專利名稱：一種提高蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)改造的方法，特別是一種提高蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的方法。
背景技術(shù)：
定向進(jìn)化的方法已有許多解決工業(yè)生物催化劑的例子，相對(duì)來說理性設(shè)計(jì)在生物催化劑這方面的運(yùn)用較少。近年來隨著核磁共振光譜學(xué)和X-衍射晶體分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，理性設(shè)計(jì)的能力將得到迅速發(fā)展，這使我們對(duì)蛋白質(zhì)折疊、動(dòng)力學(xué)和構(gòu)效關(guān)系有更好的理解。另一方面，在定向進(jìn)化的實(shí)驗(yàn)中，所有蛋白突變株數(shù)對(duì)任何實(shí)驗(yàn)篩選方法來說都很巨大。為了克服這個(gè)限制，常用結(jié)構(gòu)計(jì)算法來減少定向進(jìn)化的研究時(shí)間。例如Voigt C A[Christopher A.Voigt，Stephen L.Mayo，F(xiàn)rances H.Arnold，and Zhen-GangWang，Computational method to reduce the search space for directed proteinevolution，PNAS 2001 983778-3783]等改進(jìn)了一個(gè)有效的結(jié)構(gòu)計(jì)算方法，它能辨別出可提高功能的進(jìn)化位點(diǎn)，在這些位點(diǎn)有目的地突變將極大地減少實(shí)驗(yàn)研究的篩選量。顯然綜合了理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化的優(yōu)點(diǎn)的工程方法是將來推動(dòng)生物催化劑發(fā)展的最有力的工具。
理性設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)定向進(jìn)化相結(jié)合的方法已成功運(yùn)用到DNA shuffling的技術(shù)中[Moreland D.Gibbsa，K.M.Helena Nevalainena，Peter L.Bergquist，Degenerateoligonucleotide gene shuffling(DOGS)a method for enhancing the frequency ofrecombination with family shuffling，Gene(2001)271 13-20]、[Sabine Jung，AnnemarieHonegger and Andreas ckthun*，Selection for Improved Protein Stability by PhageDisplay，J.Mol.Biol.(1999)294 163-180]。結(jié)合蛋白質(zhì)合理設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化的方法，可以建立一條半合理設(shè)計(jì)的路線。
但是，由于天然存在的蛋白質(zhì)(酶)不適用于工業(yè)生產(chǎn)中高溫高壓的環(huán)境，例如熱穩(wěn)定性低，對(duì)工業(yè)應(yīng)用的底物適應(yīng)性差，酶易失活等等，間接提高了成本。
目前提高生物學(xué)功能最常用的策略包括合理設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化的方法，這兩種方法對(duì)生物催化劑的改造都有許多成功的例子，各自都有一定的優(yōu)勢(shì)和缺陷。定向進(jìn)化在事先不了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制的情況下仍可用于任何酶分子改造，這大大拓寬了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究和應(yīng)用范圍，缺陷在于擴(kuò)大蛋白質(zhì)突變范圍的同時(shí)，使后期篩選的工作量十分巨大；合理設(shè)計(jì)的方法對(duì)前期蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)知識(shí)的依賴性很強(qiáng)，但相應(yīng)減少了后期實(shí)驗(yàn)工作量。
傳統(tǒng)的藥物研究方法是從已知對(duì)相關(guān)病癥有療效的藥物出發(fā)，改變它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)，創(chuàng)造出新的化合物，然后再測(cè)試它們是否具有預(yù)期的療效。這種從改變現(xiàn)有藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)去尋找新藥的方法，通常需要花費(fèi)大量時(shí)間和金錢，而且往往會(huì)無功而返。
