專利名稱：重組微生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可用于生產(chǎn)有用蛋白質或多肽的重組微生物，以及涉及該蛋白質和多肽。
背景技術：
微生物廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)大量有用物質，包括酒精飲料、例如味噌和醬油之類的某些類型的食品、氨基酸、有機酸、核酸相關物質、抗生素、糖、脂質和蛋白質。這些物質還發(fā)現(xiàn)具有多種用途，包括食品、醫(yī)藥品、洗滌劑、例如化妝品之類的日用品和各種化工原料。
在利用微生物工業(yè)生產(chǎn)有用物質時，生產(chǎn)率的提高是一個主要關注點，因此一種方法是通過誘變或其它基因手段進行微生物育種。最近，特別是隨著微生物遺傳學和生物技術的進步，通過基因重組技術進行更有效的有用微生物育種，并與其相關地是正在開發(fā)用于獲得重組基因的宿主微生物。例如，已經(jīng)進一步改進了枯草桿菌Marburg No.168，其作為宿主微生物已經(jīng)被證實是安全且具有優(yōu)異特性的。
然而，微生物本身擁有各種基因使其能夠應對自然界中的環(huán)境變化，因此，它們在只采用有限的生產(chǎn)媒介的工業(yè)生產(chǎn)中不一定表現(xiàn)出蛋白質和類似物質的高生產(chǎn)效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種重組微生物，其通過將編碼異性蛋白質或多肽的基因轉移到枯草桿菌基因comA、yopO、treR、yvbA、cspB、yvaN、yttP、yurK、yozA、licR、sigL、mntR、glcT、yvdE、ykvE、slr、rocR、ccpA、yaaT、yyaA、yycH、yacP、hprK、rsiX、yhdK以及ylbO的任意一種或一個或多個與這些基因的任意一種功能相當?shù)幕蛉笔Щ虮惶蕹奈⑸锏耐蛔冎晟隙苽洹?br>

圖1示意性地顯示了通過SOE-PCR(SOE重疊延伸拼接法)(參見Gene，77，61(1989))缺失基因以制備DNA片段的方法，和使用該DNA缺失目標基因的方法(用抗藥性基因取代目標基因)。
具體實施例方式
本發(fā)明針對一種通過將編碼蛋白質或多肽的基因轉移到能夠以提高的生產(chǎn)率生產(chǎn)蛋白質或多肽的宿主微生物上而獲得的重組微生物，以及針對使用該重組微生物生產(chǎn)蛋白質或多肽的方法。
本發(fā)明人在微生物基因組上編碼的許多不同基因中對有用蛋白質或多肽的生產(chǎn)中不需要或有害的基因進行了廣泛的研究，并發(fā)現(xiàn)，當特異性基因從微生物的基因組中缺失或剔除之后，編碼目標蛋白質或多肽的基因轉移到例如枯草桿菌之類的微生物上，與缺失或剔除之前的情況相比，目標蛋白質或多肽的生產(chǎn)率提高。
在本發(fā)明的微生物中，由于缺失或剔除了對目標蛋白質或多肽的生產(chǎn)不必要或有害的基因，因此包括能量損耗、副產(chǎn)物生成和單位生產(chǎn)率降低在內(nèi)的培養(yǎng)基的浪費顯著減少，并且此外，蛋白質和多肽可以持續(xù)生產(chǎn)，從而高效地生產(chǎn)目標產(chǎn)物。
在本發(fā)明中，氨基酸序列之間的同源性和核酸序列之間的同源性都使用Lipman-Pearson法(Science，227，1435(1985))測定。具體而言，將ktup參數(shù)(相匹配的單元大小)設定為2，使用Genetyx-Win(Software Development Co.，Ltd.)的遺傳信息處理軟件開發(fā)的同源性分析程序(Search Homology)進行計算。
對構成本發(fā)明的微生物的母體微生物沒有特別的限制，只要其含有對于目標蛋白質或多肽的生產(chǎn)不是必需的基因。具體而言，可以使用如表1所示的任何枯草桿菌基因或與其功能相當?shù)幕颍渲谢蚩梢允且吧突蛲蛔凅w。具體例子包括枯草桿菌和屬于芽孢桿菌屬的類似微生物、屬于梭狀芽胞桿菌屬的微生物和酵母。其中，優(yōu)選屬于芽孢桿菌屬的微生物。特別是從已經(jīng)獲得該微生物的完全基因組信息、并由此確立了基因工程技術和基因組工程技術、并且該微生物具有細胞外分泌所得蛋白質的能力的角度考慮，優(yōu)選枯草桿菌。
使用本發(fā)明的微生物生產(chǎn)的目標蛋白質或多肽的例子包括酶、生理活性物質，和其它發(fā)現(xiàn)在食品、醫(yī)藥品、化妝品、洗滌劑、纖維處理劑、臨床化驗劑等有用的蛋白質和多肽。
以已知在基因組上含有4,106個基因的枯草桿菌為例，要被缺失或剔除的一個或多個基因是表1所示的任一枯草桿菌基因，或者選自與其功能相當?shù)幕?。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這些基因不會直接參與目標蛋白質或多肽的生產(chǎn)并且對于微生物在普通工業(yè)生產(chǎn)培養(yǎng)基中的生長不是必需的。
此處所含表中的各個基因的名稱、數(shù)量和功能與Nature，390，249-256(1997)中報道并由JAFAN(Japan Functional Analysis Networkfor Bacillus subtilis；BSORF DB)在互聯(lián)網(wǎng)上公開(http:∥bacillus.genome.ad.jp/，2003年6月17日更新)的枯草桿菌基因組數(shù)據(jù)相符。
表1


來源于其它微生物的基因，優(yōu)選來源于屬于芽胞桿菌屬的細菌的基因，其具有與表1所示的任一枯草桿菌相同的功能，或具有與表1所示任一基因的核苷酸序列70％或更高的同源性，優(yōu)選80％或更高的同源性，更優(yōu)選90％或更高，進一步優(yōu)選95％或更高，仍然更優(yōu)選98％或更高的同源性的，應該被認為與表1所示的基因功能相當，并因此構成根據(jù)本發(fā)明要缺失或剔除的基因。在這一方面，使用Lipman-Pearson法(Science，227，1435，1985)用計算機計算核苷酸的同源性。
表1所示的編碼枯草桿菌的多種基因是參與各種基因表達的活化或抑制的調(diào)節(jié)基因，或被推導成這種調(diào)節(jié)基因的基因。基于此發(fā)現(xiàn)實現(xiàn)了本發(fā)明；即，在本發(fā)明中揭示了對蛋白質或多肽的生產(chǎn)不必要或有害的調(diào)節(jié)基因的存在。
值得注意地是下列事實已經(jīng)引起了注意，即所列的許多“不必要”或“有害”基因是參與糖攝取或代謝的調(diào)節(jié)基因，以下列基因為例glcT基因，其對葡萄糖PTS攝取操縱子起到抗終止子的作用；LicT基因，其對地衣淀粉水解操縱子起到抗終止子的作用；treR基因，其起到海藻糖攝取和代謝的阻遏物的作用；和hprk基因和ccpA基因，其關系到葡萄糖分解代謝物的阻遏。
而且，除了參與糖攝取和代謝的調(diào)節(jié)基因外，可以缺失或剔除參與激活精氨酸同化的rocR基因、和感受態(tài)相關的comA基因和slr基因，它們也是調(diào)節(jié)基因，從而提高蛋白質或多肽的生產(chǎn)率。
