專(zhuān)利名稱(chēng)：雙層培養(yǎng)容器以及培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞或微生物的培養(yǎng)容器以及培養(yǎng)方法，特別涉及保存培養(yǎng)液、實(shí)現(xiàn)最佳培養(yǎng)環(huán)境、內(nèi)容物的易提取性優(yōu)異，適合于浮游細(xì)胞的培養(yǎng)和使用小珠、無(wú)紡織布等載體的附著細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)容器以及使用所述培養(yǎng)容器的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
過(guò)去，作為細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)容器，已知的有在由透氣性好的塑料制成的袋中填充培養(yǎng)液的裝有培養(yǎng)基的袋。例如實(shí)開(kāi)平2-93999號(hào)公報(bào)中公開(kāi)了裝有培養(yǎng)基的袋，它是在由柔韌的塑料片形成的袋狀主體上端部中間安裝配置除菌過(guò)濾器的溶劑注入軟管和培養(yǎng)基導(dǎo)出口，在袋狀主體內(nèi)封入經(jīng)過(guò)滅菌的培養(yǎng)基組成的袋。另外實(shí)開(kāi)平3-172169號(hào)公報(bào)中公開(kāi)了一種保存兼組織培養(yǎng)用容器，其由非透氣性材料包裝密封內(nèi)部容納組織培養(yǎng)用培養(yǎng)基的透氣性組織培養(yǎng)用密封容器組成，在組織培養(yǎng)時(shí)除去非透氣性材料使用。特開(kāi)平4-71482號(hào)公報(bào)中公開(kāi)了裝有液體培養(yǎng)基的包裝袋的制造方法，它是在由透氣率高的薄膜組成的、經(jīng)γ射線滅菌的培養(yǎng)袋中，無(wú)菌填充經(jīng)過(guò)濾除菌的液體培養(yǎng)基，對(duì)其填充口進(jìn)行無(wú)菌密封后，再由透氣率低、并經(jīng)γ射線滅菌的2次包裝材料無(wú)菌包裝制成的。
發(fā)明公開(kāi)發(fā)明要解決的課題細(xì)胞培養(yǎng)通常是在可以控制氣體的組成的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，所以當(dāng)同時(shí)培養(yǎng)偏嗜不同氣體濃度的多種類(lèi)細(xì)胞時(shí)，應(yīng)用過(guò)去的培養(yǎng)袋，則必需要有氣體濃度不同的多個(gè)培養(yǎng)箱，需要大的空間，除此之外操作也很復(fù)雜，耗時(shí)多。另外培養(yǎng)時(shí)，過(guò)去的培養(yǎng)袋只能以扁平狀態(tài)擺放在培養(yǎng)箱內(nèi)的網(wǎng)架上，即不能重疊放置或吊起，所以必需要有大的空間。
另外過(guò)去的培養(yǎng)袋的壁薄，形狀穩(wěn)定性差，在流通過(guò)程中有可能破損，操作時(shí)需要相當(dāng)注意，非常麻煩。即使如上述專(zhuān)利文獻(xiàn)2、3所述，保存時(shí)在外側(cè)使用非透氣性的包裝材料，培養(yǎng)袋在內(nèi)側(cè)處于浮動(dòng)狀態(tài)，形狀不穩(wěn)定；或附著在外側(cè)的包裝材料上，其狀態(tài)與單層培養(yǎng)袋沒(méi)有大差別，所以在缺乏形狀穩(wěn)定性、流通過(guò)程中有可能破損方面沒(méi)有變化。
而且過(guò)去的培養(yǎng)袋，在細(xì)胞培養(yǎng)完畢后取出內(nèi)容物時(shí)，是將培養(yǎng)袋吊起，通過(guò)重力而取出內(nèi)容物，所以相當(dāng)費(fèi)時(shí)間，效率低。即使要暫時(shí)對(duì)培養(yǎng)袋內(nèi)加載內(nèi)壓而取出內(nèi)容物，袋自身會(huì)膨脹，取出也很困難。
本發(fā)明是鑒于過(guò)去涉及培養(yǎng)容器的上述問(wèn)題進(jìn)行研究，目的在于提供即使同時(shí)培養(yǎng)偏嗜不同氣體濃度的多種類(lèi)細(xì)胞，也不需要多個(gè)不同的培養(yǎng)箱，培養(yǎng)時(shí)可以重疊放置或吊起，能夠節(jié)約空間；在流通過(guò)程中不易破損，利于作為流通容器；在細(xì)胞培養(yǎng)完畢后，可以高效取出內(nèi)容物的培養(yǎng)容器。
本發(fā)明的另一目的在于提供使用上述培養(yǎng)容器培養(yǎng)細(xì)胞、微生物的方法。

發(fā)明內(nèi)容
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所提供的雙層培養(yǎng)容器的特征是具備具有注入·抽出口的透氣性培養(yǎng)容器、罩在該培養(yǎng)容器上的氣密性容器、和使該培養(yǎng)容器和該氣密性容器之間能夠形成空間并把該培養(yǎng)容器保持在該氣密性容器內(nèi)的培養(yǎng)容器保持手段，在細(xì)胞或微生物培養(yǎng)時(shí)，在該培養(yǎng)容器和該氣密性容器間形成的空間中容納控制氣體的組成的氣體。
