專利名稱：一種以泥炭土為載體的固定化細(xì)菌制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞固定化技術(shù)，具體的說(shuō)是一種用于多環(huán)芳烴污染土壤原位修復(fù)的固定化微生物顆粒的制備方法，主要是以泥炭土為載體的吸附固定化微生物工藝。
背景技術(shù)：
泥炭是部分化石化的植物殘?bào)w，常呈深棕色。泥炭組成成分復(fù)雜，主要是木質(zhì)素和纖維素。泥炭具有多孔結(jié)構(gòu)，部分分解的泥炭具有近乎95％的多孔結(jié)構(gòu)以及值為200m2/g的特定表面積，是天然載體材料。
多環(huán)芳烴(PAHs)是指2個(gè)或2個(gè)以上的苯環(huán)稠合在一起的一類化合物，它們?cè)诃h(huán)境中普遍存在。人類活動(dòng)特別是化石燃料的燃燒是環(huán)境中PAHs的主要來(lái)源。由于該類化合物的辛醇-水分配系數(shù)高，水溶性差，常被吸附于土壤顆粒上。因此，土壤就成為PAHs的主要載體。PAHs在土壤中比較穩(wěn)定而且難于分解，即便采用處理土壤中易揮發(fā)、易降解有機(jī)污染物較成功的方法也很難去除土壤中的PAHs。多環(huán)芳烴在自然界中的積累會(huì)對(duì)人類以及整個(gè)自然界造成極大的危害，一些多環(huán)芳烴進(jìn)入人體和動(dòng)物體內(nèi)后，會(huì)產(chǎn)生致癌、致畸、致突變的后果。因此，有關(guān)PAHs污染土壤的修復(fù)技術(shù)倍受關(guān)注。盡快開(kāi)發(fā)出安全、高效、實(shí)用性強(qiáng)的多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)技術(shù)，是科研工作者面臨的艱巨而緊迫的任務(wù)。
近年來(lái)，發(fā)展起來(lái)的微生物修復(fù)技術(shù)為PAHs的降解提供了較好的途徑，但也存在一些缺陷，如單位體積內(nèi)有效降解菌濃度低、反應(yīng)啟動(dòng)慢、與上著菌競(jìng)爭(zhēng)處于劣勢(shì)、抗毒性侵害能力差、對(duì)環(huán)境條件敏感，加入到修復(fù)現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境中的微生物可能由于競(jìng)爭(zhēng)或難以適應(yīng)環(huán)境而導(dǎo)致作用結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大出入，使得不能很好的應(yīng)用于原位污染土壤修復(fù)。因此，亟需開(kāi)發(fā)更高效更適合于原位多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的新型生物技術(shù)，而微生物固定化技術(shù)可以克服這些弊端。
所謂固定化技術(shù)，是利用化學(xué)或物理的手段，將游離的細(xì)胞(微生物)或酶定位于限定的空間區(qū)域使其保持活性并能反復(fù)使用的一種基本技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)是可以大幅度提高參加反應(yīng)的微生物濃度，固定化后的微生物耐環(huán)境沖擊性增強(qiáng)，根據(jù)需要可選擇適宜的微生物，可降低二次污染等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛用于修復(fù)受污染的流體介質(zhì)(如廢水)和半流體介質(zhì)(如泥漿)環(huán)境中。但將固定化微生物用于降解非流體介質(zhì)(土壤)中有機(jī)污染物的研究，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
微生物固定化技術(shù)的關(guān)鍵是篩選適宜的載體材料和確定優(yōu)化的固定化工藝條件。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤的固定化顆粒制備方法。本發(fā)明以泥炭土為載體材料，采用吸附固定化方法，對(duì)高效降解多環(huán)芳烴的菌株進(jìn)行固定化，將制得的固定化微生物應(yīng)用于多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)，結(jié)果表明按照該配方制得的固定化生物產(chǎn)品對(duì)高分子量多環(huán)芳烴污染土壤具有良好的修復(fù)效果，是一種可信賴的新型環(huán)保生物產(chǎn)品。