碳酸鹽，如碳酸鈉或碳酸鉀。優(yōu)選使用氫氧化鈉。
當使用許多先前提到的金屬氫化物或半金屬氫化物時，還原反應(yīng)通常放熱進行，這樣在除去反應(yīng)熱，即冷卻下適宜地進行反應(yīng)。反應(yīng)溫度優(yōu)選為-50至40℃，特別優(yōu)選為-30至30℃并且尤其為-20至20℃。使用現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法如由例如Organikum[Practical course in organicchemistry]，VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften，第17版，1988年，492頁以及以下描述的方法可以進行還原反應(yīng)。在這些方法中，通常最初將丙酮III導入并按份加入還原劑。然而，也可以將丙酮和還原劑按份同時加入。
例如，也可用烴醇鋁還原丙酮III。用烴醇鋁還原酮通常也稱為Meerwein-Ponndorf-Verley還原。在該還原反應(yīng)中，酮轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇并且同時將醇鹽氧化為相應(yīng)的醛(在由伯醇形成的醇鹽的情況時)或酮(在由仲醇形成的醇鹽的情況時)。反應(yīng)可以用例如在Organikum[Practical coursein organic chemistry]，VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften，第17版，486頁以及以下描述的已知方法進行。
而且，也可以通過催化加氫的方式還原丙酮III，即通過在存在合適的過渡金屬催化劑時將丙酮III與氫反應(yīng)還原丙酮III。合適的過渡金屬包括VIII、VI和I副族金屬，特別是鉑、釕、銅、鉻和鎳。自然，必須選擇催化劑以使得它們不能催化噻吩基的氫化。催化劑可用作非勻相催化劑或用作勻相催化劑。合適的方法大體上已知并在例如Transition Matals inOrganic Synthesis.M.Beller，C.Bolm，Wiley-VCH，Weinheim，1998年，第2卷，第1頁及以后等(勻相催化劑)或者第81頁及以后(非勻相催化劑)中描述。
用金屬氫化物或半金屬氫化物并特別優(yōu)選用一種上述配位金屬氫化物或半金屬氫化物優(yōu)選實現(xiàn)步驟b)中的還原。特別是使用硼氫化鈉。
當使用上面描述的非對稱還原劑時，前手性3-鹵-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮III主要還原為外消旋的醇IV。隨后與甲胺反應(yīng)相應(yīng)地產(chǎn)生外消旋的3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮I。
在優(yōu)選的實施方案中，使用根據(jù)本發(fā)明的方法制備式I-S的(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇 或制備該化合物和它的R對映體I-R一起的混合物，其中對映體I-S占優(yōu)勢，步驟b)中的還原反應(yīng)在存在手性還原劑或表現(xiàn)出關(guān)于(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇I-S的形成的選擇性的手性催化劑時進行。
當完成這些后，在步驟b)中將前手性鹵代丙酮III對映體選擇性還原成式IV-S的S-鹵代丙醇 或S和R對映體的混合物，其中S對映體占優(yōu)勢。為此，例如使用不對稱金屬氫化物或半金屬氫化物作為步驟b)中的還原劑，或在存在介導不對稱誘導的化合物時進行還原。
不對稱金屬氫化物或半金屬氫化物優(yōu)選是不對稱的氫化鋁、氫化硼或氫化硅。合適的不對稱硼氫化物如在E.J.Corey，C.J.Helal，Angew.Chem.1998，110，2092-2118或在M.M.Midland、L.A.Morell，Methoden Org.Chem.[Methods of organic chemistry]，Houben-Weyl，第4版，卷E21d，4082-4098頁，1995年中描述，將它們?nèi)囊米鳛閰⒖?。合適的不對稱氫化硅尤其在H.Brunner，Methoden Org.Chem.[Methods of organicchemistry]，Houben-Weyl，第4版，卷E 21d，4074-4081頁，1995年中描述，同樣特此全文引用作為參考。
在本發(fā)明上下文中，將介導不對稱誘導的化合物認為是這樣的化合物，其通過影響實際的還原劑，例如通過與還原劑形成鍵或形成絡(luò)合物，或通過從還原劑吸收氫原子或另一還原性部分，使得對映體選擇性地還原丙酮III。通常，介導不對稱誘導的化合物本身不具還原性。
一方面，這些化合物包括不對稱加氫催化劑。在不對稱氫化作用中，氫作為實際的還原劑而不對稱催化劑促成對映體選擇性地形成一種可能的對映體。氫化作用或在非均相中或在勻相中進行。用于在非均相中不對稱氫化的合適催化劑是例如在A.Baiker，H.U.Blaser in Handbook ofHeterogeneous Catalysis，第5卷(編輯G.Ertl、Knrzinger和J.Weitkamp)，Wiley-VCH，Weinheim，1997，2422-2436中描述，這里通過全文引用作為參考。
然而，用于在均相中氫化的催化劑更加重要。包含副族VIII金屬如鉑或釕，特別是釕，以及至少一個含磷配體的催化劑是特別合適的。合適的催化劑描述于例如R.Noyori，T.Ohkuma，Angew.Chem.2001，113，40-75中，這里通過全文引用將其作為參考。特別適宜的是釕(II)肼絡(luò)合物，其中釕額外地結(jié)合雙配位基手性二膦配體。適合用于將鹵代丙酮III還原為S-鹵代丙醇IV-S的二膦配體的實例是式A的(R)-BINAP、式B的(R，R)-DIOP和式C的(R，R)-CHIRAPHOS Ar＝苯基(BINAP)Ph＝苯基4-甲基苯基(TolBINAP)3，5-二甲基苯基(XylBINAP)而且，特別優(yōu)選的催化劑含有肼配體。合適的肼配體的實例是對映體形式的1，2-乙二胺、1，2-二苯基-1，2-乙二胺和1，2-環(huán)己二胺。
通常，氫化作用在先前描述的條件下進行。
式D的oxzaborylidine是特別優(yōu)選的介導不對稱誘導的化合物 其中R是C1-C4-烷基，如甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基或叔丁基并特別是甲基。
該試劑可用于以高度對映體選擇性將前手性酮轉(zhuǎn)化為仲醇(E.J.Corey，Pure Appl.Chem.62，1209，1990；E.J.Corey，J.O.Link，J.Am.Chem.Soc.114，1906，1992)。將硼烷，如BH3、二烷基硼烷、二烷氧基硼烷或二芳氧基硼烷用作實際的還原劑。W.J.Wheeler和F.Kuo已經(jīng)在Journal of Labelled Compounds和Radiopharmaceuticals，XXXVI卷，No.3，213-223中描述了氯代丙酮III.1與oxazaborylidine D(R＝甲基)和BH3反應(yīng)產(chǎn)生S-氯代丙醇IV.1-S。
在還原反應(yīng)中，oxazaborylidine通常以催化量使用。盡管將硼烷基于鹵代丙酮III至少以等摩爾量使用，但是優(yōu)選過量使用。反應(yīng)通常在合適的溶劑中進行。合適的溶劑是質(zhì)子惰性溶劑，其不具有在給定還原條件下能被還原的基團。這些溶劑包括，特別是前面提到的鹵代烷烴、芳香族化合物和環(huán)狀或無環(huán)醚。優(yōu)選使用醚，四氫呋喃是特別優(yōu)選的。反應(yīng)溫度優(yōu)選從-80至20℃，特別優(yōu)選從-30至10℃。通常進行反應(yīng)使得最初將oxazaborylidine導入溶劑中并或者首先加入硼烷并隨后加入鹵代丙酮III或相反地，先加入鹵代丙酮III然后加入硼烷，在所希望的反應(yīng)溫度下進行，優(yōu)選第一種加入步驟。反應(yīng)持續(xù)時間尤其決于反應(yīng)批量的大小并在每種情況下由技術(shù)人員確定。
令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)當用酶催化，特別是存在脫氫酶時，將丙酮III對映體選擇性地還原成S-鹵代丙醇IV-S進行得很好。因此在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一優(yōu)選實施方案中將脫氫酶用作還原劑。
根據(jù)本發(fā)明的方法中的還原已經(jīng)完成后，并取決于所用的還原方法，適宜時，將所用的催化劑或過量的還原劑失活或除去。當使用金屬氫化物或半金屬氫化物時，這通常通過水解，如用水溶液或醇溶液水解來實現(xiàn)。當用均相加氫催化劑或當用烴醇鋁還原時，也經(jīng)常使用催化處理。如果在非均相中以催化加氫的形式進行還原，或用酶作為還原劑，那么可以通過物理分離，如通過傾析或過濾除去催化劑或酶。然而，當使用均相還原體系時，特別是當用金屬氫化物或半金屬氫化物進行還原時，優(yōu)選最初不進行失活。
已經(jīng)證明將還原后獲得的鹵代丙醇IV不經(jīng)分離而直接與甲胺反應(yīng)生成3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇I是有利的。為此，可將反應(yīng)混合物用甲胺處理并反應(yīng)，優(yōu)選在升高的溫度如在30至80℃，特別是在50至70℃時反應(yīng)，其中所述反應(yīng)混合物適宜時已經(jīng)經(jīng)過失活處理或已經(jīng)從非均相還原體系分離。甲胺以氣體形式使用或作為水溶液使用，優(yōu)選作為水溶液使用?；谑褂玫柠u代丙酮III的量，優(yōu)選以1-100摩爾當量，特別優(yōu)選5-10摩爾當量的量使用鹵代丙酮III。優(yōu)選在1-250巴的壓強下，并特別是在系統(tǒng)自己產(chǎn)生的固有壓強下實現(xiàn)反應(yīng)。
和甲胺的反應(yīng)已經(jīng)完成后，以常規(guī)的方式處理反應(yīng)混合液。為此，如果在加入甲胺之前沒有處理，那么按照已經(jīng)描述的，將催化劑或還原劑失活并分離，之后，將溶劑除去并通過例如結(jié)晶、消化、萃取或?qū)游龇◤臍堄辔镏蟹蛛x純的甲基氨基丙醇I。
也可能用根據(jù)本發(fā)明的方法來獲得好產(chǎn)量的3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇I。具體地，步驟a)中不需要昂貴的或難以操作的試劑或溶劑并且形成十分高產(chǎn)量的鹵代丙酮。步驟b)中，避免了不穩(wěn)定的鹵代丙醇IV的分離以及與之相關(guān)的鹵代丙醇IV的產(chǎn)量損失和/或它的難以操作。而且，根據(jù)本發(fā)明的方法可用于選擇性的獲得甲基氨基丙醇I-S的S對映體，如果使用手性還原劑進行步驟b)中的還原，那么該對映體對進一步轉(zhuǎn)化為度洛西汀是必需的。
而且，本發(fā)明還涉及用于制備式I-S的(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的方法，方法中對映體選擇性地還原3-鹵代-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮，包括在存在脫氫酶時進行還原。在該方法的優(yōu)選實施方案中，將就此獲得的(S)-3-鹵代-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇IV-S與甲胺反應(yīng)而不需分離。關(guān)于合適的和優(yōu)選的脫氫酶及關(guān)于實施方法，讀者可清楚地參照下面的觀察。
生物化學實施方案合適的脫氫酶(EC 1.1.X.X)特別是脫氫酶(EC 1.1.1.X)，特別是引起鹵代丙酮III選擇性地還原為S-鹵代丙醇IV-S的醇脫氫酶(E.C.1.1.1.1或E.C.1.1.1.2)。脫氫酶優(yōu)選從微生物、特別優(yōu)選從細菌或真菌，特別是酵母中獲得，這些微生物在每種情況下在菌株保藏中心保藏或可從天然來源分離物如土壤樣品、生物量樣品等獲得。脫氫酶特別源于酵母或乳酸細菌。
脫氫酶能以純化或部分純化的形式或微生物本身的形式使用。從微生物分離和純化脫氫酶的方法是技術(shù)人員足夠公知的，例如從K.Drauz和H.Waldmann，Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002，Vol.III，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim中的K.Nakamura &T.Matsuda，，“Reduction of Ketones”獲知。生產(chǎn)脫氫酶的重組方法也可從例如W.Hummel，K.Abokitse，K.Drauz，C.Rollman和H.Grger，Adv.Synth.Catal.2003，345，Nos.1+2，pp.153-159獲知。
合適的細菌實例是假單胞菌屬(Pseudomonas)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、紅球菌屬(Rhodococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)或乳球菌屬(Lactococcus)的那些細菌。合適的酵母樣品是地霉屬(Geotrichum)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(hansenula)或酵母屬(saccharomyces)。
特別優(yōu)選使用源于酵母和乳酸細菌的脫氫酶。這些脫氫酶中，優(yōu)選地是那些從地霉屬或假絲酵母屬酵母獲得的脫氫酶或者是那些從乳桿菌屬或乳球菌屬的乳酸細菌獲得的脫氫酶。
乳桿菌種的實例是短乳桿菌(L.brevis)、克非爾乳桿菌(L.kefir)、植物乳桿菌(L.plantarum)、干酪乳桿菌(L.casei)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、德氏乳桿菌(L.delbrueckii)和舊金山乳桿菌(L.sanfrancisco)。
假絲酵母種的實例是木蘭假絲酵母菌(C.magnoliae)、皺褶假絲酵母(C.rugosa)、產(chǎn)朊假絲酵母(C.utilis)、博伊丁假絲酵母(C.boidinii)、近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)和南極洲假絲酵母(C.antarctica)。
地霉種的實例是白地霉(G.candidum)、棒地霉(G.clavatum)和發(fā)酵地霉(G.fermentans)。
特別優(yōu)選使用源于木蘭假絲酵母菌、白地霉或短乳桿菌的脫氫酶。
