專利名稱：HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
HER2/neu為EGFR家族成員之一，該家族包括EGFR(epidermal growth factorreceptor，又稱c-c-erbB-1，HER1)、HER2/neu(c-erbB-2)、HER3(c-erbB-3)和HER4(c-erbB-4)等成員。HER2/neu基因編碼1255個氨基酸，分子量大小為185KD。胞外區(qū)分為四個功能結(jié)構(gòu)域，L1和L2區(qū)，S1和S2區(qū)。兩S區(qū)為富含半胱氨酸區(qū)。胞漿中的C末端1139、1196和1246的酪氨酸為酪氨酸磷酸化區(qū)域。HER2/neu與EGFR家族成員形成同源或異源二聚體而激活，伴隨HER2/neu胞內(nèi)的酪氨酸磷酸化，引起胞內(nèi)能結(jié)合含SH2區(qū)、SH3區(qū)和PTB區(qū)蛋白的位點活化，從而激活下游的相關(guān)蛋白的活化，通過級聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，最終影響細(xì)胞增殖、分化和存活等生理機(jī)能的改變。HER2/neu具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖效應(yīng)。激活的PI3K-Akt不僅有促進(jìn)細(xì)胞的增殖作用，而且通過NF-κB的激活使細(xì)胞具有抵抗TNF-α和各種化療藥物引起的細(xì)胞凋亡作用。甚至通過MDM2途徑，促使P53的泛素化，使P53在細(xì)胞內(nèi)的水平下降，抑制突變細(xì)胞的凋亡。所以，HER2/neu的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
臨床研究發(fā)現(xiàn)，HER2/neu在多種腫瘤組織中過表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)。HER2/neu在乳腺癌(25～30％)、卵巢癌(18～43％)、非小細(xì)胞肺癌(13～55％)、前列腺癌(5-46％)、胃癌(21-64％)、頭頸部腫瘤(16-50％)等多種上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤中過表達(dá)。HER2/neu高表達(dá)的臨床腫瘤患者對放療和化療不敏感，易發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后不佳。HER2/neu在成人正常組織中表達(dá)水平很低或不表達(dá)，因而成為腫瘤治療的理想靶分子，也是目前腫瘤研究治療的熱點。
目前，以HER2/neu為治療靶點的手段主要有1、抗HER2/neu受體的抗體，如鼠源的抗HER2/neu的4D5抗體經(jīng)人源化改造的后得到的抗體，商品名為Herceptin，1998年已被FDA批準(zhǔn)用于乳腺癌的臨床治療，并收到了較好的治療效果；2、抑制HER2/neu表達(dá)的策略，如5型腺病毒的ElA蛋白可抑制HER2/neu mRNA的轉(zhuǎn)錄，使HER2/neu高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞生長受到抑制，轉(zhuǎn)移能力下降，對化療藥物敏感性增強(qiáng)，對它的研究已進(jìn)入臨床II期；3、抑制HER2/neu的酪氨酸激酶活性和信號傳導(dǎo)途徑，emodin能抑制HER2/neu的自身磷酸化和酪氨酸激酶活性，喹唑啉類的CI-1033能抑制EGFR家族酪氨酸磷酸化，已通過I期臨床實驗。此外還有針對HER2/neu的小分子模擬肽、反義核苷酸和HER2/neu的DNA疫苗等。
最近的研究發(fā)現(xiàn)，HER2/neu mRNA加工過程中可發(fā)生選擇性地剪接，產(chǎn)生一種可溶性的受體-Herstatin。體外實驗證實，Herstatin能與細(xì)胞表面HER2/neu高親和力結(jié)合，它們的親和常數(shù)為14nM。與HER2/neu結(jié)合后干擾HER2/neu同源或異源二聚體的形成。Herstatin存在時，AKTPI3K/AKT的磷酸化水平僅為對照細(xì)胞的2％，AKT信號通路幾乎完全被抑制。此外，Herstatin可阻礙HER2/neu和HER3間異源二聚體形成，由于HER3缺乏自身磷酸化的能力，它的磷酸化過程依賴于與其他EGFR受體家族成員形成異二聚體。所以，Herstatin作用于HER2過表達(dá)的SKOV-3細(xì)胞和NIH3T3/HER2細(xì)胞，可使其克隆形成能力降低數(shù)倍，細(xì)胞增殖能力受到抑制。
但Herstatin如何與HER2/neu相互作用這一基本的問題目前還不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段，是具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的多肽或?qū)⑿蛄斜碇蠸EQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且可與Herstatin相互作用的多肽。
序列表中的序列1由340個氨基酸殘基組成，為L1和S1結(jié)構(gòu)域，自序列1的氨基端第149-151位、170-171位、173-181位、256位、266-267位、275-280位、284位、317-319位、321-324位、329位、336-340位氨基酸殘基為直接參與作用的氨基酸殘基。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
所述HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段的編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1多肽序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能多肽的DNA序列。
序列表中的序列2由1020個堿基組成，其開放閱讀框架為自5′端起第1位-1020位堿基。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