高通量篩選技術(shù)(HTS，High Throughput Screening)是近十年興起的一門新興技術(shù)，它已經(jīng)被世界各大醫(yī)藥公司廣泛用于藥物先導(dǎo)物的篩選。高通量藥物篩選是以自動(dòng)化的方式進(jìn)行大量的化合物篩選，以獲取能夠作用于各種生物分子靶位點(diǎn)(細(xì)胞表面受體和藥物代謝酶等)的具有生物活性的化合物，例如激動(dòng)劑，抑制劑或拮抗劑等。高通量藥物篩選涉及到多個(gè)學(xué)科和領(lǐng)域，如分析化學(xué)，生物學(xué)，生物化學(xué)，合成化學(xué)，分子生物學(xué)，自動(dòng)化工程和計(jì)算機(jī)科學(xué)。目前，高通量藥物篩選已經(jīng)實(shí)現(xiàn)高度自動(dòng)化和計(jì)算機(jī)化。大規(guī)模的高通量藥物篩選和計(jì)算分析處理已經(jīng)達(dá)到每天可篩選100,000個(gè)化合物。我們通常所說的高通量藥物篩選平臺(tái)是由化合物庫、靶體選擇、靶體和化合物反應(yīng)的測(cè)試方法的建立、靶體作用物的高通量篩選和數(shù)據(jù)的信息處理系統(tǒng)這幾大部分組成。它的目的是通過對(duì)種類繁多的合成及天然化合物作針對(duì)各種藥物靶體的篩選，從中尋找最佳的先導(dǎo)化合物，進(jìn)而用于新型藥物的開發(fā)。其特點(diǎn)是規(guī)模大、速度快、成本相對(duì)較低，縮短新藥開發(fā)周期并可找到最佳新藥。
分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法(或稱篩選模型)是實(shí)現(xiàn)藥物高通量篩選的技術(shù)基礎(chǔ)。藥物高通量篩選模型的實(shí)驗(yàn)方法，根據(jù)其生物學(xué)特點(diǎn)，可分為以下幾類受體結(jié)合分析法；酶活性測(cè)定法；細(xì)胞分子測(cè)定法；細(xì)胞活性測(cè)定法；代謝物質(zhì)測(cè)定法；基因產(chǎn)物測(cè)定法。這些實(shí)驗(yàn)方法，均已廣泛用于藥物高通量篩選中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)單、快捷、高效的提高蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案將合理設(shè)計(jì)的技術(shù)方法和蛋白質(zhì)定向的技術(shù)方法結(jié)合起來，共同運(yùn)用于蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的改造上。它包括幾個(gè)部分采用蛋白質(zhì)合理設(shè)計(jì)的方法確定蛋白質(zhì)的與熱穩(wěn)定性有關(guān)的功能區(qū)，建立突變基因文庫，進(jìn)行蛋白質(zhì)定向進(jìn)化(采用高通量篩選方法)，獲得所需蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的目的是通過下列措施來實(shí)現(xiàn)的一種提高蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的方法，包括下列步驟a.采用常規(guī)的蛋白質(zhì)合理設(shè)計(jì)的方法確定與蛋白質(zhì)生物學(xué)功能相關(guān)的功能區(qū)；b.用隨機(jī)變化的引物片段替換與蛋白質(zhì)生物學(xué)功能相關(guān)的功能區(qū)的基因，用常規(guī)基因工程方法構(gòu)建突變基因庫；c.進(jìn)行蛋白質(zhì)定向進(jìn)化，從突變基因庫中篩選生物學(xué)功能提高的蛋白質(zhì)。
所述的方法，其中蛋白質(zhì)合理設(shè)計(jì)的方法是通過相關(guān)的分析軟件將蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和一維結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來，并確立蛋白質(zhì)與生物學(xué)功能有關(guān)的功能區(qū)域。
所述的方法，其中相關(guān)的分析軟件是序列分析軟件Clustal W，結(jié)構(gòu)分析軟件Rasmol，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件DeepView，蛋白質(zhì)與底物對(duì)接實(shí)驗(yàn)軟件AutoDock，分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件GROMACS。
所述的方法，其中采用降低PCR反應(yīng)退火階段和延伸階段的溫度來提高隨機(jī)引物與蛋白質(zhì)生物學(xué)功能相關(guān)的功能區(qū)基因的替換效率，使構(gòu)建的蛋白質(zhì)的基因突變庫含有最大可能的變化。
所述的方法，其中建立突變基因庫的方法是采用組合突變文庫的技術(shù)進(jìn)行，具體來說是將每個(gè)突變位點(diǎn)突變成20種不同氨基酸形成的突變文庫。
所述的方法，其中蛋白質(zhì)定向進(jìn)化的方法是采用高通量篩選的方法。
所述的方法，其中高通量篩選方法采用微培養(yǎng)板聯(lián)合酶標(biāo)儀檢測(cè)的技術(shù)進(jìn)行高通量的篩選。
本發(fā)明的有益效果1、采用本發(fā)明的方法可以獲得生物學(xué)功能較高的蛋白質(zhì)(如提高天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的熱穩(wěn)定性，見實(shí)施例1；提高海因酶的底物適應(yīng)性，見實(shí)施例2)；2、該方法簡(jiǎn)單、實(shí)用、效果好。
