專利名稱：利用大菱鲆鰭細胞系繁殖大菱鲆出血性敗血癥病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用大菱鲆鰭細胞系繁殖大菱鲆出血性敗血癥病毒的方法。
背景技術(shù)：
大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)是我國海水養(yǎng)殖的一個重要支柱產(chǎn)業(yè)，但大菱鲆的傳染性病毒病的廣泛傳播，給大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的打擊，經(jīng)濟損失慘重。如何解決大菱鲆病毒病的預(yù)防和治療問題，已成為當(dāng)今世界上大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)中急需解決的重要問題。學(xué)者們認為，利用病毒疫苗免疫大菱鲆，是預(yù)防大菱鲆病毒病和提高大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟效益的重要途徑。在哺乳類和鳥類動物中，已有利用細胞系大規(guī)模繁殖病毒和生產(chǎn)病毒疫苗的成功先例，但到目前為止，在海水魚中還沒見報道。
大量的研究表明，只有建立病毒大量繁殖的條件和方法，才能成功制備和生產(chǎn)病毒疫苗，才能成功而有效地進行其病毒病的預(yù)防免疫。但至今還沒檢索到大菱鲆病毒大量繁殖成功的報道，特別是大菱鲆的主要致病病毒——大菱鲆出血性敗血癥病毒。因此，建立一種利用大菱鲆細胞系進行大菱鲆出血性敗血癥病毒的繁殖方法，是制備和生產(chǎn)大菱鲆出血性敗血癥病毒疫苗的核心技術(shù)，也是進行大菱鲆病毒病的預(yù)防免疫、提高大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟效益的關(guān)鍵技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是利用大菱鲆鰭細胞系細胞，提供一種大菱鲆出血性敗血癥病毒的繁殖方法，以便用于制備和生產(chǎn)大菱鲆出血性敗血癥病毒疫苗或者科學(xué)研究。
首先，取出患病毒性出血性白血癥的病魚的內(nèi)臟，裝入玻璃勻漿器中，添加20毫升無血清MEM培養(yǎng)液后，利用已有的勻漿處理破碎細胞，所得勻漿物進行高速離心后收集合病毒的上清液，利用0.45μm微孔濾膜過濾除菌后，直接用于以下的細胞接種。
將長滿單層的大菱鲆鰭細胞系細胞分別接種于10個500毫升培養(yǎng)瓶中，每瓶利用22.5毫升含15％小牛血清的MEM培養(yǎng)液(pH 7.0)22℃進行擴增培養(yǎng)，待細胞長至對數(shù)期時，去除原瓶中的培養(yǎng)液，每瓶接種6.75ml過濾除菌后的大菱鲆出血性敗血癥病毒液，置22℃培養(yǎng)箱中吸附2h后，加入含10％小牛血清的MEM培養(yǎng)液至22.5毫升，置22℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于接種病毒后的第4天，無菌條件下用滴管吹打下每個培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)細胞，將10瓶培養(yǎng)液和培養(yǎng)細胞的混合物收集于500毫升消毒玻璃瓶中，置于-30℃冰柜中冷凍過夜，再取出冷凍玻璃瓶于水池中流水沖化，待冰塊剛好完全溶解時，分裝入50毫升離心管中，用離心機6000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，收集離心上清液，即為大菱鲆出血性敗血癥病毒液。所得病毒液即可用于制備病毒疫苗，也可再接種于培養(yǎng)細胞進行病毒繁殖。
由此構(gòu)筑的本發(fā)明方法簡便、穩(wěn)定性好，所得的繁殖病毒，數(shù)量多、感染能力強，可直接用于病毒疫苗的制備與生產(chǎn)，對于提高養(yǎng)殖大菱鲆的存活率具有明顯的效果，實用性強。
具體實施例方式
作為實施例，本發(fā)明給出詳細具體的制備或繁殖方法。
