專利名稱：可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌及其誘變選育方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌，及其誘變選育方法和用途。
背景技術(shù)：
由于多年來在動物飼養(yǎng)和飼料中廣泛和長期使用抗生素、化學(xué)合成藥物、激素等促生長保健劑，導(dǎo)致畜禽和水產(chǎn)產(chǎn)品中藥物殘留嚴(yán)重、畜禽產(chǎn)品品質(zhì)下降、細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)、耐藥菌株增多，因而極大的威脅著人類健康和生態(tài)環(huán)境。由于抗生素的上述諸多副作用，和近年來消費(fèi)者對食品安全問題的關(guān)注，世界各國都在紛紛禁用或限制抗生素的使用，并加速開發(fā)、推廣新型安全高效的綠色飼料添加劑，以減少或替代抗生素等藥物添加劑。
靈芝和靈芝糖肽復(fù)合物因其獨(dú)特的理化特性和神奇的生物學(xué)功能而成為新型綠色飼料添加劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。靈芝真菌的生長是孢子→菌絲體→子實(shí)體的過程。由于靈芝人工栽培生長周期過長(大于2-3個月)，且靈芝子實(shí)體糖肽復(fù)合物提取工序復(fù)雜，因此成本過高，難以滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的需要，從而限制了其在畜牧業(yè)中的應(yīng)用；另一方面，研究發(fā)現(xiàn)，同種(株)靈芝真菌的菌絲體與子實(shí)體的糖肽復(fù)合物的分子量、組成、結(jié)構(gòu)、比例、化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)活性相似，因此采用生物發(fā)酵方法直接培養(yǎng)靈芝真菌絲體，再分別提取胞內(nèi)、胞外糖肽復(fù)合物具有許多優(yōu)點(diǎn)。與前者相比，生物發(fā)酵法只將靈芝真菌培養(yǎng)到菌絲體階段，且其糖肽復(fù)合物后提取工序簡單，生產(chǎn)周期縮短，生產(chǎn)效率得以提高。
在生物發(fā)酵生產(chǎn)的過程中，決定生產(chǎn)水平和生產(chǎn)成本高低的主要因素有三個生產(chǎn)菌種、發(fā)酵工藝和后提取工藝或后加工工藝，其中，最重要的是生產(chǎn)菌種的特性。從自然界分離出的菌種，由于生產(chǎn)能力低，往往不能滿足工業(yè)上的需要。因?yàn)樵谡Ｉ項(xiàng)l件下，微生物依靠其代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，菌體趨向于快速生長和繁殖。但是，發(fā)酵工業(yè)的期望或需要與此相反，需要微生物的代謝產(chǎn)物，如多糖或其它活性成分等，能夠大量積累。為此，采用種種方法來打破菌種的正常代謝，使之失去自我保守性的調(diào)節(jié)控制，從而大量積累我們所需要的目標(biāo)代謝產(chǎn)物，如靈芝糖肽復(fù)合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)制備靈芝糖肽復(fù)合物飼料添加劑的成本高而不易于在動物養(yǎng)殖行業(yè)推廣使用的缺陷，通過原生質(zhì)體紫外誘變技術(shù)選育一株可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌，使其能經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)出在飼料中添加量低、功能明確，具有提高動物體免疫力、抗病力，促進(jìn)免疫系統(tǒng)生長發(fā)育，提高其奶、肉、蛋產(chǎn)量和生產(chǎn)能力，改善奶、肉、蛋的品質(zhì)和風(fēng)味，提高水產(chǎn)動物的生長速度和存活率，能廣泛用于禽、牛、羊、豬、水產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)動物，可作為抗生素的替代品等優(yōu)點(diǎn)的靈芝糖肽復(fù)合物飼料添加劑。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌的誘變選育方法。
本發(fā)明的再一目的在于該可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌用于液體發(fā)酵制備糖肽復(fù)合物飼料添加劑或免疫強(qiáng)化飼料添加劑等的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌，其分類命名為靈芝真菌Ganoderma Lucidum，于2004年11月22日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCC No.1251。
該靈芝真菌菌絲生長速度快，菌絲體為純白色，產(chǎn)孢子；需避光培養(yǎng)，其培養(yǎng)需Mg2+、K+等微量元素及B族維生素；高產(chǎn)糖肽復(fù)合物等生物活性物質(zhì)。
本發(fā)明提供的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其誘變選育步驟如下1)出發(fā)菌株CAU55菌絲體的培養(yǎng)以本實(shí)驗(yàn)室于4℃保存，購自《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，菌種保藏號為CGMCC 5.533的靈芝真菌CAU55作為出發(fā)菌株；將出發(fā)菌株CAU55接種于滅菌固體培養(yǎng)基上，25～30℃固體培養(yǎng)5～10天；將培養(yǎng)好的菌株接種于滅菌液體培養(yǎng)基中，28～32℃搖瓶培養(yǎng)3～5天，再將培養(yǎng)好的種子液接種于滅菌液體培養(yǎng)基中，28～32℃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)3～5天，得到出發(fā)菌株CAU55菌絲體液，備用；所述的固體培養(yǎng)基為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖20～30g，KH2PO41.5～3g，MgSO4·7H2O0.75～2.5g，瓊脂15～20g；所述的液體培養(yǎng)基為按下述比例配制的葡萄糖20～40g，蛋白胨2～4g，KH2PO40.5～2g，MgSO4·7H2O 0.5～2g，蒸餾水1000ml；