表1所示的基因包括yhdK基因，以及編碼抑制ECFσ(sigma)因子表達的抗EC Fσ因子，即抗σx因子的rsiX基因。有報道yhdK參與了σM的抑制(Mol.Microbiol.，32，41，1999)。編碼σL的σ基因也包括在表1的基因中。這表明，在σX或σM調(diào)節(jié)下的基因表達有利于蛋白質生產(chǎn)，相反，在σL調(diào)節(jié)下的一些基因表達是不利的。
通過缺失或剔除一個或多個選自上述基因的基因，可以防止對蛋白質或多肽的生產(chǎn)不必要的或有害的表達，從而使該蛋白質或多肽生產(chǎn)中的生產(chǎn)率提高。
要缺失或剔除的基因數(shù)為一個或更多，優(yōu)選兩個或更多，更優(yōu)選三個或更多，甚至更優(yōu)選5個或更多。當構筑本發(fā)明的微生物時，可以缺失或失活上述基因以外的一個或多個基因。在這種情況下，預計會有更好的效果。另一種實現(xiàn)本發(fā)明的方法是通過將另一來源的DNA片段插入到目標基因中或在該基因的轉錄/轉譯起始區(qū)域引入突變體來使目標基因失活或剔除。然而，優(yōu)選物理缺失目標基因。
在缺失或剔除基因的示例性的方法中，根據(jù)之前提出的方案缺失或剔除表1所示的任一目標基因。或者，進行基因的隨機缺失或通過剔除進行突變，然后對蛋白質生產(chǎn)率進行評測并進行基因分析。
目標基因可以通過同源重組而缺失或剔除。也就是，用合適的質粒載體克隆含有部分目標基因的DNA片段從而獲得環(huán)形重組質粒，并將所得質粒轉移到母體微生物的細胞中。此后，通過在目標基因的部分區(qū)域中進行同源重組，使母體微生物基因組上的目標基因裂解，從而完成目標基因的失活?；蛘?，通過堿基的取代或插入來使目標基因剔除，或者通過PCR或類似方法構成含有目標基因序列外的區(qū)域但不含目標基因的線型DNA片段，并將由此制成的基因或片段轉移到母體微生物的細胞中。在母體微生物基因組的目標基因中突變點外部的兩個位點上，或在目標基因序列外的兩個區(qū)域上，發(fā)生雙交換同源重組，從而替換成基因組上的目標基因缺失或剔除的基因片段。
特別是當用于構筑本發(fā)明的微生物的母體微生物是枯草桿菌時，由于一些文獻已經(jīng)描述了缺失或剔除目標基因的方法(參見，例如，Mol.Gen.Genet.，223，268 1990)，可以根據(jù)這些方法的任何一種重復，從而生產(chǎn)本發(fā)明的宿主微生物。
基因隨機缺失或失活可以通過使用與上述通過使用隨機克隆的DNA片段誘發(fā)同源重組的方法類似的方法，或通過用γ射線或類似射線輻射母體微生物而進行。
接下來將更詳細地描述通過使用為缺失目的而設計的DNA片段采用雙交換的缺失方法，該DNA片段是通過SOE-PCR制備的(Gene，77，61，1989)。然而，在本發(fā)明中，缺失基因的方法不僅僅限于下述方法。
用于缺失目的的DNA片段是如下構成的片段抗藥標記基因在ca.0.5至3kb上游序列的側面之間插入并且處于要缺失的基因的上游，以及抗藥標記基因在ca.0.5至3kb下游序列的側面之間插入并且處于相同基因的下游。在PCR的第一次循環(huán)中，制備下列三個片段要缺失的上游片段和下游片段，和抗藥標記基因。例如，要在該步驟中使用的引物可以是專門設計的引物，以便將抗藥性基因的上游10-30堿基對序列加入到上游片段的下端，以及將抗藥性標記基因的下游10-30堿基對序列加入到下游片段的上端(圖1)。
接下來，使用在第一次循環(huán)中制備的三個PCR片段作為模板，使用上游片段的上部引物和下游片段的下部引物進行PCR的第二次循環(huán)。該步驟導致與如上制成的抗藥性基因序列中的抗藥性標記基因片段退火接合，并通過PCR擴增，可以獲得在上游片段和下游片段之間插有抗藥性標記基因的DNA片段(圖1)。
當采用抗氯霉素基因作為抗藥性標記基因時，可以使用合適的DNA模板和如表2所示的引物組和傳統(tǒng)的PCR酶試劑盒(例如PyrobestDNA聚合酶(Takara Shuzo的產(chǎn)品)在文獻中描述的典型條件下(參見，例如，PCR Protocols.Current Methods and Applications，Edited by B.A.White，Humana Press，pp.251(1993)，Gene，77，61，1989)通過SOE-PCR獲得用于缺失基因的DNA片段。
當由此獲得的用于實現(xiàn)基因缺失的DNA片段通過轉化方法(competent method)或類似方法引入細胞中時，在要缺失的基因上游和下游存在的同源區(qū)域中發(fā)生細胞內(nèi)基因重組。因此，其中的目標基因已經(jīng)被抗藥性基因取代的細胞可以通過使用抗藥性標記物而選擇性地分離(圖1)。具體而言，當在細胞中引入通過表2所列的引物組而制備的用于基因缺失的DNA片段時，分離出在含有氯霉素的瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落，并通過例如使用基因組作模板的PCR之類的合適方法來證實通過被抗氯霉素基因取代而缺失了目標基因。
隨后，當將編碼目標蛋白質或多肽的基因轉移到表1所示的任一枯草桿菌基因或一個或多個選自與其相對應的基因的基因從中缺失或剔除的宿主突變微生物菌株上時，可以獲得本發(fā)明的微生物。
對編碼目標蛋白質或多肽的基因沒有特別的限制。蛋白質和多肽的例子包括用于工業(yè)用途的例如洗滌劑、食品、纖維、飼料、化學品、藥品和診斷用藥之類的生理活性多肽和酶。工業(yè)酶從功能上可以分成氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶和連接酶/合成酶。優(yōu)選地，可以使用例如纖維素酶、α-淀粉酶和蛋白質酶之類的水解酶。具體例子包括屬于水解酶分類中的族5的纖維素酶(Bioche M.J.，280，309，1991)；特別是源自微生物的纖維素酶，更特別是源自芽孢桿菌屬的纖維素酶。這些類型的工業(yè)酶的其它具體例子包括源自芽孢桿菌屬并含有氨基酸序列號2或4的堿性纖維素酶，以及含有與所述氨基酸序列具有70％同源性，優(yōu)選80％同源性，更優(yōu)選90％同源性，進一步優(yōu)選95％同源性，又進一步優(yōu)選98％或更高同源性的另一氨基酸序列的纖維素酶。
α-淀粉酶的具體例子包括源自微生物的α-淀粉酶，優(yōu)選源自芽孢桿菌屬的液化淀粉酶。更具體的例子包括源自芽孢桿菌屬并含有序列號6的氨基酸序列的堿性淀粉酶，以及含有與所述氨基酸序列具有70％同源性，優(yōu)選80％同源性，更優(yōu)選90％同源性，進一步優(yōu)選95％同源性，特別優(yōu)選98％或更高同源性的另一氨基酸序列的淀粉酶。氨基酸序列的同源性通過Lipman-Pearson法(Science，227，1435(1985))計算。蛋白酶的具體例子包括源自微生物，特別是源自屬于芽孢桿菌屬的微生物的絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。
