專利名稱：工程蛋白及制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及工程蛋白，尤其是當用于制備生物醫(yī)學(xué)模制品如眼用模制品時。
背景技術(shù)：
角膜占人眼屈光力的2/3。此屈光力可通過改變角膜曲率或通過改變角膜折射率而改變。據(jù)美國國家健康統(tǒng)計中心(National Center forHealth Statistics)的數(shù)據(jù)，美國人群中約52％戴有某些形式的矯正透鏡。盡管在過去的十年中在矯正近視、遠視和散光的屈光手術(shù)方面已取得了顯著進步，但仍存在一些問題。激光原位角膜磨鑲術(shù)(LASIK)和光性屈光性角膜切削術(shù)(PRK)已被證實在矯正近視、散光和低-中度遠視方面非常有效。這些方法的原理上局限在于其缺乏可逆性以及矯正遠視和高度近視的效力有限。
最近，隨著FDA批準有晶體眼人工晶狀體(IOL)[Verisyse，Advanced Medical Optics Santa Ana，CA]，有一種潛在的改進方法治療高度近視。盡管這些有晶體眼IOL為植入的近視者提供了極佳的視力品質(zhì)，但其可能與嚴重眼內(nèi)并發(fā)癥如眼內(nèi)炎和角膜失代償有關(guān)。另外，這些IOL對于在有淺前房趨勢的遠視患者中植入沒有同樣的安全性，增加了植入體損傷角膜的風險。
當前屈光手術(shù)方法的這些問題已重新點燃了對治療遠視和高度近視的角膜內(nèi)植入體(嵌體)的興趣。在角膜中植入微透鏡以矯正屈光不正并非新主意。在1949年，Barraquer描述了在兔模型中植入6mm無色玻璃(flint glass)角膜內(nèi)晶狀體。角膜出現(xiàn)基質(zhì)壞死，晶狀體被擠出。Barraquer使用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)晶狀體的隨后實驗得到相似的結(jié)果。他推斷經(jīng)合成高嵌體交換的有限代謝與角膜存活力不相容。在1967年，Dohlman在兔和貓中測試了由甲基丙烯酸甘油酯制成的水凝膠嵌體。這些水可滲透性植入體能夠進行代謝交換，且被兔角膜更好地耐受；但是，至3個月時，植入體經(jīng)常被擠出。在貓中，有極佳的臨床生物相容性，沒有擠出現(xiàn)象。其它在使用膠體素、聚丙烯、sialastic和聚砜的合成嵌體方面的嘗試沒有被角膜良好耐受，導(dǎo)致透明度受損。
基于水凝膠嵌體有前景的初步結(jié)果，這些材料已在動物模型中得到最透徹的研究，新近，已進入臨床實驗。業(yè)已將微孔化水凝膠制劑(Nutrapore)摻入到角膜嵌體(PermaVision，Anamed Inc.，Anaheim，CA)中并植入，以矯正遠視和高度近視。這些嵌體直徑為5.0mm，中心厚度為25-60μm。其水含量為78％，屈光指數(shù)近似于角膜。Michieletto和同事報道了10例遠視者，對這些遠視者，使用微型角膜刀創(chuàng)建角膜瓣，并在無縫線的情況下固定植入體，由此植入PermaVision晶狀體。盡管1個嵌體由于偏心而不得不被取出，但其它眼沒有失去最佳的矯正視力敏銳度，晶狀體在隨后的6個月看起來被良好耐受。值得注意的是，未對術(shù)前散光超過0.5屈光度的眼進行手術(shù)。Guell等報道了6例植入PermaVision嵌體的遠視眼。盡管所有的眼在沒矯正的情況下在12個月時均為20/40或更佳，但僅有1只眼在沒矯正時為20/20。作者推斷嵌體屈光力的可預(yù)測性“必須被提升”。Werblin和同事報道了應(yīng)用不同的水凝膠嵌體Permalens(Alcon Labs，F(xiàn)ort Worth，TX)矯正高度近視。將-10.00至-15.00屈光度的嵌體植入5名近視患者中。對于所有病例進行至少18個月的隨訪，角膜澄清度都得以保持，但和遠視嵌體中的情況一樣，屈光力的可預(yù)測性是一個重大問題。實際上，平均術(shù)后屈光不正為-5.7+2.1屈光度。盡管這些使用水凝膠嵌體矯正遠視和高度近視的探索性研究建立了一般的生物相容性(某些研究已出現(xiàn)晶狀體周炎癥或纖維化的病例)，但其確實揭示出需要可調(diào)性以使視覺效果最佳。因為不可能預(yù)知植入后患者的術(shù)后屈光不正，所以需要術(shù)后調(diào)節(jié)嵌體屈光力的方法。
當前水凝膠嵌體的一個顯著局限是其不能解決術(shù)后可調(diào)性的重要需求。
美國專利第4,264,155號(授予Miyata)公開了由膠原凝膠制的軟性接觸透鏡，在膠原凝膠中加入了水溶性有機多羥基聚合物，例如粘多糖、聚乙烯醇等，接著化學(xué)交聯(lián)凝膠。多羥基聚合添加劑據(jù)說“環(huán)繞”著膠原分子鏈，以保護其對抗微生物降解。在美國專利第4,264,155號中沒有講述或提示可能?；z原，以產(chǎn)生烯鍵式不飽和或聚合取代的膠原，其然后可聚合，形成生物和組織可接受性高的有用生物醫(yī)學(xué)制品。
例如，由WO95/13764已知提供由多孔聚合材料組成的角膜假體，用于矯正眼的光學(xué)特性或改變其外觀。角膜嵌體一般采用手術(shù)方法植入到哺乳動物角膜中或角膜上，例如通過在角膜的基質(zhì)組織中做一個切口，形成高嵌體置于其中的囊袋，然后通過縫合封口。
矯正屈光不正的替代方法是放置角膜高嵌體。其優(yōu)勢是可撤消、手術(shù)較簡單和穩(wěn)定。思路是將高嵌體放置在角膜基質(zhì)之上的前界層(Bowman’s layer)上，這改變了角膜曲率，由此改變了角膜的屈光力。
一種方法包括通過刮擦去除角膜的角膜上皮細胞層，將合成微透鏡直接放置于其上，和角膜組織密切接觸，并將其在適當?shù)奈恢帽３忠欢螘r間，這段時間足以使上皮細胞恢復(fù)、于植入體上生長，因此以持久方式固定植入體。使用生物相容性粘著劑，例如市售可得的膠原或纖維蛋白型雙組分粘著劑，實現(xiàn)高嵌體在角膜上的初始臨時固定。但是，所述粘著劑尚未被證實令人滿意，主要是因為嚴重的操作問題。
鑒于這些和其它缺點，有需要改進用于生物醫(yī)學(xué)模制品的材料，特別是用于角膜高嵌體的材料。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供工程蛋白及制備和使用該工程蛋白的方法。本發(fā)明的工程蛋白可為任何非天然蛋白、肽或多肽，其在交聯(lián)時可形成具有有利眼特性的晶狀體。在本發(fā)明的某些實施方案中，工程蛋白含至少一個纖連蛋白結(jié)構(gòu)域和至少一個彈性蛋白結(jié)構(gòu)域。蛋白可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法合成，可為重組蛋白或融合蛋白。在某些實施方案中，纖連蛋白結(jié)構(gòu)域可含CS1、CS5或III型結(jié)構(gòu)域，或RGD結(jié)構(gòu)域。在其它特定實施方案中，彈性蛋白結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列VPGVG、VPGKG、VPGIG或其功能等同物中的一個或組合。
在一個實施方案中，工程蛋白含SEQ ID NO1(LD-YAVTGRGDSPASSKPIA((VPGIG)2VPGKG(VPGIG)2)4VP)3。還設(shè)想蛋白可具有某些標志，例如His標志，以利于純化。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，這樣的標志可被切除或以其它方式去除，而不影響工程蛋白的材料特性。在本發(fā)明的一個實施方案中，工程蛋白小于30kd、小于15kd或小于10kd。
蛋白可按照本發(fā)明交聯(lián)。設(shè)想交聯(lián)可為化學(xué)或紫外交聯(lián)。在某些實施方案中，交聯(lián)以在交聯(lián)產(chǎn)物中留下最少雜質(zhì)的方式發(fā)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，工程蛋白的彈性特性可通過交聯(lián)度改變，通過增加交聯(lián)可產(chǎn)生更剛性的產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會認識到，可通過改變蛋白設(shè)計實現(xiàn)交聯(lián)增加。例如，在本發(fā)明的某些實施方案中，工程蛋白經(jīng)結(jié)構(gòu)域VPGKG中的賴氨酸殘基交聯(lián)。增加交聯(lián)可用的賴氨酸數(shù)可改變蛋白的彈性特性。因此，可通過改變相對于VPGKG區(qū)段數(shù)的VPGIG重復(fù)區(qū)段數(shù)，改變SEQ ID NO1中的蛋白。在某些實施方案中，交聯(lián)產(chǎn)物中的雜質(zhì)可通過清洗或化學(xué)提取去除。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供含纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域和彈性蛋白樣結(jié)構(gòu)域的重復(fù)區(qū)段鏈的工程蛋白組合物。設(shè)想工程蛋白組合物還可包含絲心蛋白、彈性蛋白、角蛋白、膠原蛋白的重復(fù)區(qū)段或重復(fù)單元組合。
本發(fā)明的一個實施方案是含工程蛋白的晶狀體，其中工程蛋白是交聯(lián)的。在一個具體實施方案中，晶狀體是接觸透鏡、角膜高嵌體、角膜嵌體或人工晶狀體。在另一個具體實施方案中，產(chǎn)物形成角膜移植片或角膜片(corneal patch)。本發(fā)明的工程蛋白產(chǎn)物適于角膜置換，其中角膜組織的全部或部分被本文所述的工程蛋白置換。
在某些實施方案中，設(shè)想晶狀體具生物相容性、光學(xué)透明、抗生物降解，刺激鄰近細胞粘附，具有有利的彈性特性。在本發(fā)明的一個實施方案中，晶狀體具有約0.01至約5.0Mpa的彈性模數(shù)。在另一個實施方案中，晶狀體具有約0.05至約2.0Mpa的彈性模數(shù)。在另一個實施方案中，晶狀體基本上沒有內(nèi)毒素或其它污染物。
本發(fā)明的另一個實施方案是由本文描述的工程蛋白制成的薄膜或覆膜(coating)。
本發(fā)明的另一個實施方案是通過將含工程蛋白的角膜高嵌體植入角膜中或角膜上從而矯正眼光學(xué)特性的方法，其中該蛋白含至少一個纖連蛋白結(jié)構(gòu)域和至少一個彈性蛋白結(jié)構(gòu)域。
在某些實施方案中，設(shè)想可通過含對光化學(xué)交聯(lián)敏感的反應(yīng)性側(cè)鏈，由工程蛋白制備可調(diào)節(jié)的生物醫(yī)學(xué)植入體，例如角膜植入體。例如，可將丙烯?；虍惗∠；B接至本發(fā)明蛋白的賴氨酸側(cè)鏈。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，可調(diào)節(jié)單個工程蛋白中具有丙烯酰基或異丁烯?；陌被釟埢鶖?shù)。在本發(fā)明的某些實施方案中，每個工程蛋白都具有至少一個具有丙烯酰基或異丁烯?；男揎椯嚢彼釟埢?。在本發(fā)明的其它實施方案中，一些賴氨酸殘基被修飾，而其它賴氨酸殘基未被修飾。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，改變修飾的賴氨酸殘基數(shù)會產(chǎn)生具有可變材料特性的光固化變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，可用增加交聯(lián)度的反應(yīng)性側(cè)鏈類似地修飾其它氨基酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉其中可調(diào)節(jié)眼晶狀體的技術(shù)。參見例如美國專利公開說明書第20030176521號和第20030174375號，這兩個專利說明書都在此引入作為參考。
在本發(fā)明的某些實施方案中，工程蛋白是低分子量蛋白，其提供通過圖案照射(patterned irradiation)和低分子量物質(zhì)在滲透梯度作用下擴散從而改變植入體局部曲率的基礎(chǔ)。在達到目的形狀改變后，通過進一步照射整個植入體“鎖定”結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明的某些實施方案中，本發(fā)明的工程蛋白與可通過工程蛋白溶液擴散并有助于交聯(lián)或聚合過程的小分子接觸。
在本發(fā)明的某些實施方案中，本發(fā)明的工程蛋白可形成置換全部或部分角膜的移植片。
前文相當廣泛地概述了本發(fā)明的特征和技術(shù)優(yōu)勢，以便可更好地理解隨后的本發(fā)明詳述。下文描述本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢。應(yīng)當認識到，可容易地利用所公開的理念和具體實施方案作為修飾或設(shè)計用于實施本發(fā)明相同目的的其它結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。還應(yīng)當認識到，這樣的等同構(gòu)造并沒有偏離如本文闡明的本發(fā)明。當將以下描述連同附圖一起考慮時，由以下描述可更好地理解相信為本發(fā)明特征的、關(guān)于其組成和操作方法的新特征，以及進一步的目標和優(yōu)勢。但是，不言而喻，提供的每幅圖都僅是為了例證和描述目的，無意界定本發(fā)明的限制。
附圖簡述為更全面地理解本發(fā)明，現(xiàn)在參考以下的描述以及附圖，其中


圖1顯示了工程蛋白材料的蛋白設(shè)計。顯示了完整的氨基酸序列。顯示了纖連蛋白衍生結(jié)構(gòu)域(促進與上皮細胞的相互作用)和彈性蛋白結(jié)構(gòu)域(用于結(jié)構(gòu)支持體柔性)。還有一個用于蛋白鑒別的標志、用于蛋白純化的標志和切割位點；圖2顯示了SDS凝膠和對應(yīng)的顯示單一條帶的蛋白質(zhì)印跡，該單一條帶代表具有35.1kDa分子量的人工蛋白；圖3顯示工程蛋白如何交聯(lián)在高嵌體中。然后工程蛋白溶液在成型入角膜高嵌體后經(jīng)歷交聯(lián)反應(yīng)。顯示了模制品。其由PMMA材料制成，產(chǎn)生6.0mm高嵌體；圖4顯示了高嵌體圖象；圖5顯示了臨床檢查照片，其圖示了在術(shù)后即時、術(shù)后48小時和術(shù)后1周植入角膜中的高嵌體。空心白箭頭顯示了囊袋中植入高嵌體的折入邊(tucked-in edge)。黑箭頭顯示了環(huán)鉆傷口。熒光素染料使整個暴露的高嵌體表面染色。在相同眼48小時后的照片中，上皮再形成過程業(yè)已開始，細胞由外周向內(nèi)遷入，證據(jù)是在這些區(qū)域缺乏熒光素染料。黑箭頭顯示了用于對比的初始傷口邊緣。在術(shù)后1周，高嵌體已被上皮摻入并完全覆蓋。沒有熒光素染色；圖6顯示了對照眼的示意剖面；和圖7顯示了植入高嵌體的示意剖面。PAS染色的低放大倍數(shù)視野顯示了板層囊袋中的高嵌體。變形的角膜結(jié)構(gòu)是保藏過程的人工制品。
圖8顯示了在第7天時間點的組織學(xué)檢查。(A)在低放大倍數(shù)時，Mason三色染色顯示了與天然角膜對比新高嵌體材料未染色。(B)經(jīng)H & E染色的標本證實高嵌體表面上皮再形成。(C)較高放大倍數(shù)揭示了角膜基質(zhì)、高嵌體和上覆的1-2個細胞層厚度的上皮，該上皮通常用于再生角膜上皮。
發(fā)明詳述I.本發(fā)明本發(fā)明涉及工程蛋白產(chǎn)物，其可形成可用于醫(yī)學(xué)用途的成型制品，包括用于眼科學(xué)、手術(shù)、矯形外科和心臟病學(xué)的植入體。這些由工程蛋白制成的材料還可用于替換部分或全部角膜，即在板層或穿透式角膜移植術(shù)后作為移植組織。本發(fā)明的工程蛋白材料和制品既可用作高嵌體，也可用作嵌體。工程蛋白材料和制品可用于白內(nèi)障手術(shù)，以替換晶狀體或用作有晶狀體眼人工晶狀體。
