專利名稱：菜豆炭疽病菌的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是生物檢測(cè)領(lǐng)域。具體而言，本申請(qǐng)涉及菜豆炭疽病菌的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
菜豆炭疽病是由菜豆炭疽病菌(Colletetrichum lindemuthianum)引起的一種真菌性病害，屬半知菌亞門刺盤孢屬，病菌的有性世代是菜豆小叢殼菌(Glomerella lindemuthianum)屬于真菌子囊菌亞門小叢殼屬，能對(duì)菜豆的子葉、幼莖、真葉、莖、莢及種子發(fā)生危害，而一旦發(fā)生病害，就會(huì)嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至絕收。同時(shí)該病在采后也造成菜豆的腐爛變質(zhì)，使菜豆不能儲(chǔ)藏和運(yùn)輸，因此，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病在世界各國菜豆產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，在我國，北京、天津、河北、陜西、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、黑龍江、山東、江蘇、浙江、江西、福建、臺(tái)灣、河南、湖南、廣東、廣西、陜西、青海、四川及云南等二十幾個(gè)省市均有發(fā)生。
因此，準(zhǔn)確在發(fā)病前或初期對(duì)病菌進(jìn)行鑒定、監(jiān)測(cè)，及時(shí)采取有效的防治方法控制病原菌的傳播、流行和采后病害的發(fā)生，減少經(jīng)濟(jì)損失，具有十分重大的意義。從傳統(tǒng)檢測(cè)手段上，炭疽病菌的分類、鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特性，例如培養(yǎng)學(xué)特征、分生孢子盤、分生孢子和附著孢的形態(tài)和大小、致病性測(cè)定等。這種傳統(tǒng)的病原菌鑒定方法耗時(shí)長、程序繁瑣、靈敏度低以及經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)，從發(fā)病初期植株中分離并鑒定病原菌需要幾天時(shí)間，如果這幾天中遇見病害有利天氣即可迅速蔓延，錯(cuò)過病害的最佳防治時(shí)期，難以做到對(duì)病害發(fā)生的及時(shí)監(jiān)測(cè)，控制病原菌的傳播和流行。同時(shí)，造成菜豆不能長期儲(chǔ)藏和遠(yuǎn)距離運(yùn)輸?shù)闹饕蚓褪遣硕共珊蟾癄€變質(zhì)，而采后腐爛變質(zhì)的主要原因是由于菜豆炭疽病菌在采收前侵染，采收后儲(chǔ)藏和運(yùn)輸過程中引起發(fā)病。因此，在菜豆采收后儲(chǔ)運(yùn)前必須對(duì)菜豆炭疽病的潛伏侵染情況進(jìn)行檢測(cè)。傳統(tǒng)的菜豆炭疽病檢測(cè)方法一般需要6～8天，并且需要在產(chǎn)生癥狀后進(jìn)行，所以在儲(chǔ)藏和運(yùn)輸之前，不能明確炭疽病菌潛伏侵染的情況，造成已被炭疽病菌侵染的菜豆在儲(chǔ)運(yùn)過程中大量腐爛，產(chǎn)生巨大損失。
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，不同分子技術(shù)用于真菌的檢測(cè)，它們包括核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列分析、隨機(jī)擴(kuò)增長度多態(tài)性(RAPD)分析、線粒體DNA限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析、同工酶分析等。和傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比，這些基于多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的分子檢測(cè)技術(shù)，不需要經(jīng)過病原菌的分離、純培養(yǎng)等過程，而且具有快速、靈敏、特異性等優(yōu)點(diǎn)。
