專利名稱：一種的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定性同位素標(biāo)記化合物生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其涉及采用微生物發(fā)酵和生物提取生產(chǎn)15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-精氨酸的方法。
背景技術(shù)：
對(duì)L-精氨酸的生產(chǎn)，國(guó)內(nèi)外有一些研究小組對(duì)其作了許多研究工作(微生物學(xué)報(bào)，28(2)131～135(1988)；28(3)257～264(1988)；31(6)460～465(1991)；無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，22(2)10～13(2003)；Agri.Biol.Chem.，45(4)959～963(1981)；Journal of Bacteriology.，91(2)617～621(1996)；European Patent 0～378 223 A1；United States Patent 5,034,319等)。但是，關(guān)于生物合成法研究15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-精氨酸的生產(chǎn)領(lǐng)域中還不見專利和文獻(xiàn)報(bào)道。采用直接發(fā)酵法生產(chǎn)，目標(biāo)氨基酸大量富集，15N穩(wěn)定性同位素容易標(biāo)記，但由于發(fā)酵配方中有機(jī)氮源很難標(biāo)記，常常使L-精氨酸-15N4的豐度下降很多，達(dá)不到產(chǎn)品要求，所以需要對(duì)常規(guī)發(fā)酵配方進(jìn)行改善。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-精氨酸-15N4，目的在于解決15N豐度下降的問(wèn)題，并盡量提高15N利用率，以滿足產(chǎn)品生產(chǎn)要求。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-精氨酸的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法利用低糖流加發(fā)酵工藝生產(chǎn)L-精氨酸-15N4，控制玉米漿有機(jī)氮源添加量，添加15N高豐度菌體水解液部分代替玉米漿等有機(jī)氮源，直接添加包括生物素、維生素B1、維生素B6、泛酸、尼克酸和對(duì)氨基安息香酸的維生素復(fù)合物，通過(guò)改善發(fā)酵配方來(lái)提高產(chǎn)酸率。
該方法包括以下工藝步驟(1)適用菌種適用于L-精氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的菌種包括棒桿菌、短桿菌屬的突變菌株；(2)種子和發(fā)酵培養(yǎng)基以全合成培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加少量有機(jī)氮源，種子培養(yǎng)基主要配方如下表所示

發(fā)酵培養(yǎng)基以全合成培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，高豐菌體水解液部分替代玉米漿，直接添加生長(zhǎng)因子。主要配方如下表所示


(3)發(fā)酵工藝將活化斜面菌苔用少量培養(yǎng)基洗下后接種于已滅菌的裝有上述種子培養(yǎng)基的種子搖瓶開始培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度30～37℃，初始pH6.4～6.8，搖床轉(zhuǎn)速180～220r/min；種子培養(yǎng)18～24小時(shí)后按5～10％接種量接種于裝有上述發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中，搖床發(fā)酵控制條件為發(fā)酵溫度30～37℃，初始pH6.4～6.8，巡回式搖床轉(zhuǎn)速180～220r/min，發(fā)酵24小時(shí)左右提高轉(zhuǎn)速至220～240r/min，發(fā)酵48小時(shí)左右提高轉(zhuǎn)速至240～280r/min，發(fā)酵時(shí)間72～96小時(shí)；發(fā)酵罐控制條件為發(fā)酵初始溫度30～37℃，初始pH6.4～6.8，通氣量0.5～1.5VVM，罐壓0.02～0.05Mpa，溶解氧0.5～90％飽和度，通過(guò)聚醚類或硅酮類消泡劑消泡；在發(fā)酵中后期18～32小時(shí)后，提高轉(zhuǎn)速和通氣量保證溶解氧在20～50％飽和度；發(fā)酵全過(guò)程控制pH在微酸性添加15N標(biāo)記尿素、氨水或液氨調(diào)節(jié)pH6.4～7.0，流加50％葡萄糖控制發(fā)酵液葡萄糖濃度10～50g/L，發(fā)酵時(shí)間60～72小時(shí)；(4)分離提取發(fā)酵液中15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-精氨酸的分離采用離子交換法分部提取得到15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-精氨酸溶液，通過(guò)真空濃縮趕氨并采用乙醇低溫結(jié)晶、真空干燥得到產(chǎn)品；采用同位素專用質(zhì)譜儀或光譜法分析15N豐度，純度分析采用常規(guī)方法。
所述的短桿菌屬的突變菌株包括黃色短桿菌，該黃色短桿菌是指黃色短桿菌(Brevobacterium flavum)ATCC14067突變株。
所述的棒桿菌屬的突變菌株包括谷氨酸棒桿菌，該谷氨酸棒桿菌是指谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、ATCC21831、ATCC21493或ATCC21659。