2)出發(fā)菌株CAU55原生質(zhì)體的制備酶解將步驟1)中培養(yǎng)的出發(fā)菌株CAU55菌絲體液于2000～4000r/min離心1～3min；去上清，加滅菌滲透壓穩(wěn)定劑1～3ml，輕微振蕩后2000～4000r/min離心1～3min，此步驟重復(fù)操作2～3次；去上清后，按酶解液(ml)菌絲體重(g)1～4∶1的比例，在菌絲體沉淀中加入濾菌后的酶解液，充分振蕩，25～30℃培養(yǎng)1～3小時(shí)，備用；過濾將酶解好的菌絲體液過濾，再用少量滲透壓穩(wěn)定劑沖洗濾膜，1000～3000r/min離心1～5min，得到出發(fā)菌株CAU55原生質(zhì)體沉淀；所述滲透壓穩(wěn)定劑為按下述比例配制的80～130g葡萄糖溶于1000ml蒸餾水中，滅菌備用；3)原生質(zhì)體的紫外誘變和再生培養(yǎng)將步驟2)所得出發(fā)菌株CAU55原生質(zhì)體沉淀制成懸浮液，并調(diào)至原生質(zhì)體個數(shù)為104～106個/ml，液層厚度0.2～0.4cm；進(jìn)行紫外線誘變，紫外線誘變所用紫外燈功率為15～18W，照射時(shí)間為0.5～5min，照射距離25～30cm；照射后立即稀釋涂布在原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，27～32℃培養(yǎng)6～10天，進(jìn)行初篩，挑選10～40個菌絲體生長速度較快的單菌落，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，用苯酚-硫酸法測定其糖肽復(fù)合物含量，選擇6～10株糖肽復(fù)合物高產(chǎn)菌株CAU550N，再分別做傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，選出一株菌絲生長速度最快，糖肽復(fù)合物產(chǎn)量最高且穩(wěn)定性好的菌株CAU5501；所述原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基為按下述比例配制的D-纖維二糖10～15g，蛋白胨2～3.5g，酵母浸粉1.5～4g，KH2PO42～3g，MgSO4·7H2O 1.0～2.5g，VB120～50μg，滲透壓穩(wěn)定劑1000ml；所述傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的步驟是將選出的6～10株糖肽復(fù)合物高產(chǎn)菌株CAU550N，分別接種到滅菌固體培養(yǎng)基上，25～30℃固體培養(yǎng)5～8天，培養(yǎng)好后再接種到滅菌固體培養(yǎng)基上，25～30℃固體培養(yǎng)5～8天，重復(fù)此步驟5～10次，觀察CAU550N的生長速度；將已傳種5～10代的CAU550N接種到液體培養(yǎng)基中，28～32℃搖瓶培養(yǎng)3～5天，再將培養(yǎng)好的種子液接種于滅菌液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，28～32℃培養(yǎng)3～5天，得菌絲體液，分別測定它們的糖肽復(fù)合物產(chǎn)量，剔除菌種退化，生長速度下降或生產(chǎn)性能下降的菌株，保留生長速度快，生產(chǎn)性能優(yōu)良、穩(wěn)定的菌株，最后得到可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌CAU5501，其分類命名為靈芝真菌Ganoderma Lucidum，于2004年11月22日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，保藏號為CGMCC No.1251。
本發(fā)明提供的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌的誘變選育方法，還包括將得到的高產(chǎn)菌株CAU5501保存在固體培養(yǎng)基II上，4℃保藏，每3個月轉(zhuǎn)接一次。轉(zhuǎn)接用于該菌株的正常傳代，以防止菌株退化。
所述固體培養(yǎng)基II為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖20～30g，KH2PO41.5～3g，MgSO4·7H2O0.75～2.5g，瓊脂15～20g。
本發(fā)明提供上述可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌的用途，該可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌可用于液體發(fā)酵制備糖肽復(fù)合物綠色飼料添加劑，或用于制備微生物飼料添加劑、免疫增強(qiáng)劑等微生物制劑。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌及其制備方法的優(yōu)點(diǎn)在于1.將原生質(zhì)體技術(shù)和紫外誘變方法相結(jié)合進(jìn)行處理，可多角度改變微生物的遺傳性能，保證變異菌株的穩(wěn)定性，并提高誘變效率，易于建立優(yōu)良再生無性變異株系；2.誘變方法不復(fù)雜，操作方便，效果明顯；3.用其發(fā)酵制備靈芝糖肽復(fù)合物飼料添加劑可明顯縮短生產(chǎn)周期達(dá)50％，降低發(fā)酵成本，使靈芝糖肽復(fù)合物在畜牧業(yè)中的應(yīng)用成為可能；4.誘變選育的高產(chǎn)菌株可用于制備微生物飼料添加劑；5.誘變選育的高產(chǎn)菌株可用于制備飼用免疫增強(qiáng)(強(qiáng)化)劑。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、誘變選育本發(fā)明的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌按照本發(fā)明提供的誘變選育方法，誘變選育可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌，其步驟如下1)出發(fā)菌株CAU55菌絲體的培養(yǎng)以本實(shí)驗(yàn)室于4℃保存，購自《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，菌種保藏號為CGMCC 