含有所述HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段編碼基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增所述HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段編碼基因中任一片段的引物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明采用結(jié)構(gòu)生物學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)相結(jié)合的方法，根據(jù)已解析出的HER2/neu細(xì)胞外區(qū)ECD的晶體結(jié)構(gòu)，利用同源模建、分子對接的方法獲得Herstatin與HER2/neu相互作用的復(fù)合物理論模型。借助分子間氫鍵形成理論、反應(yīng)自由能理論、范德華作用力及靜電作用從理論上初步確定Herstatin與HER2/neu結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)，及參與二者結(jié)合的關(guān)鍵性殘基。根據(jù)計算機(jī)模擬結(jié)果，利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移和免疫共沉淀等技術(shù)手段，證實計算機(jī)模擬的正確性，得到HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段。
本發(fā)明的HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段是HER2/neu分子能被有效抑制的敏感位點，是今后設(shè)計拮抗HER2/neu的小分子肽或抑制劑的理想靶標(biāo)，將在制備拮抗HER2/neu的藥物中發(fā)揮重要作用。


圖1A為pcDNA3.1(-)myc-his/Hst載體的酶切鑒定結(jié)果圖1B為含有pDsRedHst載體的菌落PCR鑒定結(jié)果圖1C為pDsRedHst載體的XhoI和HindIII雙酶切鑒定結(jié)果圖1D為pcDNA3.1(-)myc-his/Hst和pDsRedHst轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞表達(dá)的Herstatin和DsRedHst電泳圖譜圖2A為以Her2/neu胞外段晶體結(jié)構(gòu)為模板獲得的Her2/neu胞外段理論空間結(jié)構(gòu)圖2B為Herstatin蛋白C端79個殘基二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖2C為利用從頭搭建、同源模建獲得的Herstatin蛋白優(yōu)化構(gòu)象圖2D為Her2/neu與Herstatin作用復(fù)合物模型圖2E為Her2/neu與Herstatin二者的作用模式示意3為HER2/neu缺失突變體與EGFP融合蛋白ErbB2ECD-EGFP、mE1-EGFP和mE2-EGFP及DsRedHst示意4A為pDsRedHst單獨轉(zhuǎn)染時，表達(dá)的DsRedHst的細(xì)胞定位照片圖4B為pEGFP/ECDt單獨轉(zhuǎn)染時，表達(dá)的ErbB2ECD-EGFP的細(xì)胞定位照片圖4C為pEGFP/mE1單獨轉(zhuǎn)染時，表達(dá)的mE1-EGFP細(xì)胞定位照片圖4D為pEGFP/mE2單獨轉(zhuǎn)染時，表達(dá)的mE2-EGFP定位照片圖5A為pDsRedHst與pEGFP/ECDt共轉(zhuǎn)染時，表達(dá)的ErbB2ECD-EGFP細(xì)胞定位照片圖5B為pDsRedHst與pEGFP/ECDt共轉(zhuǎn)染時，表達(dá)的DsRedHst細(xì)胞定位照片圖5C為pDsRedHst與pEGFP/ECDt共轉(zhuǎn)染時，表達(dá)的ErbB2ECD-EGFP和DsRedHst疊加的細(xì)胞定位照片圖5D為pDsRedHst與pEGFP/ECDt共轉(zhuǎn)染時，表達(dá)的ErbB2ECD-EGFP和DsRedHst的FRET結(jié)果圖6A為pDsRedHst與pEGFP/mE1共轉(zhuǎn)染時，表達(dá)的mE1-EGFP細(xì)胞定位照片圖6B為pDsRedHst與pEGFP/mE1共轉(zhuǎn)染時，表達(dá)的DsRedHst細(xì)胞定位照片圖6C為pDsRedHst與pEGFP/mE1共轉(zhuǎn)染時，表達(dá)的mE1-EGFP和DsRedHst疊加的細(xì)胞定位照片圖6D為pDsRedHst與pEGFP/mE1共轉(zhuǎn)染時，表達(dá)的mE1-EGFP和DsRedHst的FRET結(jié)果圖7A為pDsRedHst pEGFP/mE2共轉(zhuǎn)染時，表達(dá)的mE1-EGFP細(xì)胞定位照片圖7B為pDsRedHst與pEGFP/mE2共轉(zhuǎn)染時，表達(dá)的DsRedHst細(xì)胞定位照片圖7C為pDsRedHst與pEGFP/mE2共轉(zhuǎn)染時，表達(dá)的mE1-EGFP和DsRedHst疊加的細(xì)胞定位照片圖7D為pDsRedHst與pEGFP/mE2共轉(zhuǎn)染時，表達(dá)的mE2-EGFP和DsRedHst的FRET結(jié)果圖8為免疫共沉淀結(jié)果具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1、HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段一、Herstatin基因的克隆及表達(dá)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM和pcDNA3.1/Myc-His(-)為Invitrogen產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs公司；T4DNA連接酶購自Promega公司；Pyrobest DNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000為TaKaRa產(chǎn)品；DNA片段回收試劑盒、質(zhì)?；厥赵噭┖匈徸圆┐筇┛斯荆灰镉刹櫳镉邢薰竞铣?。
1、構(gòu)建pcDNA3.1(-)myc-his/Hst載體按Doherty等(Doherty JK，Bond C，Jardim A，Adelman JP，Clinton GM.1996.The ER-2/neu receptor tyrosine kinase gene encodes a secreted autoinhibitor.Proc Natl Acad Sci USA 9610869-10874)介紹的方法將Herstatin的全長cDNA(克隆號gi|10181232|gb|AF177761.2|AF177761)克隆到pcDNA3.1(-)mvc-his表達(dá)載體的限制性內(nèi)切酶XhoI和HindIII識別位點間，得到含有Herstatin的全長cDNA的重組表達(dá)載體pcDNA3.1(-)myc-his/Hst。將pcDNA3.1(-)myc-his/Hst導(dǎo)入E.coli JM109，培養(yǎng)E.coli JM109，提取質(zhì)粒，用XhoI和HindIII雙酶切提取的質(zhì)粒，1％瓊脂糖凝膠電泳后可得到一條分子量為1300bp左右的酶切片段(圖1A)。圖1A中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，1為pcDNA3.1(-)myc-his/Hst。說明目的片段成功地插入載體中。將pcDNA3.1(-)myc-his/Hst載體送上海博亞生物有限公司測序，測序結(jié)果與GenBank中公布的序列比較并用DNAClub軟件預(yù)測表達(dá)的蛋白序列。測序結(jié)果與GenBank中公布的cDNA序列一致，預(yù)測表達(dá)的氨基酸序列結(jié)果也一致。