用脫氫酶還原通常在存在合適的輔酶(也稱輔因子)時進行。通常將NADH和/或NADPH用作輔酶來還原酮。而且，可能以本身含有輔因子的細胞體系使用脫氫酶，或可加入備選的氧化還原介體(A.Schmidt，F(xiàn).Hollmann和B.Bühler“Oxidation of Alcohols”in K.Drauzand H.Waldmann，Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2000，Vol.III，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim)。
用脫氫酶還原也通常在存在合適的共底物時完成，所述共底物通常作為在還原過程中經(jīng)氧化的輔酶的還原劑并因而再生這種輔酶。合適的共底物的實例是糖類，特別是己糖如葡萄糖、甘露糖或果糖，和/或可氧化的醇，特別是乙醇、丙醇或異丙醇，也可以是甲酸鹽?？梢约尤肓硪环N脫氫酶，例如當將葡萄糖作為共底物時可加入葡萄糖脫氫酶，以便氧化共底物，與此相關(guān)，用來再生輔酶。這種脫氫酶可以作為游離的或固定化酶或以游離細胞或固定化細胞的形式使用。脫氫酶或者可以單獨地制備或者通過在(重組)脫氫酶菌株中共表達來制備。
根據(jù)本發(fā)明使用的脫氫酶能以游離或固定化形式使用。固定化酶可以理解為固定至惰性支持體的酶。合適的支持材料以及固定在它們上的酶可以從EP-A-1149849、EP-A-1069183和DE-OS 100193773獲知，并且也可以從其中引用的參考文獻中獲知。在這一點上，這些文獻中的公開內(nèi)容通過全文引用作為參考。合適的支持材料包括例如粘土、粘土礦物如高嶺土、硅藻土、珠光體、二氧化硅、氧化鋁、碳酸鈉、碳酸鈣、纖維素粉、陰離子交換材料、合成聚合物如聚苯乙烯、丙烯酸樹脂、酚醛樹脂、聚氨基甲酸酯以及聚烯烴如聚乙烯和聚丙烯。將支持材料用于制備受支持的酶，其通常是細分的微粒形式，優(yōu)選多孔形式。支持材料的顆粒大小通常不超過5mm，特別是不超過2mm(分級曲線)。以類似的方式，當將脫氫酶作為完整細胞催化劑使用時，可以選擇游離或固定化形式。支持材料的實例是藻酸鈣和角叉菜膠。酶及細胞能直接與戊二醛交聯(lián)(交聯(lián)產(chǎn)生CLEAs)。相應(yīng)的，另外的固定化方法例如在J.Lalonde和A.Margolin“Immobilization ofEnzymes”in K.Drauz and H.Waldmann，Enzyme Catalysis in OrganicSynthesis 2002，Vol.III，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim中描述。
還原反應(yīng)能在含水或不含水的反應(yīng)介質(zhì)中或雙相體系或(微)乳劑中進行。含水反應(yīng)介質(zhì)優(yōu)選是緩沖液，通其pH值為5-8，優(yōu)選為6-8。除了水，含水溶劑可另外含有至少一種醇，如乙醇或異丙醇。
“非含水反應(yīng)介質(zhì)”應(yīng)該理解為反應(yīng)介質(zhì)，其基于該反應(yīng)介質(zhì)的總重量，含有按重量計少于1％、優(yōu)選少于0.5％的水。反應(yīng)優(yōu)選在有機溶劑中進行。合適的溶劑的實例是脂族烴，優(yōu)選具有5-8個碳原子的脂族烴，如戊烷、環(huán)戊烷、己烷、環(huán)己烷、庚烷、辛烷或環(huán)辛烷，鹵化脂族烴，優(yōu)選具有一個或兩個碳原子的鹵化脂族烴，如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或四氯乙烷，芳烴，如苯、甲苯、二甲苯類、氯苯或二氯苯、脂族無環(huán)的和環(huán)醚類，優(yōu)選具有4-8個碳原子的脂族無環(huán)的和環(huán)醚類，如二乙醚、甲基叔丁基醚、乙基叔丁基醚、二丙基醚、二異丙基醚、二丁基醚或四氫呋喃或酯類，如乙酸乙酯或乙酸正丁酯或酮類，如甲基異丙基酮或二烷，或它們的混合物。特別優(yōu)選使用上述的醚類，特別是四氫呋喃。
例如，用脫氫酶的還原在含水有機物，特別是在含水反應(yīng)介質(zhì)中進行。
在酶促還原中，優(yōu)選使用0.1g/l-500g/l，特別優(yōu)選1g/l-50g/l濃度的鹵代丙酮III并且其可隨后連續(xù)或不連續(xù)地提供。
通常，酶促還原在低于使使用的脫氫酶失活的溫度并優(yōu)選為至少-10℃的反應(yīng)溫度下進行。反應(yīng)溫度特別優(yōu)選為0-100℃，特別為15-60℃，并尤其為20-40℃，例如約30℃。
為了實現(xiàn)反應(yīng)，例如可以最初將鹵代丙酮III和脫氫酶、溶劑以及，如果適宜，和輔酶，如果適宜，和用于再生輔酶的輔助脫氫酶，和/或其它共底物一起引入，并混合混合物，如通過攪拌或搖動混合。然而，也可能將脫氫酶固定在反應(yīng)器，如柱中，并將含有鹵代丙酮III和如果適宜，輔酶和/或共底物的混合物穿過反應(yīng)器。為此，可能將混合物以循環(huán)過程通過反應(yīng)器直到實現(xiàn)所希望的轉(zhuǎn)化。在這方面，鹵代丙酮III的酮基還原為OH基，連同基本上選擇性地形成了鹵代丙醇IV-S的S對應(yīng)體?；诨旌衔镏写嬖诘柠u代丙酮III，通常進行還原直到至少70％，特別優(yōu)選至少85％，并特別是至少95％的轉(zhuǎn)化。關(guān)于這一點，反應(yīng)的進展，即酮的順序還原可通過常規(guī)方法如氣相層析法監(jiān)視。
根據(jù)本發(fā)明的方法特別優(yōu)選使用的脫氫酶是醇脫氫酶，其具有至少一種下列性質(zhì)
具有以下氨基酸序列的醇脫氫酶，所述醇脫氫酶在N端區(qū)a)包含至少5、6、7或8，優(yōu)選至少10個，例如10、11、12、13、14或15個如SEQID NO1中描述的連續(xù)氨基酸殘基的組成型氨基酸序列，其中對應(yīng)SEQ IDNO1中描述的氨基酸位置12的位置優(yōu)選另外地代表纈氨酸；或b)包含至少5、6、7或8，優(yōu)選至少10個，例如10、11、12、13、14或15個如SEQID NO2中描述的連續(xù)氨基酸殘基的組成型氨基酸序列；和其功能等價物。
能將3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮還原為(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的醇脫氫酶。
以至少85％ee的對映體純度催化還原(存在NADH和/或NADPH；在30℃和pH6.0)的醇脫氫酶。
醇脫氫酶，其由包含SEQ ID NO3的核酸序列編碼或包含如SEQ IDNO4描述的氨基酸序列或至少如圖3中描述的組成序列，可優(yōu)選地從短乳桿菌獲得；以及源于所述脫氫酶的功能等價的醇脫氫酶。
醇脫氫酶，其由包含SEQ ID NO5的核酸序列編碼或具有包含SEQID NO6的氨基酸序列，并可優(yōu)選地從木蘭假絲酵母(ATCC 12573)獲得；以及源于所述脫氫酶的功能等價的醇脫氫酶。
本發(fā)明還涉及具有至少一種上面所列的性質(zhì)的(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-醇脫氫酶。
其中脫氫酶穩(wěn)定的溫度范圍優(yōu)選是10-80℃。其活性最優(yōu)時的溫度優(yōu)選為20-60℃，特別優(yōu)選25-40℃。脫氫酶在其中穩(wěn)定的pH范圍優(yōu)選為pH4-10。脫氫的最適pH優(yōu)選為pH 5-8。
而且，根據(jù)本發(fā)明的脫氫酶優(yōu)選地能在NAD+或NADP+存在下使(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇脫氫產(chǎn)生3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮。它優(yōu)選具有30±2千道爾頓的分子量。
本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的脫氫酶的編碼序列或組成型編碼序列的核酸序列。它的非限制性實例是在SEQ ID NO3或SEQ ID NO6中描述的序列。
本發(fā)明進一步涉及表達盒，所述表達盒包含根據(jù)本發(fā)明的核酸序列，其與至少一個調(diào)節(jié)核酸序列有效連接。
本發(fā)明進一步涉及重組載體，所述載體包含至少一個根據(jù)本發(fā)明的表達盒。
而且，本發(fā)明涉及用至少一個根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的原核或真核宿主。
最后，本發(fā)明涉及使用根據(jù)本發(fā)明的脫氫酶，或產(chǎn)生這種脫氫酶的微生物來制備(S)-3-鹵代-1-(噻烯-2-基)丙-1-醇并且，特別是用于制備度洛西汀。
根據(jù)本發(fā)明的脫氫酶的進一步修飾本發(fā)明還包括特定公開的酶的“功能等價物”，其具有(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇脫氫酶活性，還包括這些等價物在根據(jù)本發(fā)明的方法中的用途。
在本發(fā)明的上下文內(nèi)，特定公開的酶的“功能等價物”或類似物是不同于這些酶但仍具有目標生物活性如底物特異性的多肽。因而，“功能等價物”可例如理解為指這樣的酶，其將3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮還原為相應(yīng)的S醇，并且具有包含在SEQ ID NO1、2、4或6列出或圖3中描述的氨基酸序列之一的酶活性的至少20％、優(yōu)選50％、特別優(yōu)選75％、十分特別優(yōu)選90％。功能等價物也優(yōu)選在pH 4-10是穩(wěn)定的，并且有利地具有5-8的最適pH以及20-80℃的最適溫度。
根據(jù)本發(fā)明，“功能等價物”也具體地理解為指突變體，所述突變體在上述氨基酸序列中的至少一個序列位置中具有不同于特別提到的氨基酸的氨基酸，但是仍然具有上述生物活性一種?！肮δ艿葍r物”因而包含可通過一個或多個氨基酸添加、氨基酸替代、氨基酸缺失和/或氨基酸倒位獲得的突變體，所述改變可以出現(xiàn)在任意序列位置，只要它們產(chǎn)生具有根據(jù)本發(fā)明性質(zhì)譜的突變體。具體地，當突變體和未改變的多肽的反應(yīng)性模式在性質(zhì)上一致時，即同樣的底物例如以不同的速率被轉(zhuǎn)化時，也存在功能等價物。合適的氨基酸替代的實例在下表中列出
原始殘基 替代的實例AlaSerArgLysAsnGln；HisAspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyProHisAsn；GlnlleLeu；ValLeuIle；ValLysArg；Gln；GluMetLeu；IlePheMet；Leu；TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp；PheValIle；Leu上述意義的“功能等價物”也是所述多肽的“前體”以及這些多肽的“官能衍生物”和“鹽”。
就此而論，“前體”是多肽的天然或合成的前體，所述前體具有或不具有目標生物活性。
表述“鹽”可理解為根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子的羧基的鹽和氨基的酸加成鹽。羧基的鹽可以以自身已知的方式制備并包括無機鹽，如鈉、鈣、銨、鐵和鋅鹽，以及與有機堿形成的鹽，所述有機堿為例如胺，如三乙醇胺、精氨酸、賴氨酸、哌啶等。酸加成鹽，例如與無機酸，如鹽酸或硫酸形成的鹽，以及與有機酸，如乙酸和草酸形成的鹽，同樣構(gòu)成了本發(fā)明的部分。
根據(jù)本發(fā)明多肽的“官能衍生物”同樣可以用已知的技術(shù)在官能氨基酸側(cè)基或在它們的N-端或C-端制備。這些衍生物包括，例如羧酸基團的脂族酯；羧酸基團的酰胺，所述酰胺可通過與氨或與伯胺或仲胺反應(yīng)獲得；游離氨基的N-酰基衍生物，所述衍生物通過與?；磻?yīng)制備；或游離羥基的O-?；苌铮鲅苌锿ㄟ^與?；磻?yīng)制備。
在可能的蛋白質(zhì)糖基化的情況下，根據(jù)本發(fā)明的“功能等價物”包括去糖基化或糖基化形式的上述類型的蛋白質(zhì)以及可通過改變糖基化模式獲得的經(jīng)修飾的形式。
“功能等價物”自然也包括從其它生物中獲得的多肽和自然出現(xiàn)的變體。例如，同源序列區(qū)的區(qū)域可通過序列比較確定并且等價酶可用本發(fā)明的特定方針鑒別。
“功能等價物”還包括根據(jù)本發(fā)明多肽的片段，優(yōu)選個別結(jié)構(gòu)域或者序列基序，所述片段具有例如，所希望的生物學功能。
而且，“功能等價物”是含有一個上述多肽序列或源于它的功能等價物，以及至少一個其它異源序列的融合蛋白，所述異源序列功能上與之不同并功能地連接N-端或C-端(即融合蛋白的各部分沒有顯著的相互功能削弱)。這種異源序列的非限制性實例是信號肽或酶。
也包括于本發(fā)明的“功能等價物”是特定公開的蛋白質(zhì)的同源物。這些同源物與特定公開的氨基酸序列之一具有至少60％、優(yōu)選至少75％、特別是至少85％，如90％、95％、97％或99％的同源性，所述同源性用Pearson和lipman算法，Proc.Natl.Acad，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448計算。根據(jù)本發(fā)明的同源多肽的百分比同源性具體指基于此處明確描述的一個氨基酸序列的全長的氨基酸殘基的百分比同一性。
根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽的同源物可通過誘變產(chǎn)生，例如通過蛋白質(zhì)的點突變或截短產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的同源物可通過篩選突變體如截短突變體的組合文庫鑒定。例如，蛋白質(zhì)變體的多樣化文庫可通過在核酸水平上的組合誘變產(chǎn)生，例如通過酶促連接合成的寡核苷酸的混合物產(chǎn)生。有許多方法可用于從簡并的寡核酸序列制備潛在同源物的文庫。簡并基因序列可在自動DNA合成機器上通過化學合成并且合成的基因可連接進合適的表達載體中。使用簡并基因集使得可能以混合物制備編碼潛在蛋白質(zhì)序列的目的集的所有序列。用于合成簡并寡核苷酸的方法是技術(shù)人員已知的(例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 393；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等人，(1984)Science 1981056；Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11477)。
用于篩選已經(jīng)通過點突變或截短制備的組合文庫基因產(chǎn)物以及用于篩選cDNA文庫中具有所選性質(zhì)的基因產(chǎn)物的幾種技術(shù)是現(xiàn)有技術(shù)已知的。這些技術(shù)可適用于快速篩選通過將根據(jù)本發(fā)明的同源物組合誘變產(chǎn)生的基因文庫。用來篩選接受高通量分析的大型基因文庫的最常用技術(shù)包括將基因文庫克隆至可復制表達載體中，用得到的載體文庫轉(zhuǎn)化合適的細胞并在一定條件下表達組合基因，在所述條件下檢測目標活性有助于分離載體，該載體編碼將檢測其產(chǎn)物的基因。遞歸總體誘變(Recursive ensemblemutagenesis)(REM)是增加文庫中功能性突變的頻率的技術(shù)，可與篩選測試結(jié)合使用以便鑒別同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 897811-7815；Delgrave等人(1993)Protein Engineering 6(3)327-331)。