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案(固定化微生物制備方法)為一種以泥炭土為載體的固定化微生物制備方法，以經(jīng)過(guò)堿化與浸潤(rùn)處理的泥炭土為載體材料，高溫高壓蒸汽滅菌后，接入菌懸液，然后增殖培養(yǎng)，制得所需固定化顆粒所述泥炭土在作為載體以前需經(jīng)過(guò)堿化與浸潤(rùn)處理，具體處理過(guò)程為將自然風(fēng)干泥炭土過(guò)2mm篩后，用0.05～0.15mol/L NaOH溶液浸泡，固液比1∶5～10，置于恒溫?fù)u床中震蕩12～24h，110rpm；然后取出調(diào)pH至6.5～7.5，離心分離，3000rpm，10～15min；去除上清液，取沉淀物60～83℃烘干，研磨過(guò)0.25～2mm篩，然后將處理后的泥炭土按0.5～1.5ml/g的固液比用無(wú)菌水或增殖培養(yǎng)基浸潤(rùn)培養(yǎng)12～24h。
所述菌為芽孢桿菌(Bacillus sp.)，購(gòu)自北京微生物研究所，其對(duì)多環(huán)芳烴具有一定的降解能力，培養(yǎng)溫度為25～30℃；種子培養(yǎng)基可為牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，pH 7.2，較佳的種子培養(yǎng)基為葡萄糖1.25％，牛肉膏0.25％，NH4NO30.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，KCl 0.02％，pH 6.5；增殖培養(yǎng)基為葡萄糖4.0％，酵母膏0.3％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O0.025％，(NH4)2HPO40.2％，pH 7.0。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明對(duì)載體材料采用堿化與浸潤(rùn)處理等技術(shù)，制備的固定化顆粒為微生物提供了更適合的微環(huán)境，與土著菌的競(jìng)爭(zhēng)力增強(qiáng)，對(duì)環(huán)境中毒物的抗性增加，可以在不良環(huán)境中仍然發(fā)揮高效降解菌對(duì)多環(huán)芳烴的降解作用；泥炭土中含有一定量的腐殖酸，經(jīng)堿處理后生成具有良好粘結(jié)性能的腐殖酸鈉，在有水存在的條件下能形成親水溶膠，具有較大微空隙和比表面積，與微生物具有較好的親和力，提高了固定化效率；該固定化方法簡(jiǎn)單易行，適宜原位土壤大規(guī)模修復(fù)。
2.本發(fā)明所采用載體為泥炭土，主要組分是木質(zhì)素和纖維素。泥炭具有多孔結(jié)構(gòu)，部分分解的泥炭具有近乎95％的多孔結(jié)構(gòu)以及值為200m2/g的特定表面積，為微生物提供優(yōu)良的微環(huán)境，有利的屏蔽了外界土著菌的干擾，使固定化微生物很好的發(fā)揮對(duì)多環(huán)芳烴降解作用；高分子量多環(huán)芳烴一般以共代謝的方式被降解，泥炭土除作為微生物載體外，組分中的木質(zhì)素和纖維素還可為微生物提供初級(jí)共代謝底物，誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生降解多環(huán)芳烴所必需的酶類，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)高分子量多環(huán)芳烴的共代謝降解；固定化顆粒對(duì)受芘(PYR)或苯并[a]芘(BaP)等高分子量多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)中具有明顯的修復(fù)效果，在投粒比2％、修復(fù)時(shí)間60d的條件下，土壤中PYR去除率為38％，最高可達(dá)63％，而對(duì)BaP的去除率為26～45％，較游離菌提高20％以上。
3.本發(fā)明所用載體材料價(jià)格便宜，成本低，來(lái)源廣泛，通氣性良好，無(wú)毒，不會(huì)造成土壤的二次污染，亦可增加土壤肥力。


圖1為堿化泥炭土斷面固定化細(xì)菌×5,000掃描電子顯微鏡照片；圖2為堿化泥炭土斷面固定化細(xì)菌×10,000掃描電子顯微鏡照片；圖3為堿化泥炭土表面固定化細(xì)菌×7,500掃描電子顯微鏡照片；圖4為堿化泥炭土表面固定化細(xì)菌×2,000掃描電子顯微鏡照片。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1(1)固定化細(xì)菌液體培養(yǎng)在裝有種子培養(yǎng)基(葡萄糖1.25％，牛肉膏0.25％，NH4NO30.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，KCl 0.02％，pH 6.5)的三角瓶中接種芽孢桿菌，置于28～30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12h。