近年來，越來越多的分子技術(shù)用于病原菌的鑒定、檢測(cè)及病害診斷中，核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)，是介于18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之間的區(qū)域，該區(qū)域進(jìn)化速率較編碼區(qū)快，在種內(nèi)不同菌株間高度保守，而在真菌的種間存在著豐富的變化。SCAR(Sequence-characterized amplified regions)標(biāo)記是在RAPD技術(shù)上發(fā)展起來的方法，它根據(jù)篩選到的特異的RAPD片段的序列來設(shè)計(jì)引物，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣可以把與原來片段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)SCAR鑒定出來，具有比RAPD更高的穩(wěn)定性?？梢詾檠芯空婢南到y(tǒng)發(fā)育、分類鑒定和分子檢測(cè)提供豐富的遺傳信息。
Zhengguangzhang等利用ITS序列差異設(shè)計(jì)出引物Fn-1/Fn-2和Mn-1/Mn-2來分別對(duì)F.oxysporum f.sp.niveum與M.melonis進(jìn)行檢測(cè)。還有不少學(xué)者應(yīng)用ITS來研究Phytophthora、Pythium、Verticillium、Fusarium、Botryosphaeria和Hypoxylon等真菌的系統(tǒng)發(fā)育和檢測(cè)。
對(duì)于Colletotrichum spp.的檢測(cè)，已有一些報(bào)導(dǎo)。NataliaA.R.Peres等根據(jù)ITS區(qū)序列設(shè)計(jì)出引物CgInt以及CgInt2，其中CgInt和真菌通用引物ITS4組合的引物對(duì)能對(duì)Colletotrichum gloeosporioides檢測(cè)，而CgInt2和ITS4組合的引物對(duì)能對(duì)Colletotrichum acutatum檢測(cè)；D.W.Cullen等根據(jù)ITS區(qū)域設(shè)計(jì)了兩套引物進(jìn)行巢式PCR，其中外引物是能擴(kuò)增普通的炭疽菌屬，得到447bp得片斷，內(nèi)引物特異性地?cái)U(kuò)增Colletotrichum coccodes。
A.L.Dauch等利用RAPD轉(zhuǎn)SCAR標(biāo)記來檢測(cè)生防菌Colletotrichum coccodes(183088)，P.V.Martinez Culebras等通過RAPD技術(shù)隨機(jī)擴(kuò)增80株炭疽病菌，找出C.fragariae的特異條帶，轉(zhuǎn)SCAR標(biāo)記后對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。
目前，對(duì)Colletetrichum lindemuthianum進(jìn)行分子檢測(cè)，尚未見國內(nèi)外有關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)菜豆炭疽病菌檢測(cè)和鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特性，方法耗時(shí)長、程序繁瑣、靈敏度低以及經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)，難以做到對(duì)病害發(fā)生的及時(shí)監(jiān)測(cè)和控制病原菌的傳播、流行以及采后病害造成腐爛變質(zhì)的問題。提供一種對(duì)菜豆炭疽病進(jìn)行快速PCR檢測(cè)的試劑盒和檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明第一方面提供了一種用于特異性檢測(cè)樣品中菜豆炭疽菌的組合，所述組合包括兩對(duì)特異性引物，所述特異性引物選自以下序列第一對(duì)上游引物5’CTTTGTGAACATACCTAACC 3’(SEQ ID NO1)下游引物5’GGTTTTACGGCAGGAGTG 3’；(SEQ ID NO2)第二對(duì)上游引物5’ACCTGGACACATAAGTCAAAG3’(SEQ ID NO3)下游引物5’CAACAATGCCAGTATCAGAG3’(SEQ ID NO4)。
本發(fā)明第二方面提供了一種PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含PCR反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系包含兩對(duì)特異性引物，所述特異性引物選自以下序列第一對(duì)上游引物5’CTTTGTGAACATACCTAACC 3’下游引物5’GGTTTTACGGCAGGAGTG 3’；第二對(duì)上游引物5’ACCTGGACACATAAGTCAAAG3’下游引物5’CAACAATGCCAGTATCAGAG3’。