5.533的靈芝真菌CAU55作為出發(fā)菌株；將出發(fā)菌株CAU55接種于滅菌固體培養(yǎng)基A上，27℃固體培養(yǎng)10天；將培養(yǎng)好的菌株接種于滅菌液體培養(yǎng)基B中，28℃搖瓶培養(yǎng)4天，再將培養(yǎng)好的種子液接種于滅菌液體培養(yǎng)基C中，32℃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)3天，得到出發(fā)菌株CAU55菌絲體液，備用；所述的固體培養(yǎng)基A為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖25g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1.5g，瓊脂15g；所述的液體培養(yǎng)基B、C為按下述比例配制的葡萄糖20g，蛋白胨3g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，蒸餾水1000ml；2)出發(fā)菌株CAU55原生質(zhì)體的制備酶解將步驟1)中培養(yǎng)的出發(fā)菌株CAU55菌絲體液于滅菌離心管中，4000r/min離心2min；去上清，加滅菌滲透壓穩(wěn)定劑3ml，輕微振蕩后3000r/min離心2min，此步驟重復(fù)操作2次；去上清后，將所得沉淀移至滅菌Eppendorf管中，差數(shù)稱重法稱重，記錄菌絲體重量；按酶解液(ml)∶菌絲體重(g)1∶1的比例，在菌絲體沉淀中加入濾菌后的酶解液，充分振蕩，25℃培養(yǎng)1小時(shí)，備用；過濾用滅菌濾器將酶解好的菌絲體液過濾至另一滅菌Eppendorf管中，再用少量滲透壓穩(wěn)定劑沖洗濾膜，3000r/min離心3min，得到出發(fā)菌株CAU55原生質(zhì)體沉淀；所述滲透壓穩(wěn)定劑為按下述比例配制的100g葡萄糖溶于1000ml蒸餾水中，滅菌備用；3)原生質(zhì)體的紫外誘變和再生培養(yǎng)將步驟2)所得出發(fā)菌株CAU55原生質(zhì)體沉淀制成懸浮液，并調(diào)至原生質(zhì)體個數(shù)為106個/ml，液層厚度0.4cm；進(jìn)行紫外線誘變，紫外線誘變所用紫外燈功率為15W，照射時(shí)間為3min，照射距離30cm；照射后立即稀釋涂布在原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基D上，27℃培養(yǎng)9天，進(jìn)行初篩，挑選20個菌絲體生長速度較快的單菌落，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，用苯酚-硫酸法測定其糖肽復(fù)合物含量，選擇10株糖肽復(fù)合物高產(chǎn)菌株CAU550N，再分別做傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，選出一株菌絲生長速度最快，糖肽復(fù)合物產(chǎn)量最高且穩(wěn)定性好的菌株CAU5501；所述原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基D為按下述比例配制的D-纖維二糖10g，蛋白胨3g，酵母浸粉2g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1.5g，VB120μg，滲透壓穩(wěn)定劑1000ml；所述傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的步驟是將選出的10株糖肽復(fù)合物高產(chǎn)菌株CAU550N，分別接種到滅菌固體培養(yǎng)基A上，25℃固體培養(yǎng)8天，培養(yǎng)好后再接種到滅菌固體培養(yǎng)基A上，25℃固體培養(yǎng)8天，重復(fù)此步驟8次，觀察CAU550N的生長速度；將已傳種8代的CAU550N接種到液體培養(yǎng)基B中，28℃搖瓶培養(yǎng)5天，再將培養(yǎng)好的種子液接種于滅菌液體培養(yǎng)基B中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，30℃培養(yǎng)3天，得菌絲體液，分別測定它們的糖肽復(fù)合物產(chǎn)量，剔除菌種退化，生長速度下降或生產(chǎn)性能下降的菌株，保留生長速度快，生產(chǎn)性能優(yōu)良、穩(wěn)定的菌株，最后得到可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌CAU5501。
將得到的高產(chǎn)菌株CAU5501保存在固體培養(yǎng)基II上，4℃保藏，每3個月轉(zhuǎn)接一次。轉(zhuǎn)接用于該菌株的正常傳代，以防止菌株退化。
所述固體培養(yǎng)基II為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖30g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 2g，瓊脂20g。
實(shí)施例2、誘變選育本發(fā)明的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌按照本發(fā)明提供的誘變選育方法，誘變選育可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌，其步驟如下1)出發(fā)菌株CAU55菌絲體的培養(yǎng)以本實(shí)驗(yàn)室于4℃保存，購自《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，菌種保藏號為CGMCC 5.533的靈芝真菌CAU55作為出發(fā)菌株；將出發(fā)菌株CAU55接種于滅菌固體培養(yǎng)基A上，25℃固體培養(yǎng)10天；將培養(yǎng)好的菌株接種于滅菌液體培養(yǎng)基B中，30℃搖瓶培養(yǎng)3天，再將培養(yǎng)好的種子液接種于滅菌液體培養(yǎng)基C中，30℃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)3天，得到出發(fā)菌株CAU55菌絲體液，備用；所述的固體培養(yǎng)基A為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖20g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，瓊脂20g；所述的液體培養(yǎng)基B、C為按下述比例配制的葡萄糖20g，蛋白胨2.5g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1.5g，蒸餾水1000ml；2)出發(fā)菌株CAU55原生質(zhì)體的制備酶解將步驟1)中培養(yǎng)的出發(fā)菌株CAU55菌絲體液于滅菌離心管中，2000r/min離心3min；去上清，加滅菌滲透壓穩(wěn)定劑2ml，輕微振蕩后2000r/min離心3min，此步驟重復(fù)操作2次；去上清后，將所得沉淀移至滅菌Eppendorf管中，差數(shù)稱重法稱重，記錄菌絲體重量；按酶解液(ml)菌絲體重(g)2∶1的比例，在菌絲體沉淀中加入濾菌后的酶解液，充分振蕩，30℃培養(yǎng)1小時(shí)，備用；過濾用滅菌濾器將酶解好的菌絲體液過濾至另一滅菌Eppendorf管中，再用少量