本發(fā)明的一個(gè)方面是雙層培養(yǎng)容器，其中，該培養(yǎng)容器保持手段是使該培養(yǎng)容器部分連接到該氣密性容器上的手段。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供雙層培養(yǎng)容器，它是在該氣密性容器中設(shè)置通氣口，該通氣口與該培養(yǎng)容器和該氣密性容器之間的空間是連通的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供雙層培養(yǎng)容器，它是在培養(yǎng)時(shí)，該培養(yǎng)容器的容器壁基本上是形成圓筒狀、橫斷面為正多邊形的棱柱體狀、球狀或半球狀的任意一種形狀。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供雙層培養(yǎng)容器，它是在該培養(yǎng)容器中填充·密封培養(yǎng)液，用惰性氣體或惰性氣體與二氧化碳的混合氣體對(duì)該培養(yǎng)容器和該氣密性容器之間的空間進(jìn)行置換形成的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供雙層培養(yǎng)容器，它是在該培養(yǎng)容器中填充·密封培養(yǎng)液，對(duì)該培養(yǎng)容器和該氣密性容器之間的空間進(jìn)行脫氣形成的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供雙層培養(yǎng)容器，它是在該培養(yǎng)容器中填充·密封培養(yǎng)液，在該培養(yǎng)容器和該氣密性容器之間的空間封入氧吸收劑形成的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供雙層培養(yǎng)容器，該氣密性容器具有氧吸收部分或氧吸收層。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供細(xì)胞或微生物的培養(yǎng)方法，它是在由具有注入·抽出口的透氣性培養(yǎng)容器和罩在該培養(yǎng)容器上的氣密性容器組成雙層培養(yǎng)容器，在該培養(yǎng)容器和該氣密性容器之間的空間，控制氣體組成進(jìn)行培養(yǎng)的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供培養(yǎng)方法，它是從與該培養(yǎng)容器和該氣密性容器之間的空間相連通的通氣口注入·抽出控制氣體的組成的氣體的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供培養(yǎng)方法，它是在培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)向該培養(yǎng)容器和該氣密性容器之間的空間注入壓縮氣體，抽出培養(yǎng)容器中內(nèi)容物的方法。
發(fā)明的效果如果按照本發(fā)明，由于在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)容器和氣密性容器之間形成的空間中容納控制氣體的組成的氣體，所以當(dāng)同時(shí)培養(yǎng)偏嗜不同氣體濃度的多種類(lèi)細(xì)胞時(shí)，把為培養(yǎng)這些細(xì)胞的多個(gè)雙層培養(yǎng)容器配置在共同的恒溫室中，通過(guò)向這些雙層培養(yǎng)容器中注入必要?dú)怏w濃度的氣體，不需要多個(gè)培養(yǎng)箱，就可以簡(jiǎn)單地進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。另外如果按照本發(fā)明，使培養(yǎng)容器和氣密性容器之間可以形成空間，通過(guò)培養(yǎng)容器保持手段把培養(yǎng)容器保持在氣密性容器內(nèi)，所以培養(yǎng)時(shí)，即使將雙層培養(yǎng)容器重疊放置，氣體也可以滲透到各培養(yǎng)容器中，不會(huì)對(duì)培養(yǎng)形成障礙。另外培養(yǎng)容器，即使將其豎立吊起，容器的形狀也不會(huì)變化，所以在恒溫室內(nèi)可以以豎立吊起的狀態(tài)配置多個(gè)培養(yǎng)容器，與過(guò)去的培養(yǎng)容器相比，可以減少設(shè)置空間。
另外如果按照本發(fā)明，在培養(yǎng)后，通過(guò)在培養(yǎng)容器和氣密性容器之間的空間內(nèi)注入壓縮空氣等壓縮氣體，可以迅速取出培養(yǎng)容器內(nèi)的內(nèi)容物，與過(guò)去的通過(guò)重力進(jìn)行取出的方法相比，可以高效地進(jìn)行內(nèi)容物取出。
