專利名稱：一種原位中途補(bǔ)加試劑的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，特別是涉及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外擴(kuò)增特定DNA的方法，經(jīng)過(guò)25-35循環(huán)的擴(kuò)增目標(biāo)基因被放大100萬(wàn)至1億倍，反應(yīng)液的引物和四種脫氧核糖核苷酸(dNTPs)的克分子濃度至少需要是原始模板的100萬(wàn)至1億倍。顯然，反應(yīng)之初如此高飽和度的試劑不利于擴(kuò)增的嚴(yán)謹(jǐn)性，而反應(yīng)初期擴(kuò)增的嚴(yán)謹(jǐn)性對(duì)擴(kuò)增成功和形成專一擴(kuò)增產(chǎn)物至關(guān)重要。反之，大幅度降低試劑的濃度雖有益于增強(qiáng)反應(yīng)初期的嚴(yán)謹(jǐn)性，但必然造成反應(yīng)過(guò)早進(jìn)入飽和期使擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)不到檢測(cè)的所需要的數(shù)量。在中途補(bǔ)加試劑是解決之道，但中途開啟反應(yīng)管管蓋添加試劑既麻煩又容易造成滯后污染，使中途添加試劑的方法難以實(shí)施。同様，崁套式PCR有許多優(yōu)點(diǎn)，但需中途添加內(nèi)套引物帶來(lái)諸多不便也容易造成滯後污染。十幾年來(lái)雖然PCR新技術(shù)層出不窮但一次性配制反應(yīng)試劑的常規(guī)至今沒(méi)有突破。本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單、有效的在閉管和原位條件下中途補(bǔ)加試劑的方法，使擴(kuò)增的專一性得到顯著的、意想不到的改進(jìn)，也使PCR技術(shù)有更多機(jī)會(huì)創(chuàng)造更簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法和更應(yīng)泛的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問(wèn)題發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單、有效的在中途閉管和原位條件下補(bǔ)加試劑的方法，從而克服了現(xiàn)行PCR技術(shù)需一次制備配齊試劑，反應(yīng)前期相對(duì)飽和度太高影響擴(kuò)增專一性等的缺陷。
發(fā)明構(gòu)思大多數(shù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度在80-90℃之間，G+C％較低、鹼基排列合適、長(zhǎng)度又較短的擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度甚至低達(dá)70℃左右，因而完成PCR擴(kuò)增的最低允許變性溫度范圍為70-90℃，擴(kuò)增的變性溫度不必局限于現(xiàn)行的94℃左右。另一方面Taq等耐熱性DNA聚合酶能耐受短時(shí)間98℃以上的高溫，若將擴(kuò)增的一個(gè)循環(huán)或若干循環(huán)的變性溫度提高至98℃並不會(huì)導(dǎo)致酶的嚴(yán)重失活而影響擴(kuò)增。所以，針對(duì)一個(gè)既定的擴(kuò)增產(chǎn)物PCR循環(huán)的變性溫度有相當(dāng)大的伸縮變化空間。如果預(yù)先將需要添加的一種或幾種試劑用一種不溶于水、化學(xué)反應(yīng)惰性、比重小于水、融點(diǎn)在上述溫度范圍內(nèi)的固體包埋起來(lái)覆蓋在反應(yīng)液上，或者在PCR反應(yīng)液上先加上這種已融化的固體，待凝固後再覆蓋需要添加的試劑與底層的反應(yīng)液阻隔分開?？刂芇CR變性溫度高于擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度而低于所說(shuō)的固體的融化溫度就能使試劑保持與反應(yīng)液隔開。需要時(shí)只要提高反應(yīng)的變性溫度至高于所說(shuō)的固體的融化溫度，固體融化後原來(lái)被隔開的試劑就釋放到反應(yīng)液中參與反應(yīng)。本發(fā)明首選融點(diǎn)80-97℃、融化溫度區(qū)間2-5度的純的正烷TING或各種規(guī)格的微晶和合成石蠟混合物，也可使用具有類似特性、符合要求的其他化合物。
技術(shù)方案PCR反應(yīng)液包括緩沖液、鎂離子、模板核酸、dNTPs、DNA聚合酶和引物等。PCR反應(yīng)步驟依次包括(1)DNA模板變性解鏈；(2)引物與模板退火；(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互補(bǔ)DNA鏈；