所述的棒桿菌屬的突變菌株包括鈍齒棒桿菌，該鈍齒棒桿菌是指鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)AS1.542突變株，CGMCC保藏菌種。
本發(fā)明利用低糖流加發(fā)酵工藝生產(chǎn)L-精氨酸-15N4，控制玉米漿有機(jī)氮源添加量，添加15N高豐度菌體水解液部分代替玉米漿等有機(jī)氮源，直接添加生物素、維生素B1、維生素B6、泛酸、尼克酸、對(duì)氨基安息香酸等維生素復(fù)合物，通過(guò)改善發(fā)酵配方來(lái)提高產(chǎn)酸率。這樣可使15N原料得到有效利用，豐度下降不致于影響產(chǎn)品生產(chǎn)要求。
如果采用常規(guī)發(fā)酵方法，15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-精氨酸產(chǎn)量雖然相對(duì)較高，但15N豐度下降很大，往往下降3％以上，很難達(dá)到高豐度產(chǎn)品要求。采用全合成培養(yǎng)基發(fā)酵雖然對(duì)15N豐度影響不大，但產(chǎn)酸量太低使得15N原料利用率不高。通過(guò)改變發(fā)酵配方和工藝，添加15N高豐度菌體水解液部分代替玉米漿等有機(jī)氮源，直接添加生物素、維生素B1、維生素B6、泛酸、尼克酸、對(duì)氨基安息香酸等維生素復(fù)合物，本發(fā)明獲得的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-精氨酸產(chǎn)量比采用全合成培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酸量相應(yīng)提高30～90％以上，而15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-精氨酸15N豐度下降可以減少到1％以下，有的甚至幾乎不下降，大大提高了15N原料利用率，減少了生產(chǎn)成本。同時(shí)，在保證產(chǎn)品15N豐度條件下，簡(jiǎn)化發(fā)酵和提取工藝，由于原料得到充分利用大大節(jié)省了原料回收成本。本發(fā)明可利用低豐度和高豐度15N無(wú)機(jī)原料滿足不同豐度產(chǎn)品生產(chǎn)要求。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1使用菌種為以黃色短桿菌ATCC14067為出發(fā)菌誘變選育獲得的突變株TSF11(Arghxr+D-argr+His-)，使用的培養(yǎng)基包括斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、搖瓶種子和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。斜面保藏培養(yǎng)基和斜面活化培養(yǎng)基同常規(guī)發(fā)酵采用相同。
使用的種子初始配方如下表所示

使用的發(fā)酵初始配方如下表所示


將黃色短桿菌TSF11從保藏斜面接種于活化斜面，31℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用接種環(huán)刮一滿環(huán)菌苔到種子搖瓶(250mL裝量20mL，共接2瓶)，31℃、200rpm于巡回式搖床上培養(yǎng)20小時(shí)，取上述培養(yǎng)好的種子液按10％接種量轉(zhuǎn)入上述發(fā)酵搖瓶中(500mL裝量10mL，共接30瓶)，然后加入分消CaCO3，31℃、200rpm于巡回式搖床上發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)左右時(shí)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速220rpm，48小時(shí)左右時(shí)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速240rpm直到發(fā)酵終了，發(fā)酵從24小時(shí)開始流加15N標(biāo)記尿素，48小時(shí)開始流加葡萄糖，發(fā)酵培養(yǎng)72小時(shí)結(jié)束，發(fā)酵平均產(chǎn)L-精氨酸-15N4可達(dá)16g/L。發(fā)酵液采用732陽(yáng)離子交換樹脂單株分離，采用常規(guī)方法得到干燥固體L-精氨酸-15N4產(chǎn)品，經(jīng)質(zhì)譜分析得到產(chǎn)品豐度98.88％，豐度下降0.723％。
如果將發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿改為0.6，發(fā)酵工藝不變，發(fā)酵平均產(chǎn)L-精氨酸-15N4可達(dá)22g/L，但豐度只有96.30％，豐度下降3.31％。如果發(fā)酵培養(yǎng)基中不加玉米漿，發(fā)酵平均產(chǎn)L-精氨酸-15N4只有8g/L，豐度99.48％，豐度下降0.12％。上述發(fā)酵培養(yǎng)基中如果不添加泛酸、尼克酸、維生素B6、維生素B1、生物素和對(duì)氨基安息香酸等維生素復(fù)合物，發(fā)酵平均產(chǎn)L-精氨酸-15N4只有12g/L。綜合考慮，此發(fā)明效果顯著。
實(shí)施例2使用菌種為以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為出發(fā)菌誘變選育獲得的突變株CHA156(Arghxr+D-argr+SGr)，使用的培養(yǎng)基包括斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、搖瓶種子和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。斜面保藏培養(yǎng)基和斜面活化培養(yǎng)基同常規(guī)發(fā)酵采用相同。
使用的種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。使用的發(fā)酵初始配方，將實(shí)施例1發(fā)酵配方中硫酸銨改為氯化銨，其它不變，所采用氮源豐度均為5.31％。發(fā)酵工藝同實(shí)施例1，發(fā)酵平均產(chǎn)L-精氨酸-15N4可達(dá)17g/L。