滲透壓穩(wěn)定劑沖洗濾膜，3000r/min離心2min，得到出發(fā)菌株CAU55原生質(zhì)體沉淀；所述滲透壓穩(wěn)定劑為按下述比例配制的130g葡萄糖溶于1000ml蒸餾水中，滅菌備用；3)原生質(zhì)體的紫外誘變和再生培養(yǎng)將步驟2)所得出發(fā)菌株CAU55原生質(zhì)體沉淀制成懸浮液，并調(diào)至原生質(zhì)體個數(shù)為105個/ml，液層厚度0.2cm；進(jìn)行紫外線誘變，紫外線誘變所用紫外燈功率為15W，照射時(shí)間為2.5min，照射距離25cm；照射后立即稀釋涂布在原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基D上，30℃培養(yǎng)6天，進(jìn)行初篩，挑選40個菌絲體生長速度較快的單菌落，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，用苯酚-硫酸法測定其糖肽復(fù)合物含量，選擇6株糖肽復(fù)合物高產(chǎn)菌株CAU55N1、CAU55N2、CAU55N3、CAU55N4、CAU55N5、CAU5501，再分別做傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，選出一株菌絲生長速度最快，糖肽復(fù)合物產(chǎn)量最高且穩(wěn)定性好的菌株CAU5501；所述原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基D為按下述比例配制的D-纖維二糖12g，蛋白胨2.0g，酵母浸粉2.5g，KH2PO42.0g，MgSO4·7H2O1.5g，VB150μg，滲透壓穩(wěn)定劑1000ml；所述傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的步驟是將上述步驟選出的6株糖肽復(fù)合物高產(chǎn)菌株CAU55N1、CAU55N2、CAU55N3、CAU55N4、CAU55N5、CAU5501，分別接種到滅菌固體培養(yǎng)基A上，26℃固體培養(yǎng)6天，培養(yǎng)好后再接種到滅菌固體培養(yǎng)基A上，26℃固體培養(yǎng)6天，重復(fù)此步驟10次，觀察CAU55N1、CAU55N2、CAU55N3、CAU55N4、CAU55N5、CAU5501的生長速度；將已傳種10代的CAU55N1、CAU55N2、CAU55N3、CAU55N4、CAU55N5、CAU5501分別接種到液體培養(yǎng)基B中，30℃搖瓶培養(yǎng)4天，再將培養(yǎng)好的種子液接種于滅菌液體培養(yǎng)基B中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，30℃培養(yǎng)5天，得菌絲體液，分別測定它們的糖肽復(fù)合物產(chǎn)量，剔除菌種退化，生長速度下降或生產(chǎn)性能下降的菌株，保留生長速度快，生產(chǎn)性能優(yōu)良、穩(wěn)定的菌株，最后得到可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌CAU5501。
將此得到的高產(chǎn)菌株CAU5501保存在固體培養(yǎng)基II上，4℃保藏，每3個月轉(zhuǎn)接一次。轉(zhuǎn)接用于該菌株的正常傳代，以防止菌株退化。
所述固體培養(yǎng)基II為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖25g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.75g，瓊脂17g。
實(shí)施例3、誘變選育本發(fā)明的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌按照本發(fā)明提供的誘變選育方法，誘變選育可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌，其步驟如下1)出發(fā)菌株CAU55菌絲體的培養(yǎng)以本實(shí)驗(yàn)室于4℃保存，購自《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，菌種保藏號為CGMCC 5.533的靈芝真菌CAU55作為出發(fā)菌株；將出發(fā)菌株CAU55接種于滅菌固體培養(yǎng)基A上，30℃固體培養(yǎng)10天；將培養(yǎng)好的菌株接種于滅菌液體培養(yǎng)基B中，32℃搖瓶培養(yǎng)4天，再將培養(yǎng)好的種子液接種于滅菌液體培養(yǎng)基C中，32℃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)5天，得到出發(fā)菌株CAU55菌絲體液，備用；所述的固體培養(yǎng)基A為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖30g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 2.5g，瓊脂20g；所述的液體培養(yǎng)基B、C為按下述比例配制的葡萄糖40g，蛋白胨4g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1.5g，蒸餾水1000ml；2)出發(fā)菌株CAU55原生質(zhì)體的制備酶解將步驟1)中培養(yǎng)的出發(fā)菌株CAU55菌絲體液于滅菌離心管中，3000r/min離心1min；去上清，加滅菌滲透壓穩(wěn)定劑1ml，輕微振蕩后4000r/min離心1min，此步驟重復(fù)操作3次；去上清后，將所得沉淀移至滅菌Eppendorf管中，差數(shù)稱重法稱重，記錄菌絲體重量；按酶解液(ml)∶菌絲體重(g)4∶1的比例，在菌絲體沉淀中加入濾菌后的酶解液，充分振蕩，28℃培養(yǎng)3小時(shí)，備用；過濾用滅菌濾器將酶解好的菌絲體液過濾至另一滅菌Eppendorf管中，再用少量滲透壓穩(wěn)定劑沖洗濾膜，1000r/min離心5min，得到出發(fā)菌株CAU55原生質(zhì)體沉淀；所述滲透壓穩(wěn)定劑為按下述比例配制的80g葡萄糖溶于1000ml蒸餾水中，滅菌備用；3)原生質(zhì)體的紫外誘變和再生培養(yǎng)將步驟2)所得出發(fā)菌株CAU55原生質(zhì)體沉淀制成懸浮液，并調(diào)至原生質(zhì)體個數(shù)為104個/ml，液層厚度0.3cm；進(jìn)行紫外線誘變，紫外線誘變所用紫外燈功率為18W，照射時(shí)間為1min，照射距離25cm；照射后立即稀釋涂布在原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基D上，32℃培養(yǎng)10天，進(jìn)行初篩，挑選10個菌絲體生長速度較快的單菌落，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，用苯酚-硫酸法測定其糖肽復(fù)合物含量，選擇6株糖肽復(fù)合物高產(chǎn)菌株CAU550N，再分別做傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，選出一株菌絲生長速度最快，糖肽復(fù)合物產(chǎn)量最高且穩(wěn)定性好的菌株CAU5501；所述原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基D為按下述比例配制的D-纖維二糖15g，蛋白胨3.5g，酵母浸粉4g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1g，VB140μg，滲透壓穩(wěn)定劑1000ml；所述傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的步驟是將選出的6株糖肽復(fù)合物高產(chǎn)菌株CAU550N，分別接種到滅菌固體培養(yǎng)基A上，30℃固體培養(yǎng)5天，培養(yǎng)好后再接種到滅菌固體培養(yǎng)基A上，30℃固體培養(yǎng)5天，重復(fù)此步驟5次，觀察CAU550N的生長速度；將已傳種5代的CAU550N接種到液體培養(yǎng)基B中，32℃搖瓶培養(yǎng)3天，再將培養(yǎng)好的種子液接種于滅菌液體培養(yǎng)基B中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，32℃培養(yǎng)5天，得菌絲體液，分別測定它們的糖肽復(fù)合物產(chǎn)量，剔除菌種退化，生長速度下降或生產(chǎn)性能下降的菌株，保留生長速度快，生產(chǎn)性能優(yōu)良、穩(wěn)定的菌株，最后得到可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌CAU5501。
將此得到的高產(chǎn)菌株CAU5501保存在固體培養(yǎng)基II上，4℃保藏，每3個月轉(zhuǎn)接一次。轉(zhuǎn)接用于該菌株的正常傳代，以防止菌株退化。
所述固體培養(yǎng)基II為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖20g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O 0.75g，瓊脂15g。
對上述三個實(shí)施例所得可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌CAU5501的菌絲生長速度、產(chǎn)糖肽復(fù)合物能力進(jìn)行測試，實(shí)施例2所得可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌菌絲生長速度最快，為7.34cm/7d，其產(chǎn)胞外糖肽復(fù)合物能力也最強(qiáng)，為2.45mg/ml。將實(shí)施例2所得可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌CAU5501于2004年11月22日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，分類命名為靈芝Ganoderma Lucidum，其保藏號為CGMCC No.1251。
菌絲生長速度是衡量靈芝真菌株生長性能的有效指標(biāo)，也是縮短生產(chǎn)周期的關(guān)鍵。菌絲生長速度＝斜面培養(yǎng)基菌絲生長長度/天數(shù)(所述天數(shù)為7天)。實(shí)施例2中各步驟突變株與母株的菌絲生長速度列于表1。
表1、出發(fā)菌株與誘變株的菌絲生長速度和胞外糖肽復(fù)合物產(chǎn)量的比較

靈芝胞外糖肽復(fù)合物產(chǎn)量(mg/ml)，與靈芝糖肽復(fù)合物總產(chǎn)量呈正相關(guān)，是衡量靈芝真菌生產(chǎn)性能的重要指標(biāo)，也是衡量靈芝糖肽復(fù)合物總產(chǎn)量的關(guān)鍵指標(biāo)。測定時(shí)先利用多糖類化合物不溶于有機(jī)溶劑(乙醇)的原理將其沉淀，再利用苯酚-硫酸試劑可與多糖或糖肽中的己糖起顯色反應(yīng)的原理，使其充分反應(yīng)，由于己糖在490nm處有最大吸收，吸收值與糖含量呈線性關(guān)系，因此，根據(jù)其吸收值可得胞外糖肽復(fù)合物的產(chǎn)量。
苯酚-硫酸顯色法測定靈芝胞外糖肽復(fù)合物產(chǎn)量的方法如下標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制首先配制標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，其濃度為3mg/ml，搖勻備用；然后嚴(yán)格按下表2所列加樣量順序加樣。
表2、葡萄糖、5％苯酚、濃硫酸的加樣量

按表2在編號試管中加入葡萄糖溶液和蒸餾水，再加5％苯酚溶液1ml，混勻后緩慢滴加濃硫酸4ml，振蕩混勻，冷卻至室溫，放置20分鐘，以第一管調(diào)零點(diǎn)，在490波長處測定吸收度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值(OD值)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
樣品胞外糖肽復(fù)合物含量的測定取用乙醇處理好的樣品液3ml，4000r/m下離心20分鐘，沉淀用1ml蒸餾水溶解，再加入5％苯酚溶液1ml，混勻后緩慢滴加濃硫酸4ml，振蕩混勻，冷卻至室溫，放置20分鐘，490波長處測OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得其胞外糖肽復(fù)合物含量。實(shí)施例2中各步驟突變株與母株的產(chǎn)胞外糖肽復(fù)合物的能力比較列于表1。
實(shí)施例4、利用本發(fā)明的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌作為液體發(fā)酵制備糖肽復(fù)合物飼料添加劑利用本發(fā)明的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌作為液體發(fā)酵制備糖肽復(fù)合物飼料添加劑的具體用法如下1)制備種子液將本發(fā)明的實(shí)施例2制得的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌(Ganoderma Lucidum)接入滅菌后的液體培養(yǎng)基中，于28～32℃培養(yǎng)3～5天，得到種子液；所述液體培養(yǎng)基按以下比例配制葡萄糖20～40g，蛋白胨2～4g，KH2PO40.5～2g，MgSO4·7H2O 0.5～2g，蒸餾水1000ml。