在本發(fā)明的某些實施方案中，由工程蛋白制成的晶狀體具有至少一個(在某些實施方案中具有全部)下述有利眼特性生物相容性；可預(yù)知的近視、遠視和散光矯正；矯正高階像差(特別是球面像差)以賦予好于20/20視力的能力；能夠輕易插入的機械特性和耐久性；能夠隨時間保持穩(wěn)定屈光矯正的能力；容易和低成本生產(chǎn)；以及可更換性。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，工程蛋白制品是角膜高嵌體。本發(fā)明設(shè)想的角膜高嵌體晶狀體由重新設(shè)計的蛋白構(gòu)成，其中所述重新設(shè)計的蛋白經(jīng)基因工程而包含提供有利眼特性的結(jié)構(gòu)域。
在本發(fā)明的某些實施方案中，工程蛋白由人纖連蛋白和哺乳動物彈性蛋白制備?？砂被嵝蛄芯彼?甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的纖連蛋白結(jié)構(gòu)域設(shè)計用來促進細胞生長和粘附。彈性蛋白樣結(jié)構(gòu)域可構(gòu)成蛋白的大部分，設(shè)計用來確保交聯(lián)材料的彈性。先前還沒有考慮過應(yīng)用工程蛋白作為角膜高嵌體的基礎(chǔ)。這些蛋白由于以下原因?qū)?yīng)用于角膜高嵌體有優(yōu)勢1)已知RGD序列促進與許多細胞類型的粘附。
2)彈性蛋白樣材料先前已表現(xiàn)出生物相容性。
3)彈性蛋白和彈性蛋白樣蛋白一般來說抗酶降解，這延長了其在角膜中的預(yù)期壽命。
4)彈性蛋白樣蛋白在水中具有高分子移動性，預(yù)期這促進營養(yǎng)物通過高嵌體薄膜良好擴散。
5)蛋白的模塊設(shè)計指僅提供一些氨基酸結(jié)構(gòu)域，而可用于角膜高嵌體的天然蛋白(如膠原蛋白)的生物學(xué)更為復(fù)雜。
6)可使用現(xiàn)有的化學(xué)方法使設(shè)計的蛋白交聯(lián)，以產(chǎn)生透明薄膜，包括角膜晶狀體型薄膜。
7)交聯(lián)蛋白薄膜的模數(shù)約為0.2MPa，這對應(yīng)用來說足夠柔性，足以允許良好的手術(shù)操作。
本文描述的角膜高嵌體能夠以手術(shù)和活體角膜聯(lián)系在一起，優(yōu)選附著于活體角膜，以便改變其光學(xué)特性(例如矯正眼睛的視力缺陷)或改變眼睛外觀，例如瞳孔著色。可用一種或多種色素或染料對高嵌體或其部分著色，這在本領(lǐng)域眾所周知。著色高嵌體，特別是在瞳孔區(qū)域周圍著色，將導(dǎo)致植入時眼睛顏色改變。
本發(fā)明還設(shè)想了工程蛋白聚合組合物的眾多其它用途。用途包括但不限于以下方面生產(chǎn)工程組織和器官，包括例如工程蛋白材料的貼片、栓或組織的結(jié)構(gòu)。這些和其它構(gòu)建物可補加細胞，或不補加細胞使用。另外的用途包括以下方面假體和其它植入體；誘導(dǎo)細胞在體外或體內(nèi)分化的組織支架；傷口修復(fù)或包扎；穩(wěn)態(tài)裝置；用于組織修補和支持的裝置或結(jié)構(gòu)(例如縫線、粘合劑、手術(shù)和矯形螺釘以及手術(shù)和矯形板)；用于合成植入體的天然涂層或組分；美容用植入體和支持體；用于器官或組織的修復(fù)或結(jié)構(gòu)支持體；物質(zhì)傳遞；生物工程平臺；測試物質(zhì)對細胞作用的平臺；細胞培養(yǎng)；以及眾多其它用途。
II.定義本文使用的單詞“a”或“an”當和術(shù)語“包含”在句子和/或說明書中一起連用時，可指“一個”，但其也與“一個或多個”、“至少一個”和“一個或一個以上”的含義相一致。本文使用的“另一個”可指至少第二個或更多個。再進一步，術(shù)語“具有”、“包括”、“包含”和“含有”可交互使用，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到這些術(shù)語是開放式術(shù)語。
本文使用的術(shù)語“cDNA”可指單鏈或雙鏈DNA分子。對于單鏈cDNA分子，DNA鏈與由基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA(“mRNA”)互補。對于雙鏈cDNA分子，一條DNA鏈與mRNA互補，另一條鏈與第一條DNA鏈互補。
術(shù)語“保守置換”就蛋白或肽而言用于反映基本不改變分子活性(特異性或結(jié)合親和性)的氨基酸置換。典型的保守氨基酸置換涉及用一個氨基酸置換另一個具有相似化學(xué)特性(例如電荷或疏水性)的氨基酸。以下的6組各自包含通常彼此為保守置換的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。本發(fā)明的內(nèi)化肽可經(jīng)修飾以包含保守置換，只要置換不影響肽的內(nèi)化能力。
本文使用的“編碼序列”或“編碼”特定蛋白的“核苷酸序列”是在處于合適的調(diào)節(jié)序列控制下時在體內(nèi)或體外被轉(zhuǎn)錄和翻譯為多肽的核酸分子。編碼序列的邊界由5′-末端的起始密碼子和3′-末端的終止密碼子確定。編碼序列可包括但不限于原核核酸分子、真核mRNA的cDNA、真核(例如哺乳動物)源的基因組DNA、病毒RNA或DNA乃至合成核苷酸分子。轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3′。
本文使用的蛋白“結(jié)構(gòu)域”指肽序列的功能單元。例如，VPGVG是彈性蛋白結(jié)構(gòu)域。另外，纖連蛋白的CS1區(qū)域是結(jié)構(gòu)域。對于本發(fā)明目的，蛋白結(jié)構(gòu)域不必具有任何特定結(jié)構(gòu)或折疊特性。
本文使用的術(shù)語“工程蛋白”指非天然多肽。該術(shù)語包括例如相對于天然多肽含一個或多個改變(包括添加、缺失或置換)的多肽，其中這樣的改變通過重組DNA技術(shù)引入。該術(shù)語還包括含人工產(chǎn)生的氨基酸序列的多肽、人工蛋白、融合蛋白和嵌合多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地生產(chǎn)按照本發(fā)明的此方面有用的工程蛋白。當幾種所需蛋白片段或肽編碼在摻入到載體中的核苷酸序列中時，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，可通過由一個或多個氨基酸組成的間隔分子(例如肽)分隔蛋白片段或肽。一般而言，除了將所需蛋白片段或肽連接在一起或保持它們之間的某些最小距離或其它空間關(guān)系以外，間隔區(qū)不具有特定的生物活性。但是，可選擇間隔區(qū)的組成氨基酸，以影響分子的某些特性，例如折疊、凈電荷或疏水性?？蓪⒂脕懋a(chǎn)生可用于純化所表達重組蛋白的殘基的編碼核苷酸序列構(gòu)建入載體中。這樣的序列是本領(lǐng)域已知的。例如，可將編碼多組氨酸序列的核苷酸序列加入到載體中，以利于在鎳柱上純化表達的重組蛋白。一旦表達，就可按照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標準方法，包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、凝膠電泳等，來純化重組肽、多肽和蛋白。優(yōu)選約50-99％均一性的大致純的組合物用作治療劑，最優(yōu)選80-95％或更高均一性的組合物用作治療劑。工程蛋白可通過任何方法(包括例如肽、多肽或蛋白合成)生產(chǎn)。
本文使用的術(shù)語“基因”指直接或間接編碼具有限定生物活性的核酸或蛋白產(chǎn)物的DNA分子。本領(lǐng)域經(jīng)常遇到的一類基因是所謂的“報告基因”。報告基因是其表達用于檢測與其有效連接的控制序列活性的任何基因。常用的報告基因的實例包括但不限于β-半乳糖苷酶基因、氯霉素氨基轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因、熒光素酶(luc)基因和熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白(GFP)、藍色熒光蛋白(BFP)等)編碼基因。理想的是，報告基因不干擾作為研究靶標的基礎(chǔ)生物過程。但是，在某些情況下，可能需要通過將控制序列連接至其產(chǎn)物不改變其中發(fā)生基因表達的系統(tǒng)的基礎(chǔ)生物學(xué)的基因來檢測控制序列活性。這樣的基因盡管也是報告基因，但通常稱為“生物活性”基因。
本文使用的術(shù)語“基因組DNA”指由其轉(zhuǎn)錄RNA分子的DNA分子。RNA分子最常見的是信使RNA(mRNA)分子，其最終被轉(zhuǎn)錄為具有限定生物活性的蛋白，但作為選擇，可為轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)或核糖體RNA(rRNA)分子，它們是蛋白合成過程的介導(dǎo)物。
如本文所用，兩個核酸分子在共有兩個或多個可定量的生物功能時是“功能等同物”。例如，一級序列不同的核酸分子可編碼相同的多肽；這樣的分子盡管不同，卻是功能等同物。在該實例中，這些分子也可共有高度的序列同源性。同樣，一級序列不同的核酸分子可共有作為RNA轉(zhuǎn)錄啟動子的活性，其中所述RNA轉(zhuǎn)錄發(fā)生在特定細胞亞群中，并響應(yīng)于一組獨特的調(diào)節(jié)物質(zhì)；這樣的核酸分子也是功能等同物。
本文使用的DNA構(gòu)建物的“異源”區(qū)是另一個DNA分子中或連接至另一個DNA分子的可鑒別DNA區(qū)段，未發(fā)現(xiàn)其與另一個分子天然相連。異源編碼序列的實例是其中編碼序列自身天然不存在的構(gòu)建物(例如密碼子不同于天然基因的合成序列)。等位基因變體或天然突變事件不產(chǎn)生如本文所使用的DNA異源區(qū)。
如本文所用，據(jù)使用標準序列分析軟件如Vector NTI、GCG或BLAST的測定，當兩個核酸分子在分子的限定長度內(nèi)，包含的至少約60％-75％、優(yōu)選至少約80％或最優(yōu)選至少約90％的核苷酸相同時，兩個核酸分子是“同源”的。同源的DNA序列可通過在所限定特定系統(tǒng)的嚴格條件下雜交來鑒別。限定合適雜交條件屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍。參見例如1989年第一次印刷但每年更新的Current Protocols inMolecular Biology，卷I.Ausubel等編輯，John WileyNew York N.Y.，2.10.1-2.10.16頁，其中可通過使用在含0.1-2xSSC(15-30mM NaCl、1.5-3mM檸檬酸鈉，pH7.0)和0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的溶液中于65-68℃或更高溫度反復(fù)漂洗，達到固定在硝酸纖維素濾膜上的DNA樣品的最大雜交特異性。對于固定在尼龍濾膜上的DNA樣品，嚴格雜交漂洗溶液可由40mM NaPO4，pH7.2、1-2％SDS和1mMEDTA組成。再者，推薦至少65-68℃的漂洗溫度，但真正嚴格漂洗需要的最佳溫度將取決于核酸探針的長度、其GC含量、單價陽離子的濃度和甲酰胺的濃度，如果有甲酰胺的話，其包含于雜交溶液中(Current Protocols in Molecular Biology，卷I.Ausubel等編輯，JohnWileyNew York N.Y.，2.10.1-2.10.16頁，1989和每年更新)。
本文使用的術(shù)語“核酸分子”現(xiàn)包括DNA，也包括RNA，除非另有說明，否則既包括雙鏈核酸，也包括單鏈核酸。還包括同時含DNA和RNA的分子，或者為DNA/RNA異源雙鏈體(也稱為DNA/RNA雜合體)或者為在同一條鏈同時含DNA和RNA的嵌合分子。本發(fā)明的核酸分子可包含修飾堿基。本發(fā)明提供“有義”方向(即與基因編碼鏈方向相同)和“反義”方向(即與基因編碼鏈互補的方向)的核酸分子。
本文使用的術(shù)語“有效連接的”指核酸分子的排列，其中配置所述組分，以實現(xiàn)其常用功能。
術(shù)語“多肽”、“肽”或“蛋白”在本文用于指一列線性的氨基酸殘基，其通過相鄰殘基的α-氨基和羧基之間的肽鍵一個接一個連接。氨基酸殘基優(yōu)選為天然“L”異構(gòu)形。但是，可用“D”異構(gòu)形殘基取代任何L-氨基酸殘基，只要多肽保留了所需功能特性。另外，除20個“標準”氨基酸以外，氨基酸還包括修飾的和不常見的氨基酸。而且，應(yīng)當注意的是，在氨基酸殘基序列開始或結(jié)束處的破折號表示與具有一個或多個氨基酸殘基的其它序列連接的肽鍵或與羧基或羥基末端基團連接的共價鍵。
如本文所用，可通過稱為“轉(zhuǎn)導(dǎo)”、“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”的過程將外源DNA導(dǎo)入到細胞中。轉(zhuǎn)導(dǎo)指經(jīng)病毒來源的載體穿過真核細胞膜導(dǎo)入為RNA或DNA的遺傳物質(zhì)。轉(zhuǎn)染指利用化學(xué)方法(如通過磷酸鈣介導(dǎo)的沉淀)、機械方法(例如電穿孔)或物理方法(例如生物彈道傳遞)穿過真核細胞膜導(dǎo)入遺傳物質(zhì)。轉(zhuǎn)化指利用化學(xué)、機械、物理或生物方法將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入到非真核細胞(例如細菌細胞或酵母細胞)中。傳遞到細胞中的遺傳物質(zhì)可整合(共價連接)或不整合到染色體DNA中。
III.角膜上皮角膜具有幾種重要的視覺功能，例如將＞80％的入射光折射在視網(wǎng)膜上、濾出有害的UV射線和保持光學(xué)“窗口”。角膜由5個結(jié)構(gòu)層組成上皮、前界層、基質(zhì)、Descemet膜和內(nèi)皮。最外層角膜上皮是多層結(jié)構(gòu)，具有胞間連接、化學(xué)信號傳導(dǎo)和神經(jīng)末梢的復(fù)雜排列。和整個機體內(nèi)的其它上皮層類似，角膜上皮阻止病原體進入、提供抗體液流失的屏障和保護免受擦傷傷害。上皮僅通過一層液體淚液和外部環(huán)境分開。
角膜上皮由三種類型的細胞組成—基細胞(1層)、翼狀細胞(1-3層)和扁平細胞(3-4層)，它們通過緊密細胞連接彼此粘附?；毎€與支持性胞外基質(zhì)形成強粘附復(fù)合物，并最終與前界層形成強粘附復(fù)合物。前界層是角膜基質(zhì)的最外層，是由膠原纖維和相連的蛋白多糖組成的無細胞區(qū)，它們以隨機方式密集編織成氈樣基質(zhì)。在上皮的細胞中，僅基細胞具有有絲分裂能力。和機體內(nèi)所有復(fù)層上皮一樣，角膜上皮是自我更新的；每5-7天就發(fā)生一次徹底的細胞更新。一般來說，在基細胞經(jīng)歷有絲分裂后，子細胞開始向外遷移，向終末分化，并最終脫皮。參見C.Hanna等，“Cell production and migrationin the epithelial layer of the cornea，”Arch.Ophthalmol.，64卷，536頁(1960)。
在本發(fā)明的某些實施方案中，設(shè)想本發(fā)明的眼工程蛋白制品，包括角膜高嵌體、人工晶狀體或接觸透鏡，將在制品表面上呈現(xiàn)出上皮細胞的匯合生長。另外，在本發(fā)明的某些實施方案中，工程蛋白制品將表現(xiàn)出對降解和排斥的抗性。在某些實施方案中，工程蛋白包含促進神經(jīng)穿過植入體生長的組分，如神經(jīng)生長因子的功能片段。在某些實施方案中，合適時，可使用手術(shù)技術(shù)使本發(fā)明的高嵌體通過物理粘附附著于角膜基質(zhì)。在其它實施方案中，角膜高嵌體可借助生物粘附膠粘劑如血纖蛋白組織膠粘劑粘附于角膜。在某些實施方案中，可通過手術(shù)(或在具體實施方案中借助激光)在角膜上皮和前界層之間創(chuàng)建手術(shù)囊袋或膜瓣。然后可將本發(fā)明的晶狀體植入到膜瓣下或囊袋中，而無需使用生物膠粘劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，可能需要些許設(shè)計修改，以修改工程蛋白設(shè)計或工程蛋白產(chǎn)物形狀、提升某些優(yōu)勢，例如增強角膜中高嵌體和前界層之間的粘附。