本發(fā)明第三方面提供了一種檢測(cè)樣品中菜豆炭疽菌的方法，該方法包括以下步驟，a)用本發(fā)明上述的PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；b)測(cè)定步驟a)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，若產(chǎn)物中存在442bp和638bp的DNA片段，則表明所述樣品中有菜豆炭疽菌。
本發(fā)明還有一個(gè)方面涉及本發(fā)明所述的PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)樣品中菜豆炭疽菌中的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明技術(shù)方案的優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在1)實(shí)用性強(qiáng)菜豆炭疽病菌的快速檢測(cè)，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。菜豆采后腐爛變質(zhì)的主要原因是菜豆炭疽病菌在采收前侵染，但未顯現(xiàn)癥狀，再采收后儲(chǔ)運(yùn)過程中出現(xiàn)癥狀引起發(fā)病。傳統(tǒng)的菜豆炭疽病檢測(cè)方法一般是在植物出現(xiàn)癥狀后，借助其發(fā)病癥狀，對(duì)病原物進(jìn)行分離、純化、鑒定等一系列繁瑣的過程，一般需要6～8天，而且病原物在分離時(shí)也存在一定的困難，給快速而精確地檢測(cè)病原物增加了難度。使采收后儲(chǔ)藏和運(yùn)輸前，不能明確炭疽病菌潛伏侵染的情況，造成已被侵染得菜豆在儲(chǔ)運(yùn)過程中大量腐爛，產(chǎn)生巨大損失。同時(shí)由于不能在前期及時(shí)進(jìn)行田間的群體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，也給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的防治延誤時(shí)機(jī)。因此，現(xiàn)有的技術(shù)無法滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的要求。采用本發(fā)明，在沒有病癥出現(xiàn)的情況下，就可以進(jìn)行檢測(cè)，并且在4～6小時(shí)就能準(zhǔn)確地完成檢測(cè)工作，大大提高了工作效率，為菜豆的長期儲(chǔ)運(yùn)提供了可能，也為病害的防治創(chuàng)造了先機(jī)。
2)準(zhǔn)確性高本發(fā)明利用GeneBank中Colletetrichum屬的24個(gè)種的ITS系列比較，設(shè)計(jì)出一對(duì)引物CY1/CY2，將Colletetrichum lindemuthianum、Colletetrichumorbiculare這兩個(gè)種的菌和其它菌分開。進(jìn)一步利用RAPD反應(yīng)隨機(jī)擴(kuò)增Colletetrichum lindemuthianu和Colletetrichum orbiculare，找出在Colletetrichumlindemuthianu中的特異性條帶，經(jīng)過克隆、測(cè)序后，設(shè)計(jì)出引物CD1/CD2，將Colletetrichum lindemuthianu和Colletetrichum orbiculare分開。繼而利用上述兩對(duì)引物組合成復(fù)合PCR檢測(cè)體系，能夠直接將Colletetrichum lindemuthianu和其它相似或相關(guān)種分開。本發(fā)明者對(duì)與炭疽菌相近和相關(guān)的真菌、植物體、土壤中的常見真菌等189個(gè)菌株進(jìn)行了擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，準(zhǔn)確率高達(dá)100％。
3)靈敏度高傳統(tǒng)的菜豆炭疽病檢測(cè)方法一般是在植物出現(xiàn)癥狀后，借助其發(fā)病癥狀，進(jìn)行病原物的分離、純化、鑒定等，需要病原菌產(chǎn)生足夠多的菌絲或孢子，一般需要每克植物組織或土壤中含有500～800個(gè)分生孢子或相當(dāng)?shù)木z體，才能分離出來。本發(fā)明提供的菜豆炭疽病菌檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，能檢測(cè)到10pg/μl的DNA，也就是說，可以在病害顯現(xiàn)癥狀前，檢測(cè)出每克植物組織或土壤中含有5～10個(gè)分生孢子或相當(dāng)?shù)木z體，靈敏度相當(dāng)高。本發(fā)明的其它目的優(yōu)點(diǎn)可從以下的詳細(xì)描述結(jié)合附圖后獲知。