根據(jù)本發(fā)明的編碼核酸序列的其他實施方案具體地，本發(fā)明涉及核酸序列(單鏈和雙鏈DNA和RNA序列，如cDNA和mRNA)，該核酸序列編碼具有根據(jù)本發(fā)明的脫氫酶活性的酶。優(yōu)選例如，編碼如SEQ ID NO1、2、4、6或圖3中描述的氨基酸序列或其特征性組成序列的核酸序列，或包含如SEQ ID NO3或5中描述的核酸序列或其特征性組成序列的核酸序列。
所有在此提到的核酸序列可以以本身已知的方式，通過從核苷酸結(jié)構(gòu)單元化學合成制備，如通過雙螺旋的個別重疊的互補核酸結(jié)構(gòu)單元的片段縮合制備。寡核苷酸可例如以已知方式，用亞磷酰胺方法(Voet，第二版，Wiley Press New York，896-897頁)化學合成。合成的寡核苷酸的附著以及用DNA聚合酶Klenow片段填充缺口和連接反應(yīng)，以及常規(guī)克隆方法在Sambrook等(1989)，Molecular CloningA laboratory manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press中描述。
本發(fā)明還涉及編碼一種上面的多肽和它們的功能等價物的核酸序列(單鏈和雙鏈DNA和RNA序列，如cDNA和mRNA)，所述功能等價物例如可以用人造核苷酸類似物獲得。
本發(fā)明涉及經(jīng)分離的核酸分子，其編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)或其生物活性片段，還涉及可例如用作雜交探針或引物來鑒定或擴增根據(jù)本發(fā)明的編碼核酸的核酸片段。
根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可還含有編碼基因區(qū)的3’端和/或5’端的非翻譯序列。
本發(fā)明也包括與特定描述的核苷酸序列互補的核酸分子或其片段。
根據(jù)本發(fā)明的核酸序列使得能產(chǎn)生可用于鑒定和/或克隆其它細胞類型或生物體中的同源序列的探針和引物。這些探針或引物通常包括核苷酸序列區(qū)，所述核苷酸序列區(qū)在“嚴格”條件下(見下文)與根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的有義鏈或相應(yīng)的反義鏈中的至少約12個，優(yōu)選至少約25個，如約40、50或75個連續(xù)核苷酸雜交。
“分離的”核酸分子與存在于該核酸的天然來源的其它核苷酸分子分離，所述核酸分子當通過重組技術(shù)制備時基本無其它細胞材料或培養(yǎng)基或通過化學合成時基本無化學前體。
根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可用標準的分子生物學技術(shù)和根據(jù)本發(fā)明提供的序列信息分離。例如，可通過使用一種特定公開的完整序列或其片段作為雜交探針并使用標準的雜交技術(shù)(例如在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Mannual.第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989描述)從合適的cDNA文庫分離cDNA。而且，可用聚合酶鏈式反應(yīng)來分離包含一種公開的序列或其片段的核酸分子，所述方法使用基于這個序列構(gòu)建的寡核苷酸引物?？蓪⒁赃@種方式擴增的核酸克隆至合適的載體中并通過DNA序列分析表征。根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸也可通過標準的合成方法，如使用自動DNA合成設(shè)備制備。原則上，根據(jù)本發(fā)明的核酸序列可在任意生物體中鑒定或從其分離。有利地，根據(jù)本發(fā)明的核酸序列或其同源物可從真菌、酵母或細菌中分離?？梢蕴岬降募毦歉锾m氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌。根據(jù)本發(fā)明的核酸優(yōu)選地從革蘭氏陰性細菌，有利地從α-變形菌(alpha-proteobacteria)、β-變形菌(beta-proteobacteria)或γ-變形菌(gamma-proteobacteria)，特別優(yōu)選從腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)或根瘤菌科(Rhizobiaceae)，特別優(yōu)選從土壤桿菌屬(Agrobacterium)、假單胞菌屬或伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)中用技術(shù)人員已知的方法分離。
根據(jù)本發(fā)明的核酸序列可以，例如，用常規(guī)的雜交方法或PCR技術(shù)如通過基因組或cDNA文庫從其它真菌或細菌中分離。這些DNA序列在標準條件下與根據(jù)本發(fā)明的序列雜交。有利地使用來自保守區(qū)，如來自活性中心的短寡核苷酸用于雜交，使得可能以技術(shù)人員已知的方式通過與根據(jù)本發(fā)明的脫氫酶比較來鑒定這些寡核苷酸。然而，也可能使用根據(jù)本發(fā)明的核酸的更長的片段或全長序列用于雜交。這些標準條件取決于使用的核酸(寡核苷酸、更長的片段或完全序列)或取決于用于雜交的核酸類型DNA或RNA而不同。因而，DNADNA雜合分子的解鏈溫度比同樣長度的DNARNA雜合分子的溫度低約10℃。
取決于核酸，標準條件可理解為例如，溫度在42-58℃之間，在含有0.1-5×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，15mM檸檬酸鈉，pH 7.2)的濃度的含水緩沖液中，或額外存在50％甲酰胺，例如42℃，在5×SSC，50％甲酰胺中。有利地是，用于DNADNA雜交的雜交條件是0.1×SSC以及溫度約20℃-45℃，優(yōu)選約30℃-45℃。對于DNARNA雜交，雜交條件有利地是0.1×SSC以及溫度約30℃-55℃，優(yōu)選約45℃-55℃。這些特定用于雜交的溫度是解鏈溫度值，該值已經(jīng)通過例如具有長約100個核苷以及50％的G+C含量的核酸，在缺少甲酰胺的條件下計算得到。用于DNA雜交的實驗條件描述于遺傳學教科書中，如Sambrook等人，“MolecularCloning”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989中，并可以用技術(shù)人員已知的公式計算，例如取決于核酸的長度、雜合分子的性質(zhì)或G+C含量。技術(shù)人員可進一步從以下教科書獲得有關(guān)雜交的信息Ausubel等人(eds)，1985，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NewYork；Hames和Higgins(eds)，1985，Nucleic Acids HybridizationAPractical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown(ed)，1991，Essential Molecular BiologyA Practical Approach，IRLPress at Oxford University Press，Oxford。
本發(fā)明還涉及特定公開的或可推導出的核酸序列的衍生物。
因而，根據(jù)本發(fā)明的進一步的核酸序列可源于，例如SEQ ID NO3或5并通過加入、替代、插入或缺失單個或幾個核苷酸而與其不同但仍然編碼具有目標特性譜的多肽。
本發(fā)明還包括那些包含根據(jù)原始特定生物體或宿主生物體的密碼子選擇，稱為沉默突變或與特定提及的序列相比改變的那些核酸序列及天然發(fā)生的變體，如剪接變體或等位基因變體。
本發(fā)明同樣涉及通過保守核苷酸替代獲得的序列(例如用相同電荷、大小、極性和/或溶解度的氨基酸替代所討論的氨基酸)。
本發(fā)明還涉及由于序列多態(tài)性源于特定公開的核酸的分子。這些遺傳多態(tài)性可存在于自然變異產(chǎn)生的群體內(nèi)的個體之間。這些自然變異通常在基因的核苷酸序列中引起1-5％的變化。
“根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的衍生物”可理解為，例如等位基因變體，所述等位基因變體在推導的氨基酸水平上在全長序列區(qū)上(關(guān)于氨基酸水平的同源性，讀者可參考上面關(guān)于多肽的觀察(observation))具有至少40％的同源性，優(yōu)選至少60％同源性，特別優(yōu)選至少80、85、90、93、95或98％的同源性。在序列的組成區(qū)上，同源性可有利地更高。
而且，“衍生物”也可理解為根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的同源物，如真菌的或細菌的同源物、截短的序列或編碼和非編碼DNA序列的單鏈DNA或RNA。因此它們，例如在DNA水平上，在指定的完整DNA區(qū)具有至少40％、優(yōu)選至少60％、特別優(yōu)選至少70％、十分特別優(yōu)選至少80％的同源性。
而且，“衍生物”也可理解為例如和啟動子的融合物。啟動子位于給定核酸序列的上游，可通過一個或多個核苷酸交換、插入、倒位和/或缺失來改變，而沒有削弱啟動子的功能性或活性。而且，可通過改變它們的序列增加啟動子的活性，或啟動子可用更有活性的啟動子，包括來自屬于其它物種生物體的那些啟動子代替。
“衍生物”也可理解變體，其核苷酸序列在起始密碼子上游-1到-1000號堿基區(qū)域中或終止密碼子下游0到1000號堿基區(qū)域中受到改變，從而基因表達和/或蛋白質(zhì)表達受到改變，優(yōu)選得以增強。
本發(fā)明也進一步包含在“嚴格條件”下與上述編碼序列雜交的核酸序列。這種性質(zhì)可理解為多核苷酸或寡核苷酸在嚴格條件下結(jié)合至幾乎互補的序列，而在這些條件下，在非互補的兩者之間的不形成非特異鍵的能力。為此，序列應(yīng)該是70-100％、優(yōu)選90-100％互補的。互補序列能特異地相互結(jié)合的特征例如在RNA印跡或蛋白質(zhì)印跡技術(shù)中或與引物結(jié)合有關(guān)在PCR或RT-PCR中利用。常規(guī)上將30個堿基對及以上長度的寡核苷酸用于該目的。在RNA印跡技術(shù)中，例如，嚴格條件可理解為使用洗滌溶液，例如含有0.1％SDS的0.1×SSC緩沖液(20×SSC3M NaCl，0.3M檸檬酸鈉，pH 7.0)，于50-70℃，優(yōu)選在60-65℃的溫度，以洗脫非特異雜交的cDNA探針或寡核苷酸。關(guān)于這點，如上所述，保持相互結(jié)合的唯一核酸是那些高度互補的核酸。嚴格條件的建立為技術(shù)人員已知并例如在Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述。
通過篩選基因組或cDNA文庫并且，適當時，使用合適的引物通過PCR從中擴增并隨后，例如用合適的探針分離可以發(fā)現(xiàn)這些多核苷酸。而且，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸也可以化學合成。
根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體的實施方案此外，本發(fā)明還涉及表達構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有處于調(diào)節(jié)核酸序列的基因控制下的編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的核酸序列；本發(fā)明還涉及包含這些表達構(gòu)建體的至少一種的載體。
根據(jù)本發(fā)明的這些構(gòu)建體優(yōu)選地包含給定編碼序列的5’-上游的啟動子和3’-下游終止子序列以及還有，適宜時，另外的常規(guī)調(diào)節(jié)元件，所述調(diào)節(jié)元件在每種情況下有效連接編碼序列。
“有效連接”可理解為啟動子、編碼序列、終止子以及，適宜時，另外的調(diào)節(jié)元件的順序排列，這樣使得每個調(diào)節(jié)元件能夠依照需要完成它們與表達編碼序列中有關(guān)的功能?？捎行нB接的序列的實例是導向序列和增強子、多聚腺苷酸化信號等。其他調(diào)節(jié)元件包括選擇標記、擴增信號、復制起點等。合適的調(diào)節(jié)序列在例如Goeddel，Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)中描述。
根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體具體可理解為這樣的共建體，其中根據(jù)本發(fā)明的脫氫酶的基因有效地或功能性地連接至一種或多種調(diào)節(jié)信號用以調(diào)節(jié)(如增加)基因的表達。
除了這些調(diào)節(jié)序列，位于實際的結(jié)構(gòu)基因上游的這些序列的天然調(diào)節(jié)可仍然存在并且，適宜時，已經(jīng)受到遺傳改變，從而自然調(diào)節(jié)已經(jīng)關(guān)閉并且基因的表達已經(jīng)增加。然而，核酸構(gòu)建體也可以具有更簡單的組成，即沒有將額外的調(diào)節(jié)信號插入編碼序列的上游，并且天然調(diào)節(jié)啟動子及其調(diào)節(jié)沒有被除去。另一種方法是將天然調(diào)節(jié)序列突變從而不再具有任何調(diào)節(jié)作用并且基因的表達得以增加。
優(yōu)選的核酸構(gòu)建體也有利地含有一個或多個先前提到的增強子序列，其功能性地連接至啟動子并使得有可能增強核酸序列的表達。在DNA序列的3’端插入額外的有利序列，如其他調(diào)節(jié)元件或終止子也是可能的。根據(jù)本發(fā)明的核酸可在構(gòu)建體中以一個或多個拷貝存在。對于構(gòu)建體的選擇適宜時，構(gòu)建體也可含有額外的標記，如抗生素抗性或營養(yǎng)缺陷型互補基因。
對根據(jù)本發(fā)明的方法有利的調(diào)節(jié)序列存在于例如啟動子如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、λ-PR或λ-PL啟動子中，所述啟動子可有利地用于革蘭氏陰性細菌中。其它有利的調(diào)節(jié)序列存在于例如革蘭氏陽性啟動子amy和SPO2中以及存在于酵母或真菌啟動子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28和ADH中。例如來自漢遜酵母(Hansenula)的丙酮酸脫羧酶和甲醇氧化酶啟動子在這方面也是有利的。使用人造啟動子來調(diào)節(jié)也是可能的。
