專利名稱：生產(chǎn)l－賴氨酸的棒狀菌和制備l－賴氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有擴(kuò)增的lysE基因(賴氨酸輸出載體基因)的棒狀菌的生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株，在這些菌株中，選自包括dapA基因(二氫吡啶二羧酸合酶基因)，lysC基因(天冬氨酸激酶基因)，dapB基因(二氫吡啶二羧酸還原酶基因)和pyc基因的組的附加基因，特別是dapA基因和lysC基因(天冬氨酸激酶基因)得到擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)，本發(fā)明也涉及制備L-賴氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-賴氨酸是商業(yè)上重要的L-氨基酸，尤其是用作動(dòng)物營養(yǎng)中的飼料添加劑。近年來需求量一直穩(wěn)步增加。
L-賴氨酸由棒狀菌，尤其是谷氨酸棒桿菌的生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株的發(fā)酵過程產(chǎn)生。由于這一產(chǎn)物非常重要，人們不斷嘗試改進(jìn)其制備過程。對(duì)過程的改進(jìn)可以涉及牽涉發(fā)酵技術(shù)的手段，攪拌和氧供給，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成(如發(fā)酵期間的糖濃度)，或產(chǎn)物的檢測(cè)(如經(jīng)離子交換色譜)，或微生物自身的內(nèi)在生產(chǎn)特征。
這些微生物的生產(chǎn)能力的特性通過利用誘變，選擇以及突變體選擇的方法來改善，以給出對(duì)抗代謝物(例如S-(2-氨乙基)半胱氨酸)具有抗性，氨基酸(例如L-亮氨酸)營養(yǎng)缺陷的，并產(chǎn)生L-賴氨酸的菌株。
一些年來重組DNA技術(shù)的方法也曾用于通過擴(kuò)增個(gè)體生物合成基因改進(jìn)谷氨酸棒桿菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株，并且研究了對(duì)L-賴氨酸生產(chǎn)影響。
就此而言，EP-A-0 088 166報(bào)道了在賦予對(duì)氨乙基半胱氨酸的抗性的DNA片段擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。EP-B-0 387 527報(bào)道了編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。EP-A-0197 335報(bào)道了編碼二氫吡啶二羧酸合酶的dapA基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。EP-A-0 219 027報(bào)道了編碼天冬氨酸半醛脫氫酶的基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。Pisabarro等(細(xì)菌學(xué)雜志175(9)，2743-2749(1993)描述了編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的dapB基因。
也已經(jīng)研究了主要代謝基因的擴(kuò)增對(duì)L-賴氨酸生產(chǎn)的影響。就此而言，EP-A-0 219 027報(bào)道了編碼天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的aspC基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。EP-A-0 143 195和EP-A-0 358 940報(bào)道了編碼烯醇丙酮酸磷酸羧化酶的ppc基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。DE-A-19831609報(bào)道了編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。
最后，DE-A-195 48 222描述了由lysE基因編碼的L-賴氨酸輸送載體的活性增加促進(jìn)賴氨酸生產(chǎn)。
除這些擴(kuò)增個(gè)體基因的嘗試之外，也嘗試了在棒狀菌中同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)或更多個(gè)基因，進(jìn)而改進(jìn)L-賴氨酸生產(chǎn)。就此而言，DE-A-38 23451報(bào)道了同時(shí)擴(kuò)增大腸桿菌asd基因和dapA基因后，生產(chǎn)能力增加。DE-A39 43 117公開了用pJC50同時(shí)擴(kuò)增編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和dapA基因后，生產(chǎn)能力增加。EP-A-0 841 395特別報(bào)道了同時(shí)擴(kuò)增編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和dapB基因后，生產(chǎn)能力增加；進(jìn)一步的改進(jìn)可以由dapB，lysA，以及ddh基因的額外擴(kuò)增完成。EP-A-0 854 189描述了同時(shí)擴(kuò)增編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和dapA，dapB，lysA和aspC基因后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。EP-A-0 857 784特別報(bào)道了同時(shí)擴(kuò)增編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和lysA基因后生產(chǎn)能力增強(qiáng)；進(jìn)一步的改進(jìn)可以由ppc基因的額外擴(kuò)增完成。

發(fā)明內(nèi)容
由許多現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)中所描述的方法可以清楚看出，需要開發(fā)新的方法并改進(jìn)用棒狀菌生產(chǎn)賴氨酸的現(xiàn)行的方法。
本發(fā)明的目的是通過新的措施提供改進(jìn)的棒狀菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株。
L-賴氨酸是商業(yè)上重要的L-氨基酸，尤其是用作動(dòng)物營養(yǎng)中的飼料添加劑。
當(dāng)L-賴氨酸或賴氨酸在下文中提及時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解為其不僅包括其本身，而且包括適當(dāng)?shù)柠}，例如賴氨酸鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。
本發(fā)明提供了棒狀菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株，它們具有擴(kuò)增的lysE基因(賴氨酸輸送載體基因)，其中它們還含有單獨(dú)或一起擴(kuò)增的、優(yōu)選超量表達(dá)的選自包括dapA基因(二氫吡啶二羧酸合酶基因)，lysC基因(天冬氨酸激酶基因)，dapB基因(二氫吡啶二羧酸還原酶基因)和pyc基因(丙酮酸羧化酶基因)組的基因，尤其是dapA基因和lysC基因。
也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)位于dapB基因上游(5’末端)的新的DNA序列，其攜帶dapB啟動(dòng)子的-35區(qū)，對(duì)dapB基因的表達(dá)是有利的。其顯示在SEQID No.1中。
因此，也要求了具有在SEQ ID No.1中顯示的核苷酸序列的能夠復(fù)制的DNA。
本發(fā)明也提供了保藏號(hào)分別為DSM12868與DSM12867的SEQID No.5和SEQ ID No.6中顯示的dapA啟動(dòng)子的MC20和MA16突變。
本發(fā)明也涉及棒狀菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株，其具有擴(kuò)增的lysE基因，在這些菌株中，dapA基因和dapB基因也同時(shí)擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)。
本發(fā)明也涉及棒狀菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株，其具有擴(kuò)增的lysE基因，在這些菌株中，dapA和lysC基因也同時(shí)擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)。
在本說明書上下文中，術(shù)語“擴(kuò)增”描述的是利用強(qiáng)啟動(dòng)子或利用編碼具有高活性的適當(dāng)酶的基因，或者可以也可以不組合這兩種手段增加基因的拷貝數(shù)，來增加由適當(dāng)DNA編碼的一種或多種酶在微生物中的胞內(nèi)活性。
本發(fā)明也提供了利用以上所描述的這些棒狀菌發(fā)酵制備L-賴氨酸的方法。