發(fā)酵液采用732陽(yáng)離子交換樹脂單株分離，采用常規(guī)方法得到干燥固體L-精氨酸-15N4產(chǎn)品，經(jīng)質(zhì)譜分析得到產(chǎn)品豐度5.27％，豐度下降0.753％。
權(quán)利要求
1.一種15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-精氨酸的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法利用低糖流加發(fā)酵工藝生產(chǎn)L-精氨酸-15N4，控制玉米漿有機(jī)氮源添加量，添加15N高豐度菌體水解液部分代替玉米漿，直接添加包括生物素、維生素B1、維生素B6、泛酸、尼克酸和對(duì)氨基安息香酸的維生素復(fù)合物，通過(guò)改善發(fā)酵配方來(lái)提高產(chǎn)酸率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-精氨酸的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法包括以下工藝步驟(1)適用菌種適用于L-精氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的菌種包括棒桿菌、短桿菌屬的突變菌株；(2)種子和發(fā)酵培養(yǎng)基以全合成培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加少量有機(jī)氮源，種子培養(yǎng)基主要配方如下表所示
發(fā)酵培養(yǎng)基以全合成培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，高豐菌體水解液部分替代玉米漿，直接添加生長(zhǎng)因子。主要配方如下表所示
(3)發(fā)酵工藝將活化斜面菌苔用少量培養(yǎng)基洗下后接種于已滅菌的裝有上述種子培養(yǎng)基的種子搖瓶開始培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度30～37℃，初始pH6.4～6.8，搖床轉(zhuǎn)速180～220r/min；種子培養(yǎng)18～24小時(shí)后按5～10％接種量接種于裝有上述發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中，搖床發(fā)酵控制條件為發(fā)酵溫度30～37℃，初始pH6.4～6.8，巡回式搖床轉(zhuǎn)速180～220r/min，發(fā)酵24小時(shí)左右提高轉(zhuǎn)速至220～240r/min，發(fā)酵48小時(shí)左右提高轉(zhuǎn)速至240～280r/min，發(fā)酵時(shí)間72～96小時(shí)；發(fā)酵罐控制條件為發(fā)酵初始溫度30～37℃，初始pH6.4～6.8，通氣量0.5～1.5VVM，罐壓0.02～0.05Mpa，溶解氧0.5～90％飽和度，通過(guò)聚醚類或硅酮類消泡劑消泡；在發(fā)酵中后期18～32小時(shí)后，提高轉(zhuǎn)速和通氣量保證溶解氧在20～50％飽和度；發(fā)酵全過(guò)程控制pH在微酸性添加15N標(biāo)記尿素、氨水或液氨調(diào)節(jié)pH6.4～7.0，流加50％葡萄糖控制發(fā)酵液葡萄糖濃度10～50g/L，發(fā)酵時(shí)間60～72小時(shí)；(4)分離提取發(fā)酵液中15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-精氨酸的分離采用離子交換法分部提取得到15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-精氨酸溶液，通過(guò)真空濃縮趕氨并采用乙醇低溫結(jié)晶、真空干燥得到產(chǎn)品；采用同位素專用質(zhì)譜儀或光譜法分析15N豐度，純度分析采用常規(guī)方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-精氨酸的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的短桿菌屬的突變菌株包括黃色短桿菌，該黃色短桿菌是指黃色短桿菌(Brevobacterium flavum)ATCC14067突變株。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-精氨酸的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的棒桿菌屬的突變菌株包括谷氨酸棒桿菌，該谷氨酸棒桿菌是指谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、ATCC21831、ATCC21493或ATCC21659。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-精氨酸的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的棒桿菌屬的突變菌株包括鈍齒棒桿菌，該鈍齒棒桿菌是指鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)AS1.542突變株，CGMCC保藏菌種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種
文檔編號(hào)C07B59/00GK1869244SQ20051002624
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2005年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月27日
發(fā)明者譚青喬, 王雁宇, 梅叢笑, 孫建春, 杜曉寧, 李良君 申請(qǐng)人:上海化工研究院