2、構(gòu)建Herstatin與DsRed融合蛋白表達(dá)載體pDsRedHstpcDNA3.1(-)myc-his/Hst經(jīng)XhoI和HindIII雙酶切后，回收1300bp酶切片段，與同樣雙酶切后的線性質(zhì)粒pDsRed-Express-N1(購自Clontech)，經(jīng)T4DNA連接酶連接。室溫連接4小時后，轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌。12小時后挑取轉(zhuǎn)化菌落。利用引物P1ccgctcgaggcaccatggagctggcggc和P2cccaagcttgccttcatac cgggac進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增Herstatin基因，結(jié)果如圖1B所示，得到大小為1300bp的片段；提取質(zhì)粒經(jīng)XhoI和HindIII雙酶切鑒定，結(jié)果得到與插入基因大小相同1300bp的片段(圖1C)。說明載體構(gòu)建成功，命名為pDsRedHst。圖1B和圖1C中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；圖1B中2、3、4和5為菌落號；圖1C中，6為pDsRedHst。
3、pcDNA3.1(-)myc-his/Hst和pDsRedHst轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞將pcDNA3.1(-)myc-his/Hst、pDsRedHst通過轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM分別轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，具體方法如下細(xì)胞培養(yǎng)于含10％FCS的DMEM培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染前一天均勻鋪于6孔板，每孔3×105個細(xì)胞，24h后，開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染。載體pcDNA3.1(-)myc-his/Hst或pDsRedHst 3μg/孔，脂質(zhì)體9μl/孔，分別加入用無抗生素?zé)o血清的雙無DMEM培養(yǎng)基，至最終體積100μl，混勻。靜置10min后，將兩液(含有載體的DMEM和含有脂質(zhì)體的DMEM)混合，室溫放置30min。吸棄培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，用雙無DMEM培養(yǎng)液輕輕洗兩次，加入800μl雙無DMEM培養(yǎng)液。再將混勻好的載體/脂質(zhì)體混合液200μl加入培養(yǎng)板，輕輕混勻。細(xì)胞置于5％CO2，37℃孵箱孵育8h。加入等體積(1mL)20％FCS的DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h后，吸棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗二次，每孔加入80μl1×SDS上樣緩沖液(50mmol/L Tris，pH6.8，2％SDS，10％甘油，0.1％溴酚藍(lán)，臨用前加入100mmol/LDTT)，刮下細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液吸入EP管。100℃水浴3min。離心取上清進(jìn)行10％SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)印膜用含5％脫脂奶粉的TBS(150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris，pH7.5)室溫封閉2h。5％脫脂奶TBS-T(50mmol/L NaCl，50mmol/L Tris，pH7.5，0.2％Tween 20)稀釋Herstatin抗體(anti-Herstatin，克隆號CW001，Upstate產(chǎn)品，美國)至1μg/ml，4℃孵育3h，TBS-T洗膜3次，每次10min；用5％脫脂奶稀釋HRP-羊抗鼠IgG(購自中山生物制品有限公司)(1∶5000)，室溫孵育1h，TBS洗膜3次，每次10min；按照公司手冊(Amersham Biosciences產(chǎn)品，美國)用增敏的化學(xué)發(fā)光底物(ECL)，進(jìn)行X光顯影。結(jié)果如圖1D所示，表明轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)myc-his/Hst的CHO細(xì)胞表達(dá)的Herstatin為60KD左右蛋白，除該條帶外，還可在上述細(xì)胞中檢測到一條特異的大分子條帶，其可能為Herstatin的多聚體；轉(zhuǎn)染pDsRedHst的CHO細(xì)胞表達(dá)的Herstatin與DsRed融合蛋白-DsRedHst則為87KD左右。圖1D中，1為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)myc-his/Hst的CHO細(xì)胞表達(dá)的Herstatin；2為轉(zhuǎn)染pDsRedHst的CHO細(xì)胞表達(dá)的DsRedHst。
二、Her2/neu和Herstatin空間結(jié)構(gòu)的理論模擬1、Her2/neu空間結(jié)構(gòu)的理論模擬以Her2/neu基因胞外段晶體結(jié)構(gòu)(PDB庫號1n8z)為模板，利用InsightII(2000)程序包同源模建方法從理論上構(gòu)建Her2/neu胞外段功能域的理論空間結(jié)構(gòu)。依次選擇CVFF、Amber力場，通過InsightII(2000)程序包Discover_3方法對構(gòu)建的Her2/neu胞外段功能域理論空間結(jié)構(gòu)依次經(jīng)最陡下降(收斂判據(jù)0.05Kcal/molA)、共軛梯度(收斂判據(jù)0.01Kcal/molA)進(jìn)行能量最小化處理，獲得常溫條件下的優(yōu)勢構(gòu)象(圖2A)。將獲得的Her2/neu胞外段理論空間結(jié)構(gòu)與其晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行主鏈碳原子結(jié)構(gòu)疊合，計算均方根位移RMSD為0.32，表明選擇的模建方法、優(yōu)化手段、分子力場是合適的。