優(yōu)選地，編碼目標蛋白或多肽的基因在其上游區(qū)域具有一個或多個適當?shù)亟雍系狡渖系呐c基因的轉錄、轉譯或分泌有關的調(diào)節(jié)區(qū)域(具體而言，一個或多個選自包含啟動子和轉錄起始位點的轉錄起始調(diào)節(jié)區(qū)域；包含核蛋白體結合位點和起始密碼子的轉譯起始區(qū)域；和分泌信號肽區(qū)域的區(qū)域)。優(yōu)選將由轉錄起始調(diào)節(jié)區(qū)域、轉譯起始調(diào)節(jié)區(qū)域和分泌信號區(qū)域構成的三個區(qū)域接合到目標基因上。更優(yōu)選分泌信號肽區(qū)域是源自屬于芽孢桿菌屬的微生物的纖維素酶基因，且轉錄起始區(qū)域和轉譯起始區(qū)域是該纖維素酶基因上游的0.6至1kb區(qū)域。在一個優(yōu)選例子中，在例如日本專利申請(公開)第2000-210081號和第190793/1990號中公開的源自屬于芽孢桿菌屬的微生物的纖維素酶基因；即，源自KSM-S237菌株(FERM BP-7875)或KSM-64菌株(FERMBP-2886)的纖維素酶基因的轉錄起始調(diào)節(jié)區(qū)域、轉譯起始區(qū)域、和分泌信號肽區(qū)域，適當?shù)亟雍系侥繕说鞍谆蚨嚯牡慕Y構基因上。更具體地，要接合的優(yōu)選DNA片段包括序列號1的堿基數(shù)量為1至659的核苷酸序列；序列號3的纖維素酶基因的堿基數(shù)量為1至696的核苷酸序列；含有與所述任意一種核苷酸序列具有70％同源性，優(yōu)選80％同源性，更優(yōu)選90％同源性，進一步優(yōu)選95％同源性，甚至更優(yōu)選98％或更高同源性的核苷酸序列的DNA片段；或含有缺失了所述任意一種核苷酸序列的一部分的核苷酸序列的DNA片段。優(yōu)選將這些DNA片段的一種適當?shù)亟雍系侥繕说鞍踪|或多肽的結構基因上。正如此處所用，含有缺失上述任意一種核苷酸序列的一部分的核苷酸序列的DNA片段是指不含上述任意一種核苷酸序列的一部分并具有與該基因的轉錄、轉譯和分泌有關的功能的DNA片段。
本發(fā)明的重組微生物可以通過傳統(tǒng)的轉化技術獲得，其中將含有包括編碼目標蛋白質或多肽的基因并接合到適當?shù)馁|粒載體上的DNA片段的重組質粒轉移到宿主微生物細胞中?；蛘撸亟M微生物可以利用通過將上述DNA片段接合到與宿主微生物基因組的某一部分同源的一個合適區(qū)域上而制備的DNA片段，并直接插入宿主微生物基因組中而獲得。
使用本發(fā)明的重組微生物獲得的目標蛋白質或多肽可以按照如下方式生產(chǎn)將相應的細胞株植入含有可同化的碳源和氮源以及其它主要組分的培養(yǎng)基上；通過傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法培養(yǎng)細胞株；隨后，收集并提純蛋白質或多肽。
通過前述方法，可以生產(chǎn)宿主突變微生物株，其中表1所示的任一枯草桿菌基因或一個或多個選自與其功能相當?shù)幕虻幕蛞呀?jīng)缺失或剔除。此外，通過使用這種突變株，可以生產(chǎn)重組微生物。由此，通過使用突變株或重組微生物可以有效地生產(chǎn)有用的蛋白質或多肽。
下面將以構筑屬于枯草桿菌的已經(jīng)從中缺失了枯草桿菌的ccpA基因(BG10376)的重組菌株的實施例為中心，詳細描述根據(jù)本發(fā)明構筑重組微生物的方法，以及使用該重組微生物生產(chǎn)纖維素酶和α-淀粉酶的方法。
實施例實施例1使用從枯草桿菌168菌株中提取的用作模板的基因組DNA樣品和表1和2所示的兩個引物組(ccpA-AF和ccpA-A/CmR；和ccpA-B/CmF和ccpA-BR)制備在該基因組上的ccpA基因上游側側面的0.6kb片段(A)和在ccpA基因下游側側面的0.6kb片段(B)。將質粒pC194的抗氯霉素基因(J.Bacteriol.150(2)，815(1982))插入質粒pUC18的XbaI-BamHI裂解位點，由此制備重組質粒pCBB 31。使用重組質粒pCBB和表2所示的由CmF和CmR構成的引物組制備含有抗氯霉素基因的1kb片段(C)。隨后，使用表2所示的引物ccpA-AF和ccpA-BR進行SOE-PCR，并結合使用由此制成的三個片段(A)、(B)和(C)作為模板，制備2.2kb DNA片段，其中在該序列中接合了片段(A)、(B)和(C)(參見圖1)。使用由此制成的DNA片段，通過轉化方法轉化枯草桿菌168菌株。收集在含氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌落作為轉化體。提取上述轉化體的基因組，在其上進行的PCR證實，ccpA基因已經(jīng)被缺失并被抗氯霉素基因取代。
表2-1

表2-2

表2-3

表2-4

實施例2按照與實施例1所述相似的方式，通過使用由選自表2所示的各種引物組；即，基因-AF、基因-A/CmR、基因-B/CmF、基因-BR、CmF以及CmR的適當引物組而制成的用于實現(xiàn)缺失的DNA片段來分離孢子形成基因缺失了的菌株，在該菌株中已經(jīng)通過取代下述缺失的基因而引入了抗氯霉素基因。從基因組中缺失的基因是comA、yopO、treR、yvbA、yvaN、yttP、yurK、yozA、licR、sigL、mntR、glcT、ykvE、slr、rocR、yyaA或rsiX。
實施例3按照與實施例2所述相似的方式，通過使用選自表2所示的基因-AF、基因-A/Cm2R、基因-B/Cm2F、基因-BR、Cm2F以及Cm2R的適當引物組來制備用于缺失的DNA片段。通過使用由此制成的DNA片段，分離孢子形成基因缺失了的菌株，在該菌株中已經(jīng)通過取代下述缺失的基因而引入了抗氯霉素基因。從基因組中缺失的基因是cspB、yvdE、yaaT、yycH或ylbO。
實施例4
按照與實施例2所述相似的方式，由選自表2所示的基因-AF、基因-A/Cm4R、基因-B/Cm4F、基因-BR、Cm4F以及Cm4R的適當引物組制備用于實現(xiàn)缺失的DNA片段。通過使用由此制成的DNA片段，分離孢子形成基因缺失了的菌株，在該菌株中已經(jīng)通過取代缺失的基因yacP、hprK和yhdK而引入了抗氯霉素基因。
實施例5在實施例1到4獲得的每種基因缺失的菌株中和在用作對照物的枯草桿菌168菌株中，通過原生質體轉化法引入重組質粒pHY-S237。重組質粒pHY-S237的制備如下將源自芽孢桿菌sp.KSM-S237菌株的編碼堿性纖維素酶的DNA片段(3.1kb)(序列號1，日本專利申請(公開)第2000-210081號)插入穿梭載體pHY300 PLK的限制性內(nèi)切酶BamHI裂解位點。將由此制成的每種細胞株在LB培養(yǎng)基(5毫升)中以30℃震蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)液(0.03毫升)注入2×L-麥芽糖培養(yǎng)基(2％胰胨、1％酵母提取物、1％NaCl、7.5％麥芽糖、7.5ppm4-5水合硫酸錳和15ppm四環(huán)素)中，然后在30℃震蕩培養(yǎng)三天。在培養(yǎng)完成后，通過離心去除細胞，并測定由培養(yǎng)物獲得的上層清液的堿性纖維素酶活性，由此計算細胞在培養(yǎng)過程中分泌出的堿性纖維素酶的量；即，在細胞外生成的堿性纖維素酶的量。從表3中清楚看出，與對照物168菌株(野生型菌株)相比，在使用基因缺失的可形成孢子的菌株作為宿主的所有情況下，堿性纖維素酶的生產(chǎn)或分泌都被證實更為有效。
表3