IV.工程蛋白本發(fā)明的工程蛋白可為任何蛋白，其在交聯(lián)或形成成型制品時，具有有利眼特性，例如彈性、透明度、生物相容性等。在本發(fā)明的某些實施方案中，工程蛋白是融合蛋白或嵌合蛋白。在本發(fā)明的某些實施方案中，工程蛋白由各種蛋白來源的人蛋白結(jié)構(gòu)域組合制成。在本發(fā)明的一個實施方案中，工程蛋白包含至少一個來自人胞外基質(zhì)蛋白的結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的另一個實施方案中，人蛋白結(jié)構(gòu)域是已經(jīng)過修飾從而增加了工程蛋白有利眼特性的野生型蛋白變體。
適用于工程蛋白的結(jié)構(gòu)域或蛋白片段的一個實例是彈性蛋白結(jié)構(gòu)域。彈性蛋白(SEQ ID NO29)是提供巨大強度和彈性的結(jié)構(gòu)分子。其抗分解。其序列主要由疏水氨基酸的簡單重復(fù)序列組成。彈性蛋白的重要特征是發(fā)生在賴氨酸殘基上的其多肽鏈之間的廣泛交聯(lián)，這是彈性蛋白獨特結(jié)構(gòu)和不溶性的原因。彈性蛋白的一個典型重復(fù)序列是VPGVG。纖連蛋白(SEQ ID NO28)是由稱為I、II和III型的三種原型結(jié)構(gòu)域的同源重復(fù)序列組成的模塊式蛋白質(zhì)(modularprotein)。纖連蛋白III型(FN3)重復(fù)序列是最大且最常見的纖連蛋白亞結(jié)構(gòu)域。FN3表現(xiàn)出功能以及結(jié)構(gòu)模塊性。業(yè)已將與其它分子相互作用的位點作圖至短氨基酸序列段上，例如存在于各種FN3結(jié)構(gòu)域中的Arg-Gly-Asp(RGD)序列。RGD序列參與和整合素的相互作用。含RGD序列的小肽可調(diào)節(jié)各種與血栓形成、炎癥和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的細胞粘附事件。在角膜中，已知纖連蛋白在傷口愈合中起重要作用其觸發(fā)上皮細胞生長、遷移和粘附至下面的胞外基質(zhì)。已知含F(xiàn)N3結(jié)構(gòu)域的一些其它蛋白是接觸蛋白2或axonin-1蛋白、膠原蛋白α1鏈、神經(jīng)細胞粘附蛋白L1、白細胞共同抗原和接觸蛋白。
一般而言，區(qū)段包括組成蛋白中存在的肽序列的重復(fù)氨基酸組。定性地看，基因工程蛋白與天然存在的連續(xù)多肽的區(qū)別在于其區(qū)段重復(fù)序列的長度可以更大(達數(shù)百個氨基酸，相比之下連續(xù)多肽少于10個)，其區(qū)段重復(fù)序列的序列幾乎可無限復(fù)雜。表1描述了基因工程區(qū)段的實例。表1和基因工程區(qū)段的進一步描述可見于Franco A.Ferrari和Joseph Cappello，Biosynthesis of Protein Polymers，載于Protein-Based Materials，(Kevin McGrath和David Kaplan編輯)，第2章，37-60頁，Birkhauser，Boston(1997)。本發(fā)明的工程蛋白可包含任何順序、任意重復(fù)序列數(shù)、與任何其它合適結(jié)構(gòu)域(例如纖連蛋白結(jié)構(gòu)域和彈性蛋白結(jié)構(gòu)域)組合的任何以下序列，從而提供在形成晶狀體或人工組織時提供有利眼特性的蛋白。本發(fā)明的工程蛋白還包括本文所述任意序列的功能變體。在本發(fā)明的某些實施方案中，功能變體與其參比序列具有至少80％的序列同源性。
表1蛋白聚合物序列


選定蛋白聚合物的重復(fù)氨基酸序列。SLP＝絲樣蛋白；SLPF＝含纖連蛋白RGD序列的SLP；SLPL 3/0和SLPL 3/1＝含層粘連蛋白的兩個不同序列的SLP；ELP＝彈性蛋白樣蛋白；SELP＝絲狀彈性蛋白樣蛋白；CLP＝膠原蛋白樣蛋白；CLP-CB＝含人膠原蛋白細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的CLP；KLP＝角蛋白樣蛋白。
工程蛋白的實施方案包括交聯(lián)蛋白產(chǎn)物。可通過使蛋白與合適的生物相容性交聯(lián)劑反應(yīng)而交聯(lián)蛋白。交聯(lián)劑包括但不限于戊二醛、辛二酸雙(磺基琥珀酰亞胺)酯、對疊氮苯甲酰肼(p-AzidobenzolylHydazine)、N-5-疊氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酸亞胺、4-[對疊氮基水楊基酰氨基]丁胺、任何其它合適的交聯(lián)劑及其任意組合。各種交聯(lián)劑的描述和羅列以及用這樣的交聯(lián)劑實施交聯(lián)步驟的方法的公開內(nèi)容可見于Pierce Endogen 2001-2002目錄，其在此引入作為參考。工程蛋白可利用本領(lǐng)域一般已知的方法交聯(lián)。例如，可通過使工程蛋白裝置暴露于氣態(tài)交聯(lián)劑、液態(tài)交聯(lián)劑、光或其組合或與其接觸和/或溫育，使工程蛋白部分或全部地交聯(lián)。
可調(diào)節(jié)的生物醫(yī)學(xué)植入體，例如角膜植入體，可通過使工程蛋白含對光化學(xué)交聯(lián)敏感的反應(yīng)性側(cè)鏈而由工程蛋白制備。使丙烯?；虍惗∠；鶊F連接至蛋白的賴氨酸側(cè)鏈產(chǎn)生可通過激光輻射交聯(lián)的光固化變體。包含類似地官能化的低分子量蛋白提供了通過圖案照射和低分子量物質(zhì)在滲透梯度作用下擴散從而改變植入體局部曲率的基礎(chǔ)。在達到目的形狀變化后，通過進一步照射整個植入體“鎖定”結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的工程蛋白還可包括治療性肽片段，以在蛋白用作例如晶狀體時提供給患者治療利益。
V.肽合成本發(fā)明的工程蛋白可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的肽合成技術(shù)合成(Bodanszky等，1976；)Peptide Synthesis，1985；Solid PhasePeptide Synthelia，1984)；The Proteins，1976。適用于此合成的保護基可見于以上文獻以及載于Protective Groups in Organic Chemistry，1973。這些合成方法包括序貫加入一個或多個氨基酸或合適的受保護氨基酸殘基，以增長肽鏈。通常，第一個氨基酸殘基的氨基或羧基的任一個受到合適的、可選擇性去除的保護基保護。不同的可選擇性去除的保護基用于含反應(yīng)性側(cè)基的氨基酸，例如賴氨酸。
使用固相合成作為實例，通過其未被保護的羧基或氨基將受保護或衍化的氨基酸連接至惰性固體支持體。然后選擇性去除氨基或羧基的保護基，與序列中具有適當受保護的互補(氨基或羧基)基團的下一個氨基酸混合，并與已連接至固體支持體的殘基反應(yīng)。然后去除此新加入的氨基酸殘基中的氨基或羧基的保護基，接著加入下一個氨基酸(適當受保護)，以此類推。在所有需要的氨基酸都以正確的順序連接后，序貫或同時去除任何剩余的端基和側(cè)基保護基(和固體支持體)，以提供最終的肽。本發(fā)明的肽優(yōu)選沒有芐化或甲芐化的氨基酸。這樣的保護基部分可用于合成過程，但其在使用肽之前去除。如其它文獻所述，可能需要另外的反應(yīng)，以形成抑制構(gòu)象的分子內(nèi)鍵合。
VI.融合蛋白本發(fā)明涉及工程蛋白，其可為重組蛋白。在本發(fā)明的某些實施方案中，融合蛋白可能是有用的。融合蛋白一般可使用標準技術(shù)制備，包括化學(xué)綴合。優(yōu)選融合蛋白表達為重組蛋白，使得可在表達系統(tǒng)中相對于非融合蛋白以增加水平生產(chǎn)。簡言之，編碼多肽組分的DNA序列可單獨裝配，并連接入合適的表達載體中。用或不用肽接頭，將編碼一種多肽組分的DNA序列的3′末端連接至編碼第二種多肽組分的DNA序列的5′末端，以使序列讀框一致。這允許翻譯為單個融合蛋白，其保有兩種組成多肽的生物活性。
可使用肽接頭序列以足以確保每個多肽折疊成其二級或三級結(jié)構(gòu)的距離分隔第一種和第二種多肽組分。使用本領(lǐng)域眾所周知的標準技術(shù)將這樣的肽接頭序列摻入到融合蛋白中?？筛鶕?jù)以下因素選擇合適的肽接頭序列(1)其采用柔性延長構(gòu)象的能力；(2)其不能采用可與第一種和第二種多肽上的功能表位相互作用的二級結(jié)構(gòu)；和(3)沒有可與多肽功能表位反應(yīng)的疏水或帶電殘基。優(yōu)選的肽接頭序列包含Gly、Asn和Ser殘基。其它近中性氨基酸，如Thr和Ala，也可用于接頭序列?？捎行У赜米鹘宇^的氨基酸序列包括公開于Maratea等，Gene 4039-46，1985；Murphy等，Proc.Natl.Acad Sci.USA838258-8262，1986；美國專利第4,935,233號和美國專利第4,751,180號的那些序列。接頭序列長度一般可為1至約50個氨基酸。當?shù)谝环N和第二種多肽具有可用于分隔功能結(jié)構(gòu)域和防止空間干擾的非必需N-端氨基酸區(qū)時，不需要接頭序列。
已連接的DNA序列有效連接至合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件。負責DNA表達的調(diào)節(jié)元件只位于第一種多肽編碼DNA序列的5′。同樣，終止翻譯所需的終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止信號只存在于第二種多肽編碼DNA序列的3′。
VII.蛋白表達系統(tǒng)本發(fā)明的工程蛋白可重組生產(chǎn)?？墒褂迷撕?或真核型系統(tǒng)，按照本發(fā)明的使用方式，生產(chǎn)核酸序列或其關(guān)聯(lián)多肽、蛋白或肽。許多這樣的系統(tǒng)在商業(yè)上是可廣泛獲取的。
昆蟲細胞/桿狀病毒系統(tǒng)可產(chǎn)生異源核酸區(qū)段的高水平蛋白表達，例如述于美國專利第5,871,986、4,879,236號，這兩個專利都在此引入作為參考，此系統(tǒng)例如可按照名稱Invitrogen的MaxBac2.0和Clontech的BacPackTMBaculovirus Expression System購買。
表達系統(tǒng)的其它實例包括含有合成蛻皮素誘導(dǎo)型受體的Stratagene的Complete ControlTM誘導(dǎo)型哺乳動物表達系統(tǒng)，或其pET表達系統(tǒng)、大腸桿菌表達系統(tǒng)。誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)的另一個實例可得自Invitrogen，其出售T-RexTM(四環(huán)素調(diào)節(jié)表達)系統(tǒng)，該系統(tǒng)是使用全長CMV啟動子的誘導(dǎo)型哺乳動物表達系統(tǒng)。Invitrogen還提供叫做甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)表達系統(tǒng)的酵母表達系統(tǒng)，其設(shè)計用于在甲基營養(yǎng)酵母甲醇畢赤酵母中高水平生產(chǎn)重組蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉如何表達載體(例如表達構(gòu)建物)、生產(chǎn)核酸序列或其關(guān)連多肽、蛋白或肽。
設(shè)想可使通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的蛋白、多肽或肽“過表達”，即相對于其在細胞中的天然表達以增加水平表達。這樣的過表達可通過各種各樣的方法評價，包括放射性標記和/或蛋白純化。但是，優(yōu)選簡單直接的方法，例如包括SDS/PAGE和蛋白染色或蛋白質(zhì)印跡分析接著進行定量分析(例如光密度掃描所獲得的凝膠或印跡)的那些方法。相比于在天然細胞中的水平，重組蛋白、多肽或肽的水平特異性增加是過表達的標志，特定蛋白、多肽或肽相對于宿主細胞生產(chǎn)的其它蛋白的相對豐余并例如在凝膠上可見也是過表達的標志。
在某些實施方案中，表達的蛋白質(zhì)序列在宿主細胞中形成內(nèi)含體，宿主細胞例如通過在細胞勻漿器中破碎而裂解，清洗和/或離心，以將密集的內(nèi)含體和細胞膜與可溶性細胞組分分離。此離心可在以下條件下進行通過將糖(例如蔗糖)加入到緩沖液中并以選定速度離心，選擇性富集密集的內(nèi)含體。在還原劑(例如β-巰基乙醇或DTT(二硫蘇糖醇))存在下，內(nèi)含體可溶解在含高濃度尿素(例如8M)或離液劑(例如鹽酸胍)的溶液中，并重折疊成更理想的構(gòu)象，這是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所知曉的。
VIII.蛋白質(zhì)組合物在某些實施方案中，本發(fā)明的工程蛋白可為蛋白質(zhì)分子。本文使用的“蛋白質(zhì)分子”、“蛋白質(zhì)組合物”、“蛋白質(zhì)化合物”、“蛋白質(zhì)鏈”或“蛋白質(zhì)材料”一般是指但不限于至少兩個氨基酸的蛋白或多肽。上述所有的“蛋白質(zhì)”術(shù)語在本文都可交互使用。另外，術(shù)語蛋白、肽和多肽在本文可交互使用。
在某些實施方案中，至少一種蛋白質(zhì)分子或工程蛋白的大小可包含但不限于具有約2個至約2500個或更多氨基分子殘基的分子，以及由此可推論的任何范圍。本發(fā)明包括本文論述的任意序列的連續(xù)氨基酸的那些長度。
本文使用的“氨基分子”指本領(lǐng)域一般技術(shù)人員應(yīng)知曉的任意氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模擬物。在某些實施方案中，蛋白質(zhì)分子的殘基是連續(xù)的，沒有任何非氨基分子中斷氨基分子殘基的序列。在其它實施方案中，序列可包含一個或多個非氨基分子部分。在具體的實施方案中，蛋白質(zhì)分子殘基的序列可被一個或多個非氨基分子部分中斷。
因此，術(shù)語“蛋白質(zhì)組合物”包括含天然合成蛋白中20種常見氨基酸中的至少一種或至少一種經(jīng)修飾或不常見氨基酸的氨基分子序列。
在某些實施方案中，蛋白質(zhì)組合物包含至少一種蛋白、多肽或肽。在進一步的實施方案中，蛋白質(zhì)組合物包含生物相容性蛋白、多肽或肽。本文使用的術(shù)語“生物相容性”指當按照本文描述的方法和量應(yīng)用于或給予給定生物時不產(chǎn)生顯著的不適當作用的物質(zhì)。此不適當或不需要的作用是例如顯著毒性或不利免疫反應(yīng)的那些作用。在優(yōu)選實施方案中，組合物包含的生物相容性蛋白、多肽或肽一般為哺乳動物蛋白或肽或合成蛋白或肽，其中每種都基本無毒素、病原體或有害免疫原。
蛋白質(zhì)組合物可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)制備，包括通過標準分子生物學(xué)技術(shù)表達蛋白、多肽或肽；由天然來源分離蛋白質(zhì)組合物或化學(xué)合成蛋白質(zhì)材料。各種基因的核苷酸和蛋白、多肽和肽序列先前已公開，并可在本領(lǐng)域一般技術(shù)人員知曉的計算機化數(shù)據(jù)庫中查找。一個此類數(shù)據(jù)庫是美國國家生物技術(shù)信息中心的Genbank和GenPept數(shù)據(jù)庫。這些已知基因的編碼區(qū)可使用本文公開的技術(shù)或本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的技術(shù)擴增和/或表達。另一方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉蛋白、多肽和肽的各種商業(yè)化制品。
在某些實施方案中，可對蛋白質(zhì)化合物進行純化。一般來說，“純化的”指特定的或蛋白、多肽或肽組合物，其已經(jīng)過分級分離，去除了各種其它蛋白、多肽或肽，該組合物基本上保留了其活性，可通過例如蛋白質(zhì)測定評價，所述測定對于特定的或所需的蛋白、多肽或肽的組合物而言應(yīng)是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所知曉的。