2)發(fā)酵制備糖肽復(fù)合物飼料添加劑將發(fā)酵底物粉碎到40～120目后放入發(fā)酵罐中，依次加入水和碳源，所加入水的重量與發(fā)酵底物的重量份配比為100∶3～20，所加入碳源的含碳量與發(fā)酵底物的含氮量的重量份配比為10～80∶1，將發(fā)酵液在0.1～0.13MPa，115～125℃滅菌10～30分鐘，冷卻到25℃，再加入上述步驟制備的種子液，種子液和發(fā)酵液的體積比為0.3～15∶100，混合均勻后在25～32℃，以0.5～2.5vvm的速度通入無菌空氣，以80～200rpm速度攪拌發(fā)酵3～7天，得到糖肽復(fù)合物發(fā)酵液，于140～145℃滅菌2～8秒，得到液態(tài)糖肽類飼料添加劑；還可將該糖肽復(fù)合物飼料添加劑進(jìn)行超濾、濃縮、干燥等，得到粉狀糖肽類飼料添加劑；另外，通過發(fā)酵工業(yè)的后提取工藝(浸提、醇沉等)，可將發(fā)酵液和菌絲體分別提取胞外、胞內(nèi)糖肽復(fù)合物，得到精制糖肽類飼料添加劑——糖肽復(fù)合物飼料添加劑。
所述的發(fā)酵底物(即碳源)為選自玉米面、酒糟、麩皮、紅糖、食用白糖、玉米糖漿、淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜中的一種或幾種的混合物；所述的氮源為選自大豆蛋白、谷蛋白中的一種或幾種的混合物；所述的大豆蛋白包括大豆分離蛋白、豆粕、豆餅、大豆；所述的谷蛋白包括玉米蛋白、玉米蛋白粉和小麥蛋白。
制備的糖肽類飼料添加劑具有多種用途1)該糖肽類飼料添加劑可提高畜禽的抗體水平和細(xì)胞免疫功能，增強(qiáng)免疫力和抗病力，減少病死率。
2)該糖肽類飼料添加劑能明顯刺激動物免疫器官的生長發(fā)育，提高動物的健康水平。
3)該糖肽類飼料添加劑無毒、無殘留，具有抑制有害菌和消炎的作用，可作為抗生素替代產(chǎn)品，用于調(diào)節(jié)家畜、家禽腸道微生物區(qū)系平衡。
4)該糖肽類飼料添加劑有調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)代謝，降血脂、膽固醇，降血糖的作用，提高畜產(chǎn)品品質(zhì)。
5)該糖肽類飼料添加劑能提高動物的生產(chǎn)性能，如提高生長速度、節(jié)約飼料、降低生產(chǎn)成本等。
實(shí)施例5、實(shí)施例4制得的糖肽復(fù)合物飼料添加劑對肉仔雞生產(chǎn)性能的影響。
將1日齡公母混合的健康愛維因肉雞500只，隨機(jī)分成5個處理，每個處理100只，每個處理分為5個重復(fù)，每個重復(fù)20只雞。5個處理分別為A組，空白對照組，僅飼喂肉仔雞基礎(chǔ)日糧；B組，抗生素組，除飼喂肉仔雞基礎(chǔ)日糧外，每噸飼料添加3.2g安來霉素(常用量)；C組，靈芝糖肽復(fù)合物飼料添加劑組，除飼喂肉仔雞基礎(chǔ)日糧外，每噸飼料添加1kg實(shí)施例4制得的糖肽復(fù)合物飼料添加劑，其中有效成分2.5g/t飼料；D組，靈芝糖肽復(fù)合物飼料添加劑組，除飼喂肉仔雞基礎(chǔ)日糧外，每噸飼料添加3kg實(shí)施例4制得的糖肽復(fù)合物飼料添加劑，其中有效成分7.5g/t飼料；E組，靈芝糖肽復(fù)合物飼料添加劑組，除飼喂肉仔雞基礎(chǔ)日糧外，每噸飼料添加5kg實(shí)施例4制得的糖肽復(fù)合物飼料添加劑，其中有效成分12.5g/t飼料。
糖肽復(fù)合物對肉仔雞生產(chǎn)性能的影響結(jié)果列于表3。
表3、糖肽復(fù)合物飼料添加劑在肉仔雞生產(chǎn)性能的影響 注同行數(shù)字右肩標(biāo)有不同大寫字母(A、B、C)者為差異達(dá)極顯著(P＜0.01)，同行數(shù)字右肩標(biāo)有不同小寫字母者(a，b，c)為差異顯著(P＜0.05)，有相同字母者或無字母標(biāo)注者為差異不顯著(p＞0.05)。A、B、C、a，b，c為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性檢驗(yàn)的表示方法。
從表3可以看出，在1～4周和1～7周，D組的日增重效果最好，在1～4周D組的日增重和其它組存在極顯著差異(P＜0.01)。在整個飼養(yǎng)周期(1～7周)中，隨著糖肽復(fù)合物添加量的增加，肉仔雞日增重先上升后下降，D組的日增重是峰值和其它組差異顯著(P＜0.05)；且隨著糖肽復(fù)合物添加量的增加，肉仔雞生長的料肉比先下降后上升，D組的料肉比最小，但與其它組相比差異不顯著(p＞0.05)。從表中可以看出D組(7.5g/t糖肽復(fù)合物添加組)和B組(抗生素組)相比，日增重相似，但料肉比較低，說明D組效果好于B組?？傊?，本試驗(yàn)表明，在肉仔雞飼料中添加糖肽復(fù)合物飼料添加劑可提高家禽日增重，降低料肉比，提高生產(chǎn)性能，降低生產(chǎn)成本。
實(shí)施例6、實(shí)施例4制得的糖肽復(fù)合物飼料添加劑在養(yǎng)豬生產(chǎn)中應(yīng)用為檢驗(yàn)本發(fā)明的產(chǎn)品的功效和在養(yǎng)豬業(yè)上的應(yīng)用效果，以及代替抗生素的可行性。試驗(yàn)選取體重接近健康的35日齡斷奶仔豬(公母各半)180頭分為5個處理，每個處理(組)36頭豬，每個處理6個重復(fù)，每個重復(fù)6頭豬，均為3公3母，試驗(yàn)期8周(2個月)，試驗(yàn)結(jié)果列于表4。5個處理如下所示空白對照組不添加任何添加劑，僅飼喂豬基礎(chǔ)日糧；抗生素對照組粉劑金霉素100mg/kg，均勻混合于基礎(chǔ)日糧中；靈芝糖肽復(fù)合物1組5mg/kg實(shí)施例4制得的糖肽復(fù)合物飼料添加劑，均勻混合于基礎(chǔ)日糧中；靈芝糖肽復(fù)合物2組10mg/kg實(shí)施例4制得的糖肽復(fù)合物飼料添加劑，均勻混合于基礎(chǔ)日糧中；靈芝糖肽復(fù)合物3組15mg/kg實(shí)施例4制得的糖肽復(fù)合物飼料添加劑，均勻混合于基礎(chǔ)日糧中。
表4、在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的使用效果

從表5可以看出，添加了實(shí)施例4制得的糖肽復(fù)合物飼料添加劑的3個組的平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率均好于空白對照組，可明顯提高豬只的生產(chǎn)性能，即日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率。其中靈芝糖肽復(fù)合物2組(有效成分120mg/kg飼料)的平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率顯著好于空白對照組及抗生素組，完全可以替代抗生素。