如果按照本發(fā)明的一個(gè)方面，培養(yǎng)容器，在培養(yǎng)時(shí)基本上形成圓筒狀、橫斷面為正多邊形的棱柱體狀、球狀或半球狀的任意一種形狀，所以容器內(nèi)的氣體擴(kuò)散方向幾乎是氣體從360度方向面對(duì)容器中心部分?jǐn)U散，所以與由扁平袋組成的過(guò)去的培養(yǎng)容器相比，在容器壁附近和遠(yuǎn)離容器壁部分的各溶解氣體濃度差變小。因此可以使培養(yǎng)條件更加接近最佳培養(yǎng)條件，可以提高細(xì)胞等的培養(yǎng)效率和細(xì)胞培養(yǎng)的活度。
如果按照本發(fā)明的另一個(gè)側(cè)面，通過(guò)用惰性氣體或惰性氣體與二氧化碳的混合氣體對(duì)培養(yǎng)容氣和氣密性容器之間的空間進(jìn)行置換，或者對(duì)該空間進(jìn)行脫氣，可以更加徹底防止培養(yǎng)液的氧化，延長(zhǎng)培養(yǎng)液的保存時(shí)間。同樣通過(guò)在該空間中，封入氧吸收劑或者在氣密性容器中設(shè)置氧吸收部或氧吸收層，可以獲得同樣的效果。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1是有關(guān)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的雙層培養(yǎng)容器的平面圖。
圖2是圖1的A-A斷面圖。
圖3是圖1的B-B斷面斜視圖。
圖4是培養(yǎng)容器的平面圖。
圖5是為了表示預(yù)先設(shè)置的通氣口，切去一部分氣密性容器表示的斜視圖。
圖6是表示后設(shè)置通氣口的雙層培養(yǎng)容器的斷面圖。
圖7是表示容器壁的各種形狀的斷面圖。
圖8是表示把過(guò)去的容器和本發(fā)明的培養(yǎng)容器分別豎立吊起狀態(tài)的側(cè)斷面圖。
圖9是表示培養(yǎng)容器制造方法的斷面圖。
圖10是表示有關(guān)本發(fā)明另一實(shí)施方案雙層培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)容器的平面圖。
圖11是表示有關(guān)本發(fā)明另一實(shí)施方案雙層培養(yǎng)容器的平面圖。
圖12是表示培養(yǎng)容器保持手段另一例的斷面圖。
圖13是表示本發(fā)明另一實(shí)施方案的斷面圖。
圖14是表示本發(fā)明另一實(shí)施方案的斷面圖。
圖15是表示本發(fā)明另一實(shí)施方案的斷面圖，(a)是斷面圖，(b)是(b)的E-E斷面斜視圖。
圖16是表示本發(fā)明另一實(shí)施方案的斷面圖。
圖17是表示本發(fā)明另一實(shí)施方案的斷面圖。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方案以下參照附圖，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行說(shuō)明。
圖1～圖4表示有關(guān)本發(fā)明雙層培養(yǎng)容器的一個(gè)實(shí)施方案，圖1是其平面圖、圖2是圖1的A-A向視圖、圖3是圖1的B-B斜視圖、圖4是培養(yǎng)容器的平面圖。
雙層培養(yǎng)容器1由培養(yǎng)容器2和氣密性容器3組成。
本發(fā)明中培養(yǎng)容器2，在培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)選容器壁形成圓筒狀、橫斷面為正多邊形的棱柱體狀、球狀或半球狀的任意一種形狀。本說(shuō)明書(shū)中，所謂“實(shí)質(zhì)圓筒狀”的含義，如圖7(a)所示，不僅是指正圓的圓筒，還包括如圖7(d)所示的形狀多少有變化的圓形斷面或橢圓斷面等，在不影響實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的范圍內(nèi)，使正圓產(chǎn)生形狀變化的斷面形狀的圓筒。同樣所謂“橫斷面基本上為正多邊形的棱柱體狀”的含義，不僅是指斷面為正三角形、正方形(示于圖7(e))、正五邊形、正六邊形(示于圖7(b))，正八邊形(示于圖7(c))等正多邊形的棱柱體，還包括在不影響實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的范圍內(nèi)，多少使這些正多邊形產(chǎn)生變形的橫斷面形狀的棱柱體。
培養(yǎng)容器2由透氣性優(yōu)異的塑料形成，具備把多根(圖示例中為5根)圓筒5配置成游泳氣墊形狀的圓筒部4和與圓筒部4長(zhǎng)度方向兩端相連接形成的端部2a、2b，作為整體是平面視圖為矩形的袋狀容器，兩端部2a、2b的外邊緣部分分別密封，端部2a、2b表面是平坦形狀，各圓筒5通過(guò)端部2a、2b相互連通。端部2a中，設(shè)置為培養(yǎng)液、細(xì)胞、細(xì)胞生長(zhǎng)因子等各種藥品類(lèi)的注入·抽出口6，與培養(yǎng)容器2的內(nèi)部連通。這樣的注入·抽出口，可以根據(jù)所需目的設(shè)置相應(yīng)的必要數(shù)量，根據(jù)需要還可以設(shè)置連接用的軟管和在其頂端部設(shè)置連接器。
制造該培養(yǎng)器2時(shí)，如圖9所示，通過(guò)使矩形的撓性塑料片7、8以一定間隔相對(duì)配置，在四邊的邊緣部分7a、8a處用熱封進(jìn)行連接后，通過(guò)沿相對(duì)片材7、8長(zhǎng)度方向的對(duì)應(yīng)線7b和8b、7c和8c、7d和8d、7e和8e，對(duì)兩片材料7、8進(jìn)行部分熱封，可以形成由5根圓筒5組成的圓筒部分4。