本發(fā)明提供的微生物可以從葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉或纖維素或從甘油和乙醇，尤其是從葡萄糖或蔗糖制備L-賴氨酸。所說的微生物是棒狀菌，尤其是棒桿菌屬的。在棒桿菌屬菌種中，可以特別提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其產(chǎn)生氨基酸的能力。這一物種包括野生型菌株，如谷氨酸棒桿菌ATCC13032，黃色短桿菌ATCC14067，Corynebacterium melassecolaATCC17965和來源于它們的菌株或突變體。棒狀菌的生產(chǎn)L-賴氨酸的突變體的例子如谷氨酸棒桿菌FERM-P 1709黃色短桿菌FERM-P 1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P 1712黃色短桿菌FERM-P 6463黃色短桿菌FERM-P 6464谷氨酸棒桿菌DSM 5714谷氨酸棒桿菌菌株DSM 12866DE-A-195 48 222公開了lysE基因的超量表達(dá)對(duì)L-賴氨酸生產(chǎn)的有利作用。
dapB基因或pyc基因的額外擴(kuò)增表達(dá)，或特別是編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因的額外擴(kuò)增表達(dá)，或尤其是dapA基因的額外擴(kuò)增表達(dá)，會(huì)改善L-賴氨酸的產(chǎn)量。
本發(fā)明人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)給定的lysE基因的超量表達(dá)而言，dapA與dapB基因的同時(shí)額外擴(kuò)增表達(dá)進(jìn)一步地為L-賴氨酸產(chǎn)量帶來益處。
因此，也要求了具有在SEQ ID No.1中顯示的核苷酸序列的能夠復(fù)制的DNA。
對(duì)給定的lysE基因的超量表達(dá)而言，dapA以及l(fā)ysE基因的同時(shí)額外擴(kuò)增表達(dá)對(duì)L-賴氨酸產(chǎn)生也是有利的。
擴(kuò)增(超量表達(dá))是通過增加適當(dāng)?shù)幕虻目截悢?shù)，或突變位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)區(qū)，或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒以相同的方式工作。在經(jīng)發(fā)酵形成L-賴氨酸期間，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子額外地使增加表達(dá)成為可能。延長mRNA壽命的手段也改善表達(dá)。此外，酶活性也通過阻止酶蛋白質(zhì)的降解，將基因或基因構(gòu)建體位于可變拷貝數(shù)質(zhì)粒(穿梭載體)中或者在染色體中整合和擴(kuò)增而得到提高。此外，通過改變培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)技術(shù)，獲得目標(biāo)基因的超量表達(dá)也是可能的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)從下列文獻(xiàn)中找到有關(guān)說明Martin等(生物/技術(shù)5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技術(shù)6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，EP-0 472 869，US 4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技術(shù)9，-84-87(1991))，Reinscheid等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)60，126-132(1994))，LaBarre等(細(xì)菌學(xué)雜志175，1001-1007(1993))，專利出版物WO 96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本專利申請(qǐng)公開JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技術(shù)和生物工程58，191-195(1998))或者美國細(xì)菌學(xué)會(huì)“普通細(xì)菌學(xué)方法手冊(cè)”(華盛頓DC，USA，1981)和公知的遺傳學(xué)與分子生物學(xué)手冊(cè)。
本發(fā)明所利用的谷氨酸棒桿菌的基因已被描述，并且可以用已知方法分離，制備或合成。
以下文獻(xiàn)特別描述了定點(diǎn)誘變方法Higuchi等(核酸研究16，7351-7367(1988))，Silver等的題為PCR策略的手冊(cè)，Innis，Glefand和Sninsky編輯(學(xué)術(shù)出版社，倫敦，UK，1995)。
從谷氨酸棒桿菌分離目的基因的第一個(gè)步驟是在例如大腸桿菌中構(gòu)建這一微生物的基因文庫，或者也可以是在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建該文庫。基因文庫的構(gòu)建在一般性的公知的教科書和手冊(cè)中有記載?？商峒暗睦邮荳innacker的教科書，題為從基因到克隆，基因技術(shù)導(dǎo)論(Verlag Chemie，Weinheim，德國，1990)或Sambrook等的手冊(cè)，題為分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)。Bathe等(分子和普通遺傳學(xué)，252255-265(1996))描述了利用粘粒載體SuperCosI(Wahl等美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)84，2160-2164(1987))在大腸桿菌K-12NM554(Raleigh等，核酸研究161563-1575(1988))中構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。Brmann等(分子微生物學(xué)6(3)，317-326)依次描述了采用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。谷氨酸棒桿菌在大腸桿菌中的基因文庫也可以采用質(zhì)粒如pBR322(Bolivar，生命科學(xué)25，807-818(1979))或pUC19(Norrander等，基因26101-106(1983))構(gòu)建。以相同的方式，也可使用穿梭載體，如pJC1(Cremer等，分子和普通遺傳學(xué)220，478-480(1990))或pECS(Eikmanns等，基因102，93-98(1991))，這樣的載體在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中復(fù)制。限制和/或重組缺陷菌株是特別合適的宿主，例子是大腸桿菌菌株DH5αmcr，該菌株由Grant等(美國國家科學(xué)院院報(bào)87，4645-4649(1990))描述過。其它例子是限制缺陷的谷氨酸棒桿菌菌株RM3和RM4，它們由Schfer等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)60(2)，756-759(1994))描述過。
然后，通過轉(zhuǎn)化(Hanahan，分子生物學(xué)雜志166，557-580(1983))或電穿孔(Tauch等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通訊，123343-347(1994))將基因文庫轉(zhuǎn)移到指示菌株中。指示菌株的特征是其具有目的基因突變，這導(dǎo)致可檢測(cè)的表型，例如營養(yǎng)缺陷型。指示菌株或突變體可由公開的來源或菌株保藏中心(例如耶魯大學(xué)遺傳保藏中心(New Haven，Connect-icut，USA))獲得，或如果必要特別制備。這樣的指示菌株的例子可提及的是需要內(nèi)消旋二氨基庚二酸的大腸桿菌菌株RDA8(Richaud等，C.R.Acad.Sci.Paris Ser.III 293507-512(1981))，其在dapA基因中攜帶突變(dapA::Mu)。
在攜帶目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化指示菌株和目的基因表達(dá)后，就適當(dāng)?shù)奶卣鞫?，指示菌株成為原養(yǎng)型的。如果克隆的DNA片段賦予例如針對(duì)抗代謝物S-(2-氨乙基)半胱氨酸之類的抗性，攜帶重組質(zhì)粒的指示菌株可以通過在適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充營養(yǎng)物的培養(yǎng)基上選擇鑒別。
如果目的基因區(qū)的核苷酸序列是已知的或由數(shù)據(jù)庫可獲得的，則可以用已知方法分離染色體DNA，例如如Eikmanns等(微生物學(xué)140，1817-1828(1994))描述的方法?？梢圆捎煤线m的引物通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)合成目的基因，并克隆進(jìn)合適的質(zhì)粒載體中，例如Invitrogen的pCRIITOPO(Groningen，荷蘭)。PCR方法的梗概可以從Newton和Graham的題為PCR的書中找到(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德國，1994)。
公眾可利用的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫的例子是歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)庫(EMBL，Heidelberg，德國)或生物技術(shù)信息國家中心的數(shù)據(jù)庫(NCBI，Bethesda，MD，美國)。