實(shí)施例1中，用本方法的建立的突變文庫，選取4101株菌進(jìn)行測(cè)定，其中4061株菌中酶的熱穩(wěn)定得到提高(99.0％)，從這4061株菌選取15株做確證(菌體破碎后提取粗酶液再進(jìn)行驗(yàn)證)，其中12株陽性熱穩(wěn)定性提高(80％)，3株是假陽性。最終熱穩(wěn)定得到提高有效率達(dá)79.2％(99.0％×80.0％)。相對(duì)定向進(jìn)化文庫的有效突變率一般只有10-5左右。同樣就篩選來說，其最終獲得的熱穩(wěn)定性的菌庫的質(zhì)量也是很高的。以實(shí)施例1中5輪篩選中對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)可以看出，見表1。
表1.五輪篩選中熱穩(wěn)定比值的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

無論是其熱穩(wěn)定性的數(shù)值R的平均值，還是其數(shù)據(jù)的收斂性(通過標(biāo)準(zhǔn)方差的減小說明正態(tài)分布的數(shù)據(jù)在平均值附近的范圍減小，說明數(shù)據(jù)向其平均值收斂)都是逐步提高。
3、本發(fā)明將合理設(shè)計(jì)方法和定向進(jìn)化方法的優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來，去改造蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。這種方法可以根據(jù)現(xiàn)對(duì)現(xiàn)有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)知識(shí)的認(rèn)識(shí)，通過少量的篩選工作即可提高蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。


圖1是顯示天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的與穩(wěn)定性有關(guān)的功能區(qū)域的示意圖。
圖2是五次加熱前后天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性均值重疊圖。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
實(shí)施例1改造天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的熱穩(wěn)定性1、采用合理設(shè)計(jì)的方法，通過序列分析軟件(Clustal W)、結(jié)構(gòu)分析軟件(Rasmol)將天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的三維結(jié)構(gòu)和一維結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來。在此基礎(chǔ)上利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件(DeepView)，確立天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的熱穩(wěn)定性有關(guān)的功能區(qū)域1和功能區(qū)域2，它們是兩個(gè)亞基(這種酶由兩個(gè)完全相同的亞基組成)之間接觸的兩個(gè)功能區(qū)(功能區(qū)1主要為其N端的第5到12個(gè)氨基酸；功能區(qū)2主要為其第277到294個(gè)氨基酸)。見圖1，其中箭頭指向的是放大后的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶三維結(jié)構(gòu)的改造區(qū)(即與熱穩(wěn)定性有關(guān)的功能區(qū)1、2，是本發(fā)明需要通過隨機(jī)引物進(jìn)行改造的區(qū)域)。
2、突變基因文庫的建立包括以下步驟1)隨機(jī)引物的引入。人工合成的隨機(jī)引物可形成了一個(gè)小的突變來源庫，將隨機(jī)引物替換功能區(qū)1和功能區(qū)2對(duì)應(yīng)的基因(此步利用PCR擴(kuò)增的方法讓隨機(jī)引物和原來的基因配對(duì)，合成突變的基因，其結(jié)果類似直接將隨機(jī)引物替換原來的基因)，基因最基本的單位叫堿基，有四種可能的堿基，蛋白質(zhì)的最基本的單位叫氨基酸，有20種可能的氨基酸，每3個(gè)堿基表達(dá)生成一種氨基酸。本實(shí)施例共對(duì)18個(gè)堿基進(jìn)行隨機(jī)突變，隨機(jī)引物在18個(gè)堿基的位置引入10的9次方的堿基組合(418＝6.8*109)，在導(dǎo)入細(xì)胞后表達(dá)成的蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)有6個(gè)氨基酸位置突變，對(duì)應(yīng)產(chǎn)生氨基酸序列的變化容量為10的6次方，每個(gè)位置有20種不同氨基酸的可能，最終可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的序列的數(shù)目達(dá)10的7次方種堿基組合(206＝6.4*107)。
2)采用常規(guī)的基因工程手段將天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因插入pUC18而構(gòu)建重組質(zhì)粒，以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUC18為模板，加入隨機(jī)引物(見上一段描述)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使功能區(qū)相應(yīng)的氨基酸發(fā)生自由隨機(jī)突變(直接改造蛋白質(zhì)的方法較困難，常規(guī)的方法是通過基因工程的方法改造基因，然后導(dǎo)入細(xì)胞表達(dá)成蛋白質(zhì)的氨基酸)；采用降低PCR反應(yīng)退火階段和延伸階段的溫度來提高隨機(jī)引物與蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性相關(guān)的功能區(qū)氨基酸的替換效率，使構(gòu)建的基因突變庫含有最大可能的變化(隨機(jī)引物庫里有109種的組合，只要保證替換效率高，就可以保證替換這兩個(gè)區(qū)域的堿基有109種的組合，對(duì)應(yīng)形成氨基酸突變的變化有107種組合)，形成組合突變文庫。