這樣可以通過(guò)在對(duì)具有撓性的柔軟培養(yǎng)容器2的相對(duì)壁面進(jìn)行熱封的同時(shí)，填充一定量或一定量以上的培養(yǎng)液，使培養(yǎng)容器2具有形狀保持性，防止或者降低培養(yǎng)容器2和氣密性容器3之間的附著，并且可以防止或降低氣體對(duì)培養(yǎng)容器2的擴(kuò)散損失。此外作為使其具有形狀保持性的手段，除了熱封以外，還可以進(jìn)行用夾具、夾子或磁鐵等按壓容器的手段，進(jìn)行按壓，使相對(duì)的撓性容器壁部分接觸。另外，作為為了防止或降低附著的手段，也可以在培養(yǎng)容器2和氣密性容器3之間的容器壁之間夾入為防止附著的組件，或在各容器壁上設(shè)置凹凸部分。
作為透氣性培養(yǎng)容器2，優(yōu)選使用透氣性好，并可以承受γ射線滅菌材質(zhì)的容器。例如以聚乙烯(PE)、聚氯乙烯(PVC)、乙烯醋酸乙烯共聚物(EVA)、乙烯丙烯酸乙酯共聚物(EEA)、乙烯甲基丙烯酸甲酯共聚物(EEMA)、苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯(SEBS)和聚丙烯(PP)或聚乙烯等的聚合物共混物等軟質(zhì)塑料為材料的薄膜袋以及吹塑成型袋等容器。除此之外，不通過(guò)γ-射線進(jìn)行滅菌時(shí)，可以使用特氟隆(注冊(cè)商標(biāo))、硅酮橡膠、4-甲基戊烯-1的均聚物或共聚物、丁二烯的均聚物或共聚物。作為共聚物的其它單體，可以使用碳原子數(shù)為2～24的α-烯烴和苯乙烯等，還可以使用對(duì)含前述α-烯烴的1種、2種或2種以上的聚合物進(jìn)行共混的材料。
在圖1的實(shí)施方案中，如圖3所示，氣體從各圓筒5的容器壁沿箭頭C方向，也就是從360度方向面對(duì)各圓筒5的中心部分?jǐn)U散，所以容器壁附近和離容器壁最遠(yuǎn)的中心部分的各溶解氣體的濃度差別變小，可以使培養(yǎng)條件更接近最佳培養(yǎng)條件。另外在培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)需要，以不使細(xì)胞破壞的程度，對(duì)培養(yǎng)空器2進(jìn)行振蕩、搖動(dòng)或使其進(jìn)行旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。這樣可以防止在浮游細(xì)胞或微生物的培養(yǎng)時(shí)，可以看到的細(xì)胞或微生物的沉降，并促進(jìn)對(duì)培養(yǎng)液的攪拌，所以從保持均勻性觀點(diǎn)考慮是理想的。
培養(yǎng)容器2的端部2a、2b的培養(yǎng)容器長(zhǎng)度方向外側(cè)和圓筒部4的培養(yǎng)容器寬度方向外側(cè)，也就是培養(yǎng)容器2的四邊，如圖4所示通過(guò)對(duì)2枚片材進(jìn)行熱封，形成密封部2c、2d、2e、2f。這些密封部中，密封部2d形成切去氣體注出口部分的形狀，以便不妨礙設(shè)置后面將要敘述的氣密性容器3的氣體注出口。
氣密性容器3，為了使氣體能夠在其與內(nèi)側(cè)的培養(yǎng)容器2之間流通，是其尺寸大小可以形成足夠空間的容器，作為整體形成平面視圖為矩形、并且封閉其四邊。氣性密性容器3，例如是使2枚氣密性塑料片材重合進(jìn)行熱成型，使中央部分膨脹突出，并且在四邊形成密封部3a、3b、3c、3d而制造。在氣密性容器3的一側(cè)端部設(shè)置氣體注入口9，在另一端部設(shè)置氣體排出口10，與容器3內(nèi)部連通。氣體注入口9、氣體排出口10構(gòu)成本發(fā)明的通氣口。另外，通氣口可以兼作注入口9和氣體排出口10使用，至少設(shè)置1個(gè)，優(yōu)選設(shè)置2個(gè)。另外培養(yǎng)氣體的組成，可以根據(jù)要培養(yǎng)的細(xì)胞和微生物進(jìn)行適當(dāng)選擇。培養(yǎng)氣體可以是間歇流動(dòng)或連續(xù)流動(dòng)，通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)氣體的壓力，可以在加載壓力的狀態(tài)下培養(yǎng)和在變化壓力的狀態(tài)下培養(yǎng)。
氣密性容器3的密封部3a、3b，使其分別夾持培養(yǎng)容器2的密封部2c、2d，并與該密封部2c、2d熔合，這樣形成氣密性容器3和培養(yǎng)容器2的接合部12、13。，接合部分12、13使培養(yǎng)容器2和氣密性容器3之間可以形成空間，具有把培養(yǎng)容器2保持在氣密性容器3內(nèi)的功能，構(gòu)成本發(fā)明的培養(yǎng)容器保持手段。
如圖5所示，通氣口可以在制造雙層培養(yǎng)容器時(shí)，預(yù)先在氣密性容器3的端部形成，或者以沒(méi)有設(shè)置通氣口的雙層培養(yǎng)容器的形式流通，之后在培養(yǎng)時(shí)如圖6所示，在氣密性容器3密封部以外的部分安裝通氣口14。