(4)按步驟(1)-(3)循環(huán)進(jìn)行合成反應(yīng)；需要中途添加的試劑可預(yù)先用石蠟等包埋然後置于反應(yīng)液上，或製備反應(yīng)液後將已融化的石蠟迅速置于反應(yīng)液上，凝固後再在石蠟上加需要在反應(yīng)中途添加的試劑。添加試劑包括dNTPs、DNA聚合酶、引物、崁套PCR的內(nèi)套引物、促進(jìn)PCR反應(yīng)的添加劑或其他需要在反應(yīng)中途添加的試劑。添加的試劑可以是一種或同時(shí)添加幾種。添加的試劑也可以是在PCR反應(yīng)完成後的檢測(cè)用或其他用途的試劑，如雙鏈DNA專一的SYBR錄I熒光檢測(cè)試劑?？刂铺砑釉噭┑臐舛群腕w積使試劑釋放到反應(yīng)液后的終濃度達(dá)到預(yù)期的濃度。PCR反應(yīng)開始控制首次變性溫度和隨後的5-25循環(huán)的循環(huán)的變性溫度高于擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度，但低于包埋或阻隔劑開始融化的溫度。優(yōu)選變性溫度比擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度高2℃以上，比包埋或阻隔劑融化溫度下限低2℃以上。需要釋放試劑時(shí)控制該循環(huán)的變性溫度高于包埋或阻隔劑完全融化的溫度但低于99℃。優(yōu)選變性溫度比包埋或阻隔劑融化溫度上限高2℃以上。添加試劑釋放到反應(yīng)液之後的5-25個(gè)循環(huán)立即回復(fù)到原來(lái)的低變性溫度、保持若干循環(huán)高溫變性後再回復(fù)到原來(lái)的低變性溫度或繼續(xù)保持較高變性溫度直至反應(yīng)結(jié)束。包埋或阻隔劑優(yōu)選融點(diǎn)溫度符合要求的微晶石蠟或合成石蠟。
有益效果1，實(shí)現(xiàn)了閉管、原位中途添加試劑，既方便又消除了滯後污染問(wèn)題。
2，可大幅度降低PCR反應(yīng)起始液的試劑濃度、增強(qiáng)反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)性。
3，可大幅度提高PCR反應(yīng)后期反應(yīng)液的試劑濃度、增強(qiáng)擴(kuò)增產(chǎn)物形成。
4，應(yīng)用于嵌套式PCR使引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增程序設(shè)定簡(jiǎn)化、操作方便。
5，PCR反應(yīng)結(jié)束後添加檢測(cè)試劑可直接熒光檢測(cè)。
6，PCR反應(yīng)結(jié)束後反應(yīng)液上覆蓋有固體介質(zhì)減少開管時(shí)氣流震蕩、擴(kuò)散導(dǎo)致的滯後污染。
具體實(shí)施實(shí)施例1實(shí)施例1目標(biāo)基因?yàn)槿薭eta-腎上腺素受體基因(美國(guó)國(guó)家生物信息中心基因庫(kù)編號(hào)M15169)。引物采用文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)(Xie，H.G和WAJ等Clin.Pharmacol.Ther，2000，67(6)，670-5，其順序和特性示于表1。正反引物在同一外顯子內(nèi)，以基因組DNA為原始模板時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)252堿基，擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度90.1℃。試驗(yàn)采用ClonTech公司的Advantage2-PCR試劑盒，DNA濃度1ug/100ul，引物濃度0.4uM，每管反應(yīng)體積50微升。
表1，引物順序和特性

PCR初次變性92℃1分鐘，循環(huán)變性92℃30秒，退火50-68℃30秒，延伸68℃30秒。共35循環(huán)。結(jié)果示于表2。
表2，使用標(biāo)準(zhǔn)濃度dNTPs時(shí)的擴(kuò)增結(jié)果

結(jié)果說(shuō)明當(dāng)退火溫度為55-67℃時(shí)能得到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物但均有大量非專一擴(kuò)增產(chǎn)物形成，退火溫度大于68℃時(shí)沒(méi)有非專一擴(kuò)增產(chǎn)物但也沒(méi)有目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物形成。
實(shí)施例2實(shí)施例2目標(biāo)基因和試劑等與實(shí)施例1相同，但反應(yīng)液dNTPs濃度2nM是實(shí)施例1所用常規(guī)濃度的百分至一。在反應(yīng)液上加50-100ul融點(diǎn)為94-96℃的石蠟，凝固後在石蠟上加5微升2mM的dNTPs。PCR初次變性，循環(huán)變性和延伸條件也與實(shí)施例1相同，但退火65℃1分鐘。進(jìn)行不同循環(huán)后，將變性溫度提高到98℃維持2分鐘，再按上述條件繼續(xù)循環(huán)，對(duì)照組dNTPs濃度為常規(guī)的0.2mM，包埋顆粒內(nèi)含5微升水。表3顯示擴(kuò)增結(jié)果。