為了在宿主生物中表達，將核酸構(gòu)建體有利地插入至使得基因在宿主中能佳表達的載體，如質(zhì)?；蚴删w中。除了質(zhì)粒和噬菌體，載體也可理解為技術(shù)人員已知的任何其它載體，即例如，病毒，如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒、轉(zhuǎn)座子、IS元件、噬粒、粘粒、線狀和環(huán)狀DNA。這些載體在宿主生物中自主復制或隨染色體復制。這些載體構(gòu)成了本發(fā)明的另一實施方案。合適的質(zhì)粒的實例是大腸桿菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、lgt11和pBdCI，鏈霉菌(Streptomyces)中的pIJ101、pIJ364、pIJ702和pIJ361，芽孢桿菌(Bacillus)中的pUB110、pC194和pBD214，棒狀桿菌(Corynebacterium)中的pSA77和pAJ667，真菌中的pALS1、pIL2和pBB116，酵母中的2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13和pEMBLYe23，以及植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004和pDH51。這些質(zhì)粒構(gòu)成了可能的質(zhì)粒的一小部分。其他質(zhì)粒為技術(shù)人員公知并且有關(guān)它們的信息可從例如Cloning Vectors(Eds.Pouwels P.H.等人Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 9040 18)這本書中獲得。
為了表達存在的其它基因，核酸構(gòu)建體有利地還含有用于增加表達的3’-端和/或5’-端調(diào)節(jié)序列，選擇所述序列以依賴所選宿主生物和基因最佳地表達。
這些調(diào)節(jié)序列應(yīng)該使得基因選擇性地表達以及使得蛋白質(zhì)表達。這可例如表示，取決于宿主生物，基因僅在誘導后表達或過量表達，或基因立刻表達和/或過量表達。
關(guān)于這一點，調(diào)節(jié)序列或因子可優(yōu)選地正影響，并因此增加導入的基因的表達。因而，通過使用強轉(zhuǎn)錄信號如啟動子和/或增強子可在轉(zhuǎn)錄水平上有利地增強調(diào)節(jié)元件。然而，除此之外，也可能通過例如提高mRNA的穩(wěn)定性來增強翻譯。
在載體的另一實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或含有根據(jù)本發(fā)明的核酸的載體也可有利地以線性DNA的形式插入至微生物中或通過異源重組或同源重組整合至宿主生物的基因組中。這種線性DNA可由線性化的載體如質(zhì)粒，或僅由根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或核酸組成。
為了能在生物中最優(yōu)地表達異源基因，根據(jù)該生物中使用的特定密碼子選擇改變核酸序列是有利的。借助于來自所述生物的其它已知基因的計算機分析，可容易地確定密碼子選擇。
通過將合適的啟動子融合至合適的編碼核苷酸序列并融合至終止子信號或多聚腺苷化信號制備根據(jù)本發(fā)明的表達盒。常規(guī)重組和克隆技術(shù)，如描述于T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborotary，Cold SpringHarbor，NY(1989)以及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaborotary，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and WileyInterscience(1987)的技術(shù)用于此目的。
為了完成在合適的宿主生物中的表達，將重組核酸構(gòu)建體或基因構(gòu)建體有利地插入至宿主特異載體中，該載體使得基因能在該宿主中最佳地表達。載體為技術(shù)人員熟知并且有關(guān)它們的信息可例如從“CloningVectors”(Pouwels P.H.等人，Eds.，Elsevier，Amsterdan-New York-Oxford，1985)中獲得。
根據(jù)本發(fā)明可以使用的宿主生物使用根據(jù)本發(fā)明的載體或構(gòu)建體來制備重組微生物是可能的，所述重組微生物例如用至少一個根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化并可用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的多肽。有利地，將上述根據(jù)本發(fā)明的重組構(gòu)建體導入至合適的宿主系統(tǒng)中并得以表達。關(guān)于這一點，技術(shù)人員熟悉的克隆和轉(zhuǎn)染方法如共沉淀、原生質(zhì)體融合、電穿孔、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等可優(yōu)選使用以便引起所述核酸在給定的表達體系中表達。合適的系統(tǒng)在例如，Current Protocols inMolecular Biology，F(xiàn).Ausubel等人Eds.，Wiley Interscience，New York1997，或Sambrook等人Molecular CloningA Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laborary，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述。
根據(jù)本發(fā)明，也可能制備同源重組微生物。為此，有必要制備包含根據(jù)本發(fā)明的基因或編碼序列的至少一個片段，所述編碼序列中，適宜時，已經(jīng)引入至少一個氨基酸缺失、添加或替代以便修飾，如在功能上破壞(“剔除”載體)根據(jù)本發(fā)明的序列。導入的序列也可以例如是來自相關(guān)微生物的同源物或源于哺乳動物、酵母或昆蟲來源。備選地，可以配置(configured)用于同源重組的載體使得和同源重組相關(guān)的內(nèi)源基因受到突變或修飾但仍然編碼功能蛋白質(zhì)(例如，可以修飾下游調(diào)節(jié)區(qū)使得內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達因此受到改變)。根據(jù)本發(fā)明的基因的經(jīng)修飾的片段在同源重組載體中。適合用于同源重組的載體的構(gòu)建描述于例如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51503。
原則上，任何原核或真核生物適合用作根據(jù)本發(fā)明的核酸或核酸構(gòu)建體的重組宿主生物。有利地，將微生物如細菌、真菌或酵母用作宿主生物。有利地使用革蘭氏-陽性細菌或革蘭氏-陰性細菌，優(yōu)選腸桿菌科、假單胞菌科、根瘤菌科、鏈霉菌科(streptomycetaceae)或諾卡氏菌科(Nocardiaceae)的細菌，特別優(yōu)選埃希氏菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬、鏈霉菌屬(Streptomyces)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、伯克霍爾德菌屬、沙門氏菌屬(Salmonella)、土壤桿菌屬或紅球菌屬。十分特別優(yōu)選大腸桿菌(Escherichiacoli)屬和種。除此之外，其它有利的細菌可在α-變形菌、β-變形菌、γ-變形菌中找到。
關(guān)于這一點，根據(jù)本發(fā)明的一種或多種宿主生物優(yōu)選包含在本發(fā)明中描述并編碼具有根據(jù)本發(fā)明的脫氫酶活性的酶的核酸序列、核酸構(gòu)建體或載體的至少一種。
根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的生物取決于宿主生物，以技術(shù)人員已知的方式生長或培養(yǎng)。通常，將微生物培育于液體培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有通常是糖形式的碳源、通常是有機氮源形式如酵母提取物的氮源或鹽，如硫酸銨、痕量元素，如鐵鹽、錳鹽和鎂鹽以及適宜時，維生素，在0℃-100℃之間，優(yōu)選在10℃-60℃之間的溫度下，同時用氧氣充氣。在這一點上，營養(yǎng)液的pH可保持固定值，其在培養(yǎng)期間受到調(diào)節(jié)或不調(diào)節(jié)。培養(yǎng)可以分批式、半分批式或連續(xù)地進行。營養(yǎng)物可最初在發(fā)酵的開始引入或隨后半連續(xù)地或連續(xù)地加料。可以直接將酮加入至培養(yǎng)物中或有利地，在培養(yǎng)后加入。酶可用描述于實施例的方法從生物中分離或?qū)⒚敢源痔嵛镄问接糜诜磻?yīng)。
重組制備根據(jù)本發(fā)明的多肽本發(fā)明進一步涉及用于重組制備根據(jù)本發(fā)明的多肽或其功能的、生物學活性片段的方法，所述方法包括培養(yǎng)產(chǎn)生多肽的微生物，誘導多肽的表達，適宜時，并將這些多肽從培養(yǎng)物中分離。如果希望，也可以以這種方法在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)所述多肽。
可根據(jù)已知的方法培養(yǎng)和發(fā)酵重組微生物?？衫缭赥B培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基中并在20-40℃的溫度和pH6-9下繁殖細菌。合適的培養(yǎng)條件例如在T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中詳細描述。
如果多肽沒有分泌進培養(yǎng)基，那么破裂細胞并用已知的蛋白質(zhì)分離方法從溶解產(chǎn)物獲得產(chǎn)物?？扇缦Ｍ耐ㄟ^高頻超聲波、通過高壓，如在弗氏壓碎器(French pressure cell)中，通過滲透裂解(osmolysis)、通過去垢劑、裂解酶或有機溶劑的作用、通過使用勻漿器或通過所引用的幾種方法的組合破裂細胞。
使用已知的層析方法如分子篩層析(凝膠過濾)，如Q Sepharose層析、離子交換層析和疏水層析，以及使用其它常規(guī)的方法如超濾、結(jié)晶、鹽析、透析和非變性凝膠電泳法可純化多肽。合適的方法例如在Coorper，F(xiàn).G.，Biochemische Arbeitsmethoden[Biochemical methods ofoperation]，verlag Walter de Gruyter，Berling，New York，或在Scopes，R.，Protein purification，Springer Verglag，New York，Heidelberg，Berlin中詳細描述。
為了分離重組蛋白質(zhì)，可有利地使用載體系統(tǒng)或寡核苷酸，其通過特定的核酸序列延伸cDNA并因此編碼用于例如簡化純化的經(jīng)改變的多肽或融合蛋白質(zhì)。此類合適的修飾的實例是所稱作用作錨的標簽，例如稱為六組氨酸錨的修飾，或由抗體識別為抗原的表位(例如，在Harlow，E.和Lane，D.，1988，AntibodiesA Laboratory Mannual.Cold SpringHarbor(N.Y.)Press中描述)。這些錨可用于將蛋白質(zhì)連接至固相支持體，如聚合物基質(zhì)，所述固相支持體可以填裝在層析柱中，或?qū)⒌鞍踪|(zhì)連接至微量滴定板或連接至另一支持體。
同時，這些錨也可用于識別蛋白質(zhì)。為了識別蛋白質(zhì)，也可能使用常規(guī)的標記如熒光染料、酶標記，該酶標記在和底物反應(yīng)后形成可檢測的反應(yīng)產(chǎn)物，或放射性標記，它們自己或者與錨組合用來衍生蛋白質(zhì)。
實施根據(jù)本發(fā)明的酶促還原方法的其它實施方案在根據(jù)本發(fā)明的方法中，可將脫氫酶用作游離的或固定化酶。
可將根據(jù)本發(fā)明的方法有利地在0℃-95℃、優(yōu)選10℃-85℃、特別優(yōu)選15℃-75℃的溫度下實施。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，將pH有利地保持在pH 4-12之間、優(yōu)選地在pH 4.5-9之間、特別優(yōu)選在pH 5-8之間。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，對映體純的或手性產(chǎn)物如3-氯-1-(噻吩-2-基)-(S)-丙-1-醇可理解為表現(xiàn)出對映體富集的對映體。優(yōu)選在該方法中獲得至少70％ee，優(yōu)選至少80％ee，特別優(yōu)選至少90％ee，十分特別優(yōu)選至少98％ee的純度。
對于根據(jù)本發(fā)明的方法，可能使用含有根據(jù)本發(fā)明的核酸、核酸構(gòu)建體或載體的生長細胞。也可能使用靜息或破裂的細胞。破裂的細胞可理解為，例如是已經(jīng)通過例如溶劑處理使得可滲透的細胞，或已經(jīng)通過用酶處理、通過機械處理(如弗氏細胞壓碎器或超聲波)或通過另一方法處理破裂的細胞。以這種方式獲得的粗提物有利地適合于根據(jù)本發(fā)明的方法。也可能將純化的酶或部分純化的酶用于本方法?？捎欣赜糜诜磻?yīng)的經(jīng)固定的微生物或酶是同樣合適的。
根據(jù)本發(fā)明的方法可分批式、半分批式或連續(xù)地進行。
本方法可有利地在生物反應(yīng)器中進行，所述反應(yīng)器如在Biotechnology，卷3，第二版，Rehm等人Eds.，(1993)中，特別是第二章中描述。
下面的實施例目的在于闡明本發(fā)明而非限制本發(fā)明。在這方面，讀者參考包含的圖，其中

圖1顯示用于根據(jù)本發(fā)明分離的Lu10288脫氫酶的活性染色凝膠；泳道1分子量標準，從下到上47kDa、74kDa、121kDa和205kDa；泳道2空白；泳道3勻漿上清液；泳道4Q Sepharose有用的級分；泳道5QSepharose有用的級分(三倍量)；泳道6Superdex有用的級分；泳道7Mono-Q有用的級分；泳道8Mono-P有用的級分；圖2A和2B顯示用于通過短乳桿菌脫氫酶還原制備(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇I-S的不同混合物的典型反應(yīng)順序。
圖3A顯示根據(jù)本發(fā)明分離的Lu10288脫氫酶的印跡帶的N-端測序結(jié)果。圖3B顯示根據(jù)本發(fā)明純化的Lu10288脫氫酶的不同蛋白質(zhì)水解片段的測序數(shù)據(jù)；當每一測序步驟獲得幾個信號時就有可能確定主要序列，這通過雙下劃線描述。無法認清的位置用“/”標記；對于對它的識別有點不確定的位置，氨基酸殘基在括號中給出。當不可能指定任何明確的優(yōu)選時，在一個位置上給出兩個氨基酸。“？”表示未知或無法識別的氨基酸。