從谷氨酸棒桿菌ATCC13032分離與克隆lysE基因及其核苷酸序列見DE-A-195 48 222的描述。
從谷氨酸棒桿菌各種菌株中分離，克隆以及測(cè)序dapA基因在下列文獻(xiàn)中有描述Cremer等(分子和普通遺傳學(xué)220478-480(1990))，Pisabarro等(細(xì)菌學(xué)雜志1752743-2749(1993))和Bonnassie等(核酸研究186421(1990))。dapA基因的核苷酸序列可以以登記號(hào)X53993獲得。
從乳發(fā)酵短桿菌中分離，克隆以及測(cè)序dapB基因由Pisabarro等(細(xì)菌學(xué)雜志1752743-2749(1993))描述過。dapB基因的核苷酸序列可以以登記號(hào)X67737獲得。
編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因和lysC等位基因的分離，克隆以及測(cè)序由幾個(gè)作者報(bào)道過。就此而言，Kalinowski等(分子和普通遺傳學(xué)224317-324(1990))報(bào)道了來源于谷氨酸棒桿菌菌株DM58-1的lysC等位基因。DE-A-3943117報(bào)道了谷氨酸棒桿菌菌株MH20 lysC等位基因的克隆。Follettie等(細(xì)菌學(xué)雜志1754096-4103(1993))報(bào)道了黃色棒桿菌菌株N13的lysC等位基因，其可以在所說的出版物中找到。Kalinowski等(分子微生物學(xué)5，1197-1204(1991))報(bào)道了來自谷氨酸棒桿菌ATCC13032的lysC基因。lysC基因和各種lysC等位基因的核苷酸序列可以以登記號(hào)X57226和E06826獲得。
然后，可以單獨(dú)或適當(dāng)組合將以這一方法獲得的基因摻入進(jìn)質(zhì)粒載體中，例如pJC1(Cremer等，分子和普通遺傳學(xué)220，478-480(1990))或pEC5(Eikmanns等，基因，102，93-98(1991))，通過轉(zhuǎn)化例如如Thierbach等(應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)29，356-362(1988))中描述的，或通過電穿孔，例如如Dunican和Shivnan(生物/技術(shù)7，1067-1070(1989))將其轉(zhuǎn)移到所需的棒狀菌菌株中，例如菌株MH20-22B(Schrumpf等，應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)37566-571(1992))，并表達(dá)。待選擇的菌株可以用兩種質(zhì)粒載體同樣好地轉(zhuǎn)化，各質(zhì)粒載體含有所說一個(gè)或多個(gè)目的基因，從而獲得除了已知的lysE基因的擴(kuò)增外的兩種或多種基因的有利的同時(shí)擴(kuò)增表達(dá)。
這些菌株的例子是菌株MH20-22B/pJC33/pEC7lysE，其中l(wèi)ysE和lysC基因同時(shí)擴(kuò)增表達(dá)，或菌株MH20-22B/pJC50/pEC7lysE，其中l(wèi)ysE、lysC和dapA基因同時(shí)擴(kuò)增表達(dá)，或菌株MH20-22B/pJC23/pEC7lysE，其中l(wèi)ysE和dapA基因同時(shí)擴(kuò)增表達(dá)，或菌株MH20-22B/pJC23/pEC7dapBlysE，其中l(wèi)ysE，dapA和dapB基因同時(shí)擴(kuò)增表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明制備的微生物可以培養(yǎng)來連續(xù)生產(chǎn)L-賴氨酸，或者通過分批發(fā)酵，流加分批方法或重復(fù)流加分批方法不連續(xù)生產(chǎn)L-賴氨酸。已知培養(yǎng)方法的概述在Chmiel的教科書(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(生物技術(shù)1.生物工程導(dǎo)論)(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas的教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(生物反應(yīng)器和配套設(shè)備)(Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))中有描述。
所利用的培養(yǎng)基必須適合特定微生物的需要。各種微生物的培養(yǎng)基的描述在美國細(xì)菌學(xué)學(xué)會(huì)(華盛頓D.C.，USA，1981)的“普通細(xì)菌學(xué)方法手冊(cè)”中找到?？梢岳锰荚词翘呛吞妓衔铮缙咸烟?，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪，例如大豆油，向日葵油，落花生油和椰子脂肪，脂肪酸，例如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇，例如甘油和乙醇，以及有機(jī)酸，例如乙酸。這些物質(zhì)可以單獨(dú)或混合使用。可以利用氮源是有機(jī)含氮化合物，如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽抽提物，玉米漿，大豆粉和尿素，或無機(jī)化合物，如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可以單獨(dú)或混合使用?？梢岳玫牧自词橇姿岫溻浕蛄姿釟涠浕?qū)?yīng)的鈉鹽。培養(yǎng)基也必須含有金屬鹽，例如硫酸鎂或硫酸鐵，這對(duì)生長必需的。最后，除以上提及的物質(zhì)之外，可以使用必需的促生長物質(zhì)如氨基酸和維生素。所說的添加物可以一次或分批添加到培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)的pH通過適當(dāng)使用堿性化合物，如氫氧化鈉，氫氧化鉀或氨，或酸性化合物，如磷酸或硫酸控制?？梢杂美孟輨?，如脂肪酸聚乙二醇酯控制。質(zhì)粒的穩(wěn)定性可以通過向培養(yǎng)基中添加合適的選擇性作用物保持，例如抗生素。需氧條件可以通過向培養(yǎng)基中引入氧或含氧的氣體混合物保持，例如空氣。培養(yǎng)溫度通常是20℃-45℃，優(yōu)選的是25℃-40℃。繼續(xù)培養(yǎng)，直到L-賴氨酸的形成達(dá)到最大值。這一目標(biāo)通常在10小時(shí)-160小時(shí)之內(nèi)達(dá)到。
形成的L-賴氨酸的濃度可以借助氨基酸分析儀經(jīng)離子交換層析和與茚三酮的柱后反應(yīng)測(cè)定，如Spackmann等(分析化學(xué)30，1190(1958))描述的。
下列微生物按照布達(dá)佩斯條約的條款保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，Brunswick，德國)·大腸桿菌K-12菌株DH5α/pEC7lysE，保藏號(hào)DSM12871·大腸桿菌K-12菌株DH5α/pEC7dapBlysE，保藏號(hào)DSM12875·谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715/pJC23，保藏號(hào)DSM12869·谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD::dapA(MA16)，保藏號(hào)DSM12867·谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD::dapA(MC20)，保藏號(hào)DSM12868


有下列附圖·圖1pEC7lysE·圖2pEC7dapB·圖3pEC7dapBlysE用于附圖的縮寫定義如下Cm氯霉素抗性基因dapB谷氨酸棒桿菌的dapB基因lysE谷氨酸棒桿菌的lysE基因pyc谷氨酸棒桿菌的pyc基因OriE質(zhì)粒編碼的大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)pBL質(zhì)粒pBL1的DNA片段EcoRI限制酶EcoRI切割位點(diǎn)EcoRV限制酶EcoRV切割位點(diǎn)HincII限制酶HincII切割位點(diǎn)
HindIII限制酶HindIII切割位點(diǎn)KpnI限制酶KpnI切割位點(diǎn)SalI限制酶SalI切割位點(diǎn)SmaI限制酶SmaI切割位點(diǎn)SphI限制酶SphI切割位點(diǎn)PvuII限制酶PvuII切割位點(diǎn)BamHI限制酶BamHI切割位點(diǎn)具體實(shí)施方式
本發(fā)明借助下列實(shí)施例詳細(xì)說明。
實(shí)施例1制備編碼lysE的DNA染色體DNA用常規(guī)方法從菌株ATCC13032分離(Eikrmanns等，微生物學(xué)1401817-1828(1994))。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)用來擴(kuò)增攜帶lysE基因的DNA片段?；诠劝彼岚魲U菌已知的lysE基因序列(Vrljic等，分子微生物學(xué)22(5)，815-826(1996))(登記號(hào)X96471)，選擇下列引物寡核苷酸進(jìn)行PCRLysBam15′CTC GAG AGC(GGA TCC)GCG CTG ACT CAC C 3′LysBam25′GGA GAG TAC GGC(GGA TCC)ACC GTG ACC 3′所顯示的引物是通過MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成的，用Innis等的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)進(jìn)行PCR。這些引物擴(kuò)增出攜帶lysE基因的1.1kb DNA片段。所說引物也含有限制性內(nèi)切核酸酶BamHI的切割位點(diǎn)序列，在以上核苷酸序列中由括弧顯示。