實施例6在實施例1至4獲得的每種基因缺失的菌株中和在用作對照物的枯草桿菌168菌株中，通過原生質體轉化法引入重組質粒pHSP-K38。重組質粒pHSP-K38的制備如下在穿梭載體pHY300PLK的限制性內(nèi)切酶BagII-XbaI裂解位點插入如下制成的2.1kb片段(序列號5)將包含堿性纖維素酶基因的啟動子區(qū)域和信號序列區(qū)域部分的上游0.6kb片段(序列號3)與編碼源自芽孢桿菌sp.KSM-K38菌株的堿性淀粉酶基因的成熟酶區(qū)域(Asp1-Gln480)的DNA片段(1.5kb)的上游側接合(日本專利申請(公開)第2000-1884882號，Eur.J.Biochem.，268，2974(2001))。將由此獲得的每種細胞株在LB培養(yǎng)基(5毫升)中以30℃震蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)液(0.03毫升)注入2×L-麥芽糖培養(yǎng)基(2％胰胨、1％酵母提取物、1％NaCl、7.5％麥芽糖、7.5ppm4-5水合硫酸錳和15ppm四環(huán)素)中，然后在30℃震蕩培養(yǎng)三至六天。在培養(yǎng)完成后，通過離心去除細胞，并測定由培養(yǎng)物獲得的上層清液的堿性淀粉酶的活性，由此計算在培養(yǎng)過程中細胞分泌出的堿性淀粉酶的量；即，在細胞外生成的堿性淀粉酶的量。從表4中清楚看出，與對照物168菌株(野生型菌株)相比，在使用基因缺失的菌株作為宿主的情況下，堿性淀粉酶的生產(chǎn)或分泌被證實更為有效。
表4

序列表<110>花王株式會社<120>重組微生物<130>KS0795<150>JP 2003-379167<151>2003.11.7<160>122<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>3150<212>DNA<213>芽孢桿菌KSM-S237<220>
<221>CDS<222>(573)..(3044)<223>
<220>
<221>sig_peptide<222>(573)..(659)<223>
<220>
<221>mat_peptide<222>(660)..()<223>
<400>1gatttgccga tgcaacaggc ttatatttag aggaaatttc tttttaaatt gaatacggaa60taaaatcagg taaacaggtc ctgattttat ttttttgagt tttttagaga actgaagatt120gaaataaaag tagaagacaa aggacataag aaaattgcat tagttttaat tatagaaaac180gcctttttat aattatttat acctagaacg aaaatactgt ttcgaaagcg gtttactata240aaaccttata ttccggctct tttttaaaac agggggtaaa aattcactct agtattctaa300tttcaacatg ctataataaa tttgtaagac gcaatatgca tctctttttt tacgatatat360gtaagcggtt aaccttgtgc tatatgccga tttaggaagg ggggtagatt gagtcaagta420
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gat ttc ttt aga gaa att gca gct tta tac cct aat aat cca cac att1121Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile140 145 150att tat gag tta gcg aat gag ccg agt agt aat aat aat ggt gga gca1169Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala155 160 165 170ggg att ccg aat aac gaa gaa ggt tgg aaa gcg gta aaa gaa tat gct1217Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala175 180 185gat cca att gta gaa atg tta cgt aaa agc ggt aat gca gat gac aac1265Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn190 195 200att atc att gtt ggt agt cca aac tgg agt cag cgt ccg gac tta gca1313Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala205 210 215gct gat aat cca att gat gat cac cat aca atg tat act gtt cac ttc 1361Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe220 225 230tac act ggt tca cat gct gct tca act gaa agc tat ccg tct gaa act1409Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr235 240 245 250cct aac tct gaa aga gga aac gta atg agt aac act cgt tat gcg tta1457Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu255 260 265gaa aac gga gta gcg gta ttt gca aca gag tgg gga acg agt caa gct1505Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala270 275 280agt gga gac ggt ggt cct tac ttt gat gaa gca gat gta tgg att gaa1553Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu285 290 295ttt tta aat gaa aac aac att agc tgg gct aac tgg tct tta acg aat1601Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn300 305 310aaa aat gaa gta tct ggt gca ttt aca cca ttc gag tta ggt aag tct1649Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser315 320 325 330aac gca acc aat ctt gac cca ggt cca gat cat gtg tgg gca cca gaa1697