設(shè)想實際上任何含蛋白、多肽或肽的組分都可用于本文公開的組合物和方法。但是，優(yōu)選蛋白質(zhì)材料是生物相容性的。在某些實施方案中，設(shè)想形成更粘稠的組合物是有利的，因為這將使組合物更精確或容易地應(yīng)用于組織，并在整個過程中保持與組織接觸。在此情況下，設(shè)想使用肽組合物，或更優(yōu)選設(shè)想使用多肽或蛋白組合物。粘度范圍包括但不限于約40至約100泊。在某些方面，優(yōu)選約80至約100泊的粘度。
IX.蛋白質(zhì)組合物的變體本發(fā)明蛋白、多肽和肽的氨基酸序列變體可為置換、插入或缺失變體。缺失變體缺少天然蛋白中一個或多個功能和免疫原性非必需的殘基。另一種常見類型的缺失變體是缺少引導(dǎo)蛋白結(jié)合細胞特定部分的分泌信號序列或信號序列的變體。插入突變通常包括在多肽的非末端點加入材料。這可包括插入免疫反應(yīng)性表位或僅插入單個殘基。末端加入叫做融合蛋白，這在下文論述。
置換變體通常包含在蛋白中的一個或多個位點上一個氨基酸交換為另一個氨基酸，可用來調(diào)節(jié)多肽的一種或多種特性，例如抗蛋白水解切割的穩(wěn)定性，而沒有損失其它功能或特性。這類置換優(yōu)選是保守置換，即一個氨基酸被另一個具相似形狀或電荷的氨基酸所取代。保守置換在本領(lǐng)域眾所周知，包括例如丙氨酸變?yōu)榻z氨酸；精氨酸變?yōu)橘嚢彼?；天冬酰胺變?yōu)楣劝滨０坊蚪M氨酸；天冬氨酸變?yōu)楣劝彼?；半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸；谷氨酰胺變?yōu)樘於０?；谷氨酸變?yōu)樘於彼幔桓拾彼嶙優(yōu)楦彼?；組氨酸變?yōu)樘於０坊蚬劝滨０?；異亮氨酸變?yōu)榱涟彼峄蚶i氨酸；亮氨酸變?yōu)槔i氨酸或異亮氨酸；賴氨酸變?yōu)榫彼?；甲硫氨酸變?yōu)榱涟彼峄虍惲涟彼?；苯丙氨酸變?yōu)槔野彼?、亮氨酸或甲硫氨酸；絲氨酸變?yōu)樘K氨酸；蘇氨酸變?yōu)榻z氨酸；色氨酸變?yōu)槔野彼?；酪氨酸變?yōu)樯彼峄虮奖彼?；以及纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼峄蛄涟彼帷?br> 術(shù)語“生物學(xué)功能等同物”在本領(lǐng)域眾所周知，在下文進一步詳細定義。因此，保持這樣序列其約70％至約80％、更優(yōu)選約81％至約90％、乃至更優(yōu)選約91％至約99％的氨基酸與肽模擬物氨基酸相同或功能等同，且提供肽模擬物生物學(xué)活性。(參見表1，以下是功能等同密碼子的列表)。
表2密碼子表

以下是基于改變蛋白的氨基酸而產(chǎn)生等同乃至改進的第二代分子的討論。例如，某些氨基酸可置換蛋白結(jié)構(gòu)中的其它氨基酸，而與結(jié)構(gòu)(例如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子上的結(jié)合位點)的互作結(jié)合能力沒有明顯損失。因為正是蛋白的互作能力和特性限定了蛋白的生物學(xué)功能活性，所以可在蛋白序列、以及在作為其基礎(chǔ)的DNA編碼序列中實施某些氨基酸置換，仍然可產(chǎn)生具有類似特性的蛋白。因此，如下文所述，本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)想可在基因的DNA序列中實施各種改變，而其生物實用性或活性沒有明顯損失。
在進行這些改變時，可考慮氨基酸的親水指數(shù)。一般來說，本領(lǐng)域理解賦予蛋白互作生物功能的親水氨基酸指數(shù)的重要性(Kyte和Doolittle，1982)。一般公認，氨基酸的相對親水特征影響所獲蛋白的二級結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)又限定了蛋白與其它分子(例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等)的相互作用。
在本領(lǐng)域還會理解的是，可在親水性基礎(chǔ)上有效進行類似氨基酸的置換。美國專利4,554,101指出，蛋白的最大局部平均親水性由其鄰近氨基酸的親水性掌控，與蛋白的生物學(xué)特性有關(guān)聯(lián)，該專利在此引入作為參考。如美國專利4,554,101的詳述，已賦予氨基酸殘基以下的親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸*-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
當然，某氨基酸可置換另一個具有相似親水性值的氨基酸，仍產(chǎn)生生物學(xué)等同和免疫學(xué)等同的蛋白。在此變化中，優(yōu)選其親水性值在±2之內(nèi)的氨基酸置換，特別優(yōu)選親水性值在±1之內(nèi)的氨基酸置換，甚至更特別優(yōu)選親水性值在±0.5之內(nèi)的氨基酸置換。
如上所概述，氨基酸置換一般基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小等?？紤]各種前述特征的代表性置換對本領(lǐng)域技術(shù)人員是周知的，包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
實施例包含以下的實施例是為了證明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當認識到，以下實施例中所公開的技術(shù)代表了本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的、在實施本發(fā)明時運行良好的技術(shù)，因此可被認為是構(gòu)成了本發(fā)明實施的優(yōu)選模式。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當意識到，按照本文公開內(nèi)容，可對公開的具體實施方案進行多種變化，仍可獲得類似或相似的結(jié)果，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。
實施例1aECM蛋白“aE-RGD”的克隆和表達蛋白aE-RGD具有氨基酸序列M-MASMTGGQQMG-HHHHHHH-DDDDK-(LD-YAVTGRGDSPASSKPIA((VPGIG)2VPGKG(VPGIG)2)4VP)3-LE(SEQID NO1)，其包含用于蛋白質(zhì)印跡鑒別的T7標志，可用于純化的6-His標志、允許酶去除T7和6-His標志的腸激酶切割位點以及三個細胞結(jié)合彈性蛋白樣結(jié)構(gòu)域的可變重復(fù)序列。17個氨基酸的細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含RGD，其得自纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域的1/10；其用作αvβ3和α5β1整聯(lián)蛋白的配體。其它細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括纖連蛋白的CS1和CS5結(jié)構(gòu)域，也已被基因工程改造為相同的設(shè)計，以代替RGD結(jié)構(gòu)域?？捎蛇@些或其它潛在的生物活性結(jié)構(gòu)域選擇細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以激發(fā)最有利的細胞應(yīng)答。彈性蛋白樣結(jié)構(gòu)域是得自哺乳動物彈性蛋白的(VPGVG)x基序的修飾形式。賴氨酸殘基摻入到彈性蛋白樣結(jié)構(gòu)域中，以允許通過其親核側(cè)鏈進行特異性交聯(lián)。還可使用其它交聯(lián)化學(xué)方法，包括光交聯(lián)。
進行標準的克隆、細菌培養(yǎng)、蛋白表達、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)印跡方法，以生產(chǎn)aE-RGD。aE-RGD的基因處于pET28表達載體中的T7噬菌體啟動子控制之下，并轉(zhuǎn)化入蛋白表達宿主BL21(DE3)pLysS中。
使用“Terrific Broth”培養(yǎng)基pH7.4，在10L發(fā)酵罐(NewBrunswick Scientific BioFlo 3000)中培養(yǎng)宿主細胞。在光密度約為6時，用異丙基-1-β-D-硫代半乳糖苷酶(IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達；在誘導(dǎo)后1.5小時通過于4℃離心收獲細胞。
實施例2aE-RGD蛋白的純化將含表達的aE-RGD蛋白的細胞重懸浮在0.5g/mL濃度的TEN緩沖液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，100mM NaCl)中，并于-20℃冷凍。將懸浮液解凍，裂解細胞，與10μg/mL脫氧核糖核酸酶I、10μg/mL核糖核酸酶A、5mM氯化鎂和1mM用于抑制蛋白水解的苯甲基磺酰氟于37℃振搖3小時或于4℃振搖過夜aE-RGD的低臨界溶解溫度(LCST)性狀(其中隨著溫度增加，蛋白與水性溶液分離)使得蛋白可通過循環(huán)變溫(aE-RGD在水中的LCST是35℃)純化。將細胞裂解液的pH調(diào)節(jié)至9.0，以確保蛋白溶解性，并在LCST以下離心(約1小時，39,750g，4℃)。向上清液(含所述蛋白)中加入1M NaCl，在LCST以上再次離心(約1小時，39,750g，37℃)。將沉淀以50-100mg/mL的濃度再分散在水中。重復(fù)循環(huán)變溫兩次，每次蛋白的純度(SDS-PAGE)都增加。
含aE-RGD蛋白的溶液于4℃透析3天，以去除雜質(zhì)，并凍干。蛋白的純度和分子量通過SDS-PAGE凝膠、蛋白質(zhì)印跡、氨基酸分析和基質(zhì)輔助激光解吸電離-質(zhì)譜(MALDI-MS)驗證。內(nèi)毒素水平可通過相似的純化過程降低至公認的標準。使用這些步驟的典型10L發(fā)酵獲得1-2g aE-RGD。
實施例3交聯(lián)aE-RGD以形成角膜高嵌體用辛二酸雙(磺基琥珀酰亞胺)酯(BS3)在水中于4℃交聯(lián)aE-RGD，產(chǎn)生具有0.2Mpa彈性模數(shù)的薄膜，其在生理溫度時保持透明。使用6mm光學(xué)直徑和7.5mm半徑的兩片式PMMA模制品，用此化學(xué)方法制作角膜高嵌體晶狀體。所有的操作都在4℃進行，完全處于aE-RGD的LCST之下，以確保透明性。對于每個批次，將20mgaE-RGD溶解在55μL水中，然后混合剛剛?cè)芙庠?0μL水中的2.3mgBS3(BS3中的N-羥基琥珀酰亞胺酯基團與蛋白中的伯胺是化學(xué)計量的)。樣品在臺式離心機上快速旋轉(zhuǎn)(10秒)，以去除混合時引入的氣泡，將12μL混合物以移液管移入5個模制品的每一個中，這些模制品在重力(300g)下裝配，于4℃過夜交聯(lián)。測試了幾個晶狀體的彈性模數(shù)，一致觀測到約0.2Mpa的值。通過將晶狀體與過量水和乙醇接觸去除污染物和反應(yīng)副產(chǎn)物，將經(jīng)淋洗的晶狀體儲存于加濕容器中待用。
實施例4手術(shù)使用吸入3％異氟烷和局部丙氧苯卡因麻醉用于研究的兔(n＝12)。在整個手術(shù)過程中，細心監(jiān)測動物的生命指征，包括角膜反射、心率、呼吸和氧飽和度。使角膜高嵌體粘附的最初嘗試并未成功。用聚維酮碘溶液灌洗每只動物的右眼，將金屬護瞼板(wire lidspeculum)放置入眼中。通過刮擦去除中央角膜上皮的約7mm直徑區(qū)域。將角膜高嵌體置于刮擦區(qū)域中央。兔眼瞼眨眼使高嵌體移位。將Tisseel(血纖蛋白原組織封閉劑)應(yīng)用于刮擦角膜，將高嵌體置于Tisseel上。Tisseel固化，形成可見的血纖蛋白凝塊。
為了將高嵌體安全地粘附于刮擦角膜，如下所述在角膜中創(chuàng)建囊袋。用聚烯吡酮碘(Betadine)溶液灌洗每只動物的右眼，將金屬護瞼板(wire lid speculum)放置入眼中。使用3.0mm環(huán)鉆在中央角膜創(chuàng)建一個深約100-200μm的部分皮層角膜切除。使用0.12鉗和69刀片去除角膜切除基底的環(huán)鉆區(qū)域中的基質(zhì)薄層。這留下了3.0mm直徑的環(huán)狀角膜切除。使用鋒利的囊袋刀片在角膜切除基底做一個2mm寬的環(huán)狀皮層內(nèi)囊袋，其沿圓周向外向角膜緣延伸。
制備了3組角膜。在組1(n＝1)中，創(chuàng)建傷口，但沒有放入植入體。在組2(n＝8)中，構(gòu)建相同的傷口，然后小心將5.0mm直徑角膜高嵌體植入體放置在角膜表面上。使用鈍頭睫狀體分離鏟將植入體卷360°，放入具溝囊袋中。該組未布置縫線。在組3(n＝3)中，構(gòu)造相同的傷口，在囊袋中放入植入體，然后在植入體上布置9-0尼龍縫線，以固定植入體。在植入后，用BSS溶液灌洗眼。在手術(shù)后給予兔卡布洛芬(Carprofen)止痛藥(5mg/kg，肌內(nèi))注射。
實施例5臨床評價在植入后1周內(nèi)進行每日評價。密切跟蹤動物不舒服或傷口感染的任何跡象。在有任何不舒服跡象時，給予動物1滴局部0.03％氟比洛芬，以及每24小時肌內(nèi)注射5mg/kg卡洛芬。監(jiān)測動物的體重。在初始步驟后每2-4天進行裂隙燈活組織鏡檢。使用藍光熒光染色，以評價上皮再形成過程。記錄上皮再形成的速度和程度以及任何炎癥跡象。
實施例6組織學(xué)使用大動物標準指引使兔安樂死，該指引由肌內(nèi)氯胺酮35-50mg/kg和甲苯噻嗪5-10mg/kg組成。每只動物還于不同的時間點接受心內(nèi)注射戊巴比妥鈉和經(jīng)受雙側(cè)開胸。
將眼固定在戊二醛溶液中，并于不同的時間點進行組織學(xué)檢查。用蘇木精-曙紅(H&E)、高碘酸-Schiff(PAS)、用于膠原蛋白的Mason三色染色和用于粘多糖的染色方法對載玻片進行染色。將染色切片封固，利用光學(xué)顯微鏡觀察。組織學(xué)評價角膜植入體上的上皮生長模式。評價角膜基質(zhì)內(nèi)和植入體內(nèi)二者的炎癥程度。
光學(xué)顯微鏡術(shù)顯示，在術(shù)后1周的組織學(xué)檢查時間，上皮細胞覆蓋了整個角膜植入體。覆蓋在植入體上的角膜上皮顯然是正常的，由幾層細胞組成。角膜基質(zhì)和植入體之間的界面并不明顯。在一些情況下，可觀察到角膜基質(zhì)和角膜植入體有適量的炎性細胞，包括淋巴細胞和嗜中性粒細胞。在其它情況下，在植入體后方的角膜基質(zhì)和角膜上皮看起來正常，沒有炎癥。
實施例7電子顯微鏡術(shù)通過電子顯微鏡術(shù)檢查幾只眼。對動物實施安樂死，如對光學(xué)顯微鏡術(shù)的描述固定眼。使用幾只動物進行電子顯微鏡檢查，以評價植入體和上皮界面。
實施例8臨床觀察植入體還良好耐受所述操作，因為其在手術(shù)過程中相對易于操作和耐用，只要其良好水合。所有的植入體都保持完整，并在環(huán)狀基質(zhì)囊袋中良好定位。在保持植入體的正確位置方面沒有差異，無論是布置還是不布置縫線。在布置縫線的眼中，植入體顯示出某些表面起皺現(xiàn)象，原因是布置在植入體上的縫線的張力。和對照相比，在所有具有植入體的眼中都觀察到初始輕微至中度的炎癥，如球結(jié)膜輕微充血和輕度角膜基質(zhì)水腫所示。在任一只動物中都沒有記錄到顯著的粘液或膿流出。
在所有情況下，上皮形成都是在角膜高嵌體暴露表面的周圍開始，并向內(nèi)向中心發(fā)展。完全上皮形成所需的時間在動物個體之間略有變化。所有的植入動物(組2和3)在96小時的時間點都部分地上皮再形成，所有動物到1周時間點時都完全上皮再形成。對比的對照眼在96小時時完全上皮再形成。動物良好耐受所述操作，沒有手術(shù)并發(fā)癥。
實施例9上皮性狀通常，上皮細胞通過粘附復(fù)合物(包括半橋粒和固著性原纖維)固著于下面的基底膜。使用電子顯微鏡術(shù)觀察高嵌體-上皮界面，以尋找在我們的長期研究中形成的這些結(jié)構(gòu)。下一步是解決粘附于底部的前界層的問題。向蛋白中加入血纖蛋白原結(jié)構(gòu)域可在凝血酶存在下促進粘附。