借助在0.8％瓊脂糖凝膠上的電泳鑒別攜帶lysE基因的擴(kuò)增的約1.1kb DNA片段，用來源于Quiagen(Hilden，德國)的QIAquick凝膠抽提試劑盒(產(chǎn)品號(hào)28704)從凝膠上分離并純化。然后借助來源于Boehringer曼海姆(曼海姆，德國)的T4 DNA連接酶將該片段連接至載體pUC18(Norrander等，基因(26)101-106(1983))上。這一過程通過以限制性內(nèi)切核酸酶SmaI充分切割載體pUC18，并且用堿性磷酸酶(寶靈格曼海姆，曼海姆，德國)處理來完成。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α(Hanahan，DNA克隆，一種操作方法，Vol.I.IRL-出版社，牛津，華盛頓DC，USA)。通過在LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，N.Y.)上涂布轉(zhuǎn)化混合物選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞，所說的瓊脂上補(bǔ)充有氨芐青霉素50mg/l。從轉(zhuǎn)化子分離質(zhì)粒DNA，并且通過用限制酶BamHI處理，其后用瓊脂糖凝膠電泳檢查。該質(zhì)粒稱為pUC18lysE。
實(shí)施例2dapB的制備如實(shí)施例1所述，從谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032分離染色體DNA。這樣的來源于谷氨酸棒桿菌的dapB基因的序列是已知的(登記號(hào)X67737)。然而，所出版的DNA序列僅包括翻譯起始位點(diǎn)上游的56bp，因此翻譯起始位點(diǎn)的5’末端上游被附加測(cè)序。
測(cè)序利用在已知dapB序列(登記號(hào)X67737)的區(qū)中結(jié)合的引物寡核苷酸以質(zhì)粒pJC25(EP-B 0435 132)進(jìn)行。所利用的測(cè)序引物的序列是5′GAA CGC CAA CCT TGA TTC C 3′測(cè)序用由Sanger等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，(74)5463-5467(1977)描述的鏈終止方法進(jìn)行。測(cè)序反應(yīng)是借助AutoRead測(cè)序試劑盒(Pharmacia，F(xiàn)reiburg)完成的。對(duì)測(cè)序產(chǎn)品的電泳分析和檢測(cè)用Pharmacia(Freiburg，德國)的A.L.F.DNA測(cè)序儀完成。
所獲得的DNA序列用來選擇第二引物，以獲得轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的進(jìn)一步的序列數(shù)據(jù)。下列引物選擇來用于該目的5′CTT TGC CGC CGT TGG GTT C 3′如上所述進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，dapB基因上游的新序列顯示在SEQ IDNo.1中。包括dapB基因核苷酸序列的序列顯示在SEQ ID No.2中。
聚合酶鏈反應(yīng)用來擴(kuò)增dapB基因。對(duì)于這一目的而言，由MWGBiotech合成在dapB基因的已知DNA序列基礎(chǔ)上選擇的兩引物寡核苷酸P-dap5′(AAG CTT)AGG TTG TAG GCG TTG AGC 3′dapall5′TTA ACT TGT TCG GCC ACA GC 3′5′引物(引物P-dap)含有HindIII切割位點(diǎn)，在以上序列中由括弧表示。如實(shí)施例1進(jìn)行PCR。以這種方法擴(kuò)增約1.1kb DNA片段，其攜帶dapB基因并含有在一個(gè)末端的限制性內(nèi)切核酸酶HindIII切割位點(diǎn)。從0.8％瓊脂糖凝膠(QlAquick凝膠抽提試劑盒，來源于Qiagen，Hilden，德國)純化所獲得的PCR片段，用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen，Leek，荷蘭，產(chǎn)品號(hào)K4550-01)克隆進(jìn)克隆載體pCR2.1TOPO。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)Invitrogen的大腸桿菌菌株TOP10F′，將轉(zhuǎn)化混合物涂布在含有卡那霉素(50mg/l)，IPTG(0.16mM)和X-Gal(64mg/l)的LB培養(yǎng)基上，分離卡那霉素抗性菌落。借助Qiagen的QlAprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒從轉(zhuǎn)化子分離質(zhì)粒DNA，用限制酶HindIII切割和接下來的瓊脂糖凝膠電泳檢查。擴(kuò)增的DNA片段的DNA序列通過測(cè)序檢查。PCR產(chǎn)物的序列與在SEQ ID No.1中顯示的序列匹配。所獲得的質(zhì)粒稱為pCR2.1TOPOdapB。
實(shí)施例3將lysE克隆進(jìn)載體pEC7如下所述將來自質(zhì)粒pUC18lysE(實(shí)施例1)的攜帶lysE的片段插入到載體pEC7中。載體pEC7基于大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC5(Eikmanns等，10293-98(1991))。以下列方式從質(zhì)粒pEC5上除去不位于多接頭上的BamHI切割位點(diǎn)以限制酶BamHI部分切割質(zhì)粒pEC5，從瓊脂糖凝膠分離約7.2kb DNA片段，突出端以Klenow聚合酶(寶靈格曼海姆)填平。將所形成的DNA片段連接(T4連接酶，寶靈格曼海姆)。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α，在含有氯霉素(50mg/l)的LB瓊脂上分離氯霉素抗性菌落。從轉(zhuǎn)化子分離(Qiagen的QlAprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒)質(zhì)粒DNA，并且用限制酶BamHI與PstI限制切割檢查。所形成的質(zhì)粒稱為pEC6。
質(zhì)粒pEC6以限制酶XhoI充分切割。將攜帶trp終止子的DNA片段連接到載體DNA片段上(T4連接酶，寶靈格曼海姆)。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α，在含有卡那霉素(50mg/l)的LB瓊脂上分離卡那霉素抗性菌落。從轉(zhuǎn)化子分離(Qiagen的QlAprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒)質(zhì)粒DNA，并且用限制酶BamHI與XhoI限制切割檢查。所形成的質(zhì)粒稱為pEC7。
將實(shí)施例1中所描述的質(zhì)粒pUC18lysE以限制酶BamHI充分消化，攜帶lysE基因的1.1kb BamHI片段用如實(shí)施例1的方法分離。載體pEC7以限制酶BamHI同樣充分地切割，并用堿性磷酸酶處理。將BamHI載體片段和BamHI lysE片段連接(迅速DNA連接試劑盒，寶靈格曼海姆)，并且轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α。在含有氯霉素(10mg/l)的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。分離質(zhì)粒DNA(Qiagen的QlAprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒)，并且用酶BamHI限制切割檢查。所形成的質(zhì)粒稱為pEC7lysE(圖1)。通過將質(zhì)粒pEC7lysE轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α獲得的菌株稱為DH5α/pEC7lysE。
實(shí)施例4將dapB克隆進(jìn)載體pEC7從質(zhì)粒pCR2.1TOPOdapB(來源于實(shí)施例2)分離攜帶dapB基因的約1.1kb DNA片段。為這一目的，質(zhì)粒pCR2.1TOPOdapB以限制酶HindIII消化，分離攜帶dapB基因的約1.1kb DNA片段。
將攜帶dapB的DNA片段連接到載體pEC7(實(shí)施例3)(T4 DNA連接酶，寶靈格曼海姆)上，該載體已經(jīng)以限制酶HindIII充分消化，并且用堿性磷酸酶(寶靈格曼海姆)處理。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α，在含有卡那霉素(50mg/l)的LB瓊脂上分離卡那霉素抗性菌落。從轉(zhuǎn)化子分離(Qiagen的QlAprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒)質(zhì)粒DNA，并且用限制酶HindIII限制切割檢查。所形成的質(zhì)粒稱為pEC7dapB(圖2)。所獲得的大腸桿菌菌株稱為DH5α/pEC7dapB。