圖1顯示了在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中對(duì)菜豆植株葉片中炭疽菌的檢測(cè)結(jié)果，圖中泳道1陰性對(duì)照；泳道2陽性對(duì)照；泳道3、4發(fā)病菜豆葉片；泳道5健康菜豆植株。
圖2顯示了本發(fā)明另一實(shí)施方案中對(duì)菜豆豆莢中炭疽菌進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果，圖中泳道1陰性對(duì)照；泳道2陽性對(duì)照；泳道3至4發(fā)病菜豆豆莢；泳道5-7西瓜炭疽病葉；泳道8健康菜豆豆莢；泳道9健康西瓜葉片；泳道10辣椒炭疽菌；泳道11白菜炭疽菌；泳道12大豆炭疽菌；泳道13菜豆褐斑病菌；泳道14枯萎鐮刀菌；泳道15大豆疫霉菌。
圖3顯示了本發(fā)明另一實(shí)施方案中對(duì)菜豆田土壤中的菜豆炭疽菌進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果，圖中泳道1陰性對(duì)照；泳道；2、3陽性對(duì)照；泳道4發(fā)病菜豆葉片；泳道5發(fā)病菜豆田土壤；6、7非菜豆田土壤；8、9健康菜豆葉片。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明屬于農(nóng)作物防病治病及植物檢疫范疇。本發(fā)明者根據(jù)菜豆炭疽菌的ITS基因序列設(shè)計(jì)出的一對(duì)特異寡聚核苷酸引物(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)，再進(jìn)一步利用RAPD反應(yīng)，經(jīng)過對(duì)特異性條帶克隆、測(cè)序后，轉(zhuǎn)SCAR標(biāo)記，設(shè)計(jì)出另一對(duì)特異寡聚核苷酸引物(SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)。利用上述兩對(duì)引物組合成復(fù)合PCR檢測(cè)體系，從而為菜豆采前和采后炭疽病的快速、靈敏和準(zhǔn)確的檢測(cè)提供了技術(shù)和方法。
具體而言，本發(fā)明第一方面了一種用于特異性檢測(cè)樣品中菜豆炭疽菌的組合，所述組合包括兩對(duì)特異性引物，所述特異性引物選自以下序列第一對(duì)上游引物5’CTTTGTGAACATACCTAACC 3’下游引物5’GGTTTTACGGCAGGAGTG 3’；第二對(duì)上游引物5’ACCTGGACACATAAGTCAAAG3’下游引物5’CAACAATGCCAGTATCAGAG3’。
本發(fā)明的引物可用任何已知的方法產(chǎn)生，例如Matteucci等人[J.Am.Chem.Soc.(1981)1033185]的三酯合成方法或Urdea等人[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)807461]的方法，或用市售的自動(dòng)寡核苷酸合成儀合成。另外，還可以根據(jù)偏好選擇引物的化學(xué)特征。對(duì)于某些應(yīng)用，DNA或RNA是合適的。對(duì)于其它的應(yīng)用，還可以加入修飾，例如骨架修飾，如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯，改變RNA親和力，增加核酶抗性等[例如參見Agrawal和Iyer(1995)Curr Opin Biotechnol 612-19；Agrawal(1996)TIBTECH 14376-387]；還可采用類似物如肽核酸[例如參見Corey(1997)TIBTECH 15224-229；Buchardt等人(1993)TIBTECH 11384-386]。
本發(fā)明第二方面提供了一種PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含PCR反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系包含兩對(duì)特異性引物，所述特異性引物選自以下序列第一對(duì)上游引物5’CTTTGTGAACATACCTAACC 3’下游引物5’GGTTTTACGGCAGGAGTG 3’；第二對(duì)上游引物5’ACCTGGACACATAAGTCAAAG3’下游引物5’CAACAATGCCAGTATCAGAG3’。
