專利名稱：一株苜蓿根瘤菌及其發(fā)酵培養(yǎng)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株苜蓿根瘤菌及其發(fā)酵培養(yǎng)方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
國際上對豆科根瘤菌的研究和應(yīng)用已有一百多年歷史，幾乎在全世界范圍內(nèi)的苜蓿生產(chǎn)領(lǐng)域都提倡對苜蓿進行根瘤菌接種。因為接種根瘤菌可提高苜蓿的成苗率、幼苗結(jié)瘤率，增強共生固氮作用，從而提高苜蓿的產(chǎn)草量及其蛋白質(zhì)含量。近十年來，我國苜蓿產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，各地都十分重視苜蓿接種根瘤菌技術(shù)的應(yīng)用。
當(dāng)前，苜蓿根瘤菌接種技術(shù)領(lǐng)域存在的問題，主要是由于苜蓿品種的不斷推陳出新，一些苜蓿新品種與當(dāng)前推廣應(yīng)用的根瘤菌的親和性不強，導(dǎo)致接種后生固氮效果不明顯。
國外十分重視苜蓿共生固氮優(yōu)良組合篩選。1986年Tan用15個苜蓿品種與10株苜蓿根瘤菌進行共生固氮優(yōu)良組合篩選試驗，結(jié)果表明組合間的共生固氮差異有30％是苜蓿品種所致，26％的差異為苜蓿根瘤菌菌株間的差異所致，36％以上的差異來自苜蓿品種與苜蓿根瘤菌之間的相互作用(《中國苜蓿》，中國農(nóng)業(yè)出版社，152頁，1995)。在共生固氮過程中，根瘤菌不同菌株與苜蓿不同品種相互間有很強的選擇性，因而篩選苜蓿品種與根瘤菌株的共生固氮優(yōu)良組合，是提高苜蓿共生固氮效率的有效途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株用于苜蓿接種的根瘤菌及其發(fā)酵培養(yǎng)方法。
本發(fā)明所提供的用于苜蓿接種的根瘤菌菌株是(Rhizobium meliloti)17674，該菌株已于2005年07月25日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1422。
苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422屬革蘭氏陰性桿菌，無芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，能運動。菌體大小為(0.5-0.9)×(1.0-3.0)微米，在不同環(huán)境中生長的菌體形態(tài)各異。在培養(yǎng)條件下，該菌呈小的短桿狀，菌體染色不均勻，形成著色與不著色部分的環(huán)狀體，不著色的部分脂類含量高。在酵母汁甘露醇瓊脂培養(yǎng)基平面上生長的菌落呈圓形，邊緣整齊，稍突起，無色半透明或淺乳白色，菌苔較濃。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCCNo.1422的發(fā)酵培養(yǎng)方法。
本發(fā)明所提供的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的發(fā)酵培養(yǎng)方法，是將苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422接種到其專用液體培養(yǎng)基中，在28-30℃下通氣培養(yǎng)；所述專用液體培養(yǎng)基的配方為每1000mL水中含糖5-10g，酵母粉1-2g，磷酸氫二鉀0.25-0.75g，硫酸鈣0.16-0.24g，硫酸鎂0.1-0.3g，氯化鈉0.1-0.3g，1％鉬酸銨0.5-1.5mL和0.5％硼酸2-6mL，pH值為6.8-7.0；所述百分比濃度均為質(zhì)量百分比濃度。
在上述培養(yǎng)方法中，接種比例為10-20％，優(yōu)選為10％；培養(yǎng)過程的通氣量為0.4-0.8mM O2L-1h-1；培養(yǎng)24-72小時即可達到培養(yǎng)終點。
優(yōu)選的專用液體培養(yǎng)基的配方為每1000mL水中含糖10g，酵母粉2g，磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鈣0.2g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0.2g，1％鉬酸銨1mL和0.5％硼酸4mL(固體培養(yǎng)基再添加20g瓊脂)，pH值為6.8-7.0。
培養(yǎng)條件優(yōu)選為溫度為28℃，通氣量為0.5mM O2L-1h-1，培養(yǎng)時間為48小時。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCCNo.1422菌劑。
本發(fā)明所提供的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422菌劑，其活性成分為苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422。
為得到更好的使用效果，所述菌劑中還可加入草炭，草炭的細度一般為80-150目，所述苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的菌液與草炭的重量份數(shù)比為2-4∶1。