實(shí)施例5制備同時(shí)含有dapB和lysE的質(zhì)粒從含有谷氨酸棒桿菌ATCC13032的dapB基因的質(zhì)粒pCR2.1TOPOdapB分離作為HindIII片段的dapB基因。為此，質(zhì)粒以限制酶HindIII充分消化，從0.8％瓊脂糖凝膠(Qiagen的QlAquick凝膠抽提試劑盒)分離攜帶dapB的DNA片段。載體pEC7(實(shí)施例3)也以限制酶HindIII充分消化，并且利用堿性磷酸酶處理。將含有dapB的1.1kb片段連接到所形成的線型載體片段上(T4連接酶，寶靈格曼海姆)，并將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α。在含有氯霉素(10mg/l)的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。分離質(zhì)粒DNA(QlAprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒，Qiagen，Hilden，德國)，并且以限制酶HindIII限制切割檢查。
所形成的質(zhì)粒稱為pEC7lysEdapB。這一質(zhì)粒能夠在大腸桿菌和在棒桿菌中自我復(fù)制，并且賦予其宿主對(duì)抗生素氯霉素的抗性。
如圖3所示，質(zhì)粒pEC7lysEdapB同時(shí)含有dapB基因(其編碼二氫吡啶二羧酸還原酶)以及l(fā)ysE基因(其編碼賴氨酸輸送蛋白)。用pEC7lysEdapB轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α獲得的菌株被稱為DH5α/pEC7dapBlysE。
實(shí)施例6轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒pJC1、pJC33和pJC50轉(zhuǎn)化菌株MH20-22B質(zhì)粒pJC1能夠在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中復(fù)制(Cremer等，分子和普通遺傳學(xué)220478-480(1990))。攜帶谷氨酸棒桿菌菌株MH20-22B的lysC(Fbr)基因的質(zhì)粒pJC33(Cremer等，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)57(6)，1746-1752(1991))來源于該質(zhì)粒。
質(zhì)粒pJC50也基于載體pJC1，并且攜帶谷氨酸棒桿菌MH20-22B的lysC(FBR)基因和谷氨酸棒桿菌ATCC13032的dapA基因(DE-A-39 43 117)。
通過電穿孔法(Haynes和Britz，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通訊(61)329-334(1989))將質(zhì)粒pJC1，pJC33和pJC50引入菌株MH20-22B。谷氨酸棒桿菌菌株MH20-22B是AEC-抗性賴氨酸生產(chǎn)菌，以保藏號(hào)DSM5715保藏。
在含有卡拉霉素15mg/l的選擇瓊脂(LBHIS瓊脂(18.5g/l腦-心浸漬液，0.5M山梨醇，5g/l細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨，2.5g/l細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物的，5g/l NaCl，18g/l細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂))上，分離借助電穿孔法所獲得的轉(zhuǎn)化子。用常規(guī)方法(Peters-Wendisch等，微生物學(xué)144，915-927(1998))分離質(zhì)粒DNA，以合適的限制性內(nèi)切酶切割，并且檢查。所獲得的菌株稱為MH20-22B/pJC1，MH20-22B/pJC33和MH20-22B/pJC50。
實(shí)施例7用質(zhì)粒pEC7lysE和pEC7dapBlysE轉(zhuǎn)化其后將第二質(zhì)粒提供給實(shí)施例6中制備的菌株。
將質(zhì)粒pEC7lysE和pEC7dapBlysE用電穿孔法方法引入菌株MH20-22B/pJC1，MH20-22B/pJC33和MH20-22B/pJC50中。
轉(zhuǎn)化的細(xì)菌基于它們所含有的質(zhì)粒的抗生素抗性選擇。在選擇瓊脂(LBHIS瓊脂，含有卡那霉素15mg/l以及氯霉素7.5mg/l)上分離借助電穿孔法所獲得的轉(zhuǎn)化子。分離質(zhì)粒DNA，以合適的限制性內(nèi)切酶切割，并且檢查。
實(shí)施例8制備L-賴氨酸將實(shí)施例7獲得的各種谷氨酸棒桿菌菌株在適于賴氨酸生產(chǎn)的營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并測(cè)定上清液的賴氨酸含量。
其是由以下步驟完成的，首先于33℃在具有合適的抗生素的瓊脂平板(腦-心瓊脂，含有卡那霉素(25mg/l)，氯霉素(10mg/l))上培養(yǎng)各種菌株24小時(shí)。將這些瓊脂平板培養(yǎng)物用于接種預(yù)培養(yǎng)物(100ml錐形瓶中10ml培養(yǎng)基)。完全培養(yǎng)基CgIII用作預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基。加入卡那霉素(25mg/l)和氯霉素(10mg/l)。預(yù)培養(yǎng)在搖床上于240rpm下33℃進(jìn)行24小時(shí)。這一預(yù)培養(yǎng)物用來接種主培養(yǎng)物，以給出初始OD(660nm)0.2。培養(yǎng)基MM用于主培養(yǎng)。
培養(yǎng)基MMCSL 5gMOPS 20g/l葡萄糖50g/l(分別加壓滅菌)鹽硫酸銨25g/l磷酸二氫鉀0.1g/l七水硫酸鎂1.0g/l二水氯化鈣10mg/l七水硫酸亞鐵 10mg/l一水硫酸錳5.0mg/l生物素0.3mg/l(過濾滅菌)硫胺素*HCl0.2mg/l(過濾滅菌)碳酸鈣25g/l縮寫CSL玉米漿MOPS嗎啉丙烷磺酸CSL，MOPS和鹽溶液以氨水調(diào)整至pH7，并加壓滅菌。然后加入無菌底物、維生素溶液和干滅菌的碳酸鈣。
培養(yǎng)在具有擋板的100ml錐形瓶中的10ml體積中進(jìn)行。加入卡那霉素(25mg/l)和氯霉素(10mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。
在48小時(shí)之后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，慕尼黑)在660nm的波長下測(cè)量OD。所形成的賴氨酸的量借助Eppendorf BioTronik(漢堡，德國)的氨基酸分析儀經(jīng)離子交換層析和與茚三酮的柱后衍生化檢測(cè)反應(yīng)測(cè)定。葡萄糖含量用Skalar AnalytikGmbH(Erkelenz，德國)的糖分析儀測(cè)定。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。
表1

實(shí)施例9將aecD基因克隆進(jìn)載體pUC18用限制酶BglII和EcoRV充分消化質(zhì)粒pSIR21(Rossol，博士論文，Bielefeld大學(xué)，1992)，然后分離攜帶谷氨酸棒桿菌ATCC13032的aecD基因(登錄號(hào)M89931)(Rossol和Puhler，細(xì)菌學(xué)雜志，174(9)，2968-2977(1992))的1.4kb DNA片段。根據(jù)Sambrook等所述(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)用T4 DNA連接酶將分離出的DNA片段與已預(yù)先用BamHI和SmaI限制性內(nèi)切酶充分消化的質(zhì)粒pUC18連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α。在含有氨芐青霉素(100mg/l)的腦-心瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化子，分離質(zhì)粒DNA。所得質(zhì)粒被稱為pUC18::aecD。
實(shí)施例10將dapA基因克隆進(jìn)質(zhì)粒pSP72從質(zhì)粒pJC20(Cremer，J.博士論文，1989，Dusseldorf大學(xué))分離作為SphI-BamHI片段的dapA基因片段。載體pSP72(Promega公司，USA)用酶SphI和BamHI充分切割并用堿性磷酸酶處理。將載體和攜帶dapA的片段用T4 DNA連接酶連接，并將該DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株SL1 Blue(Bullock，F(xiàn)emandez和Short，生物技術(shù)(5)376-379(1987))。在含100mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子分離質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒被稱為pSP72::dapA。