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Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val440 445 450Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser455 460 465Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala470 475 480Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr485 490 495Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu500 505 510 515Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala520 525 530Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val535 540 545Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser550 555 560Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser565 570 575Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala580 585 590 595Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp600 605 610Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly615 620 625Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala
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<210>19<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>19tatacaggga ttatcagtat tgagc 25<210>20<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>20gttatccgct cacaattctt ttctccttgt tggatctg 38<210>21<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>21cgtcgtgact gggaaaacgg ggataacgat ttatgaag 38<210>22<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>22ttttgtaata atgatatgaa gctagtgttg 30<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>23atatccagcc ctgcctcttc 20<210>24<211>58<212>DNA
<213>人工序列<400>24ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc gaaatttcct cctaaagcga tcataacg 58<210>25<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>25gtcgttttac aacgtcgttg actgggaaaa cccacaagct gctaacgtta c 51<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>26tcctgtttgg gctcctgttg 20<210>27<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>27tgtttatgta tggcggcctg cgggac 26<210>28<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>28gttatccgct cacaattcag ctttccatat atctcacc 38<210>29<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>29cgtcgtgact gggaaaacac ggtctgctga tgactgac 38
<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>30gcgtttactt aagatgtcga 20<210>31<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>31tttctagcgt ttcggcaaat tgagttaag 39<210>32<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>32gttatccgct cacaattcct tactttcata cggctcac 38<210>33<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>33cgtcgtgact gggaaaacga gacgtggcgc tcaccaac 38<210>34<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>34cggattaaaa aaagaatatc gcggacagc 29<210>35<211>20
<212>DNA<213>人工序列<400>35tgccgctgcc cgccggagag 20<210>36<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>36gttatccgct cacaattcaa ggtgtagaac ttccgttg 38<210>37<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>37cgtcgtgact gggaaaacac catcaacagc ccctacac 38<210>38<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>38tcaaataaag gcggcattca gtcc 24<210>39<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>39ataatggtat ccaaatccac gc 22<210>40<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>40