2、Herstatin空間結(jié)構(gòu)的理論模擬(1)Herstatin蛋白C端79個殘基二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Herstatin蛋白源自Genbank數(shù)據(jù)庫，其序號為gi|10181232|gb|AF177761.2|AF177761。分別選擇蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫SwissProt、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB，利用http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blastp進(jìn)行序列相似性檢索發(fā)現(xiàn)，與Herstatin蛋白C端79個殘基具有序列、結(jié)構(gòu)相似性在50％以上的模板蛋白不存在。為了能夠獲得Herstatin蛋白的合理空間構(gòu)象，擬采用從頭搭建的方法對其C末端構(gòu)象進(jìn)行理論評估。
借助http//www.expasy.ch提供的GOR IV方法對Herstatin蛋白C端79個殘基進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，預(yù)測結(jié)果如圖2B，表明Herstatin蛋白C端79個殘基形成的二級結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)卷曲，存在兩段Beta片層結(jié)構(gòu)。圖2B中，大寫字母為氨基酸代號，小寫字母“c”表示其對應(yīng)的氨基酸殘基的二級結(jié)構(gòu)是無規(guī)則卷曲，小寫字母“e”表示其對應(yīng)的氨基酸殘基的二級結(jié)構(gòu)是Beta片層結(jié)構(gòu)。
(2)Herstatin蛋白C端79個殘基空間構(gòu)象搭建借助二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，考慮其骨架Ramachandran圖二面角φ、ψ的限制條件，利用從頭搭建的方法構(gòu)建Herstatin蛋白C端空間構(gòu)象。
(3)Herstatin蛋白空間構(gòu)象的理論模擬利用Her2/neu蛋白胞外段晶體結(jié)構(gòu)，通過同源模建的方法構(gòu)建Herstatin蛋白N端340個殘基的空間結(jié)構(gòu)；考慮拐角特點，通過構(gòu)型調(diào)整將其與Herstatin的C端連接，從而搭建Herstatin蛋白的空間結(jié)構(gòu)。
在CVFF、AMBER力場作用下，依次通過最陡下降、共軛梯度方法對構(gòu)建的Herstatin蛋白的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子力學(xué)優(yōu)化。其中，最陡下降法選擇的優(yōu)化步長為40000步，收斂判據(jù)0.05Kcal/molA；共軛梯度法選擇的優(yōu)化步長為50000步，收斂判據(jù)0.01Kcal/molA。
為了保證結(jié)構(gòu)的最優(yōu)化程度，考慮溶劑效應(yīng)，在CVFF、Amber力場下對Herstatin蛋白的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)一步進(jìn)行分子動力學(xué)常溫模擬。由于Herstatin蛋白的N端源自晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，在動態(tài)模擬過程中保持不變，而C端79個殘基組成的功能域處于力學(xué)動態(tài)模擬中，選定120×90×80三維箱，考慮溶劑效應(yīng)、離子氛效應(yīng)，每5fs收集1個構(gòu)象，經(jīng)歷常溫1000fs的動態(tài)模擬，最終獲得常溫穩(wěn)定構(gòu)象。經(jīng)分子力學(xué)優(yōu)化獲得的Herstatin蛋白的空間結(jié)構(gòu)如圖2C所示。
3、Her2/neu與Herstatin相互作用復(fù)合物的結(jié)構(gòu)模擬借助模擬的Her2/neu以及Herstatin理論空間結(jié)構(gòu)，通過表觀靜電分布、可及性表面積分析，利用AutoDock3.0程序評價Her2與Herstatin作用的分子作用能，計算Van der Waals能、靜電能、分子間氫鍵，確定Her2與Herstatin的作用模式。在相同力場下，依次經(jīng)過最陡下降、共軛梯度對復(fù)合物空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量優(yōu)化處理。對于最陡下降法，選用步長60000步，收斂判據(jù)0.02Kcal/molA；共軛梯度法，選用步長100000步，收斂判據(jù)0.01Kcal/molA。獲得的能量優(yōu)化構(gòu)象經(jīng)常溫動力學(xué)模擬，考慮溶劑效應(yīng)的前提下進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。獲得的Her2/neu與Herstatin作用復(fù)合物模型如圖2D所示。
4、Her2/neu與Herstatin相互作用結(jié)構(gòu)域的確定借助獲得的Her2/neu與Herstatin復(fù)合物空間結(jié)構(gòu)，利用分子間氫鍵形成理論、距離幾何學(xué)、計算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)探討了Herstatin與Her2-neu相互作用區(qū)域。二者的作用模式示意圖如圖2E所示。
利用分子間氫鍵形成理論對復(fù)合物的分子間氫鍵形成情況進(jìn)行了分析，Her2/neu與Herstatin之間的氫鍵形成情況如表1所示。
表1 Her2/neu與Herstatin二者間氫鍵形成情況


利用距離幾何學(xué)、計算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)對復(fù)合物間的作用區(qū)域進(jìn)行分析可以看出，Herstatin蛋白的C-端(1-9，15-17，19-20，32-33，47-48，50-51，74-79位氨基酸殘基)參與作用Her2/neu的L1和S1功能域(149-151，170-171，173-181，256，266-267，275-280，284，317-319，321-324，329，336-340位氨基酸殘基)，二者通過分子間氫鍵、Van der Waals力發(fā)生作用。