實施例A.化學實施例實施例1制備3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮III.1最初將33kg噻吩引入150kg二氯乙烷中，之后加入62.7kg三氯化鋁。將反應(yīng)混合液冷卻至10℃并加入55kg 3-氯丙酰氯。隨后將混合物于室溫攪拌12小時。用GC和NMR檢查表明該反應(yīng)混合物仍然含有基于所形成DMSO濃度調(diào)節(jié)到0.2％。不含有任何一種測試試樣的溶液作為陰性試樣。對II型糖尿病模型小鼠，每日一次用探棒口服給予1mL任意一種測試試樣溶液，持續(xù)40天。此外，給予模型小鼠β-谷甾醇(TamaBiochemical Co.，Ltd.)作為對照試樣1.通過Antsense II(Bayer-SankyoCo.，Ltd.)測量一段時間內(nèi)的空腹血糖值和隨機血糖值。該空腹血糖值在空腹15小時后測量。此外，在從給藥開始的第35天，通過DCA 2000(Bayer-Sankyo Co.，Ltd.)測量血紅蛋白Alc水平。
(3)結(jié)果(血糖值和血紅蛋白Alc水平)在測試試樣給藥周期內(nèi)隨機血糖值和空腹血糖值隨時間的改變示于圖1和2中。盡管在給予陰性試樣或?qū)φ赵嚇?的小鼠中都觀察到隨機血糖值和空腹血糖值急劇增加，但是在給予測試試樣1、2和3的小鼠中清楚地重復觀察到了抑制血糖值增加的作用。
在從給藥開始的第35天血紅蛋白Alc水平的測量結(jié)果示于表1中。與給予陰性試樣后血紅蛋白Alc水平相比，在給予測試試樣1或2后觀察到明顯減少了15-26％。相比之下，在給予對照試樣1后僅觀察到約0.5％的減少，且?guī)缀鯖]有觀察到使血紅蛋白Alc降低的作用。此外，在給藥期間或給藥后沒有病例顯示急性低血糖病癥，從體重和病理檢查所見的觀察點也沒有觀察到不利的副作用癥狀。
表1 進行該測試以便評估本發(fā)明化合物以及在臨床實踐中使用的抗糖尿病藥物的使血紅蛋白Alc降低的作用。
(1)制備試樣每一情況中將150ml培養(yǎng)基在兩個1升三角瓶中滅菌并補充5ml無菌鹽溶液。在從LB氨芐青霉素瓊脂板中接種后，將預培養(yǎng)物于37℃和200轉(zhuǎn)/分鐘孵育12小時并加入至發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵于37℃，0.1巴內(nèi)壓和pH7.0(用20％磷酸和25％NaOH調(diào)節(jié))時開始，通氣速率是7.5l/分鐘和在300轉(zhuǎn)/分鐘下(將pO2調(diào)節(jié)至20-50％之間，空氣以10-20l/分鐘和500-1500轉(zhuǎn)/分鐘進入)。2小時后，加入0.1mM IPTG用于誘導并且總共13小時后終止發(fā)酵。收獲并洗滌細胞(1.3kg)后，將它們于-20℃保存直至使用(混合液中2-20g/l)。
實施例4篩選用于還原3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮的脫氫酶a)將不同的細菌和真菌菌株(主要來自多個菌株保藏中心)于30℃或37℃下在20ml LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基(來自Difco)或GYP培養(yǎng)基(用于酵母)(1％w/v D-葡萄糖，每一情況中0.5％w/v酵母提取物和聚胨，pH 6.0)中培育24-48小時，并用3mM Tris-HCl，pH 7.5洗滌且重懸浮于2ml緩沖液中。用1體積玻璃珠(直徑為0.3-0.5mm)在振動碾磨機(3×5分鐘，每隔10分鐘在冰上冷卻)中將等分試樣破裂。通過離心(于4℃以14000轉(zhuǎn)/分鐘5分鐘)將混濁物分離后，獲得澄清粗提物。隨后測定細胞懸浮液和粗提物還原實施例3的3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮的活性。
使用的測定法
150μl細胞/粗提物50μl 1M葡萄糖溶液50μl來自實施例3的葡萄糖脫氫酶(12-15U/μl；20-200mg MBM/ml)50μl 2mM NADH50μl 2Mm NADPH10μl溶于甲醇中的0.5M 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮190μl 50mM MES，pH 6.0或Tris-HCl，pH 7.5孵育在30℃下進行。在1、2或24小時后用3μl濃HCl終止樣品(200μl)。離心后，用HPLC分析上清液的3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮和3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇(Chromolith Speed ROD，RP-18e 50-4.6mm，流速1.5ml/分鐘，0.0-1.0分鐘35％乙腈+65％10mM KH2PO4緩沖液，pH2.5；1.1-1.3分鐘80％乙腈+20％10mM KH2PO4緩沖液，pH 2.5；1.3-2.0分鐘35％乙腈+65％10mM KH2PO4緩沖液，pH 2.5；于230nm(醇)和260nm(酮)，保留時間Rt＝1.250分鐘(3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇)和Rt＝1.500分鐘(3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮)時檢測；在Rt＝0.971分鐘和Rt＝1.165分鐘時測定通過HCl消除可能得到的副產(chǎn)物(1-噻吩-2-基丙烯-1-酮和1-噻吩-2-基丙烯-1-醇)。
重復測定選擇的菌株，用甲基叔丁基醚(MTBE)或甲基異丁基酮(MIBK)萃取樣品，并用手性GC分析或HPLC分析表征樣品以便測定對映體過量(ee)。將以下方法用于該目的GCHydrodex-β-6-TBDM，25m，90℃10分鐘5℃/分鐘180℃10分鐘，運行時間38分鐘，出口加熱器200℃，壓強106.8kPa，總流速102ml/分鐘，分流比125∶1，分流99.8ml/分鐘，檢測器200℃或HPLCChiracel OD-H，250*4.6mm(Daicel)，40℃，流速1.0ml/分鐘，0.0-1.0分鐘97.5％正己烷+2.5％異丙醇；于230nm(醇)和260nm(酮)在Rt 9.50(3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮)，Rt 16.60分鐘(R-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇)和Rt 18.30分鐘(S-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇)下測定。
b)新近分離多種乳桿菌如下將短乳桿菌菌株Lu10288、10290和10291分離。
b1)使用的培養(yǎng)基Kleymann′s培養(yǎng)基將下面物質(zhì)溶于915ml的10g/l胰蛋白胨(Difco-Becton Dickinson)7g/l酵母提取物(Difco-Becton Dickinson)2g/l牛肉膏(Difco-Becton Dickinson)5g/l果糖2g/l麥芽糖3.6g/l葡糖酸50％1.9g/l檸檬酸*H2O5g/l乙酸鹽1g/l吐溫800.2g/l MgSO4*7H2O0.05g/l MnSO40.01g/l FeSO40.4g/l L-半胱氨酸1.25ml NH4OH(25％)對于瓊脂板加入2％Bacto Agar(Difco-Becton Dickinson)將溶液pH調(diào)節(jié)為5.4。
將溶液于120℃高壓滅菌15分鐘。
高壓滅菌后，加入50ml無菌葡萄糖溶液(5g，用H2O補足至50ml)和40ml乙醇攪拌下加入并灌瓊脂板。
KMB培養(yǎng)基10g/l胰蛋白胨(Difco-Becton Dickinson)7g/l酵母提取物(Difco-Becton Dickinson)2g/l KH2PO41g/l吐溫80
0.5g/l MgSO4*7H2O1g/l MnSO420g/l CaCO310g/l葡萄糖用1.5％瓊脂制備瓊脂板。
將溶液于120℃高壓滅菌15’。
將葡萄糖和CaCO3(Riedel de Haen)溶解并分別高壓滅菌，在倒入平板之前與瓊脂混合。
b2)分離微生物將來自德國北部地區(qū)(LUFA-Oldenburg)的5-10g玉米青貯飼料于37℃在50ml三角瓶中用20ml鹽水過夜厭氧孵育。將得到的液體部分以1∶100的比率接種到50ml Kleymann培養(yǎng)基而且將后者于RT下厭氧孵育24小時同時進行輕微攪拌。之后，將細胞懸浮物接種至所述Kleymann選擇瓊脂板。將平板于37℃厭氧孵育48-72小時并通過將在KMB培養(yǎng)基上反復劃線培養(yǎng)分離所得菌落。
通過測定含有20g果糖/L(24小時，37℃，50轉(zhuǎn)/分鐘)的液態(tài)KMB培養(yǎng)基中的酸發(fā)酵模式(測定pH值并通過HPLC分析培養(yǎng)上清液的葡萄糖、果糖、乳酸鹽、乙酸鹽和乙醇的濃度)表征菌株。通過分析16sRNA來分離及系統(tǒng)地表征形成乙酸鹽和乳酸鹽的異型發(fā)酵菌株。
c)篩選結(jié)果表1、2和3顯示菌株和/或轉(zhuǎn)化及ee值的實例。
表1
表2轉(zhuǎn)化
n.d.未確定基于形成的3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-醇(nM)的轉(zhuǎn)化表3包括ee值測定的反復試驗
實施例5純化來自短乳桿菌的脫氫酶制備下面的培養(yǎng)基用于發(fā)酵短乳桿菌Lu10288
從MRS瓊脂板接種2個預培養(yǎng)物，將預培養(yǎng)物于37℃和200轉(zhuǎn)/分鐘孵育17小時并將其加入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵于37℃、0.1巴內(nèi)壓和pH 5.8時開始，通氣速率為1升/分鐘和100轉(zhuǎn)/分鐘(無pO2調(diào)節(jié))，在23小時后OD600為14.8時終止。
與實施例4a)類似，使用MES pH 6.0中的靜息細胞測定經(jīng)洗滌的細胞樣品的活性。
如下純化Lu10288脫氫酶勻漿使用100ml MES緩沖液，1mM MgCl2，pH 7.1將100g Lu10288(短乳桿菌)的潮濕生物量以5×20g份重懸浮，并使用玻璃珠(直徑為0.1mm-0.2mm，50ml重懸浮細胞對50ml玻璃珠)將生物量以10份于4000轉(zhuǎn)/分鐘下在球磨機中勻漿20分鐘同時用冰塊冷卻。通過G2玻璃抽濾器將玻璃珠分離并用20ml緩沖液洗滌。隨后將收集到的勻漿(610ml)于12000轉(zhuǎn)/分鐘在GSA轉(zhuǎn)子中澄清20分鐘。
a)Q-Sepharose離子交換層析將直徑是5cm體積為400ml的Q-Sepharose fast flow(Pharmacia)柱在20mM MES緩沖液，1mM MgCl2，pH 6.8中平衡。用11片Complete(蛋白酶抑制劑混合物，Roche，Complete，無EDTA；目錄號1873580)處理610ml勻漿并以10ml/分鐘的上樣速率上樣至Q-Sepharose柱上。在280nm檢測。隨后用三個柱體積的相同緩沖液洗滌Q-Sepharose柱。使用20mM MES、1mM MgCl2、1M NaCl，pH 6.8(100分鐘內(nèi)從0％NaCl-100％NaCl)的線性梯度洗脫。收集并測試10ml級分。在HPLC檢測中級分42-62對3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-酮有活性。
b)Superdex分子篩層析將直徑是2.6cm且體積為240ml的Superdex 200分子篩柱(Pharmacia)用20mM MES，1mM MgCl2，每升緩沖液一片Complete(無EDTA)，pH 7.1平衡。將來自Q-Sepharose的有用的級分合并(240ml)并通過緩慢加入124g硫酸銨將其調(diào)整到80％飽和度。pH保持為7.1。將溶液于4℃攪拌10分鐘并隨后于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘。將所得沉淀物在5ml平衡緩沖液中重懸浮并將該懸浮液于4攝氏度透析1小時(10kDa排阻體積)。將經(jīng)透析的溶液分成兩個9ml并以每分鐘4ml的流速上樣至分子篩柱。收集到4ml級分并測試。級分48-56再次對兩種底物有活性。
c)Mono-Q離子交換層析將體積為20ml的制備Mono-Q HR柱(Pharmacia)用20mM MES，1mM MgCl2，pH 7.1平衡。以每分鐘4ml的流速將來自Superdex的70ml合并的有用級分上樣。Mono-Q HR柱洗滌后，在100分鐘內(nèi)用直到100％20mM MES，1mM MgCl2，0.5M NaCl，pH7.1的線性梯度處理。收集到4ml的級分。合并活性級分(級分36至41)。
d)Mono-P離子交換層析將Mono-P柱(Pharmacia，4ml)用20mM MOPS、1mM MgCl2，pH7.1平衡。以0.75ml/分鐘的流速將21ml來自Mono-Q的有用級分上樣。洗滌降至基線后，在100分鐘內(nèi)應(yīng)用直到100％的20mM MOPS，1mMMgCl2，0.5M NaCl，pH7.1的線性梯度處理。收集級分(0.75ml)。將活性級分(34-39)合并。
凝膠中的活性染色用同體積的Novex“native Tris-glycine”樣品緩沖液(Novex)稀釋樣品。將Anamed公司的tris-甘氨酸凝膠(無SDS，1mm厚，10個樣品孔)安裝在電泳槽(running chamber)內(nèi)。將Invitrogen公司的“Tris-glycine native”電泳緩沖液(Invitrogen)稀釋后用作電泳緩沖液。將樣品孔上樣并于200V和約50mA開始膠凝電泳。電泳的持續(xù)時間約1.5小時。將電泳槽置于冰水中。移出凝膠后，將其置于玻璃盤中并在50mM MES，8mM MgCl2，pH 6.2中洗滌并孵育。
然后將0.35mM NADP和0.35mM NAD、19.6mg NB-四唑和2.1mg吩嗪硫酸乙酯(PES)加入該溶液中的這種凝膠中。然后加入底物(3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇)得到1mM的終濃度。將凝膠保持在黑暗中直到它們變得染色。典型的凝膠在圖1中顯示。
LU10288脫氫酶的分離總結(jié)
UP有用的峰級分*對新鮮樣品測定的活性**保存后測定的活性SDS-PAGE和凝膠印跡后通過Edman測序法測定以這種方式純化的脫氫酶的N端(SEQ ID NO1)。