(2)固定化載體堿化處理將自然風(fēng)干泥炭土過(guò)2mm篩后，用0.1mol/L NaOH溶液浸泡，固液比1∶10，搖床震蕩24h，轉(zhuǎn)速110rpm；然后取出用1mol/LNaOH溶液調(diào)pH至7.0，再離心分離，3000rpm，15min；去除上清液，將沉淀物60℃烘干后，研磨過(guò)1mm篩。
(3)固定化載體浸潤(rùn)培養(yǎng)將堿化處理的泥炭土按1ml/g比例加無(wú)菌水，高溫濕熱滅菌90min，備用。
(4)固定化顆粒制備取細(xì)菌菌懸液，均勻地加入無(wú)菌載體表面，接種量2％，密封后放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，每天按1ml/g載體的量補(bǔ)加增殖培養(yǎng)基(葡萄糖4.0％，酵母膏0.3％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O 0.025％，(NH4)2HPO40.2％，pH 7.0)，3d后便制得固定化細(xì)菌顆粒。
經(jīng)上述步驟制得的固定化顆粒周期短，單位體積細(xì)胞密度大，1.35×1010個(gè)/g較游離細(xì)胞密度增加了2個(gè)數(shù)量級(jí)。
(5)對(duì)受多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的效果將制備好的固定化顆粒按2％投粒比，投入受多環(huán)芳烴污染的土壤中，60d后，土壤中PYR的去除率為42％；土壤中BaP的去除率為30％。在整個(gè)降解過(guò)程中，固定化顆粒的降解速度快，60d后固定化顆粒仍然具有85％以上的活性。
實(shí)施例2與實(shí)施例1不同處之一在于載體堿化處理步驟為將自然風(fēng)干泥炭土過(guò)2mm篩后，用1mol/L NaOH中和泥炭樣品到pH 7.0，然后用0.15mol/LNaOH調(diào)節(jié)固液比為1∶5，搖床震蕩12h，轉(zhuǎn)速110rpm，離心分離，3000rpm，10min，取沉淀物80℃烘干后，研磨過(guò)1mm篩。
不同處之二在于載體無(wú)堿化后的浸潤(rùn)處理步驟，而是直接將干燥后的泥炭土滅菌，然后接種，增殖培養(yǎng)3d，制得固定化顆粒。
不同處之三在于固定化顆粒無(wú)增殖培養(yǎng)過(guò)程。取細(xì)菌菌懸液，均勻地加入無(wú)菌載體表面，接種量2％，密封后放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3d，便制得固定化細(xì)菌顆粒。
經(jīng)上述步驟制得的固定化細(xì)菌顆粒單位體積內(nèi)細(xì)胞密度較大，4.27×109個(gè)/g，較對(duì)照提高了1個(gè)數(shù)量級(jí)。
固定化顆粒按照2％投粒比修復(fù)受多環(huán)芳烴污染的土壤，修復(fù)60d，PYR的去除率為38％，BaP的去除率為26％。
實(shí)施例3與實(shí)施例1不同處在于載體堿化處理時(shí)處理方法為將自然風(fēng)干泥炭土過(guò)2mm篩后，用0.05mol/L NaOH溶液浸泡，固液比1∶8，搖床震蕩18h，轉(zhuǎn)速110rpm；然后取出用1mol/LNaOH溶液調(diào)pH至6.5，再離心分離，3000rpm，15min；去除上清液，將沉淀物70℃烘干后，研磨過(guò)1mm篩。
經(jīng)上述步驟制得的固定化細(xì)菌顆粒單位體積內(nèi)細(xì)胞密度很大，3.16×1011個(gè)/g，較對(duì)照提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)。
固定化顆粒按照2％投粒比修復(fù)受多環(huán)芳烴污染的土壤，修復(fù)60d，PYR的去除率為47％，BaP的去除率為33％。
實(shí)施例4與實(shí)施例3不同之處在于載體浸潤(rùn)處理步驟為將堿化處理后的泥炭土按1ml/g比例加細(xì)菌培養(yǎng)液(牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaC l0.5％，pH 7.2)后，再高溫濕熱滅菌90min。結(jié)果表明經(jīng)培養(yǎng)液浸潤(rùn)的載體較經(jīng)無(wú)菌水或無(wú)浸潤(rùn)的載體對(duì)細(xì)菌吸附能力更強(qiáng)，細(xì)菌活力更持久，制得的固定化顆粒細(xì)胞密度可達(dá)3.12×1012個(gè)/g；固定化顆粒按照2％投粒比修復(fù)受多環(huán)芳烴污染的土壤，修復(fù)60d，PYR的去除率為52％，BaP的去除率為39％。