本發(fā)明中所用的術(shù)語“PCR”或“聚合酶鏈反應(yīng)”指一種過程或技術(shù)(如美國專利No.4,683,195(1987年7月28日授權(quán))中所述的那樣)。通常，需要獲得感興趣區(qū)域兩端或其外延的序列信息，從而可以設(shè)計(jì)寡核苷酸引物；這些引物應(yīng)與待擴(kuò)增模板相反鏈的序列相同或相似。兩個(gè)引物的5′端核苷酸可以與擴(kuò)增材料的兩端恰好重合。PCR技術(shù)可用來擴(kuò)增全部基因組DNA中的、從全細(xì)胞RNA、噬菌體或質(zhì)粒序列等轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA中的特定RNA序列、特定DNA序列。見Mullis等，ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.51263(1987)；Erlich編輯，PCR Technology(Stockton Press，NY，1989)。
聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的一種檢測(cè)少量靶核酸的手段。類似試驗(yàn)在Mullis等人[Meth.Enzymol.(1987)155335-350]；美國專利4,683,195和4,683,202中有所描述。用兩個(gè)“引物”核苷酸與靶核酸雜交，并用來引導(dǎo)反應(yīng)。引物可包含不與擴(kuò)增靶序列(或其互補(bǔ)序列)雜交的序列，以幫助雙鏈體的穩(wěn)定性，或例如可插入一個(gè)簡(jiǎn)便的限制性位點(diǎn)。為了檢測(cè)出靶核酸的存在，特異性引物的選擇是至關(guān)重要的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)熟知的技術(shù)合適的選擇本發(fā)明試劑盒中的PCR反應(yīng)體系。在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施方案中，所述反應(yīng)體系還可包含PCR反應(yīng)緩沖液、Mg2+、dNTP和Taq酶等。PCR緩沖液可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)公知技術(shù)來確定，例如可以是100mM Tris HCl(pH 8.3)；500mM KCl；1.0％Triton X-100。在一個(gè)更佳的實(shí)施方案中，所述反應(yīng)體系由以下組分組成以1毫升溶液計(jì)，100μl10×PCR反應(yīng)緩沖液，80μl 2.5mM Mg2+，4種濃度為2.5mmol·L-1的dNTP各40μl，500單位Taq酶，20μM·L-1的兩對(duì)上、下游引物各20μl，余量為超純水。
另外，本發(fā)明的PCR檢測(cè)試劑盒中還可附帶操作說明書。
本發(fā)明的的PCR檢測(cè)試劑盒可用于特異性地檢測(cè)菜豆炭疽菌的存在與否。因此，本發(fā)明另一方面涉及所述PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)樣品中菜豆炭疽菌中的應(yīng)用。
本發(fā)明另一方面還提供了一種檢測(cè)樣品中菜豆炭疽菌的方法，該方法包括以下步驟，a)用本發(fā)明上述的PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；b)測(cè)定步驟a)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，若產(chǎn)物中存在442bp和638bp的DNA片段，則表明所述樣品中有菜豆炭疽菌。
在所述方法中，樣品可以是例如，但不局限于，菜豆植株的子葉、幼莖、真葉、莖、莢及種子，較佳的是上述菜豆植株組織的DNA提取物。所述DNA提取物可用市售的DNA提取試劑盒或其他常規(guī)的DNA提取方法獲得。在另一較佳的實(shí)施方案中，所述樣品也可以來自土壤或其他懷疑含有菜豆炭疽菌的任何樣品。
在上述方法中，首先在PCR檢測(cè)試劑盒所附說明書的條件或是由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定的條件下，用本發(fā)明所述的兩對(duì)菜豆炭疽菌特異性引物對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。然后，用常規(guī)方法，如凝膠電泳(如瓊脂糖凝膠電泳)測(cè)定步驟a)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。如果可以的話，還可以采用更為精確的測(cè)定方法，如對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序等。如果結(jié)果顯示上述兩對(duì)引物成功擴(kuò)增出了具有預(yù)計(jì)長度(442bp和638bp)的條帶，則表明所述樣品中有菜豆炭疽菌。應(yīng)當(dāng)理解的是，菜豆炭疽菌的DNA序列可能會(huì)發(fā)生各種變異(如缺失、增加或取代)，因此實(shí)際測(cè)得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度可能會(huì)與上述長度有一定的差別。