作為氣密性容器3，可以是單層或多層的吹塑成型袋和單層或多層的薄膜袋，沒(méi)有特別限制。當(dāng)是單層吹塑成型袋或薄膜袋時(shí)，優(yōu)選是含有容易與培養(yǎng)容器表面層進(jìn)行熱封、并且具有撓性材質(zhì)的薄膜，例如由聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、乙烯-烯烴共聚物、乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)等組成的塑料薄膜。特別優(yōu)選由與容器主體的表面積相同或同系列的材質(zhì)組成。還優(yōu)選同時(shí)使用氧吸收劑。
當(dāng)賦予高氣密性時(shí)，優(yōu)選使用多層薄膜，作為具有氣密性的材料，優(yōu)選使用如雙軸向取向聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯薄膜、雙軸向取向尼龍薄膜等單層或多層拉伸薄膜，由乙烯-乙烯醇共聚物(EVOH)、聚乙醇酸、芳香族聚酰胺、聚偏氯乙烯(PVDC)等組成的薄膜，各種聚偏氯乙烯涂布薄膜，蒸鍍鋁或蒸鍍氧化硅的聚酯或聚酰胺薄膜等合成樹(shù)脂薄膜和以上述塑料薄膜作為密封膠的多層薄膜。
為了形成這些多層膜，除了共擠出吹塑以外，還可以應(yīng)用干復(fù)合、夾層復(fù)合、擠塑復(fù)合等已知的任意層合方法。
在雙層培養(yǎng)容器1的流通階段，通過(guò)用惰性氣體或惰性氣體與二氧化碳?xì)獾幕旌蠚怏w對(duì)培養(yǎng)容器2和氣密性容器3之間的空間進(jìn)行置換，或?qū)υ摽臻g進(jìn)行脫氣，可以提高培養(yǎng)液的保存性，延長(zhǎng)保存時(shí)間。同樣在該空間中封入氧吸收劑或者通過(guò)在氣密性容器3中設(shè)置氧吸收部或氧吸收層，也可以獲得同樣的效果。
氧吸收劑或氧吸收樹(shù)脂，可以使用已知的任意材料。例如作為鐵系的氧吸收劑，優(yōu)選使用含鐵或鐵系化合物的鐵粉和鹵化金屬的混合物。作為鐵粉，只要是能夠產(chǎn)生氧吸收反應(yīng)，對(duì)其純度沒(méi)有特別限制，例如可以使用還原鐵粉、噴霧鐵粉、電解鐵粉等鐵粉，鑄鐵、鋼材等各種鐵的粉碎物和研磨材料，以及碳化鐵、羰基鐵、氧化亞鐵、氫氧化亞鐵硅酸鐵等鐵系化合物。一般優(yōu)選粒狀材料，作為粒徑，考慮到使用操作性、可以減薄氧吸收層的膜厚、薄膜外觀上出現(xiàn)的氧吸收劑的凹凸情況，優(yōu)選1～80μm范圍，特別優(yōu)選1～50μm范圍。
作為鐵系氧吸收劑助劑的鹵化金屬，可以使用如堿金屬或堿土類(lèi)金屬的氯化物、溴化物或碘化物，優(yōu)選使用鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、鋇等的氯化物或碘化物。鐵粉每100重量份的鹵化金屬配合量?jī)?yōu)選為0.1～20重量份，特別優(yōu)選0.1～5重量份。從各成分不容易分離的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選鹵化金屬預(yù)先與鐵粉混合，進(jìn)行添加。優(yōu)選的氧吸收劑，是含有鐵粉和鹵化金屬的鐵粉系組合物，特別優(yōu)選使鹵化金屬附著在鐵粉上的鹵化金屬覆蓋鐵粉系的組合物。
鐵系的氧吸收劑，既可以把它裝在透氣性的培養(yǎng)容器2和罩在該容器上的氣密性容器3之間形成的空間或與之相連的空間中，并使其不會(huì)漏到無(wú)紡織布或者是紙等材料上使用，還可以混合到構(gòu)成容器的出入口嘴、蓋等的一部分樹(shù)脂中。另外還可以在氣密性容器3的任意層中，作為氧吸收層使用，為了能夠觀察到氣密性容器3的內(nèi)部，優(yōu)選在氣密性容器3的一個(gè)側(cè)面或一部分使用。
鐵系氧吸收劑相對(duì)于樹(shù)脂的配合量，優(yōu)選為10～70重量％范圍，更優(yōu)選10～60重量％范圍。如果氧吸收劑的配合量低于10重量％，則吸收氧的能力不充分；如果高于70重量％，則有時(shí)注射成型、壓塑成型、制膜加工等加工將變得困難。氧吸收層的膜厚，不限于何種構(gòu)成材料，優(yōu)選為10～100μm范圍，特別優(yōu)選20～80μm范圍。如果氧吸收層的膜厚比10μm薄，則薄膜單位面積的氧吸收劑量將會(huì)變少，得不到充分的氧吸收性能。另外如果比100μm厚，則薄膜的總厚度將會(huì)變厚，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生使用操作不方便或在成本上發(fā)生問(wèn)題。
作為氧吸收樹(shù)脂，可以使用含有金屬系氧化催化劑和氧化性樹(shù)脂或氧化性有機(jī)成分的樹(shù)脂、多酚類(lèi)、含有抗壞血酸類(lèi)等和堿性物質(zhì)的樹(shù)脂。
作為氧化性樹(shù)脂或氧化性有機(jī)成分，是在過(guò)渡金屬系催化劑的作用下，由于空氣中的氧作用而受氧化的樹(shù)脂或有機(jī)成分。