實(shí)施例5與實(shí)施例3不同處之一在于載體堿化處理時(shí)處理方法為將自然風(fēng)干泥炭土過(guò)2mm篩后，用0.1mol/L NaOH溶液浸泡，固液比1∶10，搖床震蕩12～24h，轉(zhuǎn)速110rpm；然后取出用1mol/LNaOH溶液調(diào)pH至6.5，再離心分離，3000rpm，15min；去除上清液，將沉淀物60℃烘干后，研磨至載體粒徑為0.25～0.45mm之間。
不同處之二在于載體浸潤(rùn)處理步驟為將堿化處理后的泥炭土按1ml/g比例加增殖培養(yǎng)液(葡萄糖4.0％，酵母膏0.3％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O0.025％，(NH4)2HPO40.2％，pH 7.0)后，靜止12～24h，然后高溫濕熱滅菌90min。
結(jié)果表明載體粒徑小于0.45mm時(shí)吸附的細(xì)菌數(shù)更多，經(jīng)SEM(掃描電子顯微鏡)觀察時(shí)(見(jiàn)圖1～4)，可見(jiàn)不但載體表面吸附大量細(xì)菌，而且載體中心部位也附著許多細(xì)菌；經(jīng)增殖培養(yǎng)液浸潤(rùn)的載體對(duì)細(xì)菌吸附能力更強(qiáng)，細(xì)菌活力更持久。
按上述步驟制得的固定化顆粒細(xì)胞密度可達(dá)7.23×1013個(gè)/g；固定化顆粒按照2％投粒比修復(fù)受多環(huán)芳烴污染的土壤，修復(fù)60d，PYR的去除率為63％，BaP的去除率為45％。
權(quán)利要求
1.一種以泥炭土為載體的固定化細(xì)菌制備方法，其特征在于以經(jīng)過(guò)堿化與浸潤(rùn)處理的泥炭土為載體材料，高壓蒸汽滅菌后，接入菌懸液，然后增殖培養(yǎng)，便制得所需固定化顆粒。
2.按照權(quán)利要求1所述以泥炭土為載體的固定化細(xì)菌制備方法，其特征在于所述堿化與浸潤(rùn)處理過(guò)程為將自然風(fēng)干泥炭土過(guò)篩后，用0.05～0.15mol/L NaOH溶液浸泡，固液比1∶5～10，置于恒溫?fù)u床中震蕩12～24h；然后取出調(diào)pH至6.5～7.5，離心分離；去除上清液，取沉淀物60～83℃烘干，研磨過(guò)0.25～2mm篩，然后將處理后的泥炭土按0.5～1.5ml/g的固液比用無(wú)菌水或增殖培養(yǎng)基浸潤(rùn)培養(yǎng)12～24h。
3.按照權(quán)利要求1所述以泥炭土為載體的固定化細(xì)菌制備方法，其特征在于所述菌為芽孢桿菌，培養(yǎng)溫度為25～30℃。
4.按照權(quán)利要求3所述以泥炭土為載體的固定化細(xì)菌制備方法，其特征在于所述菌為芽孢桿菌的種子培養(yǎng)基為牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl0.5％，pH7.2，或葡萄糖1.25％，牛肉膏0.25％，NH4NO30.1％，MgSO4·7H2O0.02％，KCl 0.02％，pH6.5；增殖培養(yǎng)基為葡萄糖4.0％，酵母膏0.3％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O 0.025％，(NH4)2HPO40.2％，pH7.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞固定化技術(shù)，具體的說(shuō)是一種以泥炭土為載體的固定化細(xì)菌制備方法，以經(jīng)過(guò)堿化與浸潤(rùn)處理的泥炭土為載體材料，高溫高壓蒸汽滅菌后，接入菌懸液，然后增殖培養(yǎng)，便制得所需固定化顆粒。本發(fā)明載體材料采用堿化與浸潤(rùn)處理，為微生物提供了更適合的微環(huán)境，與土著菌的競(jìng)爭(zhēng)力增強(qiáng)，對(duì)環(huán)境中毒物的抗性增加，可以在不良環(huán)境中仍然發(fā)揮高效降解菌對(duì)多環(huán)芳烴的降解作用；泥炭土中含有的腐殖酸，經(jīng)堿處理后生成具有良好粘結(jié)性能的腐殖酸鈉，在有水存在的條件下能形成親水溶膠，具有較大微空隙和比表面積，與微生物具有較好的親和力，提高了固定化效率；該固定化方法簡(jiǎn)單易行，該固定化方法簡(jiǎn)單易行，適宜原位土壤大規(guī)模修復(fù)。
文檔編號(hào)C12N11/14GK1982446SQ20051004803
公開(kāi)日2007年6月20日 申請(qǐng)日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日
發(fā)明者李培軍, 蘇丹, 鞠京麗, 張海榮, 許華夏 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所