所述含有草炭成分的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422菌劑的生產(chǎn)方法，是將經(jīng)上述方法發(fā)酵的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674CGMCC No.1422的菌液與干燥、無菌、pH值為6.5-7.0的草炭按重量份數(shù)比2-4∶1混勻，再在相同的條件下增殖培養(yǎng)12-36小時，得到含有草炭成分，且活菌含量大于2億個/克的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422菌劑；其中用來配制菌劑的菌液的含菌數(shù)一般為30億個/mL。
所述草炭與菌液混合前過80-150目篩，優(yōu)選為100目篩；對草炭進行滅菌的條件可為0.1兆帕壓強下，1小時。
本發(fā)明的第四個目的是提供一種提高苜蓿共生固氮作用的方法。
本發(fā)明所提供的提高苜蓿共生固氮作用的方法，是將苜蓿種子接種上述苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422或以苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)17674 CGMCC No.1422為活性成分的菌劑，再經(jīng)播種、培養(yǎng)，得到共生固氮作用提高的苜蓿。
適用于本發(fā)明提高共生固氮作用的方法的苜蓿品種可為阿爾岡金(蘭、白)、美國牧歌、淮陰苜蓿、中苜一號、保定苜蓿、金苜?；蛎绹俎Ｍ醯取?br> 本發(fā)明提供了一株苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422，該菌及以該菌為活性成分的菌劑可用于苜蓿接種。苜蓿接種組合效果的水培試驗證明將該菌接種苜蓿種子后，苜蓿植株高度和植株鮮重比不接菌的對照植株分別增長56.48％和104.93％；在土壤盆栽試驗中，接種該菌的苜蓿的植株高度和植株鮮重比不接菌的對照植株分別增長43.98％和57.16％。上述試驗證明苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)17674 CGMCC No.1422與苜蓿接種組合對苜蓿具有顯著的增產(chǎn)效果，產(chǎn)草量提高可達49％-62％，且具有較高的實用性和可推廣性，有望發(fā)展成為苜蓿根瘤菌應(yīng)用領(lǐng)域中一項新的優(yōu)良組合技術(shù)。本發(fā)明在苜蓿種植業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實施例方式
下屬實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所有百分比濃度均為質(zhì)量百分比濃度，所有培養(yǎng)基中的溶劑均為水。
苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422專用液體培養(yǎng)基的配方為每1000mL水中含糖10g，酵母粉2g，磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鈣0.2g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0.2g，1％鉬酸銨1mL和0.5％硼酸4mL(固體培養(yǎng)基再添加20g瓊脂)，pH值為6.8-7.0。
實施例1、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的保藏及發(fā)酵培養(yǎng)1、菌種的分離、保藏從山東濰坊采集野生苜蓿根瘤，用平板劃線分離得到苜蓿根瘤菌菌株(Rhizobiummeliloti)17674，該菌株已于2005年07月25日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1422。
2、苜蓿根瘤菌菌株(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的斜面培養(yǎng)挑取該菌種，對其用上述專用固體培養(yǎng)基進行斜面培養(yǎng)，在28℃下培養(yǎng)48小時。
3、菌種的搖床液體培養(yǎng)挑取步驟2斜面培養(yǎng)的根瘤菌菌株(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422，接種于搖瓶專用培養(yǎng)液中，每500mL接種2支斜面菌種，在28℃下培養(yǎng)36小時。
4、種子罐培養(yǎng)取3L步驟3的菌液，接入100L種子罐中(含有60L培養(yǎng)液)進行種子培養(yǎng)，在30℃、120rpm下攪拌培養(yǎng)56小時培養(yǎng)。
5、發(fā)酵罐培養(yǎng)按10％比例將步驟4的種子液接入1000L發(fā)酵罐中(含有600L培養(yǎng)液)進行發(fā)酵培養(yǎng)，在28℃、150rpm下攪拌培養(yǎng)48小時。所得發(fā)酵液可用于草炭吸附為苜蓿根瘤菌菌劑，菌液的含菌數(shù)約為30億個/mL。
實施例2、含草炭的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422菌劑的制備1、草炭的處理將草炭自然干燥后進行粉碎，過100目篩，然后用生石灰粉調(diào)pH值為6.8，在0.1兆帕下滅菌1小時。