1、大菱鲆出血性敗血癥病毒的分離制備將大菱鲆養(yǎng)殖場采集到的患病毒性出血性白血癥的病魚2尾，用解剖剪剪下病魚內(nèi)臟(肝臟、脾和胃等)20克左右，裝入50毫升玻璃勻漿器中，添加20毫升無血清市售MEM培養(yǎng)液，進行勻漿處理以破碎細胞，待勻漿物成均勻糊狀后，收集勻漿物裝入50毫升離心管中，于15000轉(zhuǎn)/分離心90分鐘，收集離心上清液，于無菌室中用0.45μm微孔濾器進行過濾，以去除細菌而直接用于細胞接種；多余的不馬上用于接種的病毒液密封后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 2、大菱鲆鰭細胞系細胞的擴大培養(yǎng)取5瓶500毫升長滿單層的大菱鲆鰭細胞系細胞，去除原有培養(yǎng)液，每瓶加入5毫升0.25％胰蛋白酶消化1.5分鐘后，迅速加入22.5毫升新配制的含15％小牛血清的MEM培養(yǎng)液(pH 7.0)，用滴管吹下培養(yǎng)瓶底部的細胞，上述所得的5瓶細胞懸液平均接種于10個500毫升培養(yǎng)瓶中，利用22.5毫升含15％小牛血清的MEM培養(yǎng)液(pH 7.0)22℃進行擴增培養(yǎng)，待細胞長至對數(shù)期時用于以下的病毒接種和繁殖。
3、培養(yǎng)大菱鲆細胞的病毒接種與繁殖在無菌室超凈臺中分別取出6.75毫升上述所得大菱鲆出血性敗血癥病毒液，分別接種于培養(yǎng)有對數(shù)期大菱鲆鰭細胞系細胞的培養(yǎng)瓶中，放入22℃培養(yǎng)箱中吸附2h，每瓶均加入含10％小牛血清的MEM培養(yǎng)液(pH7.0)至5毫升，置22℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，繁殖大菱鲆出血性敗血癥病毒。
4、繁殖病毒的收獲將已接種大菱鲆出血性敗血癥病毒的大菱鲆鰭細胞系細胞，連續(xù)培養(yǎng)4天后，在無菌室超凈臺中用滴灌將培養(yǎng)瓶中細胞從瓶底盡數(shù)吹下，裝入500毫升消毒玻璃瓶中，置-30℃冰柜中冷凍過夜，從冰柜中取出玻璃瓶放入水池中用流水沖刷，讓冰凍物融化，待冰塊剛好完全溶解時，分裝入50毫升離心管中，以6000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，收集離心所得上清液，即為病毒液，分裝入100毫升血清瓶中置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒃摬《疽河糜谥苽洳《疽呙?，或再接種于培養(yǎng)細胞進行病毒繁殖。
權(quán)利要求
1.一種利用大菱鲆鰭細胞系繁殖大菱鲆出血性敗血癥病毒的方法，首先從病毒性出血性白血癥病魚的肝臟、脾、胃和腸組織中，利用組織勻漿和高速離心方法獲得病毒液，并用0.45μm微孔濾膜過濾除菌；然后6.75ml病毒液接種至培養(yǎng)在500毫升培養(yǎng)瓶中的對數(shù)期大菱鲆鰭細胞系細胞上，在22℃吸附2h后，加入含10％小牛血清的MEM培養(yǎng)液至22.5毫升，置于22℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并于接種病毒后第4天，收集培養(yǎng)物，經(jīng)-30℃凍融1次后，離心收集大菱鲆出血性敗血癥病毒液上清。
全文摘要
一種利用大菱鲆鰭細胞系繁殖大菱鲆出血性敗血癥病毒的方法，它是以大菱鲆鰭細胞系細胞為繁殖體系，先將大菱鲆出血性敗血癥病毒接種至對數(shù)期大菱鲆鰭細胞系細胞上，22℃吸附2h后，加入含10％小牛血清的MEM培養(yǎng)液置22℃培養(yǎng)，并于病毒接種后第4天收獲培養(yǎng)物，經(jīng)－30℃凍融1次后，離心收集上清液中的大菱鲆出血性敗血癥病毒液。本發(fā)明所得的繁殖病毒，數(shù)量大，感染能力高，可直接用于病毒疫苗的制備與生產(chǎn)，提高養(yǎng)殖大菱鲆的存活率。
文檔編號C12N7/02GK1793342SQ20051004518
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月17日
發(fā)明者樊廷俊, 叢日山, 王麗燕, 耿曉芬, 楊秀霞, 李明玉, 于秋濤, 孫愛 申請人:中國海洋大學(xué)