所以，本發(fā)明說明書通篇中所用的長度“442bp和638bp”的含義并不僅僅表示這些長度本身，而是包括了在所述長度附近(例如相差20個(gè)bp或更多，較佳為相差10個(gè)bp，更佳為相差5個(gè)bp的)的長度。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有描述，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下列文獻(xiàn)中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover編輯1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編輯，1984)。或者，可按照試劑生產(chǎn)商所提供的說明書進(jìn)行。
實(shí)施例1、檢測(cè)菜豆植株葉片中炭疽菌a)材料設(shè)計(jì)如下所示的菜豆炭疽菌的特異性引物序列第一對(duì)上游引物5’CTTTGTGAACATACCTAACC 3’下游引物5’GGTTTTACGGCAGGAGTG 3’第二對(duì)上游引物5’ACCTGGACACATAAGTCAAAG3’下游引物5’CAACAATGCCAGTATCAGAG3’。
用DNA合成儀合成上述序列。
如下配制試劑盒反應(yīng)體系1mL檢測(cè)溶液包括100μl 10×PCR反應(yīng)緩沖液，80μl 2.5mM Mg2+，4種濃度為2.5mmol·L-1的dNTP各40μl，500單位Taq酶，20μM·L-1的上述二對(duì)上、下游引物各20μl，加入超純水至1mL檢測(cè)溶液。
b)方法1)從菜豆植株葉片中提取菜豆炭疽菌的DNA取葉背的葉脈呈紅褐色條斑的菜豆葉片，每克組織加入20μl 0.5N NaOH，在研缽中充分研磨后轉(zhuǎn)移至1.5ml的Eppendorf管中，12000rpm離心5min，取5μl上清液加入495μl 0.1mM Tris(pH 8.0)，混勻后取1μl直接用于PCR反應(yīng)。
2)菜豆炭疽菌的復(fù)合PCR檢測(cè)取1μl上述DNA粗提溶液，加入24μl試劑盒溶液總體積為25μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，進(jìn)入循環(huán)，94℃變性45S，62℃退火30S，72℃延伸1min，共計(jì)32個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸7min。
擴(kuò)增反應(yīng)的電泳檢測(cè)取8μl擴(kuò)增后的溶液，在1.5％的瓊脂糖凝膠于1×TAE中電泳，電壓5V/cm，電泳30分鐘后在紫外燈下觀察檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示，發(fā)病菜豆葉片(泳道3和4)擴(kuò)增出442bp和638bp兩條DNA譜帶(結(jié)果如圖1所示)，而健康菜豆植株(泳道5)則沒有。這說明檢測(cè)的葉片中含有菜豆炭疽病菌。
實(shí)施例2、檢測(cè)菜豆豆莢中炭疽菌采用與實(shí)施例1a)相同的反應(yīng)體系。
取有褐色小點(diǎn)狀病斑的菜豆豆莢表皮組織，每克組織加入25μl 0.5NNaOH，在研缽中充分研磨后轉(zhuǎn)移至1.5ml的Eppendorf管中，12000rpm離心5min，取8μl上清液加入492μl 0.1mM Tris(pH 8.0)，混勻后取1μl直接用于PCR反應(yīng)。
按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示發(fā)病菜豆豆莢(泳道3和4)與陽性對(duì)照(泳道2)一樣在638bp和442bp處見到兩條清晰的菜豆炭疽菌的特異譜帶，西瓜炭疽病葉顯示出有442bp的條帶，其他泳道則未見條帶(如圖2所示)。這表明本發(fā)明的方法能夠?qū)⒉硕固烤揖c其他相似或相關(guān)的菌種區(qū)分開來。