參考文獻在說明書中提及的所有專利和出版物都代表了本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。所有專利和出版物都在此引入作為參考，其程度如同各個單獨的出版物被明確和個別指出在此引入作為參考。
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盡管已詳細描述了本發(fā)明及其優(yōu)勢，但應(yīng)當理解的是，可對此進行各種改變、替換和變化，而不偏離所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明。而且，本發(fā)明的范圍無意限于說明書中描述的過程、機器、生產(chǎn)、物質(zhì)組合物、手段、方法和步驟的具體實施方案。由于人們由公開內(nèi)容能容易地意識到，可利用目前存在或以后開發(fā)的可實施和本文所述對應(yīng)實施方案基本相同的功能或獲得基本相同的結(jié)果的過程、機械、生產(chǎn)、物質(zhì)組合物、手段、方法或步驟。因此，所附權(quán)利要求書意欲將這樣的過程、機械、生產(chǎn)、物質(zhì)組合物、手段、方法或步驟包含在其范圍內(nèi)。
序列表<110>Tirrell，DavidNowatzki，PaulSchwartz，DanielGrubbs，Robert<120>新型生物醫(yī)學(xué)模制品<130>P03092WOO<140>未指定<141>2005-01-21<150>US60/552,029<151>2004-03-10<150>US 60/538,844<151>2004-01-23<160>29<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>389<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>1Met Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly His His His His1 5 10 15His His His Asp Asp Asp Asp Lys Leu Asp Tyr Ala Val Thr Gly Arg20 25 30Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ala Val Pro Gly Ile Gly35 40 45Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile Gly Val50 55 60
Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro65 70 75 80Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly85 90 95Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile100 105 110Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly115 120 125Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val130 135 140Pro Leu Asp Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser145 150 155 160Lys Pro Ile Ala Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro165 170 175Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly180 185 190Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile195 200 205Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly210 215 220Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val225 230 235 240Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro245 250 255
Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Leu Asp Tyr Ala Val Thr260 265 270Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ala Val Pro Gly275 280 285Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile290 295 300Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly305 310 315 320Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val325 330 335Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro340 345 350Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly355 360 365lle Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile370 375 380Gly Val Pro Leu Glu385<210>2<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>2Val Pro Gly Val Gly1 5
<210>3<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>3Val Pro Gly Lys Gly1 5<210>4<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>4Val Pro Gly Ile Gly1 5<210>5<211>59<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>5Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala1 5 10 15Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala20 25 30Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser
35 40 45Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Ala Gly Tyr50 55<210>6<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>6Gly Ala Gly Ala Gly Ser1 5<210>7<211>71<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>7Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala1 5 10 15Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala20 25 30Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser35 40 45Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser50 55 60Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr65 70
<210>8<211>74<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>8Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala1 5 10 15Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala20 25 30Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser35 40 45Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Ala Pro Gly Ala Ser Ile Lys Val50 55 60Ala Val Ser Ala Gly Pro Ser Ala Gly Tyr65 70<210>9<211>73<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>9Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala1 5 10 15Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala20 25 30
Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser35 40 45Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Ala Pro Gly Ala Ser Ile Lys Val50 55 60Ala Val Ser Gly Pro Ser Ala Gly Tyr65 70<210>10<211>71<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>10Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala1 5 10 15Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala20 25 30Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser35 40 45Gly Ala Gly Ala Gly Ser Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg Pro Val Cys50 55 60Phe Glu Lys Ala Ala Gly Tyr65 70<210>11<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>11Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val1 5 10 15Pro Gly Val Gly20<210>12<211>52<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>12Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly1 5 10 15Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val20 25 30Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala35 40 45Gly Ala Gly Ser50<210>13<211>82<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>13Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
1 5 10 15Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Ala Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala20 25 30Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala35 40 45Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser50 55 60Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala65 70 75 80Gly Ser<210>14<211>129<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>14Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala1 5 10 15Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala20 25 30Gly Ala Gly Ser Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly35 40 45Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly50 55 60
Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly65 70 75 80Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Val Pro Gly Val85 90 95Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly100 105 110Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val115 120 125Pro<210>15<211>88<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>15Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly1 5 10 15Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val20 25 30Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala35 40 45Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser50 55 60Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala65 70 75 80
Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser85<210>16<211>108<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>16Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly1 5 10 15Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val20 25 30Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly35 40 45Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala50 55 60Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala65 70 75 80Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Sar85 90 95Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser100 105<210>17<211>128<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>17Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly1 5 10 15Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val20 25 30Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly35 40 45Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val50 55 60Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro65 70 75 80Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala85 90 95Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala100 105 110Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser115 120 125<210>18<211>208<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>18Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly1 5 10 15
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val20 25 30Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly35 40 45Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val50 55 60Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro65 70 75 80Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly85 90 95Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val100 105 110Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly115 120 125Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val130 135 140Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro145 150 155 160Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala165 170 175Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala180 185 190Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser195 200 205
<210>19<211>76<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>19Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly1 5 10 15Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val20 25 30Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala35 40 45Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser50 55 60Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser65 70 75<210>20<211>64<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>20Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly1 5 10 15Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val20 25 30Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala
35 40 45Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser50 55 60<210>21<211>56<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>21Ala Lys Leu Lys Leu Ala Glu Ala Lys Leu Glu Leu Ala Glu Ala Lys1 5 10 15Leu Lys Leu Ala Glu Ala Lys Leu Glu Leu Ala Glu Ala Lys Leu Lys20 25 30Leu Ala Glu Ala Lys Leu Glu Leu Ala Glu Ala Lys Leu Lys Leu Ala35 40 45Glu Ala Lys Leu Glu Leu Ala Glu50 55<210>22<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>22Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro1 5 10 15<210>23<211>39
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>23Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly1 5 10 15Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro20 25 30Ala Gly Pro Val Gly Ser Pro35<210>24<211>63<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>24Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly1 5 10 15Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu20 25 30Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp35 40 45Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Val Gly Ser Pro50 55 60<210>25<211>15<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>25Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln1 5 10 15<210>26<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>26Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile1 5 10 15Ala<210>27<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成蛋白質(zhì)<400>27Leu Glu Gly Glu Glu Ile Gln Ile Gly His Ile Pro Arg Glu Asp Val1 5 10 15Asp Tyr His Leu Tyr Pro20<210>28<211>2355
<212>PRT<213>人纖連蛋白<400>28Met Leu Arg Gly Pro Gly Pro Gly Leu Leu Leu Leu Ala Val Gln Cys1 5 10 15Leu Gly Thr Ala Val Pro Ser Thr Gly Ala Ser Lys Ser Lys Arg Gln20 25 30Ala Gln Gln Met Val Gln Pro Gln Ser Pro Val Ala Val Ser Gln Ser35 40 45Lys Pro Gly Cys Tyr Asp Asn Gly Lys His Tyr Gln Ile Asn Gln Gln50 55 60Trp Glu Arg Thr Tyr Leu Gly Asn Ala Leu Val Cys Thr Cys Tyr Gly65 70 75 80Gly Ser Arg Gly Phe Asn Cys Glu Ser Lys Pro Glu Ala Glu Glu Thr85 90 95Cys Phe Asp Lys Tyr Thr Gly Asn Thr Tyr Arg Val Gly Asp Thr Tyr100 105 110Glu Arg Pro Lys Asp Ser Met Ile Trp Asp Cys Thr Cys Ile Gly Ala115 120 125Gly Arg Gly Arg Ile Ser Cys Thr Ile Ala Asn Arg Cys His Glu Gly130 135 140Gly Gln Ser Tyr Lys Ile Gly Asp Thr Trp Arg Arg Pro His Glu Thr145 150 155 160Gly Gly Tyr Met Leu Glu Cys Val Cys Leu Gly Asn Gly Lys Gly Glu165 170 175
Trp Thr Cys Lys Pro Ile Ala Glu Lys Cys Phe Asp His Ala Ala Gly180 185 190Thr Ser Tyr Val Val Gly Glu Thr Trp Glu Lys Pro Tyr Gln Gly Trp195 200 205Met Met Val Asp Cys Thr Cys Leu Gly Glu Gly Ser Gly Arg lle Thr210 215 220Cys Thr Ser Arg Asn Arg Cys Asn Asp Gln Asp Thr Arg Thr Ser Tyr225 230 235 240Arg Ile Gly Asp Thr Trp Ser Lys Lys Asp Asn Arg Gly Asn Leu Leu245 250 255Gln Cys Ile Cys Thr Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Lys Cys Glu Arg260 265 270His Thr Ser Val Gln Thr Thr Ser Ser Gly Ser Gly Pro Phe Thr Asp275 280 285Val Arg Ala Ala Val Tyr Gln Pro Gln Pro His Pro Gln Pro Pro Pro290 295 300Tyr Gly His Cys Val Thr Asp Ser Gly Val Val Tyr Ser Val Gly Met305 310 315 320Gln Trp Leu Lys Thr Gln Gly Asn Lys Gln Met Leu Cys Thr Cys Leu325 330 335Gly Asn Gly Val Ser Cys Gln Glu Thr Ala Val Thr Gln Thr Tyr Gly340 345 350Gly Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe Thr Tyr Asn Gly355 360 365Arg Thr Phe Tyr Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Gln Asp Gly His Leu
370 375 380Trp Cys Ser Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Gln Asp Gln Lys Tyr Ser Phe385 390 395 400Cys Thr Asp His Thr Val Leu Val Gln Thr Arg Gly Gly Asn Ser Asn405 410 415Gly Ala Leu Cys His Phe Pro Phe Leu Tyr Asn Asn His Asn Tyr Thr420 425 430Asp Cys Thr Ser Glu Gly Arg Arg Asp Asn Met Lys Trp Cys Gly Thr435 440 445Thr Gln Asn Tyr Asp Ala Asp Gln Lys Phe Gly Phe Cys Pro Met Ala450 455 460Ala His Glu Glu Ile Cys Thr Thr Asn Glu Gly Val Met Tyr Arg Ile465 470 475 480Gly Asp Gln Trp Asp Lys Gln His Asp Met Gly His Met Met Arg Cys485 490 495Thr Cys Val Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Thr Cys Ile Ala Tyr Ser500 505 510Gln Leu Arg Asp Gln Cys Ile Val Asp Asp Ile Thr Tyr Asn Val Asn515 520 525Asp Thr Phe His Lys Arg His Glu Glu Gly His Met Leu Asn Cys Thr530 535 540Cys Phe Gly Gln Gly Arg Gly Arg Trp Lys Cys Asp Pro Val Asp Gln545 550 555 560Cys Gln Asp Ser Glu Thr Gly Thr Phe Tyr Gln Ile Gly Asp Ser Trp565 570 575
Glu Lys Tyr Val His Gly Val Arg Tyr Gln Cys Tyr Cys Tyr Gly Arg580 585 590Gly Ile Gly Glu Trp His Cys Gln Pro Leu Gln Thr Tyr Pro Ser Ser595 600 605Ser Gly Pro Val Glu Val Phe Ile Thr Glu Thr Pro Ser Gln Pro Asn610 615 620Ser His Pro Ile Gln Trp Asn Ala Pro Gln Pro Ser His Ile Ser Lys625 630 635 640Tyr Ile Leu Arg Trp Arg Pro Lys Asn Ser Val Gly Arg Trp Lys Glu645 650 655Ala Thr Ile Pro Gly His Leu Asn Ser Tyr Thr Ile Lys Gly Leu Lys660 665 670Pro Gly Val Val Tyr Glu Gly Gln Leu Ile Ser Ile Gln Gln Tyr Gly675 680 685His Gln Glu Val Thr Arg Phe Asp Phe Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr690 695 700Pro Val Thr Ser Asn Thr Val Thr Gly Glu Thr Thr Pro Phe Ser Pro705 710 715 720Leu Val Ala Thr Ser Glu Ser Val Thr Glu Ile Thr Ala Ser Ser Phe725 730 735Val Val Ser Trp Val Ser Ala Ser Asp Thr Val Ser Gly Phe Arg Val740 745 750Glu Tyr Glu Leu Ser Glu Glu Gly Asp Glu Pro Gln Tyr Leu Asp Leu755 760 765