3)用限制性內(nèi)切酶DpnI消化原起始質(zhì)粒模板，將原來未突變的質(zhì)粒去掉，該方法是基因工程中的常規(guī)技術(shù)，是公知技術(shù)；4)采用基因工程常規(guī)的轉(zhuǎn)化手段轉(zhuǎn)化含突變基因的質(zhì)粒到宿主菌(XL-Blue)中構(gòu)建突變菌庫。
3、采用高通量篩選的技術(shù)平臺(tái)(采用多功能微板檢測(cè)系統(tǒng)(如96孔微培養(yǎng)板、384孔板)、高通量檢測(cè)光密度值的酶標(biāo)儀、高通量轉(zhuǎn)移液體的多孔道移液器等)對(duì)構(gòu)建的突變菌庫進(jìn)行篩選，其主要步驟如下1)挑取單克隆菌落(將構(gòu)建好的突變菌庫會(huì)涂布到固體平板上，上面會(huì)生長出單克隆的菌)到96孔深孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)(37℃，16-18h)，過夜；2)加LB培養(yǎng)基(含2％葡萄糖)培養(yǎng)14h；3)離心(3000r/min，20min)去上清；4)加去離子水混勻；5)取30μL菌液加水稀釋到100μL，再加100μL試劑盒試劑檢測(cè)；6)將部分菌液在55℃下放置10min，取30μL菌液加水稀釋到100μL，再加100μL試劑盒試劑檢測(cè)。(測(cè)酶活時(shí)底物需過量，所以酶量不能太多，太多將底物消耗太多，反應(yīng)速度下降就測(cè)得不正確。)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定方法如下運(yùn)用試劑盒的測(cè)定原理為樣品中的AST催化L-天冬氨酸和α-氧代戊二酸氨基轉(zhuǎn)換，生成草酰乙酸和L-谷氨酸；在NADH和蘋果酸脫氫酶(MDH)存在下，草酰乙酸被還原為L-蘋果酸，NADH被氧化為NAD+，從而使340nm處的光吸收值下降，可以測(cè)定AST的活力。
試劑盒組成乳酸脫氫酶(LDH) ＞1500U/LNADH0.26mmol/LL-天冬氨酸 220mmol/L蘋果酸脫氫酶＞150U/Lα-氧代戊二酸 13mmol/LTris緩沖液 88mmolEDTA5.0mmol/LpH7.8±0.1劑型干粉(上面試劑盒組成成分是制成干粉使用的，用前加50mL水。)結(jié)果對(duì)其中4000株突變基因菌進(jìn)行高通量篩選，共篩選了五輪，每輪中將熱穩(wěn)定性不高的從庫中去掉，最后保留的12菌株的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的活性在五輪測(cè)定中均高于原始天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的活性。結(jié)果見圖2。這個(gè)結(jié)果是五次結(jié)果的均值，除了0號(hào)是起始未突變的菌株測(cè)定的結(jié)果，其他1-12是篩選出來的12個(gè)高于加熱前活性的菌株的測(cè)定結(jié)果。從圖中可以看到0號(hào)在加熱后活性下降很快，但其它12株基本不變化或變化較小。
實(shí)施例2改造D-海因酶的底物特異性本實(shí)施例針對(duì)D-海因酶底物特異性相關(guān)的位點(diǎn)進(jìn)行改造，提高其對(duì)5-單取代海因衍生物[D-5-芐基海因(D-BH)、D-5-對(duì)羥苯海因(D-HBH)、D-5-甲硫乙基海因(D-MTEH)、D-5-異丙基海因(D-IPH)、D-5-甲基海因(D-MH)]的底物特異性。
1、采用合理設(shè)計(jì)的方法，通過對(duì)接實(shí)驗(yàn)軟件(AutoDock)、分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件(GROMACS)將海因酶的三維結(jié)構(gòu)和一維結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來，確定其與底物特異性直接相關(guān)的位點(diǎn)為Tyr155，Ser288，Asp315，Asn336。
2、突變基因文庫的建立包括以下步驟1)隨機(jī)引物的引入。本次試驗(yàn)共對(duì)12個(gè)堿基進(jìn)行隨機(jī)突變，即容量為12的4次方，約為2×104種組合，對(duì)應(yīng)產(chǎn)生氨基酸序列的變化容量為10的5次方，即最終可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的序列的數(shù)目達(dá)10的5次方；2)采用常規(guī)的基因工程手段將海因酶基因插入pUC18而構(gòu)建重組質(zhì)粒，以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUC18為模板，加入隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使功能區(qū)的位置(基因)發(fā)生自由隨機(jī)突變(方法同實(shí)施例1)；3)用限制性內(nèi)切酶DonI消化原起始質(zhì)粒模板，將原來未突變的質(zhì)粒去掉，該方法是基因工程中的常規(guī)技術(shù)，是公知技術(shù)；4)轉(zhuǎn)化含突變基因的質(zhì)粒到宿主菌XL-Blue中形成突變菌庫。