實(shí)施例7、使用實(shí)施例4制得的糖肽復(fù)合物飼料添加劑作為免疫強(qiáng)化飼料添加劑對肉雞肉免疫器官的影響(見表5)。
表5、靈芝糖肽復(fù)合物添加劑對肉雞免疫器官生長發(fā)育的影響 注1)免疫器官指數(shù)指免疫器官(胸腺、脾臟、法氏囊等)重量與動物體重量的比值；上表BW指肉雞體重。2)同行數(shù)字右肩標(biāo)有不同大寫字母(A、B、C)者為差異達(dá)極顯著(P＜0.01)，同行數(shù)字右肩標(biāo)有不同小寫字母者(a，b，c)為差異顯著(P＜0.05)，有相同字母者或無字母標(biāo)注者為差異不顯著(p＞0.05)。A、B、C、a，b，c為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性檢驗(yàn)的表示方法。
從表5可以看出，隨著靈芝糖肽復(fù)合物添加量的增加，肉雞免疫器官胸腺、脾臟增重上升，但未形成顯著差異(p＞0.05)。隨著靈芝糖肽復(fù)合物添加量的增加，肉雞法氏囊增重上升，且差異顯著(P＜0.05)；糖肽復(fù)合物組與抗生素組間的法氏囊增重差異不顯著(p＞0.05)，但各糖肽復(fù)合物添加組與空白對照組的差異均極顯著(P＜0.01)?？傊?，本試驗(yàn)表明，在禽飼料中添加實(shí)施例4制得的糖肽復(fù)合物飼料添加劑，可促使家禽免疫器官增重、提高抗體滴度，增強(qiáng)其免疫力；且可完全替代抗生素，以消除抗生素的藥物殘留及毒副作用。
實(shí)施例8、實(shí)施例4制得的糖肽復(fù)合物飼料添加劑對雞的牛血清白蛋白(BSA)抗體效價(jià)的影響為檢測本發(fā)明實(shí)施例4制得的糖肽復(fù)合物飼料添加劑對肉雞對牛血清白蛋白(BSA)特異性抗體效價(jià)的影響，將肉仔雞分為5個組，每個組分成5個重復(fù)，每個重復(fù)20只雞，試驗(yàn)期為7周。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表6，基礎(chǔ)日糧配比及營養(yǎng)水平見表7。分別于35日齡、42日齡給肉雞左右腿肌各注射牛血清白蛋白0.5ml(牛血清白蛋白濃度為2.5mg/kg)。
表6、肉雞飼養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表7、肉仔雞日糧配方及營養(yǎng)水平

注預(yù)混料向每千克全價(jià)料提供Cu 6mg，F(xiàn)e 75mg，Zn 75mg，Mn 80mg，Se 0.2mg，10.4mg，沸石粉1mg，膽堿3mg。維生素A 6000IU，維生素D3 2000IU，維生素E 12IU，維生素K3 2mg，生物素0.05mg，葉酸0.4mg，煙酸32mg，泛酸7mg，維生素B1 1mg，維生素B2 5mg，維生素B6 1mg，維生素B12 10ug。
于28日齡、49日齡每組組取12只雞心臟采血，然后3000rpm離心10min分離血清，凍存于-20℃冰箱中，用酶聯(lián)免疫方法(ELISA)檢測BSA抗體效價(jià)，結(jié)果以O(shè)D值表示，見表8。
表8、添加糖肽復(fù)合物對28日齡肉仔雞BSA抗體效價(jià)的影響

注同行數(shù)字右肩標(biāo)有不同大寫字母(A、B、C)者為差異達(dá)極顯著(P＜0.01)，同行數(shù)字右肩標(biāo)有不同小寫字母者(a，b，c)為差異顯著(P＜0.05)，有相同字母者或無字母標(biāo)注者為差異不顯著(p＞0.05)。A、B、C、a，b，c為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性檢驗(yàn)的表示方法。
從表8可以看出，隨著實(shí)施例4制得的糖肽復(fù)合物飼料添加劑添加量的增加，肉雞體內(nèi)牛血清白蛋白抗體效價(jià)上升，死亡率下降，E組與其他各組相比差異顯著(P＜0.05)。此外，添加糖復(fù)合物組的肉仔雞的抗體效價(jià)明顯高于空白對照組和抗生素組，特別是E組更為顯著。說明實(shí)施例4制得的糖肽復(fù)合物飼料添加劑可明顯提高肉仔雞的抗體效價(jià)(抗體效價(jià)是衡量機(jī)體抵抗病原能力的重要指標(biāo)，抗體效價(jià)高即表明機(jī)體的抗病力強(qiáng))，并明顯降低死亡率。
權(quán)利要求
1.一種可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌，其分類命名為靈芝真菌GanodermaLucidum，于2004年11月22日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCC No.1251。
2.一種權(quán)利要求1所述的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其誘變選育步驟如下1)出發(fā)菌株CAU55菌絲體的培養(yǎng)以本實(shí)驗(yàn)室于4℃保存，購自《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，菌種保藏號為CGMCC 5.533的靈芝真菌CAU55作為出發(fā)菌株；將出發(fā)菌株CAU55接種于滅菌固體培養(yǎng)基上，25～30℃固體培養(yǎng)5～10天；將培養(yǎng)好的菌株接種于滅菌液體培養(yǎng)基中，28～32℃搖瓶培養(yǎng)3～5天，再將培養(yǎng)好的種子液接種于滅菌液體培養(yǎng)基中，28～32℃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)3～5天，得到出發(fā)菌株CAU55菌絲體液，備用；2)出發(fā)菌株CAU55原生質(zhì)體的制備酶解將步驟1)中培養(yǎng)的出發(fā)菌株CAU55菌絲體液離心，去上清，加滅菌滲透壓穩(wěn)定劑1～3ml，振蕩后離心，此步驟重復(fù)操作2～3次；去上清后，按酶解液菌絲體重1～4ml∶1g的比例，在菌絲體沉淀中加入濾菌后的酶解液，充分振蕩，25～30℃培養(yǎng)1～3小時(shí)，備用；過濾將酶解好的菌絲體液過濾，得到出發(fā)菌株CAU55原生質(zhì)體沉淀；3)原生質(zhì)體的紫外誘變和再生培養(yǎng)將步驟2)所得出發(fā)菌株CAU55原生質(zhì)體沉淀制成懸浮液，并調(diào)至原生質(zhì)體個數(shù)為104～106個/ml，液層厚度0.2～0.4cm；進(jìn)行紫外線誘變，紫外線誘變所用紫外燈功率為15～18W，照射時(shí)間為0.5～5min，照射距離25～30cm；照射后立即稀釋涂布在原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，27～32℃培養(yǎng)6～10天，進(jìn)行初篩，挑選10～40個菌絲體生長速度較快的單菌落，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，用苯酚-硫酸法測定其糖肽復(fù)合物含量，選擇6～10株糖肽復(fù)合物高產(chǎn)菌株CAU550N，再分別做傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，選出一株菌絲生長速度最快，糖肽復(fù)合物產(chǎn)量最高且穩(wěn)定性好的菌株，即為本發(fā)明的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌CAU5501，其分類命名為靈芝真菌Ganoderma Lucidum，于2004年11月22日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，保藏號為CGMCC No.1251。