作為氧化性樹(shù)脂，可以使用(1)如聚丙烯的具有叔碳原子的樹(shù)脂；(2)如乙烯-一氧化碳共聚物的具有羰基的樹(shù)脂；(3)MXD6等具有苯環(huán)的聚酰胺樹(shù)脂；(4)如聚丁二烯、聚異戊二烯及它們的共聚物的在主鏈上具有不飽和雙鍵的樹(shù)脂；(5)在側(cè)鏈上具有如環(huán)己烯基等的不飽和雙鍵的樹(shù)脂；(6)如聚環(huán)己二烯等的環(huán)狀共軛二烯系樹(shù)脂等。作為氧化性有機(jī)成分，可以列舉(7)抗壞血酸；(8)半胱氨酸等，它們?cè)谂c碳酸鈉、乙酸鉀等堿性物質(zhì)共同存在下，吸收水分、吸收氧。
作為金屬系氧化催化劑，優(yōu)選鐵、鈷、鎳等周期表中第VIII族的金屬化合物，此外還可以列舉銅、銀等(第I族)，錫、鈦、鋯等(第IV族)，釩、(第V族)，鉻(第VI族)，錳(第VII族)的金屬化合物。這些金屬化合物中，鈷化合物的吸收氧的速度大，所以特別優(yōu)選。過(guò)渡金屬催化劑，一般以上述過(guò)渡金屬的低價(jià)數(shù)無(wú)機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽或絡(luò)合物的形式使用。相對(duì)于樹(shù)脂，這些催化劑可以以100至2000ppm的量使用。
氧化性樹(shù)脂或氧化性有機(jī)成分，與使用鐵系氧吸收劑時(shí)相反，不會(huì)損壞透視性，所以可以優(yōu)選使用。還可在透氣性培養(yǎng)容器2和氣密性容器3的一方或雙方的任意部分或全體部分中，作為氧吸收層使用。還可以把它混合在位于培養(yǎng)容器2和氣密性容器3之間形成的空間或與之相連空間中的任意容器構(gòu)成組件，例如出入口嘴、蓋等的一部分樹(shù)脂中使用。
作為在氣密性容器3中設(shè)置氧吸收層的材料結(jié)構(gòu)例子，可以是以下的任意結(jié)構(gòu)，但并不局限于此。
氧吸收層(單層時(shí))；外層/氧吸收層(2層時(shí))；外層/氧吸收層/密封膠層；外層/氣密層/氧吸收層/密封膠層；外層/氣密層/氧吸收層/氣密層/密封膠層。
制造本實(shí)施方案的雙層培養(yǎng)容器時(shí)，根據(jù)需要還可以在制造封入氧吸收劑的雙層培養(yǎng)容器后實(shí)施γ射線滅菌(或紫外線滅菌、電子射線滅菌、加熱滅菌)，接著無(wú)菌填充培養(yǎng)液，并且無(wú)菌密封填充口，即完成制造。
以前的容器，在培養(yǎng)時(shí)如果將其吊起，則如圖8(a)所示形狀變形，在容器壁附近和遠(yuǎn)離容器壁部分的氣體擴(kuò)散不均勻性非常嚴(yán)重，不能形成最佳氣體組成，所以不能向這樣吊起，但是上述實(shí)施方案的雙層培養(yǎng)容器，則如圖8(b)所示，在培養(yǎng)時(shí)即使將雙層培養(yǎng)容器豎立吊起，容器的形狀也不發(fā)生變化，因此可以把多個(gè)雙層培養(yǎng)容器以豎立吊起的狀態(tài)配置，可以減少配置空間。
圖10和圖11表示有關(guān)本發(fā)明雙層培養(yǎng)容器的另一個(gè)實(shí)施方案，在本實(shí)施方案中，是在制造設(shè)置注入·抽出口6a、6b的培養(yǎng)容器2之后，如圖11所示，使用2枚氣密性材料進(jìn)行熱封，使其罩住培養(yǎng)容器2形成氣密性容器3，制造雙層培養(yǎng)容器1。
在這個(gè)例子中，首先設(shè)置注入·抽出口·氣體排出口收存部16、氣體注入口收存部17以及前述注入·抽出口收存部18，然而使包括前述注入·抽出口收存部18的、以C-C劃分的部分19形成未密封部分，用構(gòu)成氣密性容器3的氣密性材料罩住注入·抽出口6a、6b、氣體注入口9、氣體排出口10。這時(shí)可以向注入·抽出口·氣體排出口收存部16內(nèi)封入氧吸收劑。通過(guò)這樣的操作，通過(guò)氣體排出口10可以使其具有除去容器主體內(nèi)的氧的功能，與此同時(shí)，在使用時(shí)，還可以除去氧吸收劑。
接著把這樣制造的雙層培養(yǎng)容器1的1個(gè)或多個(gè)置于滅菌袋中，實(shí)施γ射線滅菌。然后在無(wú)菌環(huán)境下打開(kāi)滅菌包裝，從位于沿C-C開(kāi)啟的未密封部分19的注入·抽出口6a無(wú)菌填充培養(yǎng)液，然后進(jìn)行無(wú)菌密封。之后剩下注入口收存部18，進(jìn)行熱封，制成雙層培養(yǎng)容器。通過(guò)這樣的操作，可以獲得注入·抽出口6a、6b受到氣密性材料保護(hù)的優(yōu)點(diǎn)。
在使用時(shí)，沿D-D對(duì)抽出口·氣體排出口收存部分16開(kāi)封，就可以使用，注入·抽出口6b已經(jīng)經(jīng)過(guò)γ射線的滅菌處理，保持著滅菌狀態(tài)，所以具有在注入細(xì)胞等時(shí)，只對(duì)外側(cè)進(jìn)行消毒，不用對(duì)抽出口6b進(jìn)行滅菌的優(yōu)點(diǎn)。
另外當(dāng)把氣體排出口10兼作為氣體注入口9使用時(shí)，可以不設(shè)置前述氣體排注入口9以及氣體注入口收存部17，即使設(shè)置，也可以不開(kāi)封。