三、熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗(fluorescence resonance energy transferFRET)確定HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指兩個熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時(＜10nm)，當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移(即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移)。本實驗供體為HER2/neu突變體與EGFP相融合蛋白ErbB2ECD-EGFP(包含HER2/neu的細(xì)胞外全長和跨膜序列T)、mE1-EGFP(包含HER2/neu的信號肽S、細(xì)胞外L1、S1結(jié)構(gòu)域和跨膜序列T)和mE2-EGFP(包含HER2/neu的信號肽S、細(xì)胞外L2、S2結(jié)構(gòu)域和跨膜序列T)。受體為Herstatin與DsRed的融合產(chǎn)物-DsRedHst。
材料轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM為Invitrogen產(chǎn)品；載體pEGFP/ECDt、pEGFP/mE1和pEGFP/mE2按照文獻(xiàn)(Wang JN，F(xiàn)eng JN，Yu M，Xu M，Shi M，ZhouT，Yu XD，Shen BF，Guo N.2004.Structural analysis of the epitopes on erbB2interacted with inhibitory or non-inhibitory monoclonal antibodies.MolImmunol 40963-969)的方法構(gòu)建，pDsRedHst載體。這些載體分別表達(dá)的蛋白ErbB2ECD-EGFP、mE1-EGFP、mE2-EGFP和DsRedHst的結(jié)構(gòu)示意圖如圖3所示，圖中，S表示HER2/neu的信號肽S；S1，S2，L1和L2表示HER2/neu胞外區(qū)的四個功能結(jié)構(gòu)域S1，S2，L1和L2區(qū)；T表示HER2/neu跨膜序列；GFP表示EGFP；Hst表示Herstatin；激光共聚焦顯微鏡Radiance 2100，美國Bio-Rad產(chǎn)品。培養(yǎng)皿，美國MatTek Co.產(chǎn)品。LaserSharp 2000 software Bio-Rad。
按照實施例1步驟一中3的方法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，其中載體DNA 3μg/皿，pDsRedHst與pEGFP/ECDt、pDsRedHst與pEGFP/mE1、pDsRedHst與pEGFP/mE2共轉(zhuǎn)染時，每個皿兩種質(zhì)粒各加等量的1.5μg，脂質(zhì)體9μl/皿；pEGFP/ECDt、pEGFP/mE1、pEGFP/mE2和pDsRedHst單獨轉(zhuǎn)染時，3μg/皿的質(zhì)粒DNA。
轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48h后，激光掃描共聚焦顯微鏡采集數(shù)據(jù)。選用三組濾片(1)ErbB2ECD-EGFP、mE1-EGFP或mE2-EGFPexcitation 488nm，dichroic mirror560DCLPXR，emission HQ515/30；(2)DsRedHstexcitation 543nm，dichroicmirror 650DCLPXR，emission HQ590/70；(3)FRETexcitation 488nm，dichroicmirror 650DCLPXR，emission HQ590/70。采集各組EGFP，DsRed和FRET圖像時各種參數(shù)分別保持不變。EGFP和FRET圖像同時采集，DsRed圖像在同一焦面上單獨采集。所有分析均選用中等表達(dá)強(qiáng)度的細(xì)胞，過高或過低表達(dá)強(qiáng)度的細(xì)胞不宜選用。FRET通道采集的數(shù)據(jù)中包含F(xiàn)RET、EGFP和DsRed通道的信號，為消除EGFP和DsRed通道光滲透的信號和消除背景的干擾，表達(dá)ErbB2ECD-EGFP、mE1-EGFP或mE2-EGFP的細(xì)胞分別同時采集EGFP及FRET圖像，表達(dá)DsRedHst的細(xì)胞也同時采集DsRed及FRET圖像，用于背景去除及串色校正。為確定兩共定位蛋白質(zhì)是否發(fā)生了相互作用，對采集到的數(shù)據(jù)用三濾片法進(jìn)行了FRET分析以計算蛋白質(zhì)間的相互作用。采用Ratio/FRET/Dencitometry Module of Slidebood 4.0(Intelligent Imaging Innovations，Denver，CO，USA)計算圖像FRETc和Ratio值。計算公式如下FRETc＝IFRET-a×IGFP-b×IDsRedRatio＝FRETc/IGFP式中a和b各為EGFP和DsRed滲透系數(shù)，I為采集到的圖像的FRET值。FRET結(jié)果用“偽彩色”表示，Ratio值接近0時，F(xiàn)RET結(jié)果陰性，“偽彩色”用藍(lán)色表示；Ratio值接近1時，F(xiàn)RET結(jié)果陽性，“偽彩色”用紅色表示?！皞尾噬秉S綠色到紅色，在圖像中代表FRET陽性。“偽彩色”由綠色到藍(lán)色，在圖像中代表FRET陰性。
結(jié)果表明pEGFP/ECDt、pEGFP/mE1和pEGFP/mE2單獨轉(zhuǎn)染時，ErbB2ECD-EGFP表達(dá)產(chǎn)物主要定位于胞膜、核膜和空泡表面(圖4B)，mE1-EGFP和EGFP-mE2則在細(xì)胞的膜系統(tǒng)分布(圖4C，圖4D)；pDsRedHst單獨轉(zhuǎn)染時，DsRedHst在細(xì)胞的胞核周圍的胞質(zhì)中均勻分布(圖4A)。但當(dāng)pDsRedHst和pEGFP/ECDt共轉(zhuǎn)染時，DsRedHst與ErbB2ECD-EGFP在細(xì)胞核周圍產(chǎn)生明顯的共定位信號，并產(chǎn)生黃色或橘黃色的結(jié)合性物質(zhì)(圖5A-圖5C)；ErbB2ECD-EGFP的分布發(fā)生了改變，由主要在細(xì)胞膜表面分布，改變在核周分布，DsRedHst繼續(xù)在細(xì)胞的核周分布。當(dāng)pDsRedHst和pEGFP/mE1共轉(zhuǎn)染時，mE1-EGFP則由在細(xì)胞的膜系統(tǒng)分布，改變到了核周分布；DsRedHst在細(xì)胞的核周分布(圖6A-圖6C)。當(dāng)pDsRedHst和pEGFP/mE2共轉(zhuǎn)染時，DsRedHst和mE2-EGFP在細(xì)胞中的分布未發(fā)生明顯改變，未觀察到明顯的共定位現(xiàn)象(圖7A-圖7C)。