實施例6純化木蘭假絲酵母脫氫酶為了發(fā)酵木蘭假絲酵母Lu8742，將兩個預培物在含有8g酵母提取物(65％)/l、5g蛋白胨/l、3.5g葡萄糖/l、5g KH2PO4/l、2g MgSO4*7H2O/l，pH 6.0的150ml培養(yǎng)基中在28℃和以200轉(zhuǎn)/分鐘生長15小時，并用于接種13.2l含有10.7g葡萄糖/l和4ml tegosipon的類似培養(yǎng)基。發(fā)酵于28℃、0.1巴內(nèi)壓和pH 6.0開始，通氣速率是5l/分鐘和500轉(zhuǎn)/分鐘(將pO2調(diào)節(jié)至＞20％)并且26小時后當OD600為15.1時終止發(fā)酵。
勻漿將收獲的細胞(378g濕潤生物量)懸浮于含有10片Roche Complete(無EDTA)蛋白酶抑制劑(約9×濃縮)的1升50mM MES+1mM MgCl2，pH 6.5中并將細胞在Z04微流化器(Microfluidizer)中以1000巴破裂兩次。離心后(20分鐘/10000g)，將一半的澄清上清液(1.3升勻漿物)如下面所述純化。純化中，于30℃在50mM MES，pH 6.0，0.2mM NaDH/NaDPH，100mM葡萄糖，50μl GDH/ml和10mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-酮中測定經(jīng)過適當稀釋的樣品級分的活性。
Q-Sepharose離子交換層析將直徑是5cm體積為400ml的Q-Sepharose fast flow(Pharmacia)柱用20mM MES緩沖液、1mM MgCl2，pH 6.8平衡。用11片Complete(蛋白酶抑制劑混合物)處理650ml勻漿并以7.5ml/分鐘的上樣速率上樣至Q-Sepharose柱。在280nm下檢測。隨后用700ml相同的緩沖液洗滌Q-Sepharose柱。為了洗脫，應(yīng)用20mM MES，1mM MgCl2，0.75M NaCl，pH 6.8(100分鐘內(nèi)從0％NaCl至100％NaCl)的線性梯度，之后用200ml20mM MES，1mM MgCl2，0.75M NaCl，pH 6.8洗滌Q-Sepharose柱。收集并檢測10ml級分。在HPLC檢測中級分56-96對3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-酮有活性。
硫酸銨沉淀將41ml來自Q-Sepharose的有用峰級分用(NH4)2SO4(pH 6.2)達到90％飽和度后，于4℃攪拌30分鐘并隨后于10000g離心10分鐘。將產(chǎn)生的沉淀物懸浮于10ml 20mM MES，1mM MgCl2，1Roche Complete(無EDTA)片/l，pH 6.2中并在Pierce Slide-A-Lyzer(10kDa排阻體積)中對20mM MES、1mM MgCl2、1Roche Complete(無EDTA)片/l，pH 6.2透析該懸浮液30分鐘。
Superdex分子過濾層析將直徑是2.6cm且體積為240ml的Superdex 200分子篩柱(Pharmacia)用20mM MES，1mM MgCl2，每升緩沖液一片Complete(無EDTA)，pH 6.2平衡。將來自硫酸銨沉淀的透析液(2×7ml)以每分鐘4ml的流速上樣至分子篩柱。收集并檢測4ml級分。級分21-24再次對兩種底物都有活性。
Mono-Q離子交換層析將體積為1ml的Mono-Q HR5/5柱(來自Pharmacia公司)用20mMMES，1mM MgCl2，pH6.8平衡。以每分鐘1ml的流速將來自Superdex柱的10ml合并的有用級分上樣。柱洗滌后，100分鐘內(nèi)用直到100％的20mM MES，1mM MgCl2，0.75M NaCl，pH 6.8的線性梯度處理。收集到1ml級分(226nm檢測)。合并活性級分(級分24-27)。
分離結(jié)果總結(jié)于下表
*(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇AS pptn硫酸銨沉淀UP有用的峰級分SDS-PAGE和凝膠印跡后通過Edman測序法測定以這種方式純化的脫氫酶的N端(SEQ ID NO2)。
實施例7通過用短乳桿菌脫氫酶還原制備(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇I-S將短乳桿菌Lu10288如實施例4中描述的生長和收獲。將靜息細胞(10-100g/l生物量)用0.2-2mM NAD(P)+、來自實施例1(分批式或補料分批)的1-100g丙酮和18g葡萄糖/l處理并將細胞于30℃孵育2-8小時。該反應(yīng)通過用0.5M NaOH滴定保持在pH 6.0-7.0并用HPLC分析監(jiān)控。圖2A和B分別顯示對應(yīng)混合液1和2的典型的反應(yīng)序列。
混合物19ml Lu10288細胞懸浮液(包含200g MBM/l)
3ml 1M葡萄糖溶液3ml 20mM NADP溶液0.9ml GDH溶液(12-15U/μl)3ml 1M NaCl溶液11.1ml水+10mM酮(來自實施例1)1小時后再加入10mM酮。
混合物29ml Lu10288細胞懸浮液(200g MBM/l)3ml 1M葡萄糖溶液3ml 2mM NADP溶液3ml 2mM NAD溶液0.9ml GDH溶液(12-15U/μl)3ml 1M NaCl溶液11.1ml水+10mM酮(0.6ml溶于甲醇中的0.5M來自實施例1的酮)每種情況中，45、110、180和300分鐘后再加入10mM酮。
隨后，通過離心和/或過濾將生物量除去。NMR分析MTBE提取物得到60-70％含量的3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-醇。每種情況中未反應(yīng)的3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-酮和副產(chǎn)物1-噻吩-2-基丙烯-1-酮的含量少于10％。僅可能測定痕量的1-噻吩-2-基-丙烯-1-醇。
隨后將1.1g 40％含水甲胺溶液加至無細胞含水混合物中。隨后將后者在內(nèi)壓下于60℃攪拌6小時?；旌衔镆呀?jīng)冷卻至室溫后，除去溶劑；隨后用甲苯消化殘渣并從中濾出。備選地，可以在氨基化反應(yīng)后進行細胞分離。將濾液干燥后，獲得202mg淡黃色固體形式的標題化合物。獲得對映體過量值ee為95％的S對映體。通過測定旋光量(c＝1，溶劑∶甲醇)并使用ShiftNMR(Shift試劑2，2，2-三氟-1-(9-蒽基)乙醇(+)(TFAE)；溶劑CDCl3；500MHz)來測定ee值。
實施例8從短乳桿菌Lu10288克隆脫氫酶a)進行原生質(zhì)化后從Lu10288制備染色體DNA(1)所需溶液溶液1∶0.41M蔗糖0.01M MgSO4*7H2O5ml/l M12培養(yǎng)基1∶210ml/l 10％KH2PO4pH 6.72.5mg/ml溶菌酶(臨用前加入)如下制備溶液1將14.03g蔗糖、0.25g MgSO4*7H2O、5ml M12(10倍濃縮)和1ml 10％KH2PO4，pH 6.7補足至100ml并通過過濾除菌。
蛋白酶來自Qiagen公司，20mg/ml貯存液RNA酶來自Qiagen公司，100mg/ml貯存液TE緩沖液10mM Tris*Cl pH 8，1mM EDTA pH 8(2)培養(yǎng)和破裂-于37℃和200轉(zhuǎn)/分鐘在250ml帶擋板的錐形瓶中的100ml MRS培養(yǎng)基(來自Difco)中培養(yǎng)過夜。
-離心細胞4000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘，4℃-丟棄上清液并將沉淀物吸收于5ml溶液1(+溶菌酶)并充分重懸浮。在培養(yǎng)箱(37℃)中孵育1-4小時。
-小心離心原生質(zhì)體3000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘-去除上清液，用10ml溶液1(無溶菌酶)洗滌沉淀物3000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃，8分鐘。
-丟棄上清液，用10ml 0.01M Tris-HCl，pH 8.0洗滌沉淀物3000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃，8分鐘。
-丟棄上清液，將沉淀物在4ml TE緩沖液中重懸浮。
-加入0.5ml10％SDS和0.5ml 5M NaCl，小心混合。
-加入1mg蛋白酶K(Qiagen蛋白酶20mg/ml，即50μl)并在培養(yǎng)箱中于37℃孵育過夜。
-用TE緩沖液補足混合物至20ml。
(3)萃取-按1∶1加入苯酚，即20ml苯酚+20ml混合物。小心混合并于4℃以4000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。
-移走上面的相并轉(zhuǎn)移至新的Falcon(20ml)中。
-加入20ml苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)。小心混合并于4℃以4000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。
-移走上面的相并轉(zhuǎn)移至新的Falcon(約18ml)中。
-加入18ml氯仿∶異戊醇(24∶1，即18ml氯仿+333μl異戊醇)。小心混合并于4℃以4000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。重復這一步驟直至上面的相澄清。
-用2體積乙醇(36ml)沉淀上面的相(18ml)。加入1/50 3M乙酸鈉(約360μl)。將沉淀置于-20℃至少30分鐘。之后，于4℃以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘。
-丟棄上清液，將沉淀物吸收于1-2ml TE緩沖液中。每毫升TE緩沖液加入20μg RNA酶。
孵育37℃水浴中1h。
(4)透析用RNA酶處理后，將混合物轉(zhuǎn)移至透析袋。在1.5L TE緩沖液中于4℃透析3次每次1小時。也可以將最后的透析步驟過夜進行。
-將透析的DNA轉(zhuǎn)移至Falcon管中并等分至幾個Eppendorff管(500μl)中。
-加入2體積的乙醇(1000μl)和1/3體積的2M LiCl(166μl)。
-于-20℃沉淀至少30分鐘。之后，于4℃以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘。
-小心地倒出上清液。
-用20ml 70％的乙醇洗滌沉淀物并于4℃以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。
-小心倒掉上清液，讓沉淀物在空氣中干燥并將DNA吸收于合適體積的10得到裝飾材料。肉眼觀察到該裝飾材料的導管部與實施例8制造的裝飾材料相比較，為缺乏銳度的形狀。
實施例9使導管油墨中的二氧化硅含量為20質(zhì)量％，除此以外與實施例8同樣進行，得到裝飾材料。肉眼觀察到該裝飾材料的導管部的光澤不太低，作為設(shè)計感未必足夠，但導管部為銳利的形狀。
實施例10將導管油墨中使用的版改變版深而制版，使油墨的轉(zhuǎn)移量不同，除此以外與實施例8同樣進行，得到裝飾材料。版深最深的部分為70μm，無階梯地調(diào)整版深，制成從沒有槽(cell)的部分到深度70μm的部分的層次版。與沒有槽的部分相對應(yīng)的部分的光澤為光澤值60，與版深30-40μm相對應(yīng)的部分的光澤，為光澤值30，與版深60-70μm相對應(yīng)的部分的光澤，為光澤值10，其之間光澤連續(xù)地無階梯地變化。通過使用該版，并使用本發(fā)明的導管油墨，可以得到更接近天然物的木紋色調(diào)的裝飾材料。
實施例11在電子射線固化性樹脂組合物中進一步加入煅燒高嶺土10質(zhì)量份(平均粒徑1.5μm)，除此以外與實施例1同樣進行，得到裝飾材料。對于該裝飾材料，對光澤、耐水性、隨時間經(jīng)過的剝離性、耐污染性及マ-リング性能進行評價。表3示出其結(jié)果。通過添加煅燒高嶺土，與實施例1得到的裝飾材料相比，マ-リング性進一步提高。
表3
1MSNRLDGKVA IVTGGTLGIG LAIATKFVEE GAKVMITGRH SDVGEKAAKS51VGTPDQIQFF QHDSSDEDGW TKLFDATEKA FGPVSTLVNN AGIAVNKSVE101ETTTAEWRKL LAVNLDGVFF GTRLGIQRMK NKGLGASIIN MSSIEGFVGD151PSLGAYNASK GAVRIMSKSA ALDCALKDYD VRVNTVHPGY IKTPLVDDLP201GAEEAMSQRT KTPMGHIGEP NDIAYICVYL ASNESKFATG SEFVVDGGYT251AQ*SEQ ID NO3Lu10288脫氫酶的核酸序列(及反義鏈)1ATGTCTAACC GTTTGGATGG AAAAGTAGCA ATCGTTACAG GTGGTACGTTTACAGATTGG CAAACCTACC TTTTCATCGT TAGCAATGTC CACCATGCAA51GGGTATCGGT TTAGCTATCG CCACGAAGTT CGTTGAAGAA GGGGCTAAGGCCCATAGCCA AATCGATAGC GGTGCTTCAA GCAACTTCTT CCCCGATTCC101TCATGATTAC CGGCCGGCAC AGCGATGTTG GTGAAAAAGC AGCTAAGAGTAGTACTAATG GCCGGCCGTG TCGCTACAAC CACTTTTTCG TCGATTCTCA151GTCGGCACTC CTGATCAGAT TCAATTTTTC CAACATGATT CTTCCGATGACAGCCGTGAG GACTAGTCTA AGTTAAAAAG GTTGTACTAA GAAGGCTACT201AGACGGCTGG ACGAAATTAT TCGATGCAAC GGAAAAAGCC TTTGGCCCAGTCTGCCGACC TGCTTTAATA AGCTACGTTG CCTTTTTCGG AAACCGGGTC251TTTCTACATT AGTTAATAAC GCTGGGATCG CGGTTAACAA GAGTGTCGAAAAAGATGTAA TCAATTATTG CGACCCTAGC GCCAATTGTT CTCACAGCTT301GAAACCACGA CTGCTGAATG GCGTAAACTA TTAGCCGTCA ACCTTGATGGCTTTGGTGCT GACGACTTAC CGCATTTGAT AATCGGCAGT TGGAACTACC351TGTCTTCTTC GGTACCCGAT TAGGGATTCA ACGGATGAAG AACAAAGGCTACAGAAGAAG CCATGGGCTA ATCCCTAAGT TGCCTACTTC TTGTTTCCGA401TAGGGGCTTC CATCATCAAC ATGTCTTCGA TCGAAGGCTT TGTGGGTGATATCCCCGAAG GTAGTAGTTG TACAGAAGCT AGCTTCCGAA ACACCCACTA451CCTAGCTTAG GGGCTTACAA CGCATCTAAA GGGGCCGTAC GGATTATGTCGGATCGAATC CCCGAATGTT GCGTAGATTT CCCCGGCATG CCTAATACAG501CAAGTCAGCT GCCTTAGATT GTGCCCTAAA GGACTACGAT GTTCGGGTAAGTTCAGTCGA CGGAATCTAA CACGGGATTT CCTGATGCTA CAAGCCCATT551ACACTGTTCA CCCTGGCTAC ATCAAGACAC CATTGGTTGA TGACCTACCATGTGACAAGT GGGACCGATG TAGTTCTGTG GTAACCAACT ACTGGATGGT601GGGGCCGAAG AAGCGATGTC ACAACGGACC AAGACGCCAA TGGGCCATATCCCCGGCTTC TTCGCTACAG TGTTGCCTGG TTCTGCGGTT ACCCGGTATA651CGGTGAACCT AACGATATTG CCTACATCTG TGTTTACTTG GCTTCTAACGGCCACTTGGA TTGCTATAAC GGATGTAGAC ACAAATGAAC CGAAGATTGC701AATCTAAATT TGCAACGGGT TCTGAATTTG TAGTTGACGG TGGCTACACTTTAGATTTAA ACGTTGCCCA AGACTTAAAC ATCAACTGCC ACCGATGTGA751GCTCAACGAGTT實施例9測定短乳桿菌Lu10288的重組脫氫酶的活性將質(zhì)粒pDHE10288adh1再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG10 pAgrO4pHSG575(TG10大腸桿菌TG1(Stratagene)的RhaA衍生物；pAgrO4Takeshita，S；Sato，M；Toba，M；Masahashi，W；Hashimoto-Gotoh，T(1978)Gene 61，63-74；pHSG575T.Tomoyasu等人(2001)，Mol.Microbiol.40(2)，397-413)。
每種情況中，將6株轉(zhuǎn)化體在(帶擋板的)100ml三角瓶中的20mlLBAmp/Spec/Cm(100μg Amp/l；50mg Spec/l；10μg Cm/l)、0.1mM IPTG、0.5g鼠李糖/l中于37℃下生長18小時，隨后于5000g離心10分鐘，用10mM Tris/HCl，pH7.0洗滌一次，并在2ml相同的緩沖液中重懸浮。將100μl細胞懸浮物在含有50μl葡萄糖DH/ml(實施例1)、100mM葡萄糖、100mMNaCl、1mM NADH、1mM NADPH和10mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-酮的900μl 50mM MES，pH 6中搖動下孵育20分鐘。與實施例4類似分析混合物。平均形成了0.13mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-醇，對應(yīng)于6.6U/l培養(yǎng)懸浮物的活性。在含有粗提物的類似測定樣品中，測定出0.21mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-醇對應(yīng)于10.7U/l的活性的樣品，通過在振動碾磨機(3×5分鐘，中間間隔在冰上冷卻)中使用0.7ml玻璃珠(d＝0.5mm)進行細胞破裂獲得所述粗提物。在培養(yǎng)過程未加入鼠李糖的對照實驗中不可能檢測到3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-醇。
實施例10從木蘭假絲酵母Lu8472克隆脫氫酶使用Edmann測序法再次測定N-端序列后，從實施例6中描述的蛋白質(zhì)純化中獲得下面的氨基酸序列(S，G或T)(T或P)TSNALVTGGSRGIGAA在肽的胰蛋白酶消化和Edmann測序后獲得下面另外的氨基酸序列IGVNSINPG考慮木蘭假絲酵母密碼子選擇，從肽推導出核酸序列(引物Mke366、367和374)，其如下使用用于通過PCR擴增從Lu8472染色體DNA(使用3倍濃縮的溶細胞酶溶液的Genomic DNA試劑盒，Qiagen，Hilden)克隆脫氫酶基因。
PCR
引物
將引物Mke366和Mke367以1∶1混合。根據(jù)標準Stratagene方案使用Pfu Turbo-聚合酶(Stratagene)和下面的溫度梯度程序?qū)嵤㏄CR95℃1分鐘；30次循環(huán)的95℃1分鐘，X℃145秒和72℃2分鐘；72℃10分鐘；10℃直到使用。使用瓊脂糖凝膠電泳(1.2％E-膠，Invitrogen)和層析柱(GFX-試劑盒，Amersham Pharmacia)將PCR產(chǎn)物(～0.5kb)分離并且隨后測序(測序引物Mke366和Mke374)。產(chǎn)生的序列在SEQ ID NO5中描述。從它推導的氨基酸序列(SEQ ID NO6)顯示與木蘭假絲酵母碳酰還原酶(WO200140450)有53％的同一性。蛋白質(zhì)純化后測定的肽序列僅存在小的分歧。差別可能是由于測序誤差或是由于木蘭假絲酵母Lu8742中存在一些同工酶。
SEQ ID NO6 Lu8742脫氫酶的部分氨基酸序列1NALVTGGSRG IGEATAIKLA EEGYSVTIAS RGLKQLEAVK AKLPIVKQGQ51VHHVWQLDLS DVDAAAAFKG SPLPASRYDV LVSNAGVAQF SPFIEHAKQD101WSQMLAINLA APIALAQTFA KAIGDKPRNT PAHIVFVSSN VSLRGFPNIG151VNSITPGSEQ ID NO5 Lu8742脫氫酶的部分核酸序列(及反義鏈)
1AACGCGCTGG TGACGGGCGG CAGCCGCGGC ATTGGCGAAG CCACTGCCATTTGCGCGACC ACTGCCCGCC GTCGGCGCCG TAACCGCTTC GGTGACGGTA51TAAGCTCGCC GAGGAGGGCT ACAGCGTCAC GATTGCGTCT CGCGGCCTTAATTCGAGCGG CTCCTCCCGA TGTCGCAGTG CTAACGCAGA GCGCCGGAAT101AGCAGCTCGA GGCTGTGAAG GCCAAACTAC CCATTGTGAA GCAGGGACAGTCGTCGAGCT CCGACACTTC CGGTTTGATG GGTAACACTT CGTCCCTGTC151GTTCACCACG TGTGGCAGCT TGATCTCAGT GATGTCGACG CTGCGGCCGCCAAGTGGTGC ACACCGTCGA ACTAGAGTCA CTACAGCTGC GACGCCGGCG201CTTCAAAGGG TCGCCGCTAC CTGCCAGCCG CTACGACGTG CTCGTCAGCAGAAGTTTCCC AGCGGCGATG GACGGTCGGC GATGCTGCAC GAGCAGTCGT251ATGCTGGCGT GGCCCAGTTT AGCCCGTTCA TCGAGCATGC GAAGCAGGACTACGACCGCA CCGGGTCAAA TCGGGCAAGT AGCTCGTACG CTTCGTCCTG301TGGTCGCAGA TGCTTGCCAT CAATCTGGCG GCACCCATTG CGCTGGCCCAACCAGCGTCT ACGAACGGTA GTTAGACCGC CGTGGGTAAC GCGACCGGGT351GACATTTGCT AAGGCCATTG GCGACAAGCC GCGCAACACA CCGGCCCACACTGTAAACGA TTCCGGTAAC CGCTGTTCGG CGCGTTGTGT GGCCGGGTGT401TTGTGTTTGT CTCGTCGAAC GTCTCGTTGC GAGGCTTCCC GAACATCGGCAACACAAACA GAGCAGCTTG CAGAGCAACG CTCCGAAGGG CTTGTAGCCG451GTCAACTCCA TCACCCCCGG CACAGTTGAGGT AGTGGGGGCC GT112個測定樣品在不同的退火溫度下進行，即從25℃-45℃(每種情況Delta約2℃)。在所有的測定樣品中，形成作為主要產(chǎn)物的相似濃度的0.5kb帶。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>產(chǎn)生3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的方法<130>M/44142<160>6<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>47<212>PRT<213>短乳桿菌<400>1Met Ser Asn Arg Leu Asp Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr1 5 10 15Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Thr Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala20 25 30
Lys Val Met Ile Thr Gly Arg His Ser Asp Val Gly Glu Lys Ala35 40 45<210>2<211>18<212>PRT<213>木蘭假絲酵母<400>2Ser Asn Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Arg Val Ile Gly Ala Gly Gly1 5 10 15Phe Ile<210>3<211>756<212>DNA<213>短乳桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(756)<223>
<400>3atg tct aac cgt ttg gat gga aaa gta gca atc gtt aca ggt ggt acg 48Met Ser Asn Arg Leu Asp Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr1 5 10 15ttg ggt atc ggt tta gct atc gcc acg aag ttc gtt gaa gaa ggg gct 96Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Thr Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala20 25 30aag gtc atg att acc ggc cgg cac agc gat gtt ggt gaa aaa gca gct144Lys Val Met Ile Thr Gly Arg His Ser Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala35 40 45aag agt gtc ggc act cct gat cag att caa ttt ttc caa cat gat tct192Lys Ser Val Gly Thr Pro Asp Gln Ile Gln Phe Phe Gln His Asp Ser50 55 60tcc gat gaa gac ggc tgg acg aaa tta ttc gat gca acg gaa aaa gcc240Ser Asp Glu Asp Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Ala Thr Glu Lys Ala65 70 75 80ttt ggc cca gtt tct aca tta gtt aat aac gct ggg atc gcg gtt aac288Phe Gly Pro Val Ser Thr Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Asn85 90 95aag agt gtc gaa gaa acc acg act gct gaa tgg cgt aaa cta tta gcc336Lys Ser Val Glu Glu Thr Thr Thr Ala Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ala100 105 110gtc aac ctt gat ggt gtc ttc ttc ggt acc cga tta ggg att caa cgg384Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg115 120 125atg aag aac aaa ggc tta ggg gct tcc atc atc aac atg tct tcg atc432Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile130 135 140gaa ggc ttt gtg ggt gat cct agc tta ggg gct tac aac gca tct aaa480Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Ser Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys145 150 155 160ggg gcc gta cgg att atg tcc aag tca gct gcc tta gat tgt gcc cta528Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu
165 170 175aag gac tac gat gtt cgg gta aac act gtt cac cct ggc tac atc aag576Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys180 185 190aca cca ttg gtt gat gac cta cca ggg gcc gaa gaa gcg atg tca caa624Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Pro Gly Ala Glu Glu Ala Met Ser Gln195 200 205cgg acc aag acg cca atg ggc cat atc ggt gaa cct aac gat att gcc672Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala210 215 220tac atc tgt gtt tac ttg gct tct aac gaa tct aaa ttt gca acg ggt720Tyr Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asn Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly225 230 235 240tct gaa ttt gta gtt gac ggt ggc tac act gct caa756Ser Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln245 250<210>4<211>252<212>PRT<213>短乳桿菌<400>4Met Ser Asn Arg Leu Asp Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr1 5 10 15Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Thr Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala20 25 30Lys Val Met Ile Thr Gly Arg His Ser Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala
35 40 45Lys Ser Val Gly Thr Pro Asp Gln Ile Gln Phe Phe Gln His Asp Ser50 55 60Ser Asp Glu Asp Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Ala Thr Glu Lys Ala65 70 75 80Phe Gly Pro Val Ser Thr Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Asn85 90 95Lys Ser Val Glu Glu Thr Thr Thr Ala Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ala100 105 110Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg115 120 125Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile130 135 140Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Ser Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys145 150 155 160Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu165 170 175Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys180 185 190Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Pro Gly Ala Glu Glu Ala Met Ser Gln195 200 205Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala
210 215 220Tyr Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asn Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly225 230 235 240Ser Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln245 250<210>5<211>472<212>DNA<213>木蘭假絲酵母<220>
<221>CDS<222>(1)..(471)<223>
<400>5aac gcg ctg gtg acg ggc ggc agc cgc ggc att ggc gaa gcc act gcc 48Asn Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly 6lu Ala Thr Ala1 5 10 15att aag ctc gcc gag gag ggc tac agc gtc acg att gcg tct cgc ggc 96Ile Lys Leu Ala Glu Glu 6ly Tyr Ser Val Thr Ile Ala Ser Arg 6ly20 25 30ctt aag cag ctc gag gct gtg aag gcc aaa cta ccc att gtg aag cag144Leu Lys Gln Leu Glu Ala Val Lys Ala Lys Leu Pro Ile Val Lys Gln35 40 45
gga cag gtt cac cac gtg tgg cag ctt gat ctc agt gat gtc gac gct192Gly Gln Val His His Val Trp Gln Leu Asp Leu Ser Asp Val Asp Ala50 55 60gcg gcc gcc ttc aaa ggg tcg ccg cta cct gcc agc cgc tac gac gtg240Ala Ala Ala Phe Lys Gly Ser Pro Leu Pro Ala Ser Arg Tyr Asp Val65 70 75 80ctc gtc agc aat gct ggc gtg gcc cag ttt agc ccg ttc atc gag cat288Leu Val Ser Asn Ala Gly Val Ala Gln Phe Ser Pro Phe Ile Glu His85 90 95gcg aag cag gac tgg tcg cag atg ctt gcc atc aat ctg gcg gca ccc336Ala Lys Gln Asp Trp Ser Gln Met Leu Ala Ile Asn Leu Ala Ala Pro100 105 110att gcg ctg gcc cag aca ttt gct aag gcc att ggc gac aag ccg cgc384lle Ala Leu Ala Gln Thr Phe Ala Lys Ala Ile Gly Asp Lys Pro Arg115 120 125aac aca ccg gcc cac att gtg ttt gtc tcg tcg aac gtc tcg ttg cga432Asn Thr Pro Ala His Ile Val Phe Val Ser Ser Asn Val Ser Leu Arg130 135 140ggc ttc ccg aac atc ggc gtc aac tcc atc acc ccc ggc a 472Gly Phe Pro Asn Ile Gly Val Asn Ser Ile Thr Pro Gly145 150 155<210>6<211>157<212>PRT<213>木蘭假絲酵母<400>6Asn Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly Glu Ala Thr Ala1 5 10 15
Ile Lys Leu Ala Glu Glu Gly Tyr Ser Val Thr Ile Ala Ser Arg Gly20 25 30Leu Lys Gln Leu Glu Ala Val Lys Ala Lys Leu Pro Ile Val Lys Gln35 40 45Gly Gln Val His His Val Trp Gln Leu Asp Leu Ser Asp Val Asp Ala50 55 60Ala Ala Ala Phe Lys Gly Ser Pro Leu Pro Ala Ser Arg Tyr Asp Val65 70 75 80Leu Val Ser Asn Ala Gly Val Ala Gln Phe Ser Pro Phe Ile Glu His85 90 95Ala Lys Gln Asp Trp Ser Gln Met Leu Ala Ile Asn Leu Ala Ala Pro100 105 110Ile Ala Leu Ala Gln Thr Phe Ala Lys Ala Ile Gly Asp Lys Pro Arg115 120 125Asn Thr Pro Ala His Ile Val Phe Val Ser Ser Asn Val Ser Leu Arg130 135 140Gly Phe Pro Asn Ile Gly Val Asn Ser Ile Thr Pro Gly145 150 15權(quán)利要求
1.制備式I 的3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的方法，其中a)在路易斯酸存在下，噻吩與β-鹵代丙酰基鹵或丙烯?；u反應(yīng)得到3-鹵代-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮，在反應(yīng)發(fā)生同時或之后，但是在分離反應(yīng)產(chǎn)物之前通入鹵化氫，和b)將在a)步驟中獲得的丙酮還原并然后，適宜時不分離反應(yīng)產(chǎn)物而直接與甲胺反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1中要求保護的方法，其中步驟a)中使用的路易斯酸是三氯化鋁。
3.如前面權(quán)利要求之一要求保護的方法，其中步驟a)中的反應(yīng)在作為溶劑的鹵化烴中進行。
4.如前面權(quán)利要求之一要求保護的方法，其中在作為還原劑的過渡金屬催化劑存在下，使用金屬氫化物或半金屬氫化物或使用氫進行步驟b)中的還原。
5.如前面權(quán)利要求之一要求保護的方法，其用于制備式I-S 的(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇，適宜時，與它的R對映體I-R一起的混合物，式I-S的丙醇在該混合物中占優(yōu)勢，其中在手性還原劑或者手性催化劑存在下進行步驟b)中的還原，所述手性還原劑或者手性催化劑顯示出對于(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇形成的選擇性。
6.如權(quán)利要求5中要求保護的方法，其中在不對稱過渡金屬催化劑存在時，用于步驟b)中的還原劑是不對稱金屬氫化物或半金屬氫化物或氫，或其中在介導不對稱誘導的化合物存在下進行所述還原。
7.如權(quán)利要求5中要求保護的方法，其中在脫氫酶(E.C.1.1.x.x)存在下進行步驟b)中的還原。
8.如權(quán)利要求7中要求保護的方法，其中在脫氫酶(E.C.1.1.1.x)存在下，尤其醇脫氫酶(E.C.1.1.1.1或E.C.1.1.1.2)存在下進行所述還原。
9.如權(quán)利要求7或8中要求保護的方法，其中脫氫酶選自來自地霉屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬或酵母屬的酵母的脫氫酶和來自假單胞菌屬、伯克霍爾德菌屬、土壤桿菌屬、紅球菌屬或乳桿菌屬的細菌的脫氫酶。
10.如權(quán)利要求9中要求保護的方法，其中脫氫酶選自來自白地霉、木蘭假絲酵母和短乳桿菌的脫氫酶。
11.醇脫氫酶和來源于它的功能等價的醇脫氫酶，其中所述醇脫氫酶的氨基酸序列在其N端區(qū)包含a)如SEQ ID NO1中描述的至少10個連續(xù)氨基酸殘基的組成型氨基酸序列，其中對應(yīng)SEQ ID NO1中描述的氨基酸位置12的位置優(yōu)選額外地代表纈氨酸；或b)如SEQ ID NO2中描述的至少10個連續(xù)氨基酸殘基的組成型氨基酸序列；
12.如權(quán)利要求11中要求保護的醇脫氫酶，所述醇脫氫酶能將3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮還原成(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇。
13.如權(quán)利要求12中要求保護的醇脫氫酶，所述醇脫氫酶以至少85％ ee(NADH和/或NADPH存在下；在30℃和pH 6.0)的對映體純度催化還原。
14.如權(quán)利要求11至13之一要求保護的醇脫氫酶和來源于它的功能等價的醇脫氫酶，所述醇脫氫酶由包含SEQ ID NO3的核酸序列編碼或所述醇脫氫酶包含如SEQ ID NO4中描述的氨基酸序列或至少如圖3中描述的組成型序列，并且可以優(yōu)選地從短乳桿菌獲得。
15.如權(quán)利要求11至13之一要求保護的醇脫氫酶和來源于它的功能等價的醇脫氫酶，所述醇脫氫酶由包含SEQ ID NO5的核酸序列編碼或具有包含SEQ ID NO6的氨基酸序列，并且可以優(yōu)選地從木蘭假絲酵母(ATCC 12573)獲得。
16.核酸序列和來源于它的衍生物，所述核酸序列包含如權(quán)利要求11至15之一要求保護的脫氫酶的編碼序列，尤其如SEQ ID NO3和5中描述的核酸序列。
17.表達盒，其包含與至少一種調(diào)節(jié)核酸序列有效連接的如權(quán)利要求15中要求保護的核酸序列。
18.重組載體，其包含至少一種如權(quán)利要求16中要求保護的表達盒。
19.原核或真核宿主，其用至少一種如權(quán)利要求17中要求保護的載體轉(zhuǎn)化。
20.如權(quán)利要求11至14之一中要求保護的脫氫酶，或產(chǎn)生該脫氫酶的天然或重組微生物的用途，用于制備(S)-3-鹵代-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇。
21.如權(quán)利要求7至10之一中要求保護的方法，其中使用的脫氫酶是如權(quán)利要求11到14之一中要求保護的醇脫氫酶或者產(chǎn)生該脫氫酶的天然或重組微生物。
22.制備式I-S的(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的方法，其中將3-鹵代-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮對映體選擇性地還原，其中在脫氫酶存在下實現(xiàn)所述還原。
23.如權(quán)利要求21中要求保護的方法，其中還原中獲得的(S)-3-鹵代-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇不經(jīng)分離就與甲胺反應(yīng)。
24.如權(quán)利要求21或22中要求保護的方法，其中脫氫酶選自來自地霉屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬或酵母屬的酵母和來自假單胞菌屬、伯克霍爾德菌屬、土壤桿菌屬、紅球菌屬或乳桿菌屬的細菌的脫氫酶。
25.如權(quán)利要求23中要求保護的方法，其中脫氫酶選自來自白地霉、木蘭假絲酵母或短乳桿菌的脫氫酶。
26.如權(quán)利要求21中要求保護的方法，其中脫氫酶選自如權(quán)利要求11至15之一中要求保護的醇脫氫酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備3－甲基氨基－1－(噻吩－2－基)丙－1－醇的酶促和非酶促方法；還涉及實現(xiàn)這些方法的酶；并涉及編碼這些酶的核酸序列，涉及含有這些核酸序列的表達盒，還涉及載體和重組宿主。
文檔編號C12N15/53GK1860110SQ200480028108
公開日2006年11月8日 申請日期2004年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月1日
發(fā)明者R·施蒂默爾, M·凱塞勒, B·豪爾, T·弗里德里希, M·布羅伊爾 申請人:巴斯福股份公司