在上述實(shí)施方案中，培養(yǎng)容器保持手段，由連接部12、13構(gòu)成，但是培養(yǎng)容器保持手段，并不只限于這樣的連接手段，例如圖12的斷面圖所示，可以通過(guò)使由剛性塑料形成的氣密性容器3內(nèi)側(cè)的四個(gè)角與培養(yǎng)容器2外側(cè)的四個(gè)角直接接觸，在容器的長(zhǎng)度方向形成支撐培養(yǎng)容器2的培養(yǎng)容器支撐臂15來(lái)保持培養(yǎng)容器2。關(guān)鍵是只要能夠使培養(yǎng)容器2和氣密性容器3之間形成空間，并且能夠把培養(yǎng)容器2保持在氣密性容器3內(nèi)的手段，則不論何種手段均可。
在上述實(shí)施方案中，是把多個(gè)圓筒并列配置成游泳氣墊狀構(gòu)成的培養(yǎng)容器，培養(yǎng)容器還可以是由一個(gè)圓筒構(gòu)成的。使容器壁形成棱柱體狀、球狀、半球狀也是同樣的，可以考慮各種變更的例子。
培養(yǎng)容器和氣密性容器，既可以是分別由具有撓性的柔軟塑料組成的袋狀容器，也可以是具有剛性的瓶等容器，還可以是它們的組合。
圖13～圖17是表示本發(fā)明另一實(shí)施方案的與圖2相同斷面的斷面圖。在圖3的例子中，培養(yǎng)容器2是對(duì)相對(duì)的壁面實(shí)施熱封，形成游泳氣墊狀，并賦予其形狀保持性。圖13～圖17示出對(duì)培養(yǎng)容器2不實(shí)施熱封，也不使其具有形狀保持特性時(shí)的示例。也就是在本發(fā)明中，只要是在培養(yǎng)容器2和氣密性容器3之間能夠形成空間，可以防止或降低氣體對(duì)培養(yǎng)容器2擴(kuò)散的損失，并且能夠把培養(yǎng)容器2保持在氣密性容器3內(nèi)的手段，則可以采用任何手段，圖13～圖17出示了這些例子的情況，以下進(jìn)行說(shuō)明。圖13～圖17中，與圖1～圖12實(shí)施方案相同的構(gòu)成要素，用相同的符號(hào)表示，在此省略其說(shuō)明。
在圖13的實(shí)施方案中，氣密性容器3是由具有剛性的塑料形成的容器，透氣性培養(yǎng)容器2是由具有撓性的柔軟塑料形成的容器，在容器2和3之間，鋪滿無(wú)紡布等由具有透氣性的材料構(gòu)成的透氣性墊17。通過(guò)該透氣性墊17，形成為容納在兩容器2、3之間控制氣體的組成的氣體的空間。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，有時(shí)需要用顯微鏡等觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)性，所以不一定要全面鋪設(shè)透氣性墊17，可以空出一部分不鋪設(shè)透氣墊，只要在可以發(fā)揮其功能的范圍內(nèi)進(jìn)行設(shè)計(jì)即可。另外為了使透氣性墊17不產(chǎn)生移位，還可以用已知手段將其粘接或固定在氣密性容器3中。另外在該實(shí)施方案中，培養(yǎng)液等的注入·抽出口6的內(nèi)端部6a在培養(yǎng)容器2內(nèi)不突出出來(lái)，所以取出培養(yǎng)液時(shí)，在培養(yǎng)容器2內(nèi)不會(huì)殘存部分培養(yǎng)液，是很方便的。
在圖14的實(shí)施方案中，氣密性容器3、培養(yǎng)容器2雙方均是由具有撓性的柔軟塑料組成的容器，在容器2和3之間，鋪滿透氣性墊17，形成容納氣體用的空間。當(dāng)沿縱向吊起該雙層容器1時(shí)，通過(guò)由板狀或多根棒狀組件等具有剛性的組件構(gòu)成的增強(qiáng)夾具18支撐容器的兩側(cè)，可以得到與圖8(b)相同的效果，即使培養(yǎng)容器2沒(méi)有形成游泳氣墊的形狀，仍然可以使其形成具有形狀保持性的狀態(tài)。
在圖15(a)的斷面圖以及圖15(a)的E-E斷面斜視圖(沒(méi)有示出氣密性容器3)的15(b)所示的實(shí)施方案中，氣密性容器3、培養(yǎng)容器2的雙方均是由具有撓性的柔軟塑料組成的容器，在容器3的內(nèi)側(cè)平面周邊部分和容器2的外側(cè)平面周邊部分之間，安裝增強(qiáng)夾具19，該夾具19分別是由矩形框狀的具有剛性的組件和在該框狀組件上張開(kāi)的網(wǎng)20組成的。通過(guò)該增強(qiáng)夾具19，在容器2、3之間形成氣體容納用的空間，對(duì)氣密性容器3的內(nèi)側(cè)和增強(qiáng)夾具19沒(méi)有進(jìn)行固定，以使氣密性容器3的內(nèi)側(cè)和增強(qiáng)夾具19的外側(cè)之間形成間隙21，在通過(guò)向容器2、3之間的空間注入壓縮空氣等壓縮氣體取出培養(yǎng)容器內(nèi)的內(nèi)容物時(shí)，不會(huì)妨礙壓縮氣體的流通。
在圖16和圖17的實(shí)施方案中，氣密性容器3只有一面是具有剛性的塑料組成，而另一面是具有撓性的柔軟塑料組成的容器；透氣性培養(yǎng)容器2是由具有撓性的柔軟塑料組成的容器，面向氣密性容器3剛性側(cè)面的培養(yǎng)容器3的側(cè)面附著在氣密性容器3的內(nèi)側(cè)，只在其相反側(cè)面和氣密性容器3柔軟側(cè)的內(nèi)側(cè)之間形成容納氣體用的空間。另外在這些實(shí)施方案中，根據(jù)需要?dú)饷苄匀萜?兩面的容器壁可以采用具有撓性的柔軟材料和具有剛性的材料。