為進(jìn)一步確定兩共定位蛋白發(fā)生了相互作用，采集到的數(shù)據(jù)用三濾片法進(jìn)行了FRET分析以計算蛋白質(zhì)間的相互作用。結(jié)果表明，含有L1區(qū)和S1區(qū)編碼基因的pEGFP/ECDt或pEGFP/mE1與pDsRedHst共同轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中檢測到明顯的FRET信號(圖5D和圖6D)，圖5D中“偽彩色”是紅色；圖6D中，“偽彩色”是黃綠色到紅色；而不含L1區(qū)和S1區(qū)編碼基因的pEGFP/mE2與pDsRedHst共轉(zhuǎn)染時細(xì)胞中檢測不到明顯的FRET信號(圖7D)，圖7D中，“偽彩色”是藍(lán)色。說明計算機(jī)模擬得到的模型Herstatin與HER2/neu相互作用模型是正確的，HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段是HER2/neu的L1和S1區(qū)域，該HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列，其編碼基因具有序列表中序列2的DNA序列。
實施例2、免疫共沉淀實驗驗證HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段為進(jìn)一步驗證計算機(jī)模建的正確性。采用Herstatin與HER2/neu三個突變體進(jìn)行免疫共沉淀的方法進(jìn)一步驗證此模型。
材料轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM為Invitrogen產(chǎn)品；pcDNA3.1(-)myc-his/Hst、載體pEGFP/ECDt、pEGFP/mE1和pEGFP/mE2按照文獻(xiàn)(Wang JN，F(xiàn)eng JN，YuM，Xu M，Shi M，Zhou T，Yu XD，Shen BF，Guo N.2004.Structural analysisof the epitopes on erbB2 interacted with inhibitory or non-inhibitorymonoclonal antibodies.Mol Immunol 40963-969)的方法構(gòu)建。proteinA/G plusagarose beads，Santa Cruz產(chǎn)品。cocktail，Roche產(chǎn)品。anti-Herstatin，小鼠單抗CW001，upstate產(chǎn)品；GFP兔多克隆抗體，BioVision公司產(chǎn)品。
將3×106個CHO細(xì)胞鋪于10cm培養(yǎng)板，24h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其中，同時有以下幾種轉(zhuǎn)染情況pcDNA3.1(-)myc-his/Hst和pEGFP/ECDt共轉(zhuǎn)染；pcDNA3.1(-)myc-his/Hst和pEGFP/mE1共轉(zhuǎn)染；pcDNA3.1(-)myc-his/Hst和pEGFP/mE2共轉(zhuǎn)染；pcDNA3.1(-)myc-his/Hst單獨轉(zhuǎn)染；pEGFP/ECDt單獨轉(zhuǎn)染；pEGFP/mE1單獨轉(zhuǎn)染；pEGFP/mE2單獨轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法同實施例1步驟一中3，共轉(zhuǎn)染時每皿兩種質(zhì)粒各1.5μg。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后。吸去培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS洗滌2次。用細(xì)胞刮刮取轉(zhuǎn)染細(xì)胞。預(yù)冷PBS再洗滌2次，每次10min。加入1ml細(xì)胞裂解液MTG(50mM Tris.Cl，pH7.4，100mM NaCl，10％glycerol，1％Nonidet P-40，1×cocktail，cocktail臨用時加入)。4℃振蕩裂解30min。細(xì)胞裂解物4℃，12000r/min，離心20min，收獲上清。
上清中加入20μl proteinA/G plus agarose beads。4℃振蕩孵育2h，4000r/min，離心5min。保存上清，去除沉淀物質(zhì)，目的是除去細(xì)胞裂解液中與proteinA/G plus agarose beads非特異結(jié)合的物質(zhì)。上清中加入4μg抗體(anti-Herstatin或GFP兔多克隆抗體)，4℃振蕩孵育4h或過夜。加入40μlproteinA/G plus agarose beads，振蕩孵育4h。4000r/min離心5min去除上清。MTG液洗滌4次，收集沉淀。
沉淀中加入70μl SDS-PAGE上樣緩沖液(100mM DTT，2％SDS，10％glycerol，0.1％溴酚藍(lán)，50mM Tris，pH6.8，DTT臨用前加入)，100℃水浴3min。離心取上清進(jìn)行8％SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)印完畢用含5％脫脂奶粉的TBS室溫封閉1.5h，TBS-T(TBS，含0.2％Tween 20)洗膜3次，每次10min；用含5％BSA的TBS稀釋一抗(GFP兔多克隆抗體或anti-Herstatin，)至1μg/ml，分別與轉(zhuǎn)印膜4℃孵育3h，TBS-T洗膜2次，每次10min；用含5％BSA的TBS稀釋酶標(biāo)二抗HRP-GAM IgG(購自中山生物制品有限公司)(1∶5000)，室溫孵育45min，TBS-T洗膜3次，每次10min；然后，按照Amersham Biosciences公司提供的增敏化學(xué)發(fā)光底物(ECL)顯色，X光片(Koda公司產(chǎn)品)顯影。
免疫共沉淀結(jié)果如圖8所示，當(dāng)pcDNA3.1(-)myc-his/Hst與pEGFP/ECDt或pEGFP/mE1或pEGFP/mE2共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞時，用抗Herstatin的抗體可從細(xì)胞裂解液中把含L1和S1結(jié)構(gòu)域的ErbB2ECD-EGFP或mE1-EGFP沉淀下來，但pcDNA3.1(-)myc-his/Hst不與缺乏L1和S1結(jié)構(gòu)域的mE2-EGFP發(fā)生免疫共沉淀。Herstatin與含L1和S1結(jié)構(gòu)域的ErbB2ECD-EGFP的免疫共沉淀產(chǎn)物大小為87KDa，Herstatin與含L1和S1結(jié)構(gòu)域的mE1-EGFP的免疫共沉淀產(chǎn)物大小為69KDa。反之，用抗GFP的抗體(GFP兔多克隆抗體)沉淀共轉(zhuǎn)染標(biāo)本，在pcDNA3.1(-)myc-his/Hst與pEGFP/ECDt或pEGFP/mE1共轉(zhuǎn)染的標(biāo)本中可沉淀到Herstatin；pcDNA3.1(-)myc-his/Hst與pEGFP/mE2共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，則沉淀不到Hersatin。這些結(jié)果說明HRE2/neu與Herstatin的結(jié)合是通過其L1和S1結(jié)構(gòu)域。