gttatccgct cacaattcat tcagtcatat gtatcacc 38<210>41<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>41cgtcgtgact gggaaaacga tccatcatac acagcatg 38<210>42<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>42cacttctcaa cggaggggat ttcacatc 28<210>43<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>43taatggagga gagaaggccg 20<210>44<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>44gttatccgct cacaattcag tcgcccatga agcatgag 38<210>45<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>45cgtcgtgact gggaaaacac caaaaaatgc tgagctgaca gc 42<210>46
<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>46ttgccaatga tgaggaaaaa ggaacc 26<210>47<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>47ctgaacgtcttgaataaaaaagcagg 26<210>48<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>48gttatccgct cacaattcgc tgaagtttca tatccatc 38<210>49<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>49cgtcgtgact gggaaaacat tccgtcatcg gcagcgag 38<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>50agcggtttac aagttggagg 20<210>51<211>22<212>DNA<213>人工序列
<400>51atttcagaag gcatacttca ag 22<210>52<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>52gttatccgct cacaattcca tacttggtgt tgtcatcg 38<210>53<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>53cgtcgtgact gggaaaacca taatcagtaa aaaggcggtc 40<210>54<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>54ttctgaccgc tctggcaacc 20<210>55<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>55ataatgcccg cttcccaacc 20<210>56<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>56gttatccgct cacaattccg atcctcagct cctttgtc 38
<210>57<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>57cgtcgtgact gggaaaactc atctgatacc gattaacc 38<210>58<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>58caactgaatc cgaaggaatg 20<210>59<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>59tcggggtcat gccgagcggt 20<210>60<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>60gttatccgct cacaattcca atgttgccat tttcatcc 38<210>61<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>61cgtcgtgact gggaaaactt gtacgagaat caacgctg 38<210>62<211>20<212>DNA<213>人工序列
<400>62cacggcaatg cattcttcgg 20<210>63<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>63agatctgtcg gccaggttta c 20<210>64<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>64gttatccgct cacaattctg atttttctgt catgtctc 61<210>65<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>65cgtcgtgact gggaaaacgg tagagatgtg caccgaaa 38<210>66<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>66gagtcagacg gcatcgatga 20<210>67<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>67ttctgattca ttttcactgc tgg 23
<210>68<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>68gttatccgct cacaattcaa cggataattc ttccaatc 38<210>69<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>69cgtcgtgact gggaaaactg tccatgaagt caaatcc 37<210>70<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>70cgctgaaata ttctctcgca 20<210>71<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>71cgccgctttc accgcggatt c 21<210>72<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>72gttatccgct cacaattcct ttgaccactg tatgaacc 38<210>73<211>38<212>DNA