實(shí)施例11dapA啟動(dòng)子的誘變及質(zhì)粒pSP72::dapA(MC20)和pSP72::dapA(MA16)的制備用Stratagene公司的Quickchange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖羞M(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)的誘變。根據(jù)已有的dapA序列設(shè)計(jì)如下引物用于誘變對(duì)于制備pSP72::dapA(MC20)針對(duì)MC20的引物dap1CCA AAT GAG AGA TGG TAA CCT TGA ACT CTA TGA GCA針對(duì)MC20的引物dap2GTG CTC ATA GAG TTC AAG GTT ACC ATC TTC CCT CATTTG G對(duì)于制備pSP72::dapA(MA16)針對(duì)MA16的引物dap3CCA AAT GAG GGA AGA AGG TAT AAT TGA ACT CTA TGAGCA針對(duì)MA16的引物dap4GTG CTC ATA GAG TTC AAT TAT ACC TTC TTC CCT CATTTG G根據(jù)廠商(Stratagene)指導(dǎo)用Quickchange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖幸再|(zhì)粒pSP72::dapA(實(shí)施例10)為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。
將誘變反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL1-Blue。在具有100mg/l羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，用BstEII切割證實(shí)BstEII切割位點(diǎn)的刪除，不再具有BstEII切割位點(diǎn)的質(zhì)粒具有所希望的突變。
將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化dapA缺陷型大腸桿菌突變體RDA8。轉(zhuǎn)化反應(yīng)物涂布在具有100mg/l羧芐青霉素的LB上，以測(cè)試dapA突變的互補(bǔ)作用。從轉(zhuǎn)化子中分離DNA，所得質(zhì)粒稱為pSP72::dapA(MC20)和pSP72::dapA(MA16)。用反向和通用測(cè)序引物經(jīng)Sanger等，美國科學(xué)院院刊(74)5463-5467(1977)所述的鏈終止反應(yīng)法測(cè)序質(zhì)粒。測(cè)序反應(yīng)用AutoRead測(cè)序試劑盒(Pharmacia，F(xiàn)reiburg)進(jìn)行。對(duì)測(cè)序產(chǎn)物的電泳分析和檢測(cè)用Pharmacia(Freiburg，德國)的A.L.F.DNA測(cè)序儀完成。
實(shí)施例12質(zhì)粒pK19mobsacBaecD::dapA(MC20)和pK19mobsacBaecD::dapA(MA16)的制備(誘變片段的克隆)用限制性內(nèi)切酶PvuII和SmaI充分消化質(zhì)粒pSP72::dapA(MC20)和pSP72::dapA(MA16)(實(shí)施例11)。1450bp的PvuII-SmaI片段攜帶具有突變的啟動(dòng)子MC20或MA16的dapA基因，將該片段與StuI酶切的載體pUC18::aecD(實(shí)施例9)經(jīng)T4 DNA連接酶連接。連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α。在具有100mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA。以此方式獲得質(zhì)粒pUC18aecD::dapA(MC20)和pUC18aecD::dapA(MA16)。
質(zhì)粒pUC18aecD::dapA(MC20)和pUC18aecD::dapA(MA16)用限制性內(nèi)切酶EcoRI部分酶切并用SalI酶充分酶切，以獲得3.0kb的攜帶aecD::dapA(MA16)或aecD::dapA(MC20)的片段。用T4 DNA連接酶將該片段與經(jīng)酶切并經(jīng)堿性磷酸酶處理的載體pK19mobsacB(Schafer等，基因(145)69-73(1994))連接。連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5(Hanahan(1985)，DNA克隆實(shí)用方案，第1卷，IRL出版社，Oxford，美國華盛頓特區(qū))。在具有50mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。由此獲得質(zhì)粒pK19mobsacBaecD::dapA(MC20)和pK19mobsacBaecD::dapA(MA16)。
用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株S17-1(Simon，Priefer和Puhler，生物/技術(shù)，(1)784-791(1983))。在具有50mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA并檢查。獲得的菌株稱為S17-1/pK19mobsacBaecD::dapA(MC20)和S17-1/pK19mobsacBaecD::dapA(MA16)。
實(shí)施例13制備谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD::dapA(MC20)和DSM5715aecD::dapA(MA16)用接合方法(Schafer等，細(xì)菌學(xué)雜志(172)1663-1666(1990))將S17-1/pK19mobsacBaecD::dapA(MC20)和S17-1/pK19mobsacBaecD::dapA(MA16)(實(shí)施例12)中的質(zhì)粒pK19mobsacBaecD::dapA(MC20)和pK19mobsacBaecD::dapA(MA16)轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715中。將接合混合物涂布在具有萘啶酮酸和卡那霉素的腦-心培養(yǎng)基上以選擇接合轉(zhuǎn)移子。將所得接合轉(zhuǎn)移子在10ml腦-心培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，將培養(yǎng)基等份涂布在含有蔗糖的培養(yǎng)基平板上(含10％蔗糖的腦-心瓊脂)，以根據(jù)對(duì)蔗糖的敏感性篩選。分離蔗糖抗性菌落并在含氯霉素和卡那霉素的瓊脂平板(含15mg/l卡那霉素的腦-心培養(yǎng)基和含10mg/l氯霉素的腦-心培養(yǎng)基)再檢查。
分離具有下述表型的菌落蔗糖抗性卡那霉素敏感性氯霉素敏感性經(jīng)Southern印跡(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)證實(shí)dapA片段插入aecD基因中。
實(shí)施例14制備谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7lysE，DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7lysE，DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7，DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7和DSM5715/pEC7將實(shí)施例3的lysE基因插入載體pEC7中，經(jīng)電穿孔(Haynes，1989，F(xiàn)EMS微生物通信61329-334)將質(zhì)粒pEC7lysE或質(zhì)粒pEC7導(dǎo)入菌株DSM5715aecD::dapA(MC20)，DSM5715aecD::dapA(MA16)和DSM5715(實(shí)施例13)中，獲得谷氨酸棒桿菌DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7lysE，
DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7lysE，DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7，DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7和DSM5715/pEC7。在具有25mg/l卡那霉素的腦-心瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子分離質(zhì)粒DNA并證實(shí)。
以此方式獲得如下菌株DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7lysE，DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7lysE，DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7，DSM5715aecD::daA(MA16)/pEC7和DSM5715/pEC7。
實(shí)施例15用實(shí)施例14中制得的菌株制備賴氨酸如實(shí)施例8所述，將菌株DSM5715aecD::dpA(MC20)/pEC7lysE，DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7lysE，DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7，DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7和DSM5715/pEC7在培養(yǎng)基CgIII(Kase&Nakayama，農(nóng)業(yè)和生物化學(xué)36(9)1611-1621(1972)中預(yù)培養(yǎng)，然后在生產(chǎn)培養(yǎng)基MM中培養(yǎng)。48小時(shí)后測(cè)660nm光密度和所形成的L-賴氨酸濃度。