pcDNA3.1(-)myc-his/Hst與pEGFP/ECDt共轉(zhuǎn)染的標(biāo)本中用GFP兔多克隆抗體可沉淀到60KD的Hersatin條帶(泳道7)；pcDNA3.1(-)myc-his/Hst與pEGFP/mE1共轉(zhuǎn)染的標(biāo)本中用GFP兔多克隆抗體可沉淀到60KD的Hersatin條帶(泳道8)；pcDNA3.1(-)myc-his/Hst與pEGFP/mE2共轉(zhuǎn)染的標(biāo)本中用GFP兔多克隆抗體沉淀不到60KD的Hersatin條帶(泳道9)。圖中50KD左右的條帶為抗GFP抗體的重鏈。
圖8中，泳道1為pcDNA3.1(-)myc-his/Hst與pEGFP/ECDt共轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞用anti-Herstatin進(jìn)行免疫沉淀的結(jié)果，泳道2為pcDNA3.1(-)myc-his/Hst與pEGFP/mE1共轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞用anti-Herstatin進(jìn)行免疫沉淀的結(jié)果，泳道3為pcDNA3.1(-)myc-his/Hst與pEGFP/mE2共轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞用anti-Herstatin進(jìn)行免疫沉淀的結(jié)果；泳道4、泳道5和泳道6為pEGFP/ECDt、pEGFP/mE1、pEGFP/mE2單獨轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的用GFP兔多克隆抗體進(jìn)行West-bloting結(jié)果；泳道7為pcDNA3.1(-)myc-his/Hst與pEGFP/ECDt共轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞用GFP兔多克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀的結(jié)果、泳道8為pcDNA3.1(-)myc-his/Hst與pEGFP/mE1共轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞用GFP兔多克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀的結(jié)果；泳道9為pcDNA3.1(-)myc-his/Hst與pEGFP/mE2共轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞用GFP兔多克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀的結(jié)果；泳道10為pcDNA3.1(-)myc-his/Hst單獨轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞用anti-Herstatin進(jìn)行免疫沉淀的結(jié)果。
序列表<160>2<210>1<211>340<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu1 5 10 15Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys20 25 30Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His35 40 45Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr50 55 60Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val65 70 75 80Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu85 90 95Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr100 105 110Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro115 120 125Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser130 135 140Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn165 170 175Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys180 185 190His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser195 200 205Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys210 215 220Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys225 230 235 240Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu245 250 255His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val260 265 270Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg275 280 285Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu290 295 300Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln305 310 315 320Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys325 330 335Pro Cys Ala Arg340<210>2<211>1020<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc 60gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag120acccacctgg acatgctccg ccacctctac cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg180gaactcacct acctgcccac caatgccagc ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg240cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg300attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac aactatgccc tggccgtgct agacaatgga360gacccgctga acaataccac ccctgtcaca ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg420cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag480ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct540ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag600ggctcccgct gctggggaga gagttctgag gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt660gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt720gctgccggct gcacgggccc caagcactct gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac780agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag840tccatgccca atcccgaggg ccggtataca ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc900tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa960gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg tgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga 1020
權(quán)利要求
1.HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段，是具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的多肽或?qū)⑿蛄斜碇蠸EQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且可與Herstatin相互作用的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性片段，其特征在于所述HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段，是具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的多肽。
3.權(quán)利要求1或2所述的HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的活性片段編碼基因，其特征在于所述HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段的編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1多肽序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能多肽的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的活性片段編碼基因，其特征在于所述HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段的編碼基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
6.含有權(quán)利要求3所述的HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段編碼基因的表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求3所述的HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段編碼基因的細(xì)胞系。
8.含有權(quán)利要求3所述的HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段編碼基因的宿主菌。
9.擴(kuò)增權(quán)利要求3所述的HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段編碼基因中任一片段的引物。
10.權(quán)利要求1或2所述的HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段在制備拮抗HER2/neu的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段及其編碼基因與應(yīng)用。HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段，是具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的多肽或?qū)⑿蛄斜碇蠸EQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且可與Herstatin相互作用的多肽。本發(fā)明的HER2/neu與Herstatin相互作用的活性片段是HER2/neu分子能被有效抑制的敏感位點，是今后設(shè)計拮抗HER2/neu的小分子肽或抑制劑的理想靶標(biāo)，將在制備拮抗HER2/neu的藥物中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/63GK1861630SQ20051006903
公開日2006年11月15日 申請日期2005年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月10日
發(fā)明者胡品良, 郭寧, 馮建男, 王嘉寧, 沈倍奮 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所