<213>人工序列<400>73cgtcgtgact gggaaaacac tcgtctaacg aataatcc 38<210>74<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>74tgtcatcacg gaatttgacg 20<210>75<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>75ccaaattatc ctttgtgagc gcggaatcag 30<210>76<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>76gttatccgct cacaattccg tagatcgtaa tattgctc 38<210>77<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>77cgtcgtgact gggaaaacag cttagaaagt caaccaag 38<210>78<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>78tttgagcatc agcacaagcc 20
<210>79<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>79tgtagcagaa gcagtcgaat t 21<210>80<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>80ctaatgggtg ctttagttga caattacgca gctgtcatgt 40<210>81<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>81ctgccccgtt agttgaagaa ctgataaacc gtgaaaaagt g 41<210>82<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>82cctttgaaaa aggctcccgt 20<210>83<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>83gttttccaag tctgccgata aaaatatgc 29<210>84<211>38
<212>DNA<213>人工序列<400>84gttatccgct cacaattcat gcttcatgta cctacacc 38<210>85<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>85cgtcgtgact gggaaaacca attaacgatt cgcatacc 38<210>86<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>86aaaaagaaga agtcacagta cagaacgtgg 30<210>87<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>87atttttcgcc atcttgaatt ttc 23<210>88<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>88ctaatgggtg ctttagttgg atgatcctct cgttgaactg 40<210>89<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>89
ctgccccgtt agttgaaggg atgagccttc agaaaagtt 39<210>90<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>90gccggacaga gatctgtatg 20<210>91<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>91gaagaaggtt tttatgttga cgcttttttg cccaatactg tataa 45<210>92<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>92caaaaaagcg tcaacataaa aaccttcttc aactaacggg gcagg 45<210>93<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>93aagacgagta cttttctctc taaatcactt 30<210>94<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>94aactcgatca aatggtgaca ggacagcatc 30<210>95
<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>95ggagaataaa gaccctcttc aactaaagca cccattagtt caaca 45<210>96<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>96tgctttagtt gaagagggtc tttattctcc cacagggttt cgttt 45<210>97<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>97tttttatatt acagcgagtt ggcgttaaat gaatgaagcg ataga 45<210>98<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>98atttaacgcc aactcgctgt aatataaaaa ccttcttcaa ctaac 45<210>99<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>99ttgattgatg ataaattcag gcaggtgcag 30<210>100<211>30<212>DNA<213>人工序列
<400>100caaagcttga gaaatgttcc catgctcttg 30<210>101<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>101caggaggaac atatctcttc aactaaagca cccattagtt caaca 45<210>102<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>102tgctttagtt gaagagatat gttcctcctg ttccgggctg ccccg 45<210>103<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>103attccagtta ctcgtaatat agttg 25<210>104<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>104gttatccgct cacaattcac ttcatcatcc attagctc 38<210>105<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>105cgtcgtgact gggaaaacct gctccaaatc cgatttcc 38