3、采用高通量篩選的技術(shù)平臺(tái)對(duì)構(gòu)建的突變菌庫進(jìn)行篩選，其主要步驟如下1)挑取單克隆菌落(將構(gòu)建好的突變菌庫會(huì)涂布到固體平板上，上面會(huì)生長出單克隆的菌)到深孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)(37℃，16-18h)，過夜；2)加LB培養(yǎng)基(含2％葡萄糖)培養(yǎng)14h；3)離心(3000r/min，20min)去上清；4)加去離子水混勻；5)取30μL菌液5份分別加上述不同底物60μL，靜止30min，加30μL三氯醋酸終止反應(yīng)；6)離心(3000r/min，20min)取50μL，加50μL水稀釋到100μL，再加100μL顯色劑，在438nm下檢測(cè)顯色劑成分為100ml 6mol/L HCl溶解5g對(duì)二甲氨基苯甲醛結(jié)果對(duì)其中4000株突變基因菌進(jìn)行高通量篩選，共篩選了兩輪，其中5株對(duì)D-5-異丙基海因(D-IPH)的底物特異性提高。
權(quán)利要求
1.一種提高蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的方法，其特征在于包括下列步驟a.采用常規(guī)的蛋白質(zhì)合理設(shè)計(jì)的方法確定與蛋白質(zhì)生物學(xué)功能相關(guān)的功能區(qū)；b.用隨機(jī)變化的引物片段替換與蛋白質(zhì)生物學(xué)功能相關(guān)的功能區(qū)的基因，用常規(guī)基因工程方法構(gòu)建突變基因庫；c.進(jìn)行蛋白質(zhì)定向進(jìn)化，從突變基因庫中篩選生物學(xué)功能提高的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于蛋白質(zhì)合理設(shè)計(jì)的方法是通過相關(guān)的分析軟件將蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和一維結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來，并確立蛋白質(zhì)與生物學(xué)功能有關(guān)的功能區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于相關(guān)的分析軟件是序列分析軟件ClustalW，結(jié)構(gòu)分析軟件Rasmol，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件DeepView，蛋白質(zhì)與底物對(duì)接實(shí)驗(yàn)軟件AutoDock，分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件GROMACS。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于采用降低PCR反應(yīng)退火階段和延伸階段的溫度來提高隨機(jī)引物與蛋白質(zhì)生物學(xué)功能相關(guān)的功能區(qū)基因的替換效率，使構(gòu)建的蛋白質(zhì)的基因突變庫含有最大可能的變化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于建立突變基因庫的方法是采用組合突變文庫的技術(shù)進(jìn)行，具體來說是將每個(gè)突變位點(diǎn)突變成20種不同氨基酸形成的突變文庫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于蛋白質(zhì)定向進(jìn)化的方法是采用高通量篩選的方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于高通量篩選方法采用微培養(yǎng)板聯(lián)合酶標(biāo)儀檢測(cè)的技術(shù)進(jìn)行高通量的篩選。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的方法。該方法采用常規(guī)的蛋白質(zhì)合理設(shè)計(jì)的方法確定與蛋白質(zhì)生物學(xué)功能相關(guān)的功能區(qū)；再用隨機(jī)變化的引物片段替換與蛋白質(zhì)生物學(xué)功能相關(guān)的功能區(qū)的基因，用常規(guī)基因工程方法構(gòu)建突變基因庫；然后進(jìn)行蛋白質(zhì)定向進(jìn)化，從突變基因庫中篩選生物學(xué)功能提高的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法能有效獲得生物學(xué)功能提高的蛋白質(zhì)，該方法簡(jiǎn)單、實(shí)用、效果好。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1763227SQ20051009417
公開日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2005年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月1日
發(fā)明者嚴(yán)明, 許琳, 林濤, 歐陽平凱 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)