產(chǎn)業(yè)上的實(shí)用性本發(fā)明，作為細(xì)胞和微生物的培養(yǎng)容器和培養(yǎng)方法是可以利用的，特別是可以作為保存培養(yǎng)液、實(shí)現(xiàn)最佳培養(yǎng)環(huán)境、內(nèi)容物的易抽出性優(yōu)異，作為適合于浮游細(xì)胞培養(yǎng)和使用小珠和無(wú)紡織布等載體的附著細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)容器和使用該容器的培養(yǎng)方法，是可以利用的。
權(quán)利要求
1.雙層培養(yǎng)容器，它的特征是具備具有注入·抽出口的透氣性培養(yǎng)容器、罩在該培養(yǎng)容器上的氣密性容器、和使該培養(yǎng)容器和該氣密性容器之間能夠形成空間并把該培養(yǎng)容器保持在該氣密性容器內(nèi)的培養(yǎng)容器保持手段，在細(xì)胞或微生物培養(yǎng)時(shí)，在該培養(yǎng)容器和該氣密性容器間形成的空間中容納控制氣體的組成的氣體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的雙層培養(yǎng)容器，其中，該培養(yǎng)容器保持手段是使該培養(yǎng)容器部分連接到該氣密性容器上的手段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的雙層培養(yǎng)容器，其中，在該氣密性容器中設(shè)置通氣口，該通氣口與該培養(yǎng)容器和該氣密性容器之間的空間是連通的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任意一項(xiàng)中所述的雙層培養(yǎng)容器，其中，在培養(yǎng)時(shí)，該培養(yǎng)容器的容器壁基本上是形成圓筒狀、橫斷面為正多邊形的棱柱體狀、球狀或半球狀的任意一種形狀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任意一項(xiàng)中所述的雙層培養(yǎng)容器，其中，在該培養(yǎng)容器中填充·密封培養(yǎng)液，用惰性氣體或惰性氣體與二氧化碳的混合氣體對(duì)該培養(yǎng)容器和該氣密性容器之間的空間進(jìn)行置換。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～4任意一項(xiàng)中所述的雙層培養(yǎng)容器，其中，在該培養(yǎng)容器中填充·密封培養(yǎng)液，對(duì)該培養(yǎng)容器和該氣密性容器之間的空間進(jìn)行脫氣。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6任意一項(xiàng)中所述的雙層培養(yǎng)容器，其中，在該培養(yǎng)容器中填充·密封培養(yǎng)液，在該培養(yǎng)容器和該氣密性容器之間的空間封入氧吸收劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～7任意一項(xiàng)中所述的雙層培養(yǎng)容器，其中，該氣密性容器具有氧吸收部分或氧吸收層。
9.培養(yǎng)方法，它是在由具有注入·抽出口的透氣性培養(yǎng)容器和罩在該培養(yǎng)容器上的氣密性容器組成的雙層培養(yǎng)容器的該培養(yǎng)容器和該氣密性容器之間的空間，控制氣體組成進(jìn)行培養(yǎng)的方法。
10.根據(jù)權(quán)利要求9中所述的培養(yǎng)方法，其中，從與該培養(yǎng)容器和該氣密性容器之間的空間相連通的通氣口注入·抽出控制氣體的組成的氣體。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10中所述的培養(yǎng)方法，其中，在培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)向該培養(yǎng)容器和該氣密性容器之間的空間注入壓縮氣體，抽出該培養(yǎng)容器中內(nèi)容物。
全文摘要
本發(fā)明提供即使同時(shí)培養(yǎng)偏嗜不同氣體濃度的多種類(lèi)細(xì)胞時(shí)，也不需要多個(gè)培養(yǎng)箱的培養(yǎng)容器和培養(yǎng)方法。雙層培養(yǎng)容器1具備具有注入·抽出口6的透氣性培養(yǎng)容器2、罩在該培養(yǎng)容器2上的氣密性容器3、和使該培養(yǎng)容器2和該氣密性容器3之間可以形成空間，把該培養(yǎng)容器2保持在該氣密性容器3內(nèi)的連接部12、13，在細(xì)胞或微生物培養(yǎng)時(shí)，在該培養(yǎng)容器2和該氣密性容器3間形成的空間中容納控制氣體的組成的氣體。
文檔編號(hào)C12N1/00GK1942575SQ200580011298
公開(kāi)日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月13日
發(fā)明者波多野靖, 松木理三郎 申請(qǐng)人:東洋制罐株式會(huì)社