<210>106<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>106gtcctgcatt tttcgaagtc tgg 23<210>107<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>107tacacatcct tcaaacaagt ctgaacaaac 30<210>108<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>108tgctttagtt gaagattacc agttccataa ttccacctcg ccgac 45<210>109<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>109tttttatatt acagcgtgtg tataccattg tatctgtaga tacga 45<210>110<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>110gctatgatca ttgtaacgaa aggaaagggg 30<210>111<211>45<212>DNA<213>人工序列
<400>111ttatggaact ggtaatcttc aactaaagca cccattagtt caaca 45<210>112<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>112caatggtata cacacgctgt aatataaaaa ccttcttcaa ctaac 45<210>113<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>113aatctgaaca agaaaaagga gctgctcctc 30<210>114<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>114tgctttagtt gaagaattca atctccctcc atgtcagctt attta 45<210>115<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>115tttttatatt acagcagaaa cgcctgaaat gaaccggccc tatag 45<210>116<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>116tgtttgacaa aggtagaacg tctgcttatc 30
<210>117<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>117ggagggagat tgaattcttc aactaaagca cccattagtt caaca 45<210>118<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>118atttcaggcg tttctgctgt aatataaaaa ccttcttcaa ctaac 45<210>119<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>119gaattgtgag cggataac 18<210>120<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>120gttttcccag tcacgacg 18<210>121<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>121caactaaagc acccattag 19<210>122<211>18<212>DNA
<213>人工序列<400>122cttcaactaa cggggcag 18
權利要求
1.一種重組微生物，其通過將編碼異性蛋白質或多肽的基因轉移到枯草桿菌基因comA、yopO、treR、yvbA、cspB、yvaN、yttP、yurK、yozA、licR、sigL、mntR、glcT、yvdE、ykvE、slr、rocR、ccpA、yaaT、yyaA、yycH、yacP、hprK、rsiX、yhdK以及ylbO的任意一種或一個或多個與這些基因的任意一種功能相當?shù)幕蛉笔Щ虮惶蕹奈⑸锏耐蛔冎晟隙苽洹?br> 2.如權利要求1所述的重組微生物，其中所述微生物是枯草桿菌或屬于芽孢桿菌屬的另一細菌。
3.如權利要求1或2所述的重組微生物，其中一個或多個選自轉錄起始調(diào)節(jié)區(qū)域、轉譯起始調(diào)節(jié)區(qū)域和分泌信號區(qū)域的區(qū)域接合到編碼異性蛋白或多肽的基因的上游區(qū)域。
4.如權利要求3所述的重組微生物，其中所述一個或多個區(qū)域是由轉錄起始調(diào)節(jié)區(qū)域、轉譯起始調(diào)節(jié)區(qū)域和分泌信號區(qū)域構成的三個區(qū)域。
5.如權利要求3或4所述的重組微生物，其中所述分泌信號區(qū)域來自屬于芽孢桿菌屬的細菌的纖維素酶基因，而轉錄起始調(diào)節(jié)區(qū)域和轉譯起始調(diào)節(jié)區(qū)域各自來自該纖維素酶基因上游的0.6至1kb區(qū)域。
6.如權利要求4所述的重組微生物，其中由所述轉錄起始調(diào)節(jié)區(qū)域、所述轉譯起始調(diào)節(jié)區(qū)域和所述分泌信號區(qū)域構成的三個區(qū)域是序列號1的纖維素酶基因的堿基數(shù)為1至659的核苷酸序列；序列號3的纖維素酶基因的堿基數(shù)為1至696的核苷酸序列；含有與所述核苷酸序列的任意一種具有70％同源性的核苷酸序列的DNA片段；或含有缺失了所述核苷酸序列的任意一種的一部分的核苷酸序列的DNA片段。
7.一種生產(chǎn)蛋白質或多肽的方法，其使用如權利要求1至6任意一項所述的重組微生物。
全文摘要
一種重組微生物，其通過將編碼蛋白質或多肽的基因轉移到能夠以提高的生產(chǎn)率生產(chǎn)蛋白質或多肽的宿主微生物上而獲得，以及使用該重組微生物生產(chǎn)蛋白質或多肽的方法。該重組微生物通過將編碼異性蛋白質或多肽的基因轉移到枯草桿菌基因comA、yopO、treR、yvbA、cspB、yvaN、yttP、yurK、yozA、licR、sigL、mntR、glcT、yvdE、ykvE、slr、rocR、ccpA、yaaT、yyaA、yycH、yacP、hprK、rsiX、yhdK以及ylbO的任意一種或一個或多個與這些基因的任意一種功能相當?shù)幕蛉笔Щ虮惶蕹奈⑸锏耐蛔冎晟隙苽洹?br> 文檔編號C12R1/125GK1875106SQ200480031689
公開日2006年12月6日 申請日期2004年11月5日 優(yōu)先權日2003年11月7日
發(fā)明者東畑正敏, 澤田和久, 尾崎克也, 小林和夫, 小笠原直毅 申請人:花王株式會社