表2示出結(jié)果。
表2

序列表<110>德古薩股份公司于利希研究中心有限公司<120>生產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌及制備L-賴氨酸的方法<130>990058BT<140>
<141>
<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>795<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>-35_信號(hào)<222>(774)..(779)<220>
<223>DNA upstream from dapB<400>1ctgcagcaat gagaccgagt aatttcgggg ttgaccagat acaccaatga gaacttggga 60acgggcttca aaaatactgg tgaagttgat gtcttcaaca atgcctgcac caggatatga 120tccggtatcg atacctggaa cgacaacctg atcaggatat ccagtgcctt gaatattgac 180gttgaggaag gaatcaccag ccatctcaac tggaagacct gacgcctgct gaattggatc 240agtggcccaa tcgacccacc aaccaggttg gccattaccg gcgatatcaa aaacaactcg 300tgtgaacgtt tcgtgctcgg caacgcggat gccagcgatc gacatatcgg agtcaccaac 360ttgagcctgc tgcttctgat ccatcgacgg ggaacccaac ggcggcaaag cagtggggga 420aggggggagt ttggtgcact ctgaaccgag tggtctctga agtggtaggc gacggggcag 480ctatctgaag gcgtgcgagt tgtggtgacc gggttagcgg tttcagtttc tgtcacaact 540ggagcaggac tagcagaggt tgtaggcgtt gagccgcttc catcacaagc acttaaaagt 600aaagaggcgg aaaccacaag cgccaaggaa ctactgcgga acgggcggtg aagggcaact 660taagtctcat atttcaaaca tagttccacc tgtgtgatta atccctagaa cggaacaaac 720tgatgaacaa tcgttaacaa cacagaccaa aacggtcagt taggtatgga tatcagcacc 780ttctgaacgg gtacg 795<210>2<211>1815<2l2>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>-35信號(hào)<222>(774)..(779)<220>
<221>-10信號(hào)<222>(798)..(803)<220>
<221>CDS<222>(851)..(1594)
<400>2ctgcagcaat gagaccgagt aatttcgggg ttgaccagat acaccaatga gaacttggga 60acgggcttca aaaatactgg tgaagttgat gtcttcaaca atgcctgcac caggatatga 120tccggtatcg atacctggaa cgacaacctg atcaggatat ccagtgcctt gaatattgac 180gttgaggaag gaatcaccag ccatctcaac tggaagacct gacgcctgct gaattggatc 240agtggcccaa tcgacccacc aaccaggttg gccattaccg gcgatatcaa aaacaactcg 300tgtgaacgtt tcgtgctcgg caacgcggat gccagcgatc gacatatcgg agtcaccaac 360ttgagcctgc tgcttctgat ccatcgacgg ggaacccaac ggcggcaaag cagtggggga 420aggggggagt ttggtgcact ctgaaccgag tggtctctga agtggtaggc gacggggcag 480ctatctgaag gcgtgcgagt tgtggtgacc gggttagcgg tttcagtttc tgtcacaact 540ggagcaggac tagcagaggt tgtaggcgtt gagccgcttc catcacaagc acttaaaagt 600aaagaggcgg aaaccacaag cgccaaggaa ctactgcgga acgggcggtg aagggcaact 660taagtctcat atttcaaaca tagttccacc tgtgtgatta atccctagaa cggaacaaac 720tgatgaacaa tcgttaacaa cacagaccaa aacggtcagt taggtatgga tatcagcacc 780ttctgaacgg gtacgtctag actggtgggc gtttgaaaaa ctcttcgccc cacgaaaatg 840aaggagcata atg gga atc aag gtt ggc gtt ctc gga gcc aaa ggc cgt889Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg1 5 10gtt ggt caa act att gtg gca gca gtc aat gag tcc gac gat ctg gag 937Val Gly Gln Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu15 20 25ctt gtt gca gag atc ggc gtc gac gat gat ttg agc ctt ctg gta gac 985Leu Val Ala Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp30 35 40 45aac ggc gct gaa gtt gtc gtt gac ttc acc act cct aac gct gtg atg 1033Asn Gly Ala Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met50 55 60ggc aac ctg gag ttc tgc atc aac aac ggc att tct gcg gtt gtt gga 1081Gly Asn Leu Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly65 70 75acc acg ggc ttc gat gat gct cgt ttg gag cag gtt cgc gac tgg ctt 1129Thr Thr Gly Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Asp Trp Leu80 85 90gaa gga aaa gac aat gtc ggt gtt ctg atc gca cct aac ttt gct atc 1177Glu Gly Lys Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile95 100 105tct gcg gtg ttg acc atg gtc ttt tcc aag cag gct gcc cgc ttc ttc 1225Ser Ala Val Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe110 115 120 125gaa tca gct gaa gtt att gag ctg cac cac ccc aac aag ctg gat gca 1273Glu Ser Ala Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Ash Lys Leu Asp Ala