表3，不同循環(huán)時(shí)提高變性溫度融化石蠟的擴(kuò)增結(jié)果

結(jié)果說(shuō)明反應(yīng)液初始dNTPs濃度低，在10-20循環(huán)時(shí)添加dNTPs均得到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物而沒(méi)有非專一產(chǎn)物形成。
實(shí)施例3實(shí)施例3的方法與實(shí)施例2相同，反應(yīng)液的初始dNTPs濃度0.1-200uM，在反應(yīng)10循環(huán)后提高變性溫度融化石蠟。試驗(yàn)結(jié)果示于表4。
表4，不同起始濃度dNTPs的擴(kuò)增結(jié)果

結(jié)果說(shuō)明試驗(yàn)組初始dNTPs濃度為0.1-10uM，即常規(guī)濃度的二十分之一至二千分之一時(shí)均得到目標(biāo)基因擴(kuò)增產(chǎn)物而沒(méi)有非專一擴(kuò)增形成。
實(shí)施例4實(shí)施例4目標(biāo)基因?yàn)槿薭eta肌動(dòng)球蛋白(美國(guó)國(guó)家生物信息中心基因庫(kù)編BC016045)，引物順序和特性示于表。
表5，實(shí)施例4引物順序和特性

以cDNA為模板外套和內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)分別為352和290鹼基，擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度分別為82.9和82.0℃。反應(yīng)試劑和濃度與實(shí)施例2相同，dNTPs濃度為常規(guī)濃度0.2mM。所用石蠟融點(diǎn)為87-90℃。反應(yīng)PCR初次變性85℃1分鐘，反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)變性85℃30秒，退火64℃30秒，延伸72℃30秒，然后將變性溫度提高到94℃維持2分鐘使內(nèi)套引物進(jìn)入反應(yīng)液，后15個(gè)循環(huán)變性85℃30秒，退火和延伸72℃1分鐘。反應(yīng)結(jié)束電泳分離熒光染色顯示專一的290鹼基條帶。
實(shí)施例5實(shí)施例5目標(biāo)基因、引物和反應(yīng)程序均與實(shí)施例4相同。反應(yīng)結(jié)束達(dá)室溫或4℃後開啟反應(yīng)管在管壁加反應(yīng)液十分之一體積、濃度為200倍稀釋的SYBR熒光錄I試劑，再放在基因擴(kuò)增儀上將試管加熱至94℃，冷卻後取出反應(yīng)管在紫外光下觀察到強(qiáng)烈熒光示陽(yáng)性反應(yīng)。負(fù)對(duì)照反應(yīng)管不加様品DNA，反應(yīng)結(jié)束后同様測(cè)定紫外光下未見熒光。
實(shí)施例6實(shí)施例6的目標(biāo)基因?yàn)槿说诹旧w中一個(gè)基因片段。(美國(guó)國(guó)家生物信息中心基因庫(kù)編號(hào)GI29801752)。引物順序和特性示于表6表6，實(shí)施例6引物順序和特性

擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)131堿基，擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度70.7℃。反應(yīng)試劑與實(shí)施例2相同。反應(yīng)液dNTPs濃度0.02uM為常規(guī)用量的十分之一。引物濃度為0.05uM也常規(guī)用量的十分之一。預(yù)先將5微升含2uMdNTPs和5uM引物的補(bǔ)加液包埋在融點(diǎn)為80-85℃的石蠟置于反應(yīng)液上。初次變性75℃1分鐘，循環(huán)變75℃30秒，退火60℃30秒，延伸68℃30秒。反應(yīng)10個(gè)循環(huán)后提高變性溫度至90℃維持一分鐘。然后恢復(fù)原先程序至35循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后取樣電泳分離熒光染色顯示專一的131鹼基條帶。
權(quán)利要求