2、含草炭的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422菌劑的獲得將實施例1中經(jīng)發(fā)酵的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的菌液與步驟1獲得的干燥、無菌、pH值為6.8的草炭按重量份數(shù)比3∶1混勻，再在28℃下增殖培養(yǎng)24小時，得到苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCCNo.1422菌劑，可分裝入庫。經(jīng)檢測成品合格，活菌含量大于2億個/克?？捎糜谲俎＝臃N。
實施例3、苜蓿接種組合效果的試驗1、苜蓿接種組合效果的水培試驗本試驗用的苜蓿品種為阿爾岡金(白、蘭)、金皇后、美國牧歌、淮蔭苜蓿和保定苜蓿。將苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422與上述苜蓿品種形成的不同的組合，用濾紙橋試管水培法進行苜蓿接種組合效果的水培試驗，同時以不接菌的植株為對照，具體方法如下1)將濾紙裁成條狀，其寬度分別為1.3cm，1.6cm，制成M型，中間凹處根據(jù)幼苗的大小制成V型小孔，M型濾紙的高度為試管的長度減去4cm。所用試管尺寸為1.5cm×18cm。
2)將配制好的無氮營養(yǎng)液分別裝入帶有濾紙支撐物的試管中，其高度位于H型濾紙的凹處，每個處理重復(fù)5個試管，并設(shè)對照管10個，灌裝后用耐高壓的塑料薄膜封好后，15磅121℃滅菌1小時備用。
3)選擇大小均一的苜蓿種子。由于其種皮較厚，先用濃硫酸浸泡2-3分鐘后用無菌水洗滌數(shù)次，以洗去表面殘留的酸為止。
4)將經(jīng)消毒的種子置于28-30℃溫箱中保溫催芽。催芽后進行培養(yǎng)，光照條件從頂部照射，根部避光，可放置溫室或光照箱中，關(guān)照強度約7000-8000/ux；溫度條件20-30℃。
表1 苜蓿接種組合效果的水培試驗結(jié)果

試驗結(jié)果如表1所示，將苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422接種苜蓿種子后，苜蓿植株高度和植株鮮重比不接菌的對照植株分別增長56.48％和104.93％，表明本發(fā)明的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422對苜蓿具有顯著的增產(chǎn)效果。
2、苜蓿接種組合效果的土壤盆栽試驗本試驗用的苜蓿品種為阿爾岡金(白、蘭)、金皇后、美國牧歌、淮蔭苜蓿和保定苜蓿。將苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422與上述苜蓿品種形成的不同的組合，進行苜蓿接種組合效果的土壤盆栽試驗，所用土壤pH值為8.02，不滅菌，在網(wǎng)室或溫室內(nèi)栽培，重復(fù)4次，同時以不接菌的植株為對照。
表2 苜蓿接種組合效果的土壤盆栽試驗結(jié)果


試驗結(jié)果如表2所示，將苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422接種苜蓿種子后，接種該菌的苜蓿的植株高度和植株鮮重比不接菌的對照植株分別增長43.98％和57.16％，表明本發(fā)明的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCCNo.1422對苜蓿具有顯著的增產(chǎn)效果。
實施例4、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422與普通應(yīng)用苜蓿根瘤菌接種苜蓿品種的效果比較試驗選用苜蓿品種阿爾岡金(蘭)、阿爾岡金(白)、美國牧歌、淮陰苜蓿、中苜一號和保定苜蓿，普通應(yīng)用苜蓿根瘤菌ACCC17512。
試驗分三組，一組對上述苜蓿品種的種子本別接種苜蓿根瘤菌ACCC17512，一組對上述苜蓿品種的種子本別接種苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCCNo.1422，另外一組為對照，不進行接種。按常規(guī)方法對上述三組苜蓿的種子進行播種、培養(yǎng)，約60天后，長成植株，記錄各個植株的高度和重量，并計算出各個組合的平均值，普通苜蓿根瘤菌ACCC17512與苜蓿品種接種結(jié)果如表3所示，苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422與苜蓿品種接種結(jié)果如表4所示，苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422與普通應(yīng)用苜蓿根瘤菌ACCC1751接種苜蓿品種效果比較結(jié)果如表5所示，結(jié)果表明將苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)17674 CGMCC No.1422接種苜蓿種子后，苜蓿植株高度和植株鮮重比接種普通苜蓿根瘤菌ACCC17512的植株相比顯著增長，表明本發(fā)明的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422對苜蓿具有顯著的增產(chǎn)效果。
表3 普通苜蓿根瘤菌ACCC17512與苜蓿品種接種結(jié)果


表4 苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422與苜蓿品種接種結(jié)果

表5 苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422與普通應(yīng)用苜蓿根瘤菌ACCC17512接種苜蓿品種效果比較結(jié)果


權(quán)利要求