3.如權(quán)利要求2所述的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其特征在于所述步驟1)的固體培養(yǎng)基為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖20～30g，KH2PO41.5～3g，MgSO4·7H2O 0.75～2.5g，瓊脂15～20g。
4.如權(quán)利要求2所述的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其特征在于所述步驟1)的液體培養(yǎng)基為按下述比例配制的葡萄糖20～40g，蛋白胨2～4g，KH2PO40.5～2g，MgSO4·7H2O 0.5～2g，蒸餾水1000ml。
5.如權(quán)利要求2所述的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其特征在于所述步驟2)的滲透壓穩(wěn)定劑為按下述比例配制的80～130g葡萄糖溶于1000ml蒸餾水中，滅菌備用。
6.如權(quán)利要求2所述的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其特征在于所述步驟3)的原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基為按下述比例配制的D-纖維二糖10～15g，蛋白胨2～3.5g，酵母浸粉1.5～4g，KH2PO42～3g，MgSO4·7H2O 1.0～2.5g，VB120～50μg，滲透壓穩(wěn)定劑1000ml。
7.如權(quán)利要求2所述的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其特征在于所述步驟3)的傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的步驟是將選出的6～10株糖肽復(fù)合物高產(chǎn)菌株CAU550N，分別接種到滅菌固體培養(yǎng)基上，25～30℃固體培養(yǎng)5～8天，培養(yǎng)好后再接種到滅菌固體培養(yǎng)基上，25～30℃固體培養(yǎng)5～8天，重復(fù)此步驟5～10次，觀察CAU550N的生長速度；將已傳種5～10代的CAU550N接種到液體培養(yǎng)基中，28～32℃搖瓶培養(yǎng)3～5天，再將培養(yǎng)好的種子液接種于滅菌液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，28～32℃培養(yǎng)3～5天，得菌絲體液，分別測定它們的糖肽復(fù)合物產(chǎn)量，剔除菌種退化，生長速度下降或生產(chǎn)性能下降的菌株，保留生長速度快，生產(chǎn)性能優(yōu)良、穩(wěn)定的菌株，最后得到可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌CAU5501。
8.如權(quán)利要求2所述的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其特征在于該方法還包括將得到的高產(chǎn)菌株CAU5501保存在固體培養(yǎng)基II上，4℃保藏，每3個月轉(zhuǎn)接一次。
9.如權(quán)利要求8所述的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其特征在于所述固體培養(yǎng)基II為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖20～30g，KH2PO41.5～3g，MgSO4·7H2O 0.75～2.5g，瓊脂15～20g。
10.一種權(quán)利要求1所述的可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌的用途，該可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌可用于液體發(fā)酵制備糖肽復(fù)合物飼料添加劑，或用于制備微生物飼料添加劑和免疫增強(qiáng)劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌，及其誘變選育方法和用途。該靈芝真菌其分類命名為靈芝真菌Ganoderma Lucidum，于2004年11月22日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCC No.1251。其誘變選育步驟包括以購自《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，菌種保藏號為CGMCC 5.533的靈芝真菌CAU55作為出發(fā)菌株，依次于固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到出發(fā)菌株CAU55菌絲體液；將此菌絲體液酶解、過濾，得到出發(fā)菌株CAU55原生質(zhì)體沉淀；再將此原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變和再生培養(yǎng)，最后得到可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌CAU5501。該可高產(chǎn)糖肽復(fù)合物的靈芝真菌可用于液體發(fā)酵制備糖肽復(fù)合物飼料添加劑，或用于制備益生素、免疫增強(qiáng)劑等微生制劑。
文檔編號C12N1/14GK1854288SQ20051006611
公開日2006年11月1日 申請日期2005年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者張日俊, 鉏曉艷, 王錚 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)