實(shí)施例3、檢測(cè)菜豆田土壤中的菜豆炭疽菌取1g上年菜豆炭疽病發(fā)病較重的菜豆田土壤，樣品中加入10ml提取液(0.5mM葡糖醇，15％聚乙二醇6 000，2％焦碳酸二乙脂，100mM EDTA和50mM三羥甲基氨基甲烷，pH 8.0)，混合5min，再加入600mg PVPP，120μl 50mg·ml-1溶菌酶和120μl 200mg·ml-1β-葡聚糖酶，混合后放置冰上2h。然后加入細(xì)胞溶解提取液(4.0ml 4％ SDS，100mM EDTA，60μl·ml-1蛋白酶K和50mM Tris pH8.0)，混合后放置冰上18h。離心10min，上清液加入3M醋酸鉀置冰上2h，離心留上清液，加入兩倍體積的100％乙醇沉淀DNA，溶于TE緩沖液。取1μl直接用于PCR反應(yīng)。按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果在442bp和638bp處可見兩條明亮的菜豆炭疽菌的特異性條帶(圖3)，這表明檢測(cè)的土壤中含有菜豆炭疽菌。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>華東理工大學(xué)<120>菜豆炭疽病菌的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法<130>058655<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1ctttgtgaac atacctaacc 20<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>3acctggacac ataagtcaaa g 21<210>4
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4caacaatgcc agtatcagag 20
權(quán)利要求
1.一種用于特異性檢測(cè)樣品中菜豆炭疽菌的組合，所述組合包括兩對(duì)特異性引物，所述特異性引物選自以下序列第一對(duì)上游引物5’CTTTGTGAACATACCTAACC 3’下游引物 5’GGTTTTACGGCAGGAGTG 3’；第二對(duì)上游引物5’ACCTGGACACATAAGTCAAAG3’下游引物 5’CAACAATGCCAGTATCAGAG3’。
2.一種PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含PCR反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系包含兩對(duì)特異性引物，所述特異性引物選自以下序列第一對(duì)上游引物5’CTTTGTGAACATACCTAACC 3’下游引物 5’GGTTTTACGGCAGGAGTG 3’；第二對(duì)上游引物5’ACCTGGACACATAAGTCAAAG3’下游引物 5’CAACAATGCCAGTATCAGAG3’。
3.如權(quán)利要求2所述的PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)體系還包含PCR反應(yīng)緩沖液、Mg2+、dNTP和Taq酶。
4.如權(quán)利要求2所述的PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)體系由以下組分組成以1毫升溶液計(jì)，100μl 10×PCR反應(yīng)緩沖液，80μl 2.5mM Mg2+，4種濃度為2.5mmol·L-1的dNTP各40μl，500單位Taq酶，20μM·L-1的兩對(duì)上、下游引物各20μl，余量為超純水。
5.一種檢測(cè)樣品中菜豆炭疽菌的方法，該方法包括以下步驟，a)用權(quán)利要求2所述的PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；b)測(cè)定步驟a)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，若產(chǎn)物中存在442bp和638bp的DNA片段，則表明所述樣品中有菜豆炭疽菌。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述樣品是菜豆植株的子葉、幼莖、真葉、莖、莢、種子及其DNA提取物。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述樣品是土壤。
8.權(quán)利要求2所述的PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)樣品中菜豆炭疽菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于特異性檢測(cè)樣品中菜豆炭疽菌的引物組合以及含有該引物組合物的PCR檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中菜豆炭疽菌的方法。本發(fā)明方法具有檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1814803SQ20051011077
公開日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日
發(fā)明者王偉, 唐建輝, 魏鴻剛, 沈國敏, 李元廣 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)