Pro Ser Thr Ala Thr Ser Val Asn Ile Pro Asp Leu Leu Pro Gly Arg770 775 780Lys Tyr Ile Val Asn Val Tyr Gln Ile Ser Glu Asp Gly Glu Gln Ser785 790 795 800Leu Ile Leu Ser Thr Ser Gln Thr Thr Ala Pro Asp Ala Pro Pro Asp805 810 815Pro Thr Val Asp Gln Val Asp Asp Thr Ser Ile Val Val Arg Trp Ser820 825 830Arg Pro Gln Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Val Tyr Ser Pro Ser835 840 845Val Glu Gly Ser Ser Thr Glu Leu Asn Leu Pro Glu Thr Ala Asn Ser850 855 860Val Thr Leu Ser Asp Leu Gln Pro Gly Val Gln Tyr Asn Ile Thr Ile865 870 875 880Tyr Ala Val Glu Glu Asn Gln Glu Ser Thr Pro Val Val Ile Gln Gln885 890 895Glu Thr Thr Gly Thr Pro Arg Ser Asp Thr Val Pro Ser Pro Arg Asp900 905 910Leu Gln Phe Val Glu Val Thr Asp Val Lys Val Thr Ile Met Trp Thr915 920 925Pro Pro Glu Ser Ala Val Thr Gly Tyr Arg Val Asp Val Ile Pro Val930 935 940Asn Leu Pro Gly Glu His Gly Gln Arg Leu Pro Ile Ser Arg Asn Thr945 950 955 960
Phe Ala Glu Val Thr Gly Leu Ser Pro Gly Val Thr Tyr Tyr Phe Lys965 970 975Val Phe Ala Val Ser His Gly Arg Glu Ser Lys Pro Leu Thr Ala Gln980 985 990Gln Thr Thr Lys Leu Asp Ala Pro Thr Asn Leu Gln Phe Val Asn Glu995 10001005Thr Asp Ser Thr Val Leu Val Arg Trp Thr Pro Pro Arg Ala Gln101010151020Ile Thr Gly Tyr Arg Leu Thr Val Gly Leu Thr Arg Arg Gly Gln102510301035Pro Arg Gln Tyr Asn Val Gly Pro Ser Val Ser Lys Tyr Pro Leu104010451050Arg Asn Leu Gln Pro Ala Ser Glu Tyr Thr Val Ser Leu Val Ala105510601065Ile Lys Gly Asn Gln Glu Ser Pro Lys Ala Thr Gly Val Phe Thr107010751080Thr Leu Gln Pro Gly Ser Ser Ile Pro Pro Tyr Asn Thr Glu Val108510901095Thr Glu Thr Thr Ile Val Ile Thr Trp Thr Pro Ala Pro Arg Ile110011051110Gly Phe Lys Leu Gly Val Arg Pro Ser Gln Gly Gly Glu Ala Pro111511201125Arg Glu Val Thr Ser Asp Ser Gly Ser Ile Val Val Ser Gly Leu113011351140Thr Pro Gly Val Glu Tyr Val Tyr Thr Ile Gln Val Leu Arg Asp
114511501155Gly Gln Glu Arg Asp Ala Pro Ile Val Asn Lys Val Val Thr Pro116011651170Leu Ser Pro Pro Thr Asn Leu His Leu Glu Ala Asn Pro Asp Thr117511801185Gly Val Leu Thr Val Ser Trp Glu Arg Ser Thr Thr Pro Asp Ile119011951200Thr Gly Tyr Arg Ile Thr Thr Thr Pro Thr Asn Gly Gln Gln Gly120512101215Asn Ser Leu Glu Glu Val Val His Ala Asp Gln Ser Ser Cys Thr122012251230Phe Asp Asn Leu Ser Pro Gly Leu Glu Tyr Asn Val Ser Val Tyr123512401245Thr Val Lys Asp Asp Lys Glu Ser Val Pro Ile Ser Asp Thr Ile125012551260Ile Pro Ala Val Pro Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile126512701275Gly Pro Asp Thr Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile128012851290Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu129513001305Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val131013151320Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val132513301335
Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg134013451350Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp135513601365Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala137013751380Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser138513901395Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile140014051410Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile141514201425Val Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln143014351440Gln Ser Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala144514501455Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val146014651470Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn147514801485Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala149014951500Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val150515101515
Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro152015251530Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln Met153515401545Gln Val Thr Asp Val Gln Asp Asn Ser Ile Ser Val Lys Trp Leu155015551560Pro Ser Ser Ser Pro Val Thr Gly Tyr Arg Val Thr Thr Thr Pro156515701575Lys Asn Gly Pro Gly Pro Thr Lys Thr Lys Thr Ala Gly Pro Asp158015851590Gln Thr Glu Met Thr Ile Glu Gly Leu Gln Pro Thr Val Glu Tyr159516001605Val Val Ser Val Tyr Ala Gln Asn Pro Ser Gly Glu Ser Gln Pro161016151620Leu Val Gln Thr Ala Val Thr Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu162516301635Ala Phe Thr Asp Val Asp Val Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu164016451650Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr Arg Val Thr Tyr Ser Ser165516601665Pro Glu Asp Gly Ile His Glu Leu Phe Pro Ala Pro Asp Gly Glu167016751680Glu Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro Gly Ser Glu Tyr168516901695
Thr Val Ser Val Val Ala Leu His Asp Asp Met Glu Ser Gln Pro170017051710Leu Ile Gly Thr Gln Ser Thr Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu171517201725Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr173017351740Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro174517501755Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp176017651770Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr177517801785Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro179017951800Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg1805810 1815Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser182018251830Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala183518401845Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro185018551860Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp186518701875Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser
188018851890Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn189519001905Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp191019151920Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu192519301935Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro194019451950Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu195519601965Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu197019751980Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val198519901995Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val200020052010Pro Ser Thr Val Gln Lys Thr Pro Phe Val Thr His Pro Gly Tyr201520202025Asp Thr Gly Asn Gly Ile Gln Leu Pro Gly Thr Ser Gly Gln Gln203020352040Pro Ser Val Gly Gln Gln Met Ile Phe Glu Glu His Gly Phe Arg204520502055Arg Thr Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Pro Ile Arg His Arg Pro206020652070
Arg Pro Tyr Pro Pro Asn Val Gly Gln Glu Ala Leu Ser Gln Thr207520802085Thr Ile Ser Trp Ala Pro Phe Gln Asp Thr Ser Glu Tyr Ile Ile209020952100Ser Cys His Pro Val Gly Thr Asp Glu Glu Pro Leu Gln Phe Arg210521102115Val Pro Gly Thr Ser Thr Ser Ala Thr Leu Thr Gly Leu Thr Arg212021252130Gly Ala Thr Tyr Asn Ile Ile Val Glu Ala Leu Lys Asp Gln Gln213521402145Arg His Lys Val Arg Glu Glu Val Val Thr Val Gly Asn Ser Val215021552160Asn Glu Gly Leu Asn Gln Pro Thr Asp Asp Ser Cys Phe Asp Pro216521702175Tyr Thr Val Ser His Tyr Ala Val Gly Asp Glu Trp Glu Arg Met218021852190Ser Glu Ser Gly Phe Lys Leu Leu Cys Gln Cys Leu Gly Phe Gly219522002205Ser Gly His Phe Arg Cys Asp Ser Ser Arg Trp Cys His Asp Asn221022152220Gly Val Asn Tyr Lys Ile Gly Glu Lys Trp Asp Arg Gln Gly Glu222522302235Asn Gly Gln Met Met Ser Cys Thr Cys Leu Gly Asn Gly Lys Gly224022452250