1，一種以基因組DNA或cDNA為模板的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，至少一種完成擴(kuò)增反應(yīng)或完成擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)所需的試劑置于反應(yīng)液管內(nèi)但被固體包埋或阻隔，不與反應(yīng)液接觸。反應(yīng)依次包括如下步驟(1)DNA模板變性解鏈；(2)引物與模板退火；(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互補(bǔ)DNA鏈；(4)按步驟(1)-(3)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；其特征在于在反應(yīng)中途或結(jié)束在不開管蓋和不移動(dòng)反應(yīng)管的前提下使所說(shuō)的被固體包埋或阻隔的試劑與反應(yīng)液接觸完成擴(kuò)增反應(yīng)或完成擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)。
2，根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所說(shuō)的包埋或阻隔試劑的固體是不溶于水、化學(xué)反應(yīng)惰性、比重小于水、融點(diǎn)80-97℃的化合物
3，根據(jù)權(quán)利要求1至2所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所說(shuō)的包埋或阻隔試劑的固體是融點(diǎn)80-97℃的微晶石蠟和合成石蠟。
4，根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)前5-25循環(huán)的變性溫度低于所說(shuō)的固體的融點(diǎn)，反應(yīng)后5-25循環(huán)的變性溫度高于所說(shuō)的固體的融點(diǎn)。
5，根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的變性溫度低于所說(shuō)的固體的融點(diǎn)，反應(yīng)中途有1-5個(gè)循環(huán)變性溫度高于所說(shuō)的固體的融點(diǎn)。
6，根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的變性溫度低于所說(shuō)的固體的融點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束時(shí)加熱至高于所說(shuō)的固體的融點(diǎn)。
7，根據(jù)權(quán)利要求1至5所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所說(shuō)的中途添加的試劑是反應(yīng)所需的至少四種脫氧核糖核苷酸(dNTPs)中的一種。
8，根據(jù)權(quán)利要求1至5所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所說(shuō)的中途添加的試劑是反應(yīng)所需的至少一個(gè)引物。
9，根據(jù)權(quán)利要求1至5和8所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所說(shuō)的中途添加的試劑是嵌套式PCR反應(yīng)的內(nèi)套引物。
10，根據(jù)權(quán)利要求1至5所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所說(shuō)的中途添加的試劑是反應(yīng)所需的DNA聚合酶。
11，根據(jù)權(quán)利要求1至3和6所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所說(shuō)的在反應(yīng)結(jié)束添加的試劑是核酸熒光試劑，優(yōu)選雙鏈DNA專一熒光試劑特別是SYBR錄I。
全文摘要
一種將擴(kuò)增所需試劑成份的一部份用高融點(diǎn)微晶石蠟或有類似特性的固體包埋或阻隔的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。PCR前階段變性溫度低于石蠟的融點(diǎn)，被包埋或阻隔的試劑不參與反應(yīng)，反應(yīng)中途一個(gè)循環(huán)或反應(yīng)后期的變性溫度高于石蠟的融點(diǎn)，被包埋或阻隔的試劑釋放到反應(yīng)液中參與反應(yīng)。中途釋放試劑可減少反應(yīng)前期試劑濃度提高反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性，又可提高反應(yīng)后期試劑濃度增強(qiáng)擴(kuò)增，將熒光檢測(cè)試劑預(yù)加在管內(nèi)在反應(yīng)結(jié)束釋放則可完成終點(diǎn)閉管檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1804036SQ200510023299
公開日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2005年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月13日
發(fā)明者徐定邦, 朱德芬, 謝文凱, 陳有容 申請(qǐng)人:徐定邦, 徐文慧