130 135 140cct tca ggc acc gcg atc cac act gct cag ggc att gct gcg gca cgc1321Pro Ser Gly Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg145 150 155aaa gaa gca ggc atg gac gca cag cca gat gcg acc gag cag gca ctt1369Lys Glu Ala Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu160 165 170gag ggt tcc cgt ggc gca agc gta gat gga atc ccg gtt cat gca gtc1417Glu Gly Ser Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val175 180 185cgc atg tcc ggc atg gtt gct cac gag caa gtt atc ttt ggc acc cag1465Arg Met Ser Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln190 195 200 205ggt cag acc ttg acc atc aag cag gac tcc tat gat cgc aac tca ttt1513Gly Gln Thr Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe210 215 220gca cca ggt gtc ttg gtg ggt gtg cgc aac att gca cag cac cca ggc1561Ala Pro Gly Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly225 230 235cta gtc gta gga ctt gag cat tac cta ggc ctg taaaggctca tttcagcagc 1614Leu Val Val Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu240 245gggtggaatt ttttaaaagg agcgtttaaa ggctgtggcc gaacaagtta aattgagcgt 1674ggagttgata gcgtgcagtt cttttactcc acccgctgat gttgagtggt caactgatgt 1734tgagggcgcg gaagcactcg tcgagtttgc gggtcgtgcc tgctacgaaa cttttgataa 1794gccgaaccct cgaactgctt c1815<210>3<211>248<2l2>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>3Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln1 5 10 15Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala20 25 30Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala35 40 45Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu50 55 60Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly65 70 75 80Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Asp Trp Leu Glu Gly Lys85 90 95
Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val100 105 110Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala115 120125Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly130 135 140Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala145 150 155 160Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser165 170 175Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser180 185 190Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr195 200 205Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly2l0 215 220Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val225 230 235 240Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu245<210>4<211>79<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>dapA野生型啟動(dòng)子<400>4gttaggtttt ttgcggggtt gtttaacccc caaatgaggg aagaaggtaa ccttgaactc 60tatgagcaca ggtttaaca 79<210>5<211>79<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列的描述具有MC20突變的谷氨酸棒桿菌的dapA啟動(dòng)子<220>
<221>突變<222>(45)<400>5gttaggtttt ttgcggggtt gtttaacccc caaatgaggg aagatggtaa ccttgaactc 60tatgagcaca ggtttaaca 79
<210>6<211>80<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列的描述具有MA16突變的谷氨酸棒桿菌dapA啟動(dòng)子<220>
<221>突變<222>(35)..(53)<400>6gttaggtttt ttgcggggtt gtttaacccc caaaatgagg gaagaaggta taattgaact 60ctatgagcac aggtttaaca 80
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)L-賴氨酸的棒狀菌，其具有擴(kuò)增的lysE基因，其中所述棒狀菌含有分別由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的dapA啟動(dòng)子的MC20或MA16突變，另外，選自包括dapA基因，lysC基因，pyc基因和dapB基因的一組的額外的基因分別或一起得到擴(kuò)增。
2.如權(quán)利要求1的棒狀菌，其中dapA基因和lysC基因被擴(kuò)增。
3.一種通過發(fā)酵具有擴(kuò)增的lysE基因的棒狀菌制備L-賴氨酸的方法，其中所述方法包含如下步驟a)發(fā)酵如權(quán)利要求1的生產(chǎn)L-賴氨酸的棒狀菌，b)富集培養(yǎng)基中或在細(xì)菌的細(xì)胞中的L-賴氨酸，和c)分離所述L-賴氨酸。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中所使用的棒狀菌中dapA基因和lysC同時(shí)得到擴(kuò)增。
5.如權(quán)利要求3的方法，其中使用這樣的細(xì)菌，其dapA基因和dapB基因同時(shí)得到擴(kuò)增。
6.如權(quán)利要求3的方法，其中使用由一種或多種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，所說的質(zhì)粒載體攜帶有待擴(kuò)增的基因的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求4的方法，其中使用由一種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，所說的質(zhì)粒載體攜帶有編碼dapA，lysC和lysE基因的核苷酸序列。
8.如權(quán)利要求6的方法，其中使用由一種或多種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，所說的質(zhì)粒載體分別或一起攜帶編碼dapA，lysC，pyc和lysE基因的核苷酸序列。
9.如權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)的方法，其中所使用的細(xì)菌是谷氨酸棒桿菌。
10.大腸桿菌K-12菌株DH5α/pEC71ysE，保藏號(hào)為DSM12871。
11.谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715/pJC23，保藏號(hào)為DSM12869。
12.谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD∷dapA(MA16)，保藏號(hào)為DSM12867。
13.谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD∷dapA(MC20)，保藏號(hào)為DSM12868。
14.谷氨酸棒桿菌DM678菌株，保藏號(hào)為DSM12866。
全文摘要
本發(fā)明涉及棒狀菌的生產(chǎn)L－賴氨酸的菌株，其具有擴(kuò)增的lysE基因(賴氨酸輸送載體基因)，在這些菌株中，選自包括dapA基因(二氫吡啶二羧酸合酶基因)，lysC基因(天冬氨酸激酶基因)，dapB基因(二氫吡啶二羧酸還原酶基因)和pyc基因的組的附加基因，特別是dapA基因和lysC基因(天冬氨酸激酶基因)得到擴(kuò)增，尤其是超量表達(dá)。本發(fā)明也涉及制備L－賴氨酸的方法。
文檔編號(hào)C12P13/08GK1706935SQ20051006886
公開日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2000年7月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月7日
發(fā)明者貝蒂娜·默克爾, 瓦爾特·普費(fèi)弗勒, 卡羅琳·克羅伊策, 斯特凡·漢斯, 梅希特希爾德·里平, 洛塔爾·埃格林, 赫爾曼·扎姆, 米羅斯拉夫·帕特克 申請(qǐng)人:德古薩股份公司, 于利希研究中心有限公司