1.苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422。
2.一種發(fā)酵培養(yǎng)苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的方法，是將苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422接種到其專用液體培養(yǎng)基中，在28-30℃下通氣培養(yǎng)；所述專用液體培養(yǎng)基的配方為每1000mL水中含糖5-10g，酵母粉1-2g，磷酸氫二鉀0.25-0.75g，硫酸鈣0.16-0.24g，硫酸鎂0.1-0.3g，氯化鈉0.1-0.3g，1％鉬酸銨0.5-1.5mL和0.5％硼酸2-6mL，pH值為6.8-7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于所述專用液體培養(yǎng)基的配方為每1000mL水中含糖10g，酵母粉2g，磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鈣0.2g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0.2g，1％鉬酸銨1mL和0.5％硼酸4mL，pH值為6.8-7.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于所述接種比例為10-20％；培養(yǎng)過程的通氣量為0.4-0.8mM O2L-1h-1，培養(yǎng)時間為24-72小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)條件為溫度為28℃，通氣量為0.5mM O2L-1h-1，培養(yǎng)時間為48小時。
6.以苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422為活性成分的菌劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的菌劑，其特征在于所述菌劑中添加有草炭，草炭的細度為80-150目，所述苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的菌液與草炭的重量份數(shù)比為2-4∶1。
8.一種權(quán)利要求7所述菌劑的生產(chǎn)方法，是將經(jīng)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法得到的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的菌液與干燥、無菌、pH值為6.5-7.0的草炭按重量份數(shù)比為2-4∶1混勻，再在相同的條件下增殖培養(yǎng)12-36小時，得到含草炭成分，且活菌含量大于2億個/克的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422菌劑；其中用來配制菌劑的菌液的含菌數(shù)為30億個/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述草炭與菌液混合前過80-150目篩；對草炭進行滅菌的條件為0.1兆帕壓強下，1小時。
10.一種提高苜蓿共生固氮作用的方法，是將苜蓿種子接種權(quán)利要求1所述的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422或權(quán)利要求6所述的以苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422為活性成分的菌劑，再經(jīng)播種、培養(yǎng)，得到共生固氮作用提高的苜蓿；所述苜蓿品種為阿爾岡金、美國牧歌、淮陰苜蓿、中苜一號、保定苜蓿、金苜蓿或美國苜蓿王。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株苜蓿根瘤菌及其發(fā)酵培養(yǎng)方法與應(yīng)用。該苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422的發(fā)酵培養(yǎng)方法，是將苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422接種到其專用液體培養(yǎng)基中，在28－30℃下通氣培養(yǎng)；所述專用液體培養(yǎng)基的配方為每1000mL水中含糖5－10g，酵母粉1－2g，磷酸氫二鉀0.25－0.75g，硫酸鈣0.16－0.24g，硫酸鎂0.1－0.3g，氯化鈉0.1－0.3g，1％鉬酸銨0.5－1.5mL和0.5％硼酸2－6mL，pH值為6.8－7.0。本發(fā)明所提供的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)17674 CGMCC No.1422與苜蓿的接種組合有望發(fā)展成為苜蓿根瘤菌應(yīng)用領(lǐng)域中一項新的優(yōu)良組合技術(shù)。
文檔編號C12R1/41GK1766090SQ20051010291
公開日2006年5月3日 申請日期2005年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月13日
發(fā)明者馬曉彤, 寧國贊, 侯向陽, 姜瑞波 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所