Glu Phe Lys Cys Asp Pro His Glu Ala Thr Cys Tyr Asp Asp Gly225522602265Lys Thr Tyr His Val Gly Glu Gln Trp Gln Lys Glu Tyr Leu Gly227022752280Ala Ile Cys Ser Cys Thr Cys Phe Gly Gly Gln Arg Gly Trp Arg228522902295Cys Asp Asn Cys Arg Arg Pro Gly Gly Glu Pro Ser Pro Glu Gly230023052310Thr Thr Gly Gln Ser Tyr Asn Gln Tyr Ser Gln Arg Tyr His Gln231523202325Arg Thr Asn Thr Asn Val Asn Cys Pro Ile Glu Cys Phe Met Pro233023352340Leu Asp Val Gln Ala Asp Arg Glu Asp Ser Arg Glu234523502355<210>29<211>757<212>PRT<213>人彈性蛋白<400>29Met Ala Gly Leu Thr Ala Ala Ala Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Ser Ile Leu His Pro Ser Arg Pro Gly Gly Val Pro Gly Ala20 25 30Ile Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly Val Phe Tyr Pro Gly Ala Gly Leu35 40 45Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala Leu Gly Pro Gly Gly Lys Pro Leu Lys
50 55 60Pro Val Pro Gly Gly Leu Ala Gly Ala Gly Leu Gly Ala Gly Leu Gly65 70 75 80Ala Phe Pro Ala Val Thr Phe Pro Gly Ala Leu Val Pro Gly Gly Val85 90 95Ala Asp Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Ala Lys Ala Gly Ala Gly Leu100 105 110Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Ser Ala Gly Ala Val115 120 125Val Pro Gln Pro Gly Ala Gly Val Lys Pro Gly Lys Val Pro Gly Val130 135 140Gly Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Gly Val Leu Pro Gly Ala Arg Phe145 150 155 160Pro Gly Val Gly Val Leu Pro Gly Val Pro Thr Gly Ala Gly Val Lys165 170 175Pro Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly Ala Phe Ala Gly Ile Pro Gly Val180 185 190Gly Pro Phe Gly Gly Pro Gln Pro Gly Val Pro Leu Gly Tyr Pro Ile195 200 205Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr Gly Leu Pro Tyr Thr Thr Gly210 215 220Lys Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Val Ala Gly Ala Ala Gly225 230 235 240Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr Gly Val Gly Pro Gln Ala Ala Ala245 250 255
Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe Gly Ala Gly Ala Ala Gly260 265 270Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Pro Gly Ala275 280 285Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala290 295 300Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Ala305 310 315 320Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly Phe Gly Pro Gly Val Val Gly Val325 330 335Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro340 345 350Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Val355360 365Ser Pro Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly370 375 380Ala Arg Pro Gly Val Gly Val Gly Gly Ile Pro Thr Tyr Gly Val Gly385 390 395 400Ala Gly Gly Phe Pro Gly Phe Gly Val Gly Val Gly Gly Ile Pro Gly405 410415Val Ala Gly Val Pro Ser Val Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Val420 425 430Pro Gly Val Gly Ile Ser Pro Glu Ala Gln Ala Ala Ala Ala Ala Lys435 440 445
Ala Ala Lys Tyr Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala450 455 460Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Pro Gly Val Gly Val Ala465 470 475 480Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly485 490 495Leu Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly500 505 510Val Gly Val Ala Pro Gly Ile Gly Pro Gly Gly Val Ala Ala Ala Ala515 520 525Lys Ser Ala Ala Lys Val Ala Ala Lys Ala Gln Leu Arg Ala Ala Ala530 535 540Gly Leu Gly Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly Val Gly Val Gly Val Pro545 550 555 560Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly565 570 575Val Pro Gly Phe Gly Ala Gly Ala Asp Glu Gly Val Arg Arg Ser Leu580 585 590Ser Pro Glu Leu Arg Glu Gly Asp Pro Ser Ser Ser Gln His Leu Pro595 600 605Ser Thr Pro Ser Ser Pro Arg Val Pro Gly Ala Leu Ala Ala Ala Lys610 615 620Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly625 630 635 640
Ala Leu Gly Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val Val Gly Ala Gly Pro645 650 655Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe660 665 670Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val Gly Gly Leu675 680 685Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile Pro Pro Ala Ala Ala690 695 700Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly705 710 715 720Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala Ala Arg Pro Gly Phe725 730 735Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys Leu Gly Lys Ala Cys740 745 750Gly Arg Lys Arg Lys75權(quán)利要求
1.含工程蛋白的晶狀體，其中所述晶狀體通過使工程蛋白交聯(lián)而形成。
2.權(quán)利要求1的晶狀體，其中所述工程蛋白含至少一個纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域和至少一個彈性蛋白樣結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求2的晶狀體，其中所述纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域含SEQ IDNO26。
4.權(quán)利要求2的晶狀體，其中所述纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域含SEQ IDNO27。
5.權(quán)利要求2的晶狀體，其中所述工程蛋白含SEQ ID NO1。
6.權(quán)利要求1的晶狀體，其中所述交聯(lián)包括照射。
7.權(quán)利要求6的晶狀體，其中所述照射包括激光照射。
8.權(quán)利要求1的晶狀體，其中交聯(lián)度是不均一的。
9.權(quán)利要求1的晶狀體，其中所述交聯(lián)以預(yù)定圖案進行。
10.權(quán)利要求1的晶狀體，其中所述晶狀體進一步經(jīng)受第二次交聯(lián)。
11.權(quán)利要求1的晶狀體，其中所述工程蛋白通過將至少一個丙烯?；虍惗∠；B接至該蛋白進行修飾。
12.權(quán)利要求1的晶狀體，其中所述工程蛋白是低于約15千道爾頓的低分子量蛋白。
13.權(quán)利要求1的晶狀體，其中所述晶狀體選自接觸透鏡、角膜高嵌體、角膜嵌體和人工晶狀體。
14.權(quán)利要求1的晶狀體，其中所述晶狀體為角膜高嵌體。
15.權(quán)利要求1的晶狀體，其中所述晶狀體為生物相容性的。
16.權(quán)利要求1的晶狀體，其中所述晶狀體是光學(xué)透明的。
17.權(quán)利要求1的晶狀體，其中所述晶狀體抗生物降解。
18.權(quán)利要求1的晶狀體，其中所述晶狀體刺激鄰近細胞粘附。
19.權(quán)利要求1的晶狀體，其中所述晶狀體具有0.05MPa至2.0MPa的彈性模數(shù)。
20.含工程蛋白的角膜移植片，其中所述移植片通過使工程蛋白交聯(lián)而形成。
21.工程蛋白，其中所述蛋白含至少一個纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域和至少一個彈性蛋白樣結(jié)構(gòu)域。
22.權(quán)利要求21的工程蛋白，其中所述纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域包含CS1、CS5、RGD結(jié)構(gòu)域或III型結(jié)構(gòu)域。
23.權(quán)利要求21的工程蛋白，其中所述彈性蛋白樣結(jié)構(gòu)域包含VPGVG(SEQ ID NO2)、VPGKG(SEQ ID NO3)、VPGIG(SEQ IDNO4)或其功能等同物。
24.權(quán)利要求21的工程蛋白，其中所述蛋白是交聯(lián)的。
25.權(quán)利要求21的工程蛋白，其中所述纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO26。
26.權(quán)利要求21的工程蛋白，其中所述纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO27。
27.權(quán)利要求21的工程蛋白，其中所述蛋白包含SEQ ID NO1。
28.權(quán)利要求21的工程蛋白，其中所述工程蛋白通過將一個或多個改變工程蛋白交聯(lián)能力的實體連接至所述工程蛋白進行修飾。
29.權(quán)利要求21的工程蛋白，其中所述工程蛋白通過將至少一個丙烯?；虍惗∠；B接至所述蛋白進行修飾。
30.權(quán)利要求21的工程蛋白，其中所述工程蛋白的分子量低于約15千道爾頓。
31.權(quán)利要求21的工程蛋白，其進一步包含絲心蛋白、彈性蛋白、角蛋白、膠原蛋白的重復(fù)區(qū)段或重復(fù)區(qū)段的組合。
32.包含工程蛋白的生物醫(yī)學(xué)覆膜，其中所述蛋白含至少一個纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域和至少一個彈性蛋白樣結(jié)構(gòu)域。
33.通過在角膜中或角膜上植入含工程蛋白的角膜高嵌體矯正眼光學(xué)特性的方法，其中所述蛋白含至少一個纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域和至少一個彈性蛋白樣結(jié)構(gòu)域。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述高嵌體的表面刺激鄰近細胞粘附于所植入的高嵌體。
全文摘要
本發(fā)明提供工程蛋白和由工程蛋白制備的生物醫(yī)學(xué)制品。生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品包括用于眼科目的的晶狀體。
文檔編號C12N15/00GK1972667SQ200580008933
公開日2007年5月30日 申請日期2005年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月23日
發(fā)明者D·A·蒂雷爾, D·M·施沃茨, P·J·諾沃茨基, R·H·格魯布斯 申請人:加州理工學(xué)院, 加州大學(xué)－舊金山評議會